AllplexTM

Panel Respiratorio 2 (Adv / MPV / HEV/ PIV) (Cat. No. RP9802X)

Sistema de PCR en tiempo real múltiplex con RT (Transcripción Inversa) en un solo paso para la detección de Adenovirus humano, Metapneumovirus humano, enterovirus humano, virus de parainfluenza humano 1, virus de parainfluenza humana 2, virus de parainfluenza

humana

3,

virus

de

parainfluenza

humana

4

en

aspirados

nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares.

Para uso exclusivo con el MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet

Para su uso con el 1. Sistema de PCR en Tiempo Real CFX96TM (Bio-Rad)

(Uso para Diagnóstico In Vitro) Éste producto puede ser usado con propósitos IVD en países autorizados.

(Únicamente para uso en investigación) Este producto debe usarse para propósitos RUO en otros países.

No disponible en los Estados Unidos

Panel respiratorio AllplexTM 2

TABLA DE CONTENIDOS NOTIFICACIONES------------------------------------------------------------------------------------------------------ 3 USO PREVISTO--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4 PRINCIPIOS Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL PROCEDIMIENTO --------------------------------------------- 5 ANTECEDENTES ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6 REACTIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8 MANEJO Y ALMACENAMIENTO ----------------------------------------------------------------------------------- 9 MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO --------------------------------------------------------------------------- 9 PROTOCOLO --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANÁLISIS DE RESULTADOS ------- 15 RESULTADOS--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24 SOLUCIÓN DE PROBLEMAS -------------------------------------------------------------------------------------- 27 RENDIMIENTO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29 REFERENCIAS -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 33 SIMBOLOGÍA --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34 INFORMACIÓN DE PEDIDO --------------------------------------------------------------------------------------- 35

2

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Panel Respiratorio AllplexTM 2

NOTIFICACIONES 

Este producto se puede utilizar con propósitos IVD (Diagnóstico In Vitro) en la UE dado que la Marca IVD CE está aprobada por la Directiva de la UE (98/79/EC) y países autorizados, pero debe utilizarse para propósitos RUO (Uso Exclusivo en Investigación) en otros países.



La confiabilidad de los resultados depende de la toma adecuada de la muestra, el almacenamiento, el transporte y la ejecución de procesamiento.



Es posible usar el mismo ácido nucleico aislado para los Paneles Respiratorios AllplexTM 1, 2, y 3.



Si la misma muestra será evaluada también con el kit del Panel Respiratorio AllplexTM 4 adicionar ambos RP-V IC y RP-B IC al ácido nucleico aislado (Véase página 12).



Este producto es para uso exclusivo con el MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet, máximo 5 ensayos separados.



Ésta prueba ha sido validada para los siguientes tipos de muestras: aspirados nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares. Ésta prueba no ha sido validada para otros tipos de muestras.



Almacene las muestras de ADN/ARN a ≤ -20℃ hasta su uso y manténgalas en hielo durante su uso.



La sensibilidad del ensayo puede disminuir en las muestras que son congeladas y descongeladas repetidamente o almacenadas por largos periodos de tiempo.



El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder de manera unidireccional.



Use siempre guantes desechables en cada área y cámbielos antes de ingresar a áreas diferentes. Cambie los guantes inmediatamente si se contaminan o trátelos con un reactivo descontaminante de ADN.



Asigne suministros y equipos a las áreas de trabajo separadas y no los mueva de un área a la otra.



No pipetee con la boca.



No coma, beba o fume en las áreas de trabajo del laboratorio. Use guantes desechables libres de talco, batas de laboratorio y gafas protectoras cuando manipule muestras y reactivos. Lávese bien las manos después de manipular muestras y los reactivos de la prueba.



Evite contaminar los reactivos al extraer las alícuotas de los tubos de reactivos. Se recomienda el uso de puntas para pipetas estériles, desechables y con filtro resistente a aerosoles



3

No mezcle los reactivos de diferentes lotes o de tubos diferentes del mismo lote.

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Panel respiratorio AllplexTM 2 

No use este producto después de la fecha de vencimiento.



Todos los elementos desechables se pueden usar una sola vez. No los reutilice.



Use tubos de tapa rosca y evite las posibles salpicaduras o contaminación cruzada de muestras durante la preparación.



Sea cuidadoso de no contaminar los reactivos con ácidos nucleicos aislados, productos de la PCR, y control positivo. Para prevenir la contaminación de los reactivos, se recomienda usar puntas con filtro.



Use áreas separadas para cada experimento.



Prepare y use un set diferente de pipetas para cada una de las siguientes áreas: aislamiento de ácido nucleico, mezcla de reactivos, la adición del ácido nucleico molde y la adición de productos de PCR.



Solo en un espacio designado, abra los tubos de reacción o tiras de PCR después de la amplificación, para evitar la contaminación con amplicones.



Almacene el material positivo aparte de los reactivos del kit.



Los procedimientos de seguridad en el laboratorio (remitirse a Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos y Documentos del CLSI) se deben tener en cuenta para manipular las muestras. Limpie y desinfecte a fondo todas la superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0.5% (en agua desionizada o destilada). Los componentes del producto (residuos del producto, empaque) se pueden considerar residuos de laboratorio. Deseche los reactivos no usados y los residuos de conformidad con los reglamentos federales, estatales y locales aplicables.

USO PREVISTO El Panel Respiratorio AllplexTM 2 es un ensayo cualitativo in vitro para la detección simple o múltiple de virus de Adenovirus humano (AdV) Metapneumovirus (MPV), Enterovirus humano (HEV), virus de parainfluenza humana 1 (PIV1), virus de parainfluenza humana 2 (PIV2), virus de parainfluenza humana 3 (PIV3), y virus de parainfluenza humana 4 (PIV4), en muestras de aspirados nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares.

AdV: Los primers están diseñados para detectar adenovirus humano. almenos de tipo B, C, y los tipos E y algunos de los tipos A, D y F. HEV: los promers estan diseñados para detectar enterovirus humano almenos de tipo A, B y algunos de tipo C y D.

