Estudio de microorganismos fotosintéticos como indicadores de cambios ambientales en las Islas Greenwich, Dee y Barrientos, Shetland del Sur, Antártida

Por

Nory Paola González Romero

Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al título de Magister Scientiarum, mención Microbiología

INSTITUTO VENEZOLANO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS I.V.I.C

CENTRO DE ESTUDIOS AVANZADOS ALTOS DE PIPE

Diciembre, 2013. i

El trabajo de Grado de Nory Paola González Romero, titulado “Estudio de microorganismos fotosintéticos como indicadores de cambios ambientales en las Islas Greenwich, Dee y Barrientos, Shetland del Sur, Antártida” ha sido aprobado por el jurado, quien no se hace responsable de su contenido, pero la ha encontrado correcta en su calidad y en su forma de presentación en fe de lo cual firman,

Dra. Edgloris Marys. IVIC

M. Sc. Beltrán Briceño. Universidad del Zulia

Dra. Soraya Silva. Tutor del trabajo de Grado IVIC

Centro de Estudios Avanzados, IVIC. Altos de Pipe, Diciembre 2013.

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Resumen del Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al título de Magister Scientiarum, mención Microbiología.

“Estudio de microorganismos fotosintéticos como indicadores de cambios ambientales en las Islas Greenwich, Dee y Barrientos, Shetland del Sur, Antártida”

Por

Nory Paola González Romero

CENTRO DE ESTUDIOS AVANZADOS INSTITUTO VENEZOLANO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS I.V.I.C ALTOS DE PIPE, Octubre 2013. Soraya Silva Tutor del Trabajo de Grado

El continente Antártico a pesar de ser uno de los ambientes más extremos en la Tierra posee arroyos, pequeños estanques y lagos alimentados del agua del deshielo de glaciares o de la nieve durante el verano austral. Estos reservorios al ser los principales depósitos de solutos y materiales particulados, y hábitat de especies únicas de microorganismos se han convertido en indicadores de alerta de cambios climáticos y ambientales. Los microorganismos fotosintéticos, a través de sus pigmentos marcadores, proveen un registro indirecto de cambios ambientales, porque estos almacenan cambios en las comunidades autótrofas que responden a condiciones físicas y químicas de ambientes acuáticos y sedimentarios. A través de este estudio se identificaron y cuantificaron por medio de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) los pigmentos marcadores de los principales taxas de microorganismos fotosintéticos de diferentes ambientes, ampliando el conocimiento de las comunidades autótrofas de los ecosistemas acuáticos de la Antártida. El análisis se realizó en muestras de agua, sedimento superficial y tapetes microbianos de cuerpos de iii

agua libres de hielo de las islas Greenwich, Dee y Barrientos, Antártida. Se analizaron las características químicas, físicas y biológicas de los estanques para identificar los factores ambientales que contribuyen a la distribución y composición de las comunidades de microorganismos autótrofos de las áreas de estudio. Se encontró un total de 14 pigmentos en el agua, 45 pigmentos sedimentarios y 35 en los tapetes microbianos, correspondiendo a bacilariofitas, cianobacterias, clorofitas, criptofitas, crisofitas, prasinofitas y bacterias fotosintéticas anaeróbicas. De estos, los tapetes microbianos aportaron la mayor cantidad de biomasa algal (122,29 µg g-1 de clorofila a) y estuvieron constituidos por cianobacterias filamentosas de los géneros Oscillatoria, Phormidium y Leptolyngbya, y varias especies de diatomeas. Entre los pigmentos fotosintéticos de los tapetes microbianos se identificó al pigmento fotoprotector scytonemina producido por las cianobacterias para protegerse de los rayos UV. El Análisis de Correspondencia Canónica mostró que las características químicas del agua y tamaño de la partícula del sedimento afectaron la distribución de los microorganismos fotosintéticos. Las Bacilariofitas fueron los microorganismos que tuvieron una distribución más amplia, ya que además de estar presentes en las islas Greenwich y Barrientos, con aguas enriquecidas naturalmente, estuvieron presentes en los cuerpos de agua de isla Dee y Ambato con características ultraoligotróficas. Los cuerpos de agua de la zona A y zona B de isla Greenwich, así como los de Barrientos fueron los reservorios sin cobertura de hielo y cercanos a la costa, teniendo la mayor concentración y diversidad de pigmentos fotosintéticos a diferencia de la baja concentración de pigmentos de Punta Ambato e isla Dee. Estos resultados permitieron generar la línea base sobre la composición y distribución de los microorganismos fotosintéticos y parámetros físico-químicos. Además, se demostró que la técnica de HPLC es una herramienta valiosa para el estudio de la composición de la comunidad autótrofa de agua dulce en la Antártida y proporciona una referencia útil para evaluar los posibles cambios futuros en estos ecosistemas acuáticos.

