NB: Esta enfermedad ya no aparece en la lista del capítulo 1.2.3 del Código de animales acuáticos. Este capítulo no ha sido actualizado desde 2003.

CAPÍTULO 2.1.13

PISCIRICKETTSIOSIS (Piscirickettsia salmonis)

RESUMEN La piscirickettsiosis es una enfermedad de los salmónidos causada por Piscirickettsia salmonis que se descubrió por primera vez en el salmón plateado de piscifactoría (Oncorhynchus kisutch) en 1989 en Chile. Piscirickettsia salmonis es una bacteria patógena intracelular de los peces, Gram-negativa y muy difícil de cultivar. Se relaciona remotamente con el género Coxiella y Francisella y se agrupa con la subdivisión gamma de las proteobacterias. La identificación de P. salmonis se basa en el aislamiento del agente causal con la subsiguiente prueba para buscar las características del patógeno intracelular. Piscirickettsia salmonis aparece en las vacuolas citoplásmicas de las células hospedadoras. El organismo se puede distinguir de Chlamydiophila ya que no posee el ciclo de desarrollo clamidial característico y no contiene el antígeno clamidial lipopolisacárido específico de grupo. La identidad se confirma por medio de pruebas serológicas o por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para obtener un resultado rápido, la identidad de P. salmonis aislado en cultivo celular u observado en frotis procedentes de tejido enfermo, puede confirmarse por medio de la prueba de inmunofluorescencia, por métodos inmunohistoquímicos con anticuerpos monoclonales o policlonales o por medio de la PCR con cebadores específicos para P. salmonis. La implementación de medidas higiénicas y la política de gestión son los únicos métodos de control utilizados actualmente. Se usan antibióticos, pero su valor es cuestionable. Varios grupos están realizando intensos esfuerzos para elaborar una vacuna efectiva.

INTRODUCCIÓN La piscirickettsiosis es una infección septicémica de los salmónidos. El agente causal de esta enfermedad es piscirickettsia salmonis (ATCC VR-1361), y el tipo de cepa es el LF-89 (13, 15). Hasta ahora la enfermedad se había descrito en Chile (5, 129, Irlanda (22, 23), Noruega (21) y tanto en la Costa Oeste como Este de Canadá (16) de Canadá. Piscirickettsia salmonis se ha detectado en el salmón plateado (Oncorhynchus kisutch), en el salmón real (O. tshawytscha), en el salmón japonés (O. masou), en la trucha arco iris (O. mykiss), en el salmón rosado (O. gorbuscha) y en el salmón del Atlántico (Salmo salar). Se cree que el salmón plateado es el más susceptible (13). Se describió una mortalidad en las jaulas de malla de las aguas marinas de entre un 30% y un 90% entre los salmones plateados criados en Chile (5). Piscirickettsia-salmonis, como otros organismos, se ha aislado recientemente de los peces no salmónidos (7-9). No se ha dilucidado por completo la relación de la mayoría de estos organismos con P. salmonis, pero el organismo aislado de la corvinata blanca (Atractoscion nobilis) (7) es genéticamente indistinguible de P. salmonis. Se están investigando aún los mecanismos de transmisión. La enfermedad se describió primeramente en las piscifactorías marinas y también en las instalaciones de agua dulce (4, 14). La transmisión horizontal ocurre en agua salada y en agua dulce (2, 10). La transmisión por vectores no pasa de ser una hipótesis y el papel de la transmisión vertical no está muy claro.

