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Biotecnología de la Inmunoglobulina Y (IgY) en animales domésticos como preventivo ó terapéutico en enfermedades entéricas - IgY biotechnology like therapeutic or prophylactic in enteric diseases in domestic animals Pamela Romeroa., Alejandra P. Magnolia., y María F. Peraltaa* a Departamento de Producción Animal, Cátedra de Producción Avícola. Facultad de Agronomía y Veterinaria. Universidad Nacional de Rio Cuarto, Ruta 36 Km 601, CP. 5800 – Río Cuarto – Córdoba – Argentina. *Correo electrónico: [email protected]

Resumen El huevo de las aves contiene todos los nutrientes y los factores de crecimiento necesarios para el desarrollo del embrión, incluyendo anticuerpos que son transportados desde la sangre de la gallina a la yema proporcionando de esta manera la inmunidad pasiva a la descendencia. Dentro de los distintos anticuerpos presentes en el huevo, en la yema se deposita la Inmunoglobulina Y (IgY), análoga a la IgG de mamíferos. Aunque se conocen desde 1800, se redescubrieron hace unos 30 años atrás por sus numerosas ventajas con respecto a los anticuerpos de mamíferos, y se aplicaron en el campo de la medicina, en particular en áreas tales como diagnóstico médico o veterinario, en inmunoterapia, e inmunoprofilaxia, y en la investigación obteniendo muy buenos resultados. Además, a través de esta nueva biotecnología se tiende a reemplazar el uso de antibióticos en animales domésticos, ofreciendo productos más naturales al consumidor, disminuyendo de esta forma la resistencia bacteriana. Numerosas investigaciones se focalizaron en la producción de IgY contra bacterias entéricas como Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter, entre otras, para ser usada como inmunoprofilaxis y/o inmunoterapia en animales domésticos, a muy bajo costo, con buen rendimiento y considerando el bienestar animal. Palabras claves: Biotecnología IgY, Animales Domésticos, Enfermedades Entéricas, Prevención, Curación.

Abstract The avian egg contains all of the necessary nutrients and growth factors required for the developing embryo, including antibodies that are transported from the blood of the hen into the egg yolk to provide passive immunity to the chicken. Between the different antibodies present in eggs, immunoglobuline Y (IgY), analog to mammiferal Ig G, is transferred into yolk. Although Ig Y Biotecnología de la Inmunoglobulina Y (IgY) en animales domésticos como preventivo ó terapéutico en enfermedades entéricas http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010114/011402.pdf

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technology is knower since 1800, it is rediscover only 30 years ago, for its advantages respect to mammalian antibodies. Also, IgY is applying in the medical fields, including in areas such as diagnostics and veterinarian, in immunotherapy and immunoprophylaxis and in research, with good results. Also, using this new biotechnology, it is tender to replace the use of antibiotics in domestic animals, so offer natural products to consumer, and then diminished the bacterial resistance. A lot of researches is focus on production IgY against enteric bacterium like Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter, etc, for be used like immunoprophylaxis and/or immunotherapy in domestic animals. Antibody production is no stressful and noninvasive, and the isolation and purification of IgY are relatively simple and high yielding. Keywords: IgY Biotechnology, Prevention, Healing