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DEDICATORIA Este trabajo está dedicado a Mary, Arturo, Pame, Vale, Alejandro y Vane por enseñarme que el amor de la familia es puro y sincero, y la sonrisa es el mejor remedio para el alma.

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AGRADECIMIENTOS

A Dios, por mostrarme día a día que con humildad, paciencia y sabiduría todo es posible. Al Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas por la ayuda económica. Al Centro de Estudios Avanzados y a su personal administrativo por todo el apoyo brindado durante los años de estudio. Al Instituto Antártico Ecuatoriano y la Secretaría de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación de Ecuador por el financiamiento prestado durante el postgrado. Al centro de Microbiología y Biología Celular y a su personal Docente e Investigativo por la formación académica impartida. A la Dra. Edgloris Marys y al M. Sc. Beltrán Briceño por dedicarle su tiempo a la lectura de este trabajo y por sus comentarios. Al personal del Laboratorio de Productos Naturales del centro de Química, Laboratorio de Virus de plantas del Centro de Microbiología, Laboratorio de Suelos del centro de Ecología y al Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal del centro de Bioquímica y Biofísica por permitirme hacer uso de sus instalaciones para el análisis de las muestras. A mi tutora, Dra. Soraya Silva por la guía brindada durante el desarrollo y culminación del presente trabajo, por compartir sus valiosos conocimientos y comentarios durante la revisión del mismo. Gracias por su amistad y apoyo desde el inicio de mis estudios. A mis amigos y compañeros del Centro de Oceanología y Estudios Antárticos, Dr. Juan Alfonso, Helga, Leinny, Juan Manuel, Yaneth, Abraham, Jackson, Carlos B., Carlos V., José, Marie Rose, Evencia y Ruber por su amistad y colaboración durante la realización de este trabajo. Al personal logístico y científico de la XVII Expedición Ecuatoriana a la Antártida. Al Lic. Carlos Ibarra por sus acertadas sugerencias e incondicional ayuda durante el desarrollo de la investigación. A mis amigos, Ana, Ricardo, Diana, Alfonso, Karina, Galo, Kelly, Yolimar, Antonio, Diego, Gaby, Eduardo, Milagros y Heicher por todo su cariño y amistad durante mi estadía en Venezuela. Así como a mis amigos de Ecuador, Cristina, Gaby, Juan Pablo, Lucy y Yamileth por su apoyo incondicional. A mi maravillosa familia por ser el motor de arranque da cada día, por acompañarme a través de este trayecto y apoyarme en los momentos más difíciles, gracias por todo su amor.

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ÍNDICE GENERAL Resumen…………………………………………………………………………... Agradecimientos…………………………………………………………………... Lista de Tablas…………………………………………………………………….. Lista de Figuras…………………………………………………………………… 1. Introducción…………………………………………………………………… 1.1. Microorganismos fotosintéticos……………………………………………… 1.1.1. Fitoplancton………………………………………………………………… 1.1.2. Microfitobentos…………………………………………………………….. 1.2. Tapetes Microbianos…………………………………………………………. 1.2.1. Cianobacterias……………………………………………………………… 1.3. Pigmentos Fotosintéticos…………………………………………………….. 1.3.1. Pigmentos Sedimentarios…………………………………………………... 1.4. Identificación de los microorganismos fotosintéticos………………………... 2. Objetivos……………………………………………………………………….. 2.1. Objetivo General……………………………………………………………... 2.2. Objetivos Específicos………………………………………………………… 3. Metodología……………………………………………………………………. 3.1. Área de estudio………………………………………………………………. 3.2. Medición de Parámetros Fisicoquímicos…………………………………….. 3.3. Procesamientos de muestras de agua………………………………………… 3.4. Procesamiento de muestras de sedimento y de los tapetes microbianos……... 3.5. Análisis de Pigmentos por Cromatografía Líquida de Alta Resolución……... 3.6. Identificación de los pigmentos……………………………………………… 3.7. Análisis Microscópicos………………………………………………………. 3.8. Ensayos de Crecimiento……………………………………………………… 3.9. Análisis químicos de las muestras de agua…………………………………... 3.9.1. Medición de Carbono Orgánico Total……………………………………… 3.9.2. Análisis de iones mayoritarios……………………………………………... 3.10. Análisis químicos de las muestras de sedimento…………………………… 3.10.1. Tamaño de las partículas del sedimento………………………………….. 3.10.2. Determinación de materia orgánica………………………………………. 3.10.3. Análisis elemental………………………………………………………… 3.11. Análisis Estadísticos………………………………………………………… 3.12. Incorporación a base de datos………………………………………………. 4. Resultados……………………………………………………………………... 4.1. Área de estudio……………………………………………………………….. 4.2. Parámetros fisicoquímicos in situ y análisis químicos del agua y sedimento... 4.2.1. Parámetros fisicoquímicos in situ en el verano austral 2012………………. vii