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Panel Respiratorio AllplexTM 2

PRINCIPIOS Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL PROCEDIMIENTO 1. Principios El Panel Respiratorio AllplexTM 2 es representativo de la tecnología patentada de Seegene MuDT™, la cual proporciona valores multi-Ct (ciclo umbral) en un solo canal de fluorescencia sin análisis de curvas de melting en los instrumentos para PCR en tiempo real. El Panel Respiratorio AllplexTM 2 es un ensayo de RT-PCR en tiempo real multiplex en un solo paso que permite la amplificación simultánea y la detección de ácidos nucleicos objetivo de AdV, MPV, HEV, PIV1, PIV2, PIV3, PIV4 y el Control Interno (IC). En la PCR, la eficiencia de amplificación puede reducirse usualmente por inhibidores que se pueden presentar en las muestras clínicas. Por ende, el control interno (IC) es incorporado dentro del producto como un control exógeno de todo el proceso para monitorear el aislamiento de ácidos nucleicos y verificar una posible inhibición de la RT-PCR. El IC es co-amplificado con los ácidos nucleicos objetivos en las muestras clínicas.

2. Descripción General del Procedimiento Muestras (Aspirados nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares)

Aislamiento de ácidos nucleicos ADN/ARN Viral RT-PCR en tiempo real en un solo paso utilizando el sistema AllplexTM Análisis de resultados

< Descripción general del procedimiento del Panel Respiratorio AllplexTM 2 >

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Panel respiratorio AllplexTM 2

ANTECEDENTES 1. Adenovirus (AdV) Adenovirus (familia Adenoviridae) es un virus sin envoltura, de doble cadena de ADN. Hay siete especies divididas de la A a la G y 57 número de serotipos. Los síntomas más comunes de la infección por adenovirus son la infección del tracto respiratorio superior que están relacionados con las especies B y C. Junto con ADV, inflamación de los ojos, amigdalitis, tympanitis, laringitis y la gastroenteritis aparecen juntos en los pacientes. Si los niños se infectan por ADV, pueden desarrollar bronquiolitis o neumonía, que puede llegar a ser graves. La mayoría de las personas tienen la capacidad de auto-curarse a sí mismos, pero AdV pueden causar la muerte en pacientes con deficiencia inmune y rara vez algunos individuos sanos pueden morir de la infección.

2. Metapneumovirus (MPV) Metapneumovirus (familia Paramyxoviridae) es un virus con envoltura con un único genoma de ARN de cadena negativa. MPV es un patógeno viral respiratoria que se extiende en todo el mundo y tiene 5 ~ 10% de probabilidad de coinfección con otros virus respiratorios. Sus síntomas son más similares a los síntomas de las infecciones por VRS. MPV puede producir infecciones del tracto respiratorio superior de menor importancia, tales como la bronquiolitis, crup, neumonía, infecciones graves del tracto respiratorio inferior, y se sabe que estar relacionado con el deterioro de asma. Entre los niños que son hospitalizados por padecer enfermedades de las vías respiratorias inferiores, los pacientes positivos MPV tienen fiebre (86%), tos (90%) y disnea (80%) como síntomas comunes. Por otra parte, la dificulta para respirar (56%) se muestra tanto en niños que estaban sanos antes de la infección y los niños con antecedentes médicos de tener asma. 12% de los pacientes externos que han sido tratados para la infección del tracto respiratorio inferior se detectaron MPV positivo. Este porcentaje es más alto después de RSV. También MPV es una de las principales causas de las convulsiones asma bronquial, tanto en niños como en adultos.

3. Enterovirus (HEV) Enterovirus es un no envuelto con una solo genoma de ARN de cadena positiva. HEV tiene 70 tipos de serotipos que están divididos en grupos: poliovirus, Coxsackievirus A, los grupos B y otros enterovirus. HEV suele entrar en huéspedes humanos a través de la vía oral-fecal, pero también puede viajar a través de las vías respiratorias a través de las infecciones de las gotitas.

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10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2 En su mayoría, los síntomas son similares a los del resfriado común, pero puede haber otros síntomas como parálisis, meningitis aséptica, encefalitis, menor inflamación respiratoria, erupción cutánea, enfermedad mano-pie-boca, miocarditis, pericarditis y dolor en el pecho

4. Virus de parainfluenza (PIV) El virus de la parainfluenza (familia Paramyxoviridae) es un virus con envoltura con un único genoma de ARN de cadena negativa. Tipo 1, tipo 2, tipo 3 y tipo 4 todo el resultado en los seres humanos y se propaga a través de contactos directos con la infección del paciente y de las gotas. Estos virus tienen 2 ~ 4 días de periodo de latencia. La mayoría de los síntomas son similares a los síntomas de enfermedad respiratoria. Además, no hay fiebre y síntomas generales raras. 80% da como resultado enfermedades de las vías respiratorias superiores. 50% de los pacientes hospitalizados con bronquitis, el 15% de los pacientes hospitalizados con bronquiolitis y el 15% de los pacientes hospitalizados con neumonía son desarrollados a partir de PIV. PIV de tipo 1 y tipo 2 son las principales causas para el desarrollo de laringotraqueobronquitis en 2 ~ 4 niños en edad. PIV de tipo 3 puede causar laringitis pseudomembranosa, pero es una de las principales causas de la bronquiolitis y la neumonía, que son más graves en los niños menores de 1 año de edad. PIV de tipo 4 se ha categorizado como el virus más fácil de transformar en formas más severas. La duración de los síntomas son diversos. El promedio es de 4 a 5 días, pero la detección puede tomar de 2 ~ 3 semanas después de la infección del virus debido a la baja potencia de los virus de la prevención de descubrimiento rápido. Si la fiebre dura más de 5 días, se pueden producir infecciones de virus secundarias como tympanitis y neumonía. Para los adultos, enfermedades del tracto respiratorio superior son comunes, pero puede producirse la muerte por neumonía en los pacientes con el sistema inmunológico disminuido como los que tuvieron un trasplante de médula ósea.