Domestic

Animal,

Enteric

Diseases,

EL SISTEMA INMUNE DE LAS GALLINAS El sistema inmune de las gallinas, en forma similar al de los mamíferos, está formado por dos componentes principales: uno de ellos inespecífico e innato y el otro específico y adquirido. Entre estos dos componentes inmunitarios existen numerosas interacciones, al igual que en mamíferos, que tienen mucha importancia en la respuesta inmune. Las aves también poseen, por ejemplo, células presentadoras de antígenos y demás componentes celulares, mecanismos funcionales que son regulados por las interleuquinas4. Otro integrante del sistema inmune que ha tomado importancia en las últimas investigaciones es el Sistema Inmune Asociado a Mucosas o MALT, tanto por su longitud y distribución como por sus funciones. El MALT abarca gran superficie en las aves ya que comprende el Tejido Linfoide Asociado al Ojo, Tejido Linfoide Nasofaringeo, Tejido Linfoide Asociado a Bronquios (BALT), Tejido Linfoide Asociado a Genitales y Tejido Linfoide Asociado a Intestino (GALT). Distintas investigaciones confirman que en el GALT se encuentran el 70 a 80% de todas las células del sistema inmune, por lo que se considera el órgano inmune efector más grande de todo el organismo y está formado por una gran cantidad de células inmunológicas, organizadas en diferentes estructuras: las Placas de Peyer (PP), Divertículo de Meckel (DM) y Tonsilas Cecales (TC). Para mayor eficiencia de la función protectora, el tubo digestivo, al igual que el sistema inmune en general, se sustenta en mecanismos de defensa, inespecíficos y específicos. La Inmunidad Innata o inespecífica es la primera línea de defensa natural contra agentes invasores, protección que puede ser estructural como el epitelio y la mucosa intestinal, químicas como el grado de acidez o alcalinidad (pH), péptidos antimicrobianos y proteínas; por ejemplo, la lisozima que es capaz de inactivar algunas bacterias Gram positivas. Los procesos inflamatorios se producen en contra de la invasión de agentes infecciosos; se caracterizan por un aumento en la permeabilidad Biotecnología de la Inmunoglobulina Y (IgY) en animales domésticos como preventivo ó terapéutico en enfermedades entéricas http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010114/011402.pdf

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capilar en el área afectada y, por consiguiente, la llegada de numerosas células (heterófilos, eosinófilos, basófilos, macrófagos y células dendríticas) que de manera particular, realizan el proceso de fagocitosis. Debido a este aumento en la permeabilidad capilar, se hace posible el paso del complemento, anticuerpos (inmunoglobulinas) y otras moléculas presentes en el plasma sanguíneo. La inmunidad adquirida o específica, se vale de la respuesta inmune humoral y la respuesta inmune celular. La inmunidad humoral se sustenta en la producción de inmunoglobulinas que producen las células plasmáticas derivadas de la estimulación de los linfocitos B. En general, la respuesta de anticuerpos está dirigida contra antígenos con localización extracelular17,4,25. En la respuesta inmune celular, los linfocitos T colaboradores y citotóxicos son las células que reconocen y responden de manera específica a los antígenos extraños, degradados y presentados por las células presentadoras de antígenos. La Bolsa de Fabricio juega un papel principal en el desarrollo de células B aviares. Mediante la colonización de un pequeño número de linfocitos B precursores, alrededor de los dos meses de edad, se origina la proliferación rápida de unos 104 folículos de la bolsa de Fabricio, donde unas semanas después, aproximadamente el 5% de sus células migran cada día a la sangre pasando al bazo, timo y tonsilas cecales, produciéndose posteriormente las inmunoglobulinas6,4. BIOTECNOLOGÌA DE IgY A pesar de todas estas semejanzas con los mamíferos, las gallinas presentan una diferencia muy importante en cuanto a la transferencia de inmunidad pasiva a los pollitos, lo hacen a través de los componentes fluidos del huevo. Cuando el huevo se encuentra en el ovario, la gallina transfiere la IgM e IgA presentes en circulación a la clara y la inmunoglobulina “Y” (IgY) a la yema. El nombre IgY proviene del nombre inglés “yolk” ó yema y es la principal inmunoglobulina del suero implicada en la respuesta inmune secundaria y análoga a la IgG presente en los mamíferos. De esta manera, el huevo de ave contiene todos los nutrientes y factores de crecimiento necesarios para que el embrión pueda desarrollarse, incluyendo además los anticuerpos para proporcionarle inmunidad11. Ventajas de esta nueva biotecnología: a fines del 1800 se descubrió esta transferencia de inmunidad de la gallina a su descendencia, pero esta interesante temática fue olvidado hasta hace 30 años atrás aproximadamente, donde resurgió su interés por sus diferentes ventajas. Entre ellas la preservación del bienestar animal, ya que no es un método invasivo como el de mamíferos donde se sacrifica al animal para obtener niveles considerables de anticuerpos en el caso del conejo, o en animales domésticos mayores se hacen sangrados seriados. En las aves se deposita el huevo y este se puede recolectar fácilmente4,11. Además la cantidad de anticuerpos producidos por una gallina es mucho mayor que los obtenidos de conejos, siendo fácilmente extraíble de la yema y relativamente sencillo su proceso. Debido a la distancia filogenética entre aves y mamíferos, los anticuerpos de aves no tienen reacciones cruzadas con las IgG de mamíferos, minimizando las falsas Biotecnología de la Inmunoglobulina Y (IgY) en animales domésticos como preventivo ó terapéutico en 3 enfermedades entéricas http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010114/011402.pdf