iii vi ix xi 1 2 3 3 4 5 6 7 9 12 12 12 13 13 16 16 17 17 18 18 18 19 19 19 19 19 19 20 20 20 21 21 22 22

4.2.2. Parámetros fisicoquímicos in situ en el verano austral 2013………………. 4.2.3. Iones mayoritarios presentes en las muestras de agua del 2012……………. 4.2.4. Iones mayoritarios y carbono orgánico total (COT) presente en las muestras de agua del 2013………………………………………………………… 4.2.5. Granulometría, análisis elemental y materia orgánica presente en el sedimento colectado en el verano austral del 2013………………………………. 4.3. Identificación de pigmentos mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución………………………………………………………………………… 4.3.1. Proporción de concentración de los pigmentos en relación con la clorofila a………………………………………………………………………………….... 4.3.2. Pigmentos presentes en el agua…………………………………………….. 4.3.3. Pigmentos sedimentarios…………………………………………………… 4.3.4. Pigmentos de tapetes microbianos…………………………………………. 4.4. Correlación de los pigmentos fotosintéticos con los parámetros fisicoquímicos, iones mayoritarios, tamaño de la partícula y principales elementos químicos……………………………………………………………….. 4.4.1. Correlación de los pigmentos presentes en las muestras de agua………….. 4.4.2. Correlación de los pigmentos sedimentarios………………………………. 4.5. Análisis de Correspondencia Canónica de los pigmentos fotosintéticos……. 4.6. Análisis Microscópico………………………………………………………... 4.7. Ensayos de crecimiento de tapetes microbianos……………………………... 5. Discusión……………………………………………………………………….. 5.1 Área de estudio………………………………………………………………... 5.2. Parámetros fisicoquímicos de las muestras de agua………………………….. 5.3. Análisis químicos de las muestras de agua…………………………………... 5.4. Análisis químicos de las muestras de sedimento…………………………….. 5.5. Pigmentos fotosintéticos presentes en las muestras de agua, sedimento y tapetes microbianos……………………………………………………………….. 5.6. Distribución de los pigmentos fotosintéticos de acuerdo a las variables ambientales………………………………………………………………………... 5.7. Análisis microscópico………………………………………………………... 5.8. Ensayos de crecimiento de tapetes microbianos……………………………... 6. Conclusiones…………………………………………………………………… 7. Recomendaciones……………………………………………………………… 8. Bibliografía…………………………………………………………………….. Hoja Curricular…………………………………………………………………..

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LISTA DE TABLAS Tabla I II III IV

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VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI VII