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Panel Respiratorio AllplexTM 2

REACTIVOS Los reactivos contenidos en un kit son suficientes para 100 reacciones. Información de pedido (

RP9802X)

Panel Respiratorio AllplexTM 2 Símbolo

Contenido

Volumen

Descripción

5X RP2 MOM

500 μL

- Reactivo para la amplificación y detección

Enzima para tiempo real en un solo paso

200 μL

Mezcla de enzimas para la RT-PCR en un solo paso.

Buffer 5X para tiempo real en un solo paso

500 μL

Buffer para RT-PCR en un paso – Buffer que contiene dNTPs.

RP2 PC

80 μL

Control Positivo (PC): - Mezcla de patógenos y clones de IC

RP-V IC

1000 μL

Control Interno Exógeno (IC) para el Panel Respiratorio Allplex 1, 2, y 3

1.000 μL

Control Negativo (NC) grado PCR de calidad ultrapura: - Agua esterilizada como control negativo

Mezcla de Oligos MuDT (MOM):

Agua libre de RNasas

Manual de usuario AllplexTM es una marca registrada de Seegene Inc.

8

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Panel Respiratorio AllplexTM 2

MANEJO Y ALMACENAMIENTO Todos los componentes del Panel Respiratorio 2 AllplexTM deben almacenarse a ≤ -20° C. Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta. El congelamiento y descongelamiento repetido debe evitarse ya que podría disminuir la sensibilidad. Si los reactivos serán usados de manera intermitente, deberán almacenarse en alícuotas.

MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO 

Guantes desechables libres de polvo (látex o nitrilo).



Pipetas (ajustables) y puntas estériles.



Microcentrífuga para tubos de 1.5 ml.



Kit para aislamiento de ácidos nucleicos.



Máquina de hielo.



Centrífuga de mesa.



Agitador vórtex.



Equipo para PCR en tiempo real CFX-96TM (Bio-Rad).



Tiras de 8 tubos de bajo perfil de 0.2 ml sin tapas (color blanco, No. Cat. TLS0851, BioRad)



Tiras de 8 tapas planas de grado óptico (No. Cat. TCS0803, Bio-Rad)



Plato de 96 pozos, pozo blanco. (cat. No. HSP-9655, Bio-Rad)

9

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Panel Respiratorio AllplexTM 1

PROTOCOLO 1. Toma de muestra, almacenamiento y transporte Nota: Todas las muestras tienen que ser tratadas como materiales potencialmente infecciosos. Sólo las muestras que sean recogidas, transportadas y almacenadas y atiendan estrictamente las siguientes normas e instrucciones, serán permitidas: Nota: Para garantizar una alta calidad de las muestras, se deben transportarse lo más rápidamente posible. Las muestras tienen que ser transportadas en las condiciones de temperatura indicadas.

A. Toma de muestra

Aspirado nasofaríngeo, hisopado nasofaríngeo, lavado broncoalveolar 

Las

muestras

de

aspirado

nasofaríngeo,

hisopado

nasofaríngeo,

y

el

lavado

broncoalveolar son examinadas rutinariamente para patógenos respiratorios comunes. 

La obtención de las muestras puede ser difícil en algunos pacientes. En tales casos, el hisopado nasofaríngeo puede recolectarse simple y eficientemente con el hisopo de nylon (COPAN, Italia) y en el medio universal de transporte (UTM).

Manufacturer

Specimen collection device

Cat. No.

COPAN

ESwab

482CE

COPAN

ENAT PM 2ML PERNASAL APPLICATOR

606CS01P

COPAN

UTM con hisopos flocados

360C / 305C

DIAGNOSTIC HYBRIDS

UTM con hisopo flocado de minipunta flexible

403C / 406C

Nota: Recomendaciones del kit de ácidos nucleicos para el MICROLAB NIMBUS IVD o MICROLAB STARlet. SE RECOMIENDA ESPECIALMENTE SEGUIR LAS SIGUIENTES INSTRUCCIONES DEL FABRICANTE. 1. 2. 3.

10

Utilice el kit STARMag 96 para tejidos o para virus para muestras clínicas tomadas en UTM. Utilice el kit STARMag 96 para tejidos para muestras clínicas tomadas en ESwab. Utilice el kit STARMag 96 para virus para muestras clínicas tomadas con ENAT.

10/2015 V1.03

Panel Respiratorio AllplexTM 2

B. Almacenamiento y transporte de muestras

Muestra

Almacenamiento y Transporte Temperatura Duración*

Nota - El desempeño podrá afectarse

Aspirado Nasofaríngeo

por

el

almacenamiento

prolongado de las muestras.

Hisopado Nasofaríngeo 2~8°C.

3 días.

- Las muestras deben ceñirse a las

Lavado broncoalveolar

instrucciones

locales

y

nacionales para el transporte de material patogénico.

* Duración: Muestras tomadas de la prueba antes del periodo.

2. Aislamiento de ácidos nucleicos Diversos fabricantes ofrecen kits para aislamiento de ácidos nucleicos. Use el protocolo correcto de acuerdo al protocolo del fabricante. Los siguientes kits han sido validados para uso con este kit.

A. Control Interno Nota: IC está incluido en el kit para permitir a los usuarios confirmar no solamente el procedimiento de extracción de ácidos nucleicos sino también identificar cualquier inhibición de la RT-PCR. 

Se deben añadir 10 μL de RP-V IC a cada muestra antes del aislamiento de ácidos nucleicos.



Cuando use este producto con el kit del Panel Respiratorio AllplexTM 4, debe agregar 10 μL de RP-V IC y 10 μL de RP-B IC a cada muestra antes del aislamiento de ácidos nucleicos.