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Aunque el tratamiento antibacteriano proporciona algún beneficio, éste no es completamente efectivo como medio de controlar la enfermedad. Actualmente el ácido oxolínico parece ser el fármaco a emplear. Pueden desinfectarse los huevos como parte de una buena práctica de crianza. La enfermedad es una infección sistémica y crónica que afecta generalmente a los salmónidos criados en agua marina. Todas las edades son susceptibles, desde los esguines hasta los adultos. Están bien documentados los signos de la enfermedad tanto externos como internos (10, 12, 21, 23). La enfermedad empieza aproximadamente un mes después de la introducción de los peces en las jaulas de malla de las aguas marinas y se cree que el organismo es una bacteria marina. Una gran variedad de síntomas generales de la infección están presentes en los salmónidos infectados con P. salmonis. Los peces gravemente afectados tienen color oscuro y muestran anorexia y letargo. Generalmente, nadan cerca de la superficie o de los bordes de las jaulas. Los peces con infecciones más leves generalmente no muestran signos externos anormales. Las infecciones en el cerebro pueden causar un comportamiento irregular al nadar (25). También pueden aparecer lesiones en la piel de algunos peces, como pequeños parches blancos que pueden convertirse en úlceras superficiales. Posiblemente los signos externos observados más evidentes durante la infección por P. salmonis sean las branquias pálidas como resultado de una anemia significativa, pero esto no es patognomónico para esta enfermedad. Compatibles con muchas enfermedades inflamatorias crónicas y sistémicas de los salmónidos, los signos internos son: riñón inflamado y descolorido y bazo agrandado. Pueden estar presentes ascitis en el peritoneo y también pueden ocurrir hemorragias en la grasa visceral, el estómago, la vejiga natatoria y la musculatura del cuerpo (10, 24). Aparecen marcas distintivas de lesiones internas por la enfermedad en el hígado, que puede presentar nódulos piogranulomatosos agrupados, multifocales, de color blanquecino o amarillento. Dichas lesiones, a menudo agrietadas, dan como resultado cavidades crateriformes superficiales en el hígado. Aunque estas lesiones hepáticas son en cierta medida únicas en la piscirickettsiosis, muchos peces que la padecen no muestran dichas lesiones. Los cambios histológicos más destacados se encuentran en el hígado, el riñón, el bazo y el intestino, pero también se pueden observar cambios patológicos en el cerebro, el corazón, los ovarios y las branquias (3, 7, 10, 22, 24). En el hígado se observa una necrosis multifocal de hepatocitos, acompañada de un infiltrado inflamatorio crónico de células mononucleares. Las necrosis perivascular y vascular son evidentes en el hígado, y es un hallazgo común la coagulación intravascular que causa trombos de fibrina en los vasos más importantes. Las áreas focales de la necrosis son la base de las lesiones circulares y pálidas observadas macroscópicamente en los peces crónicamente más afectados. En las infecciones más agudas, la fusión de las áreas de la necrosis origina una apariencia muy moteada del órgano en lugar de nódulos moderados. La inflamación granulomatosa también ocurre en el intersticio y en el parénquima del hígado y del bazo. Se puede observar meningitis, endocarditis, peritonitis, pancreatitis y branquitis acompañadas de inflamación crónica y de cambios vasculares similares a los del hígado y los órganos hematopoyéticos. Se ha involucrado a los ovarios en ciertas infecciones del salmón plateado (10). Un examen realizado con aumento elevado revela agregados del microrganismo en el citoplasma de los hepatocitos degenerados y en los macrófagos. Los macrófagos infectados están generalmente hipertrofiados y llenos de detritus celulares. En los cortes de tejido teñidos con hematoxilina y eosina (H&E), el organismo aparece como una esfera anfófila o basófila de aproximadamente 1 µm de diámetro.

PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO Los cambios globales y microscópicos derivados de la piscirickettsiosis no son lo bastante importantes para permitir un diagnóstico definitivo de la enfermedad. Por tanto, el análisis para el diagnóstico de la piscirickettsiosis se basa en la detección del agente causal. Se puede obtener un diagnóstico presuntivo mediante la visualización del agente causal dentro de los macrófagos o hepatocitos en los cortes histológicos o en las improntas de los tejidos. Se obtiene un diagnóstico confirmativo mediante el aislamiento de Piscirickettsia salmonis en cultivo celular, pero éste no crece en ningún medio bacteriológico artificial conocido. La confirmación de P. salmonis en cultivo celular puede hacerse mediante la prueba de

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inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (IFI) o por la prueba de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ensayos de la PCR pueden realizarse directamente en tejidos (19, 20), y de este modo los ensayos de la PCR en tejidos junto con la observación de organismos sospechosos dentro de los macrófagos o de los hepatocitos son también métodos apropiados para un diagnóstico confirmativo. Alternativamente, P. salmonis puede detectarse en frotis de tejidos teñidos con Giemsa, seguidos de la prueba IFI para identificación positiva. Está disponible en el mercado un enzimoinmunoensayo para detectar P. salmonis, aunque no se ha publicado información sobre el uso de este método. Los tejidos de peces infectados por Piscirickettsia-salmonis- apropiados para el examen en cultivos celulares, la PCR, las improntas de los tejidos y la histología son: el riñón, el hígado y la sangre, recogidos de los peces enfermos durante las infecciones bien sea visibles o encubiertas (18). Debido a la sensibilidad de P. salmonis a los antibióticos in vitro, no debería usarse ningún antibiótico en el medio durante la recogida de tejido o del cultivo celular. Procedimiento de muestreo: véase el capítulo I.1, sección B.