Página Pigmentos que identifican a cada grupo de microorganismos fotosintéticos………………………………………………………….. Coordenadas geográficas de los sitios de estudio y tipo de muestra colectadas durante el verano austral 2012 en la isla Greenwich……… Coordenadas geográficas de los sitios de estudio y tipo de muestra colectadas durante el verano austral 2013…………………………….. Condiciones del gradiente de las fases móviles utilizado para el análisis de pigmentos fotosintéticos, modificado de VanHeukelem y Thomas (2001)………………………………………………………... Características físicas de los tapetes microbianos colectados en la Zona A de la Isla Greenwich………………………………………….. Valores promedios de los parámetros fisicoquímicos in situ tomados de en las muestras de agua de los sitios de estudio durante el verano austral 2012…………………………………………………………… Valores promedios de los parámetros fisicoquímicos in situ tomados de en las muestras de agua de los sitios de estudio durante el verano austral 2013…………………………………………………………… Iones mayoritarios (mg l-1) de las aguas colectadas en el 2012………. Concentración de Iones mayoritarios y carbono orgánico total (mg l-1) presentes en el agua colectada durante el verano austral del 2013……. Porcentajes promedios de la granulometría del sedimento colectado en el verano austral 2013……………………………………………… Porcentajes promedios de Nitrógeno, Carbono, Hidrógeno, Azufre y materia orgánica de las muestras de sedimento del 2013……………... Proporciones de la concentración de los pigmentos en relación a clorofila a……………………………………………………............... Características de los pigmentos detectados por HPLC en muestras de agua……………………………………………………………………. Concentraciones promedios (µg l-1) de pigmentos presentes en las muestras de agua colectadas en el verano austral 2012 y 2013……….. Características de los pigmentos detectados por Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en sedimento……………………………… Concentraciones promedios (µg g-1) de pigmentos sedimentarios colectados durante el verano austral 2012 y 2013…………………….. Características de los pigmentos detectados por HPLC en muestras de ix

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tapetes microbianos…………………………………………………… Concentraciones promedios (µg g-1) de pigmentos presentes en tapetes microbianos colectados durante el verano austral 2013………. Distribución espacial y temporal de los microorganismos fotosintéticos de las muestras de agua, sedimento y tapetes microbianos…………………………………………………………….

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LISTA DE FIGURAS Figura 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Página Área de estudio y tipos de muestras colectadas durante el verano austral 2012……………………………………………………………. Área de estudio y tipos de muestras colectadas durante el verano austral 2013……………………………………………………………. Tapetes microbianos presentes en la zona A de isla Greenwich………. Concentración de Clorofila a de las muestras de agua, tapetes microbianos y sedimentos del verano austral 2013……………………. Concentraciones de los pigmentos encontrados en el agua, tapetes microbianos y sedimentos colectados en el verano austral 2013………. Concentraciones y distribución de los pigmentos fotosintéticos de las zonas A, B, Punta Ambato, Dee y Barrientos………………………….. Cromatograma obtenido de la muestra de agua de Barrientos 2………. Concentración y distribución de los pigmentos fotosintéticos presentes en las muestras de agua del verano austral 2013………………………. Concentración y distribución de los pigmentos sedimentarios del verano austral 2013…………………………………………………….. Cromatograma obtenido de la muestra de sedimento del sitio B1…….. Concentraciones de los pigmentos fotosintéticos encontrados en el veranos austral 2012 y 2013…………………………………………… Cromatograma obtenido de la muestra de tapetes microbianos del sitio A9……………………………………………………………………… Biplot pigmentos + variables ambientales de las muestras de agua del 2013…………………………………………………………………….. Biplot pigmentos + variables ambientales de las muestras de sedimento del 2013…………………………………………………….. Microorganismos fotosintéticos presentes en el agua de la isla Barrientos……………………………………………………………..... Microorganismos fotosintéticos presentes en el sedimento de la zona A de isla Greenwich………………………………………………………. Microorganismos fotosintéticos presentes en el sedimento de la isla Barrientos……………………………………………………………..... Cianobacterias presentes en los tapetes microbianos colectados en la zona A de isla Greenwich……………………………………………… Crecimiento de filamentos de los tapetes microbianos en el medio de cultivo BG-11…………………………………………………………... xi

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Microorganismos fotosintéticos cultivados en medio BG-11…………..