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reacciones positivas. Por ejemplo, la IgY no produce reacciones cruzadas con los factores reumatoides, lo cual disminuye las falsas reacciones positivas cuando se evalúan marcadores de inflamación (proteína C-reactiva), característica importante para el estudio y seguimiento de los procesos inflamatorios. Otra gran ventaja es la ausencia de reacciones inespecíficas con el complemento y heteroaglutininas de mamíferos, lo que la hace una inmunoglobulina de elección para pruebas de ELISA evitando así resultados falsos positivos. Por otro lado el sistema inmune de las aves es capaz de producir anticuerpos específicamente dirigidos contra antígenos de mamíferos altamente conservados (antígenos que no sufrieron cambios sustanciales durante la filogenia). De este modo la IgY puede reconocer ciertas partes de una molécula que no son reconocidas por la IgG, importante en el momento de construir herramientas de diagnóstico24,4,16,3,15,21,11,20. Además, se requiere una baja cantidad de antígenos para obtener una concentración duradera de IgY desde la yema de los huevos inmunizados9. Este proceso ha sido aprovechado para producir anticuerpos específicos para numerosas aplicaciones tanto en medicina como en el campo de la investigación6,4,9. Sin embargo, muchos estudios se han centrado en el uso de IgY en la inmunización pasiva para tratar y prevenir enfermedades en humanos y animales9. PRODUCCION DE IgY Uno de los desafíos mayores de la investigación actual es disminuir el uso de antibióticos utilizados como promotores de crecimiento, preventivos y/o curativos incorporados en las dietas animales. Además, se han demostrado sus impactos negativos tanto en lo económico como en la resistencia bacteriana de los mismos, haciéndolos menos efectivos. En la búsqueda de una alternativa viable para su reemplazo, se cuentan con la biotecnología de la IgY, basada en la inmunoterapia oral (inmunización pasiva) con anticuerpos específicos (por ejemplo, microorganismos entéricos), siendo una estrategia que se sigue investigando de manera activa11,22. Para la producción de estas IgY, las gallinas se inoculan con antígenos específicos, que inducen respuesta inmune produciendo gran cantidad de anticuerpos que se transfieren a la yema del huevo, y para mantener niveles elevados, se realizan booster de inmunización cada dos semanas, para asegurar la transferencia continua de estosi2,19,22. Una vez recolectados los huevos se les extrae la yema y se la purifica mediante diferentes técnicas (método de dilución en agua, electroforesis, polietilenglicol, entre otras), para administrarlos directamente al animal o incluirlos en los alimentos24,12,3,ii. Sin embargo, diferentes estudios demostraron que la administración directa de la IgY específica se inactiva cuando toma contacto con el estomago debido a su pH ácido y a las enzimas presentes en el mismo, razón por la cual se la ha envuelto en liposomas, cápsulas de gelatina, o adosado a nanotubos de carbón, para aumentar su estabilidad y absorción en el sitio correcto24,12,22. Biotecnología de la Inmunoglobulina Y (IgY) en animales domésticos como preventivo ó terapéutico en 4 enfermedades entéricas http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010114/011402.pdf