1. MÉTODOS ESTÁNDAR DE CONTROL DE LA PISCIRICKETTSIOSIS 1.1. Aislamiento de Piscirickettsia salmonis en cultivo celular (18) Línea celular a usar: CHSE-214 o EPC (sin antibióticos añadidos) a) Preparación del tejido i)

Se debe extraer el riñón asépticamente y depositarlo en un contenedor esterilizado. No se deben utilizar antibióticos en ninguna etapa del procedimiento de aislamiento. Los tejidos deben conservarse a 4ºC o en hielo mientras se procesan y no deben congelarse.

ii)

El tejido de riñón debe homogeneizarse a 1/20 en solución salina equilibrada (BSS) y libre de antibiótico, y luego, sin centrifugarlo, se diluye en 1/5 y 1/50 BSS libre de antibiótico para inoculación en cultivos celulares. Las diluciones finales a usar son 10–2 y 10–3.

b) Inoculación de las monocapas celulares i)

Una dilución 10–2 y una 10–3 del órgano homogeneizado debe inocularse en monocapas celulares y mantenerse en medio libre de antibióticos.

ii)

El homogeneizado diluido puede inocularse directamente (0,1 ml/cultivo) en el medio de cultivo libre de antibiótico recubriendo las células.

iii) Los cultivos celulares deben incubarse a 15–18°C durante 28 días y observarse para la aparición del efecto citopático (ECP). El ECP de P. salmonis consiste en una formación como de placas o de células redondeadas. Con el tiempo, el ECP avanza hasta destruir por completo las células. iv) Si el ECP no ocurre (excepto en controles positivos), los cultivos deben incubarse a 15– 18°C durante un período adicional de 14 días. 1.2. Prueba de anticuerpos fluorescentes y de tinción de Giemsa del sobrenadante de cultivo celular El sobrenadante de los cultivos celulares que muestran un ECP muy extenso puede depositarse directamente en los portas del microscopio y teñirse con Giemsa o probarse mediante IFI (17) como se describe en la siguiente sección.

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2. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE LA PISCIRICKETTSIOSIS 2.1. Tinción de Giemsa i)

Las preparaciones del sobrenadante de cultivo de tejido, de los frotis o improntas del riñón, del hígado y del bazo deben realizarse secándolas al aire y fijándolas durante 5 minutos en metanol absoluto.

ii)

Los portas se sumergen en una solución de trabajo de tinción de Giemsa durante 30 minutos. Solución stock: solución de metanol tamponado pH 6,9 (disponible comercialmente) en 0,4 (w/v). Solución de trabajo: se diluye 1/10 en tampón fosfatado pH 6,0 (0,074 M de NaH2PO4, 0,009 M de Na2HPO4).

iii) Se destiñe con agua corriente. iv) Se observan los portas bajo inmersión en aceite. Los frotis de tejido de órganos infectados muestran organismos pleomórficos teñidos de color oscuro que se presentan en forma cocoide o de anillo, frecuentemente en pares y con un diámetro de 0.5–1.5 µm. 2.2. Prueba de anticuerpo fluorescente de frotis de tejido (17) i)

La identidad positiva de P. salmonis aislado en cultivo celular u observado en frotis teñidos de Giemsa, puede determinarse por métodos serológicos, por ejemplo la prueba IFI.

ii)

Los frotis o improntas de riñón, hígado y bazo deben prepararse secándolas al aire y fijándolas durante 5 minutos en metanol absoluto.

iii) Los frotis de tejido que se van a examinar por IFI deben estar recién preparados o almacenados a –20°C. iv) La muestra se incuba primero con un anticuerpo monoclonal o policlonal anti-P. salmonis, luego se lava y se incuba con un anticuerpo secundario conjugado con isotiocianato de fluoresceína. v)

Después del lavado, se aplica medio montado en glicerol como base y un cubreobjetos, luego se examina con un microscopio de fluorescencia.

2.3. Histología i)

Se fijan los órganos en formalina y se procesan para histología rutinaria.

ii)

Se tiñen los portas histológicos con H&E o Giemsa.

iii) Se examinan los macrófagos dentro del intersticio del riñón, del bazo o la sangre o los hepatocitos en las lesiones del hígado, para la presencia de cuerpos antófilos, basófilos, esféricos o múltiples (con H&E) o azul oscuro (con Giemsa), aproximadamente de 1 µm de diámetro, en el citoplasma. 2.4. Immunohistoquímica de sección de tejido (1) i)

Los cortes (5 µm) de tejidos fijados con formalina, incluidos en parafina y tratados para eliminar la actividad de la peroxidasa endógena.

ii)

El tejido se incuba primero con un anticuerpo monoclonal o policlonal anti-P. salmonis, a continuación se lava y se incuba con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano.

iii) Después del lavado, el tejido se expone a un cromógeno, se contrasta con hematoxilina se deshidrata y se prepara para examen en un microscopio de luz.