B. Sistema automatizado para el aislamiento de ácidos nucleicos B-1. MICROLAB NIMBUS IVD Nota: Por favor use las muestras y los volúmenes de elución como se indica abajo. Para todos los demás, refiérase al protocolo del fabricante.

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10/2015 V1.032

Panel respiratorio AllplexTM 2

Sistema automatizado para el aislamiento

Fabricante

Cat. No.

Vol. recomendado

MICROLAB NIMBUS IVD

Hamilton

65415-02*

-

STARMag96 Virus

Seegene

744800.4.205875

Cartucho para virus STARMag 48 X 8

Seegene

STARMag 96 Tejido

Seegene

744300.4.205875

Cartucho para tejidos STARMag 48 X 8

Seegene

744300.4.TC384

744800.4.VC384

Muestra: 600 µL Elución: 100 µL Muestra: 600 µL Elución: 100 µL Muestra: 450 µL Elución: 100 µL Muestra: 450 µL Elución: 100 µL

* Si desea comprar este producto a Seegene Inc., por favor utilice este número de Cat.

B-1. MICROLAB STARlet Nota: Por favor use las muestras y volúmenes de elución recomendados como se indica abajo. Para todos los demás refiérase al protocolo del fabricante.

Sistema de aislamiento automatizado

Fabricante

Cat No.

Vol. recomendado

MICROLAB STARlet

Hamilton

173000-075*

-

STARMag 96 Virus

Seegene

744800.4.205875

STARMag 96 Tejido

Seegene

744300.4.205875

Muestra: 600 µL Elución: 100 µL Muestra: 450 µL Elución: 100 µL * Si desea comprar este producto a Seegene Inc., por favor utilice este número de Cat.

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10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2

3. Preparación de la RT-PCR en tiempo real en un solo paso. Nota: Se deben usar los tubos y tapas correctas (véase MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO). Nota: Se deben usar puntas con filtro resistente a aerosoles y guantes ajustados durante la preparación de las reacciones RT-PCR de un solo paso. Preste cuidado especial para prevenir la contaminación cruzada. Nota: Descongele completamente los reactivos sobre hielo. Nota: Prepare todas las reacciones sobre hielo para minimizar el riesgo de degradación del ARN. Nota: Centrifugue brevemente los tubos de reactivos para remover gotas del interior de la tapa. Nota: Los pasos A – D se procesan se procesan automáticamente en el MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet. Remítase a cada manual de operación.

A. Prepare la Mastermix de la RT-PCR en un solo paso 5 µL

5X RP1 MOM

5 µL

Agua libre de RNasa

5 µL

Buffer 5X para tiempo real en un solo paso

2 µL

Enzima para tiempo real en un solo paso

17 µL

Volumen total de Mastermix de RT-PCR en un solo paso

Nota: Calcule la cantidad necesaria de cada reactivo requerida según el número de reacciones (muestras + controles).

B. Mezcle por inversión el tubo 5 veces o haga un vórtex rápido, y centrifugue brevemente.

C. Alicuote 17μL de Mastermix de RT-PCR en un solo paso en los tubos de PCR. D. Adicione 8μL de cada ácido nucleico en el tubo que contiene la alícuota de Mastermix de RTPCR en un solo paso.

17 μL

Mastermix de RT-PCR en un solo paso

8 μL

Ácido nucleico de la muestra.

25 μL

Volumen total de la reacción.

E. Cierre la tapa y centrifugue brevemente los tubos de PCR.

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10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2

F. Verifique que el líquido que contiene todos los componentes de la PCR este en el fondo de cada tubo de PCR. Si no es así, centrifugue nuevamente a un rpm más alto por un mayor tiempo. Nota: Los tubos de PCR deben ser centrifugados antes de iniciar la reacción de PCR. Esto fuerza a que el líquido vaya al fondo y a eliminar burbujas de aire. Correcto

Incorrecto

Burbuja

Nota: Use una punta nueva estéril para cada muestra. Nota: Para el Control Negativo (NC), use 8µL de agua libre de RNasa en lugar de ácido nucleico de muestra. Nota: Para el Control Positivo (PC), use 8μL de RP1 PC. Nota: Por favor ser cuidadoso de no contaminar la Mastermix de RT-PCR en un solo paso ni las muestras con el Control Positivo. Nota: Los tubos de PCR deben mezclarse y centrifugarse antes de iniciar la reacción de PCR. Asegúrese que el líquido que contiene todos los componentes de la reacción de la PCR este en el fondo de cada tubo de PCR. Nota: No marque la tapa de los tubos de reacción dado que la fluorescencia es detectada a través de la tapa del tubo.

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10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2

CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANÁLISIS DE RESULTADOS 1. Sistema para PCR en tiempo real CFX96TM (Bio-Rad) 1.1. Configuración del Equipo para PCR en tiempo real

Nota: La configuración del experimento en el Sistema para PCR en tiempo real CFX96 TM (BioRad) puede dividirse en tres pasos: Configuración del Protocolo, Configuración de la Placa, Inicio del Ensayo.

A. Configuración del Protocolo

1) En menú principal, seleccione File  New  Protocol para abrir la ventana de Protocol Editor.

Fig. 1. Configuración del Protocolo. Cree un Nuevo protocolo o cargue un protocolo existente para el experimento

2) En Protocol Editor, defina el perfil térmico como se menciona a continuación:

Nota*: Lectura de placa en el segmento 4 y 5. Fluorescencia detectada a 60°C y 72°C.

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10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2

Fig. 2. Editor del Protocolo 3) Haga clic sobre Sample Volume para modificar directamente el valor a 25 μL. 4) Haga clic en OK y guarde el protocolo para abrir la ventana de Experiment Setup.

Fig. 3. Configuración del Experimento: Protocolo

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10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2 B. Configuración de la Placa

1) En la pestaña Plate en Experiment Setup, haga clic en Create New para abrir la ventana de Plate Editor para crear una nueva placa.