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En numerosos estudios se ha demostrado que la administración de estos anticuerpos ha sido muy efectiva en la prevención de infecciones entéricas virales y bacterianas en humanos, lechones, becerros, peces y conejos20,7,17,24,23,4,10,12,24,3,19,11. Dentro de los diferentes usos de la IgY en bacterias entéricas, se enfatiza la inmunoterapia oral, aunque diferentes estudios in vitro, han demostrado otros modos de acción de esta inmunoglobulina como evitar la unión de bacterias al enterocito, al unirse al receptor intestinal y bloquearlo, la inmovilización de la bacteria al rodearla y evitar también que se una a la célula intestinal, inhibiendo así la formación de unidades de colonias y la replicación13,4,3,16,14,2,11,2. Numerosos investigaciones han demostrado el éxito del uso profiláctico/terapéutico de productos basados en la IgY tanto en la prevención como en el tratamiento de diarreas producidas por bacterias en diferentes especies de animales domesticos13,4,3,16,14,2,11,2. Bellingeri y col. (2013)2, observaron inhibición del crecimiento bacteriano luego de la adición de IgY específica, en un estudio in vitro realizado en cultivos primarios de células intestinales de bovino infectadas con Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC). Por otro lado, Jin y col. (2011)13, mediante un estudio in vitro con cultivos de células epiteliales de cerdos infectadas con Escherichia coli K88, demostraron la inhibición de la adhesión bacteriana luego de la incorporación de la IgY específica al medio de cultivo. Melo y Col. (2005)1iii en otro estudio in vitro, observaron el bloqueo de la apoptosis inducida por el factor de virulencia bfpA de Escherichia coli en células Vera, luego de la adición de IgY específica. Estudios in vivo, utilizando lechones de días de vida a los cuales se les administraron cápsulas de arginato quitosano conteniendo IgY anti Escherichia coli no sólo evitó la mortalidad de los primeros días de vida, sino que se observó un alto rango de crecimiento de los animales15. Yegani y Korver (2007)28 realizaron un estudio in vitro, usando esta biotecnología innovadora anti Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium en cultivos de enterocitos porcinos, notándose que la IgY específica impidió la colonización de la bacteria y generó la inhibición del crecimiento bacteriano. Sin embargo, estos resultados llevados a estudios in vivo con aves, han dado resultados opuestos para el caso de esta bacteria entérica. Por ejemplo, en un estudio en ponedoras comerciales, la adición de yema en polvo con IgY anti Salmonella, disminuyo la eliminación fecal de esta bacteria, de la colonización cecal y del número de huevos contaminados2iv. Sin embargo, en otra investigación no se han encontrado resultados positivos con la adición de IgY anti Salmonella en pollos de semanas de vida, infectados con esta misma bacteria27. Posiblemente estos resultados dispares se deban a la falta de madurez del sistema inmune de los pollos, ya que es bien conocido que la madurez del GALT, se adquiere en las dos primeras semanas de vida1,28,26. De esta manera, al usar pollos parrilleros cuyo sistema inmune no está maduro, Biotecnología de la Inmunoglobulina Y (IgY) en animales domésticos como preventivo ó terapéutico en 5 enfermedades entéricas http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010114/011402.pdf

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no se pueden aprovechar los efectos beneficiosos de esta biotecnología. Más investigaciones sobre este tema serían necesarias, a fin de aclarar estos resultados. En otros estudios in vitro realizados con Campylobacter jejuni se encontró que la adición de la IgY específica en el medio de cultivo, inhibió el crecimiento de la misma dependiendo de la concentración de IgY aplicada. Estos resultados in vitro fueron corroborados en un estudio in vivo realizado en pollos infectados con esta bacteria 4 días antes de la administración oral de la IgY especifica, notándose una reducción del 80% del número de bacterias liberadas en heces. Estas observaciones demuestran que la inmunización pasiva administrada oralmente podría ser una herramienta profiláctica y terapéutica para proteger pollos contra Campylobacter jejuni2v. En otra interesante investigación usando estos anticuerpos específicos anti Campylobacter spp, en células epiteliales de ratas y células mucinosas de porcinos se inhibió el ataque bacteriano27. Estos mismos autores en otras investigaciones en gallinas ponedoras notaron que la administración oral conjunta de IgY anti Salmonella enteritidis y typhimurium, Campylobacter jejuni y Escherichia coli redujeron la colonización intestinal de estas bacterias en las heces, luego de 2 semanas de administración27. Agradecimiento Los autores agradecen a Secyt-UNRC por el subsidio otorgado para la realización de esta revisión. BIBLIOGRAFIA 1

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REDVET: 2013, Vol. 15 Nº 1 Recibido 11.12.2013 / Ref. prov. DIC1304_REDVET / Revisado 22.12.2013 Aceptado 29.12.2012 / Ref. def. 011413_REDVET / Publicado 01.01.2014 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010114.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010114./011413.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización®. Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET®- http://www.veterinaria.org/revistas/redvet

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