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2.5. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (20) Se ha desarrollado la PCR anidada para detectar el ADN genómico de P. salmonis utilizando cebadores generales de rADN 16S bacteriano en la primera amplificación y cebadores específicos para P.-salmonis- en la segunda reacción. Las dos secuencias de cebadores generales para eubacterias son EubA (1518R) 5’-AAG-GAG-GTG-ATC-CAN-CCR-CA-3’ y EubB (27F) 5’AGA-GTT-TGA-TCM-TGG-CTC-AG-3’. Los dos cebadores específicos para P. salmonis PS2S (223F) y PS2AS (690R) tienen las siguientes secuencias: 5’-CTA-GGA-GAT-GAG-CCC-GCGTTG-3’ y 5’-GCT-ACA-CCT-GAA-ATT-CCA-CTT-3’, respectivamente. Estos cebadores aportan un producto específico de 467 pares de bases. La secuencia del cebador PS2AS se ha actualizado para que corresponda a las correcciones de la secuencia de ADN diana (Número de acceso U36941 en GenBank). a) Preparación del sobrenadante o del tejido de cultivo celular infectado Se recomienda el uso de una columna de centrifugación, disponible en el mercado, para purificar el ADN del sobrenadante de cultivo celular o de tejido para la preparación de la muestra de PCR. Además de seguir las instrucciones del fabricante para el uso de la columna, se sugiere la digestión inicial de la muestra durante 30 minutos a 37ºC en tampón de lisis (20 mM Tris/HC, pH 8,0, 2 mM EDTA (ácido etilendiaminotetracético), 1,2% de Tritón X100, 4 mg/ml de lisozima). b) Reacción en cadena de la polimerasa anidada i)

Se añade 5 µl de la preparación de ADN a los 45 µl de la mezcla de reacción que consta de tampón para la PCR (10 mM de Tris/HCl, pH 9, 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, y 0,1% de Tritón X-100), 200 µM de dATP, de dCTP, de dTTP y de dGTP, 1 µM de cebador EubA, 1 µM de cebador EubB, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq. Se cubre la mezcla con 50 µl de aceite mineral. Se desnaturaliza la mezcla a 94°C durante 2 minutos y luego se amplifica mediante 35 ciclos a 94°C durante 1 minuto, 50°C durante 2 minutos, y 72°C durante 3 minutos.

ii)

La segunda amplificación se realiza añadiendo 2 µl de los primeros productos de la PCR a 48 µl de una mezcla de reacción que contenga 2 µM de cada uno de los cebadores PS2S y PS2AS en vez de EubA y EubB bajo las siguientes condiciones de reacción: se desnaturaliza la mezcla a 94°C durante 2 minutos y luego se amplifica mediante 35 ciclos a 94°C durante 1 minuto, 65°C durante 2 minutos y 72°C durante 3 minutos. El ADN amplificado (476 pb) (10 µl de mezcla de reacción para la PCR) se analiza mediante electroforesis en gel TAE de agarosa al 2% (40 mM de Tris acetato/1 mM de EDTA) que contenga 1 mg por 50 ml de bromuro de etidio. Para confirmar la identificación, se pueden digerir 10 µl de alícuotas de la mezcla de amplificación por PCR con EcoR1 y Pst1 siguiendo las instrucciones del fabricante (productos esperados: EcoR1 994, 546; Pst1 541, 519, 480). Si se obtiene un producto con cebadores específicos para P. salmonis pero no corta según lo esperado, se debe obtener una confirmación adicional del aislamiento mediante secuenciación.

c) Identificación directa mediante reacción en cadena de la polimerasa Se añade 5 µl de preparación de ADN a los 45 µl de mezcla de reacción que consta de tampón para la PCR (10 mM de Tris/HCl, pH 9, 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, y 0,1% de Tritón X-100), 200 µM de dATP, de dCTP, de dTTP y de dGTP, 2 µM de cada uno de los cebadores PS2S y PS2AS, y 2,5 unidades de ADN de polimerasa Taq. Se cubre esta mezcla con 50 µl de aceite mineral si el termociclador no tiene una tapa caliente. La PCR directa se lleva a cabo en las mismas condiciones de reacción que las del segundo paso de la PCR anidada. Se han desarrollado otros ensayos de PCR para detectar P. salmonis (19). Estas primeras secuencias y las condiciones de reacción pueden ser apropiadas para la confirmación de la presencia de P. salmonis.

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