Fig. 4. Editor de Placa. Cree una nueva placa

2) Haga clic en Select Fluorophores para indicar los fluoróforos (FAM, HEX, Cal Red 610, y Quasar 670) que serán utilizados en el experimento y haga clic en OK.

Fig. 5. Seleccionar Fluróforos (FAM, HEX, Cal Red 610 y Quasar 670) 3) Seleccione los pozos deseados y luego su tipo de muestra del menú desplegable Sample Type. - Unknown: Muestras clínicas - Control Negativo - Control Positivo

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10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2 4) Haga clic en las casillas de verificación apropiadas (FAM, HEX, Cal Red 610 y Quasar 670) para especificar los fluoróforos que se detectarán en los pozos seleccionados. 5) Digite el nombre de la muestra en Sample Name y presione la tecla enter. 6) En Settings del menú principal del Plate Editor, elija el tamaño de la placa en Plate Size (96 wells) y el tipo de placa en Plate Type (BR White).

Fig. 6. Plate Setup

7) Haga clic en OK para guardar la nueva placa. 8) Se devolverá a la ventana de Experiment Setup.

Fig. 7. Configuración del Experimento: Placa

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10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2

C. Inicio del ensayo

1) De la pestaña Start Run en Experiment Setup, haga clic en Close Lid para cerrar la tapa del equipo.

Fig. 8. Cierre de Tapa

2) Haga clic en Start Run. 3) Guarde el archivo del ensayo en Mis Documentos o en la carpeta que usted designe. Ingrese el nombre del archivo, haga clic en SAVE, y el ensayo iniciará.

1.2. Análisis de datos

A. Cree carpetas para la exportación de datos

1) Cree una carpeta para guardar los resultados de la curva de amplificación. 2) El nombre de la carpeta podrá ser designado por el usuario (Para la función ‘Seegene Export’, las Carpetas “QuantStep4” y “QuantStep5” se crean automáticamente para guardar los datos de cada curva de amplificación en la carpeta creada por el usuario).

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10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2 B. Pre-ajustes para el Análisis de Datos en el CFX96TM

1) Después de la prueba, haga clic en la pestaña de Cuantificación para confirmar los resultados de curva de amplificación.

Fig. 9. Resultados de la curva de amplificación

2) Seleccione No Baseline Subtraction del Modo de Análisis del menú Settings.

Fig. 10. Sin sustracción de línea de referencia

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10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2

3) Seleccione Seegene Export del menú Tools.

Fig. 11. Exportación Seegene

4) Elija una ubicación para guardar los datos y haga clic en OK.

Fig. 12. Exportación Seegene a la carpeta designada

21

10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2

C. Ajustes para el análisis de datos en el Seegene Viewer 1) Abra el programa Seegene Viewer, y haga clic en Open para encontrar el archivo guardado en la carpeta “QuantStep4”.

Fig. 13. Seegene Viewer

2) Después de abrir la carpeta de resultados, seleccione el kit de prueba del menú PRODUCT.

Fig. 14. Ajustes para el análisis de datos en Seegene Viewer Nota: Por favor verifique el tipo de tubo al seleccionar el kit de prueba (banda de 8 o placa de 96).

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10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2 3) Verifique el resultado de cada pozo.

Fig. 15. Resultados de la prueba en el CFX96TM mediante el Seegene Viewer

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10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2

RESULTADOS 1. Interpretación de Resultados

Analito Fluoróforo

Valor Ct

Resultado

Gráfica 1

Gráfica 2

≤ 42

Detectado (+)

FAM

PIV4

MPV

> 42 or N/A

No detectado (-)

HEX

PIV2

PIV1

Cal Red 610

AdV

HEV

Quasar 670

IC

PIV3

Resultado Objetivo* Gráfica 1

Gráfica 2

+

-

-

+

+

+

+

-

24

-

+

+

+

-

-

Resultado IC

Interpretación

Ácido nucleico objetivo, Detectado

+

Ácido nucleico objetivo, Detectado *

-

+

- Virus respiratorios adicionales que no fueron detectados pueden estar presentes.

Ácido nucleico objetivo, No detectado

10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2 Inválido** - Señal débil o negativa del control interno es indicativa de una toma de muestra inadecuada, o errores en el procedimiento o presencia de inhibidores. - Repita la prueba de aislamiento de ácido nucleico -

-

-

utilizando otra alícuota de la muestra original. - Si el mismo resultado se muestra en el ácido nucleico reaislado, por favor diluya la muestra (1/3~1/10) en solución salina y repita el aislamiento (después de añadir RP-V IC) y RTPCR.

*La detección del Control Interno en el canal de detección del Quasar 670 no es requerida para resultados positivos de patógenos objetivo. Una carga elevada de otro analito puede conducir a una reducción o ausencia de la señal del Control Interno. **Si no se observa ninguna de las señales incluyendo el Control Interno, véase Solución de Problemas TROUBLESHOOTING.

25

10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2

2. Aplicación a Muestras Clínicas Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

FAM (Ct)

Muestra

26

HEX (Ct) PIV1

Cal Red 610 (Ct)

Quasar 670 (Ct)

AdV

HEV

PIV3

IC

Auto interpretación

PIV4

MPV

PVI2

1

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

34.78

AdV

2

N/A

N/A

N/A

24.99

N/A

N/A

N/A

34.76

PIV1

3

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

29.57

20.86

33.51

HEV, PIV3

10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2

SOLUCIÓN DE PROBLEMAS Panel Respiratorio AllplexTM 1 OBSERVACIONES

CAUSAS PROBABLES

No se observa señal

Los fluoróforos para análisis

Seleccione los fluoróforos correctos para el

de datos no cumplen con el

análisis de datos y exporte los datos de nuevo. No

protocolo.

hay necesidad de repetir la prueba en este caso.

Ajustes

incorrectos

SOLUCIÓN

del Verifique las condiciones del ciclo térmico y repita

termociclador en tiempo real

la prueba bajo los ajustes correctos.

Almacenamiento incorrecto o Verifique las condiciones de almacenamiento posterior

a

la

fecha

de (Véase página 9) y la fecha de vencimiento

vencimiento del kit de la (remítase a la etiqueta) del kit de la prueba y prueba.

utilice un nuevo kit, si es necesario.

Fallo en el aislamiento de

Una ausencia de señal de IC puede indicar la

ácidos nucleicos

pérdida

de

ácidos

nucleicos

durante

su

aislamiento. Asegúrese de utilizar el método de aislamiento recomendado. Si es debido a los inhibidores, re-aísle la muestra original o diluya la muestra (1/3~1/10) en solución salina y repita la prueba desde el paso de aislamiento. No se observa señal

Alta carga del ácido nucleico Si se observa la señal del patógeno objetivo pero

de Control Interno

del patógeno

no la del IC, entonces la amplificación del IC podrá haberse inhibido por la alta carga del patógeno objetivo. Con el fin de confirmar la señal de IC, diluya la muestra (1/3~1/10) en solución salina y repita la prueba desde el paso de aislamiento.

Se observan señales

Presencia de inhibidores de

Diluya la muestra (1/3~1/10) en solución salina y

RT-PCR

repita la prueba desde el paso de aislamiento.

Contaminación

Descontamine todas las superficies y los equipos

objetivo o falsos

con

positivos putativos

solamente

en el Control

procedimiento y cambie las puntas entre cada

Negativo

tubo. Repita todo el procedimiento del aislamiento

hipoclorito

de

puntas

sodio con

y filtro

etanol.

Utilice

durante

el

de ácidos nucleicos con un nuevo set de reactivos.

27

10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2

Panel Respiratorio AllplexTM 1 OBSERVACIONES

CAUSAS PROBABLES

SOLUCIÓN

No se observan

Error en la toma de muestras Verifique el método de toma de muestras y tome

señales o falsos

de nuevo la muestra.

negativos putativos en el Control

Almacenamiento incorrecto

Tome de nuevo la muestra y repita todo el

de la muestra

procedimiento. Asegúrese de que la muestra sea

Positivo

almacenada, según las recomendaciones. Error en el aislamiento de

Verifique el procedimiento de aislamiento de

ácido nucleico

ácidos nucleicos así como la concentración de ácidos nucleicos, y re-aísle el ácido nucleico.

Error en la adición de ácido Verifique los números de muestra de los tubos nucleico a los tubos de PCR que contienen ácido nucleico y asegúrese de correspondientes

adicionar ácido nucleico en el tubo correcto de PCR y repita cuidadosamente la prueba, si es necesario.

Presencia de inhibidores

Diluya la muestra (1/3~1/10) en solución salina y repita la prueba desde el paso de aislamiento.

Mezclado de la PCR

Confirme que todos

los componentes sean

incorrecto

adicionados al mezclado de la RTPCR (La sensibilidad está comprometida con el pre-mix compuesto). Todos los reactivos deben ser homogeneizados y girados hacia abajo antes de ser utilizados.

Solo se detecta

Carga baja del ácido

el

nucleico del patógeno

subtipo

del

virus

de

Los resultados se deberían interpretar de acuerdo con la tabla de interpretación proporcionada, pero se puede realizar una nueva prueba con un

Influenza A pero

volumen disminuido de agua libre de RNasa y un

no el virus de

mayor volumen de ácido nucleico.

Influenza A Burbuja en el tubo de PCR

Centrifugue el tubo de PCR antes de iniciar.

Picos en los ciclos de la curva de amplificación

28

10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2

RENDIMIENTO 1. Especificidad La alta especificidad del Panel Respiratorio Allplex TM 2 está asegurada por los oligos diseñados específicamente para los blancos de interés bajo las condiciones definidas de reacción. Se evaluó reactividad cruzada del Panel respiratorio AllplexTM 2 con 85 patógenos diferentes, y en la amplificación RT-PCR y detección se identificaron únicamente los blancos específicos. No.

Organismo

Número de Cepa

Resultado

1

Adenovirus Humano C tipo 1

ATCC VR-1

2

Adenovirus Humano C tipo 2

ATCC VR-58

AdV Detectado AdV Detectado

3

Adenovirus Humano B tipo 3

ATCC VR-3

AdV Detectado

4

Adenovirus Humano E tipo 4

ATCC VR-1572

AdV Detectado

5

Adenovirus Humano C tipo 5

ATCC VR-61

AdV Detectado

6

Adenovirus Humano D tipo 6

ATCC VR-1368

AdV Detectado

7

Adenovirus Humano A tipo 7

ATCC VR-1095

AdV Detectado

8

Adenovirus Humano D tipo 23

ATCC VR-1101

AdV Detectado

9

Adenovirus Humano F tipo 40

ATCC VR-931

AdV Detectado

10

Metapneumovirus humano

Aislamiento koreano

MPV Detectado

11

Virus Coxsackie humano A9

KBPV VR-11

HEV Detectado

12

Virus Coxsackie humano B1

KBPV VR-13

HEV Detectado

13

Virus Coxsackie humano B2

KBPV VR-14

HEV Detectado

14

Virus Coxsackie humano B3

KBPV VR-15

HEV Detectado

15

Virus Coxsackie humano B4

KBPV VR-16

HEV Detectado

16

Virus Coxsackie humano B5

KBPV VR-18

HEV Detectado

17

Virus Coxsackie humano B6

KBPV VR-18

HEV Detectado

18

Echovirus humano 6

KBPV VR-19

HEV Detectado

19

Echovirus humano 7

KBPV VR-20

HEV Detectado

20

Echovirus humano 9

ATCC VR-39

HEV Detectado

21

Echovirus humano 11

KBPV VR-22

HEV Detectado

22

Echovirus humano 22 (Parechovirus)

KBPV VR-23

HEV Detectado

23

Echovirus humano 25

KBPV VR-24

HEV Detectado

24

Echovirus humano 30

KBPV VR-25

HEV Detectado

29

10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2

No.

Organismo

Número de Cepa

Resultado

25

Echovirus Humano 34 (Cox A24C)

ATCC VR-583

HEV Detectado

26

Echovirus Humano 70 (D)

ATCC VR-836

HEV Detectado

27

Echovirus Humano 71 (A)

ATCC VR-784

HEV Detectado

28

Virus de polio

KBPV VR-74

HEV Detectado

29

Virus de parainfluenza humana 1

ATCC VR-1380

PIV1 Detectado

30

Virus de parainfluenza humana 2

ATCC VR-92

PIV2 Detectado

31

Virus de parainfluenza humana 3

ATCC VR-93

PIV3 Detectado

32

Virus de parainfluenza humana 4A

ATCC VR-1378

PIV4 Detectado

33

Virus de parainfluenza humana 4B

ATCC VR-1377

PIV4 Detectado

34

Virus de influenza A humana (H3N2)

ATCC VR-544

No Detectado

35

Virus de influenza A humana (H3N2)

ATCC VR-547

No Detectado

36

Virus de influenza A humana (H3N2)

ATCC VR-822

No Detectado

37

Virus de influenza A humana (H3N2)

ATCC VR-810

No Detectado

38

Virus de influenza A humana (H1N1)

ATCC VR-546

No Detectado

39

Virus de influenza A humana (H1N1)

ATCC VR -95

No Detectado

40

Virus de influenza A humana (H1N1)

ATCC VR-97

No Detectado

41

Virus de influenza A humana (H1N1)

ATCC VR-219

No Detectado

42

Virus de influenza A humana (H1N1)

ATCC VR-98

No Detectado

43

Virus de influenza A humana (H1N1)

ATCC VR-825

No Detectado

44

Virus de influenza A humana (H1N1)

ATCC VR-897

No Detectado

45

Virus de influenza A humana (H1N1)

ATCC VR-1683

No Detectado

46

KBPV VR-1736

No Detectado

47

Virus de influenza A humana (H1 pdm09) Virus de influenza B humana

KBPV VR-101

No Detectado

48

Virus de influenza B humana

KBPV VR-102

No Detectado

49

Virus de influenza B humana

KBPV VR-103

No Detectado

50

Virus de influenza B humana

KBPV VR-295

No Detectado

51

Virus de influenza B humana

KBPV VR-296

No Detectado

30

10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2 No.

Organismo

Número de Cepa

Resultado

52

Virus de influenza B humana

ATCC VR-823

No Detectado

53

Virus de influenza B humana

ATCC VR-523

No Detectado

54

Virus de influenza B humana

ATCC VR-786

No Detectado

55

Virus respitarorio sincital humano A

ATCC VR-26

No Detectado

56

Virus respitarorio sincital humano B

ATCC VR-955

No Detectado

57

Rhinovirus Humano A8

ATCC VR-488

No Detectado

58

Rhinivirus Humano A16

ATCC VR-283

No Detectado

59

Rhinivirus Humano B14

ATCC VR-284

No Detectado

60

Rhinivirus Humano C

Korean isolate

No Detectado

61

Bocavirus Humano

Korean isolate

No Detectado

62

Coronavirus Humano 229E

ATCC VR-740

No Detectado

63

Coronavirus Humano NL63

Korean isolate

No Detectado

64

Coronavirus Humano OC43

ATCC VR-1558

No Detectado

65

Legionella pneumophila 


ATCC 41782

No Detectado

66

Streptococcus pneumoniae

ATCC BAA-255D

No Detectado

67

Bordetella pertussis 


ATCC BAA-589D

No Detectado

68

Haemophilus influenzae 


ATCC 51907D

No Detectado

69

Mycoplasma pneumoniae 


ATCC 293442

No Detectado

70

Chlamydophila pneumoniae 


Korean isolate

No Detectado

71

Klebsiella pneumoniae 


ATCC 700721D-5

No Detectado

72

Klebsiella oxytoca 


ATCC 700324D

No Detectado

73

Serratia macrescens 


ATCC 27137D-5

No Detectado

74

Enterobacter cloacae 


KCTC 13047

No Detectado

75

Enterobacter aerogenes 


ATCC 15038D

No Detectado

76

Proteus mirabilis 


ATCC 12453D

No Detectado

77

Pseudomonas aeruginosa 


ATCC 47085D

No Detectado

78

Pseudomonas fluorescens 


KCTC 49642

No Detectado

79

Candida albicans 


ATCC 14053

No Detectado

31




10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2

No.

Organismo

Número de Cepa

Resultado

80

Staphylococcus aureus 


ATCC 700699D-5

No Detectado

81

Streptococcus mitis 


ATCC 3556

No Detectado

82

Streptococcus agalactiae 


ATCC BAA-611D

No Detectado

83

Fusobacterium nucleatum 


ATCC 25586D-5

No Detectado

84

Herpes virus humano 1

ATCC VR-260

No Detectado

85

Herpes virus humano 1

Atcc vr-734

No Detectado

† Para

evaluar la reproducibilidad de los resultados, el experimento se repitió tres veces.

2. Sensibilidad Con el fin de determinar la sensibilidad del Panel Respiratorio AllplexTM 2 se realizó una dilución seriada estándar de ADN blanco clonado desde 105 a 100 copias/reacción y se analizó con el Panel Respiratorio AllplexTM 2. El límite de detección del Panel Respiratorio AllplexTM 2 fue 100 copias/reacción. metapneumovirus humano y el virus de la parainfluenza humana 4 se decidio de ellos el límite de detección a 1.000 copias / reacción, y los otros se decidieron con un límite de detección a 100 copias / reacción.

3. Reproducibilidad Se realizaron pruebas de reproducibilidad en 5 momentos diferentes en el transcurso de 5 días, por 3 experimentadores diferentes, y con 3 lotes de producto distintos. Se obtuvieron los mismos resultados en todas las pruebas, confirmando la reproducibilidad del Panel Respiratorio AllplexTM 2.

32

10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2

REFERENCIAS

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33

2.

A. Purkayastha, S. E. Ditty, et al. [Genomic and bioinformatics analysis of HAdV-4, a human adenovirus causing acute respiratory disease: implication for gene therapy and vaccine vector development.] Journal of Virology. (2005) 79: 2559-2572 D. H. Lee. [TOCE: Innovative Technology for High Multiplex Real-time PCR.] Seegene Bulletin. (2012) 1: 5-10

3.

C. E. Corless, M. Guiver, R. Borrow, V. Edwards-Jones, E. B. Kaczmarski, and A. J. Fox. [Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rRNA PCR.] Journal of Clinical Microbiology. (2000) 38: 1747-1752

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J. Y. Chun. [High Multiplex Molecular Diagnostics.] Seegene Bulletin. (2012) 1: 1-4

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J. Y. Chun, K. J. Kim, I. T. Hwang, Y. J. Kim, D. H. Lee, I. K. Lee, and J. K. Kim. [Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene.] Nucleic Acids Research. (2007) 35: e40

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M. T. Coiras, J. C. Aguilar, M. L. Garcia, I. Casas, and P. Perez-Brena. [Simultaneous detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse transcription nested-PCR assays.] Journal of Medical Virology. (2004) 72: 484-495

8.

M. T. Coiras, P. Perez-Brena, M. L. Garcia, and I. Casas. [Simultaneous detection of influenza A, B, and C viruses, respiratory syncytial virus, and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested-PCR assays.] Journal of Medical Virology. (2003) 69: 132-144

9.

M. W. Syrmis, D. M. Whiley, M. Thomas, I. M. Mackay, J. Williamson, D. J. Siebert, M. D. Nissen, and T. P. Sloots. [A sensitive, specific, and cost-effective multiplex reverse transcriptase-PCR assay for the detection of seven common respiratory viruses in respiratory samples.] Journal of Diagnostics. (2004) 6: 125-131

10.

S. Bellau-Pujol, A. Vabret, L. Legrand, J. Dina, S. Gouarin, J. Petitjean-Lecherbonnier, B. Pozzetto, C. Ginevra, and F. Freymuth. [Development of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12 respiratory RNA viruses.] Journal of Virological Methods. (2005) 126: 53-63

11.

S. Gottlieb [Metapneumovirus is a leading cause of respiratory tract infection in infants.] BMJ. (2004) 328: 7434

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Y. J. Lee, D. Y. Kim, K. H. Lee, and J. Y. Chun. [Single-channel multiplexing without melting curve analysis in real-time PCR.] Scientific Reports. (2014) 4: 1-6

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14.

Medimmune progresses development of respiratory syncytial virus and parainfluenza virus type-3 vaccines. Pharmaceutical News, Oct 13, 2004

10/2015 V1.02

Panel respiratorio AllplexTM 2

SIMBOLOGÍA Explicación de los símbolos utilizados en el manual y en las etiquetas. Símbolo

Explicación Dispositivo médico de diagnóstico In vitro Uso exclusivo en investigación Número de lote Número de catálogo Fecha de vencimiento Límite de temperatura de almacenamiento Mezcla de oligonucleotidos para amplificación y detección Mezcla de enzimas Buffer Agua libre de RNasa Control Positivo (PC) Control Interno (IC) Consulte instrucciones de uso Fabricante Fecha de fabricación Representante autorizado en la Comunidad Europea Precaución

34

10/2015 V1.02

Panel Respiratorio AllplexTM 2

INFORMACIÓN DE PEDIDO

Cat. No.

Producto

Tamaño

RP9801Y

Panel Respiratorio AllplexTM 1

50 rxns

RP9801X

Panel Respiratorio AllplexTM 1

100 rxns*

RP9802Y

Panel Respiratorio AllplexTM 2

50 rxns

RP9802X

Panel Respiratorio AllplexTM 2

100 rxns*

RP9601Y

Panel Respiratorio AllplexTM 3

50 rxns

RP9601X

Panel Respiratorio AllplexTM 3

100 rxns*

RP9803Y

Panel Respiratorio AllplexTM 4

50 rxns

RP9803X

Panel Respiratorio AllplexTM 4

100 rxns*

Serie AllplexTM

* Para su uso exclusivo con MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet Serie AnyplexTM RV7G01Y

Detección AnyplexTM II RV16 (V1.1)

50 rxns

RV7G01X

Detección AnyplexTM II RV16 (V1.1)

100 rxns*

AnyplexTM II

RB7500Y

Detección

RB5

RB7500X

Detección AnyplexTM II RB5

Detección en tiempo real de digitación AnyplexTM FluA/B (V1.1) * Para su uso exclusivo con MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet RV7310X

50 rxns 100 rxns* 100 rxns

Serie Seeplex® RV3210

Detección Seeplex® RV7

50 rxns

RV6C00Y

Detección Seeplex® RV12 ACE

50 rxns

RV6F00Y

Detección Seeplex® RV15 ACE

50 rxns

RV6F01Y

Detección Seeplex® RV15 OneStep ACE (V1.1)

50 rxns

RV6520X

Seeplex® Influenza A/B OneStep Typing (V2.1)

100 rxns

PB1610Y

Detección Seeplex® PneumoBacter ACE (V3.0)

50 rxns

Productos accesorios SG1701

35

Ribo_spin vRD (Kit de aislamiento de ARN/AND Viral)

50 preps

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Panel respiratorio AllplexTM 2

Sistemas automáticos de aislamiento 65415-02

MICROLAB NIMBUS IVD

EA

173000-075

MICROLAB STARlet

EA

744800.4.205875

STARMag 96 Virus

384T / 1 caja

744800.4.VC384

STARMag 48 X 8 Virus Cartridge kit

384T / 1 caja

744300.4.205875

STARMag 96 Tissue

384T / 1 caja

744300.4.TC384

STARMag 48 X 8 Tissue Cartridge kit

384T / 1 caja

36

10/2015 V1.02