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1. INTRODUCCIÓN

El continente Antártico posee uno de los ambientes más extremos en la Tierra debido a sus bajas temperaturas, baja disponibilidad de agua líquida y de nutrientes. La Antártida, la plataforma continental y las islas cubren un área de aproximadamente 14 x 106 Km2 correspondiente a cerca del 10% de la superficie del planeta (Convey et al., 2009; Malandrino, et al., 2009). Debido a estas condiciones extremas, el estudio de los ecosistemas antárticos provee información de procesos evolutivos y de respuestas biológicas al cambio climático debido a las estrategias que tienen los organismos para combatir las condiciones extremas. Demostrando así también la alteración del clima y las modificaciones de la Tierra, ya que existen evidencias que estos cambios ocurren en las regiones polares de manera más acelerada, siendo la parte norte y oeste de la Península Antártica la que ha sufrido un mayor cambio de temperatura en relación al resto del continente (Borghini y Bargagli, 2004; Clarke et al., 2007; Convey et al., 2009). Las temperaturas de la superficie del océano en el margen continental de la península, al oeste de la península antártica, han sufrido un pronunciado calentamiento (3 - 4 ºC) en relación al siglo pasado (Mendes et al., 2012). Los efectos de estos cambios son evidentes en sistemas acuáticos, pequeños arroyos y lagos alimentados por agua del deshielo de glaciares o de la nieve durante el verano austral, debido a que son ecosistemas delicados que responden rápidamente a las perturbaciones climáticas locales (Laybourn-Parry y Pearce, 2007; Howard-Williams y Hawes, 2007; Quesada et al., 2008). El agua de los lagos y sedimentos son los principales depósitos para solutos y materiales particulados de los alrededores, convirtiéndose como integradores a corto y largo período de los productos de procesos biogeoquímicos que ocurren en el lago y sus alrededores (Vincent y Laybourn-Parry, 2008; Lyons, et al., 1997; Bargagli, 2005; Hawes et al., 2011) y además, son refugio de especies únicas e indicadores de cambios climáticos y ambientales. Los cuerpos de agua dulce de la Antártida son considerados los ecosistemas más productivos en este continente debido a que estas áreas libres de hielo proveen el ambiente adecuado para el crecimiento de microorganismos bénticos formados por tapetes microbianos que consisten principalmente de cianobacterias, clorofitas y fitoflagelados (Laybourn-Parry y Marchant, 1992; Sabbe et al., 2004; Tanabe et al., 2010). Estos fotótrofos son considerados alimento para los niveles tróficos altos incluyendo un amplio rango de bacterias heterótrofas, hongos, protozoos ciliados y flagelados, y algunas especies de rotíferos, nematodos y tardígrados (Borghini et al., 2010). El crecimiento y desarrollo de los microorganismos fotosintéticos depende de la energía de la luz mediante la fotosíntesis; proceso que lo realizan gracias a la presencia de clorofilas,

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carotenoides y otros pigmentos que funcionan principalmente como agentes captadores de luz y para la fotoprotección (Jeffrey et al., 1997; Leavitt y Hodgson 2001). Los pigmentos son un recurso importante de información en los sistemas acuáticos, ya que con la clorofila a se estima la biomasa total de productores primarios (Leavitt y Hodgson, 2001), la clorofila b está presente en las algas verdes y plantas superiores, la clorofila c está en las diatomeas y dinoflagelados y los carotenoides son biomarcadores de diferentes taxas (Hodgson et al., 2004; Kowalewska, 2001). Además, estos pigmentos marcadores proveen un registro indirecto de cambios ambientales debido a que almacenan modificaciones en las comunidades autótrofas que responden a condiciones físicas y químicas de ambientes acuáticos y sedimentarios (Jeffrey et al., 1997; Borghini et al., 2007).

1.1. Microorganismos fotosintéticos. Los microorganismos fotosintéticos son un grupo de protistas fotosintéticos y procariotas acuáticos que contienen clorofila a como su principal pigmento fotosintético y con estructuras reproductivas simples (Pienitz et al., 2004). Este grupo de microorganismos presentan una amplia diversidad en la forma de vida, características morfológicas, así como estrategias reproductivas y fisiológicas. Dentro de los ecosistemas de agua dulce, los microorganismos fotosintéticos están presenten como organismos de vida libre (planctónicos) o asociados al sustrato (bénticos). Las planctónicas se desplazan libremente dentro del cuerpo de agua, mientras que los organismos asociados al sustrato están fijos en una posición o tienen un movimiento limitado en relación al sustrato (Bellinger y Sigee, 2010). Las microalgas planctónicas son los principales organismos de los cuerpos de aguas permanentes con grandes florecimientos de diatomeas y dinoflagelados en lagos eutróficos (Bellinger y Sigee, 2010), aunque también se encuentran bacterias fototróficas (marrones no sulfurosas, púrpuras sulfurosas y verdes sulfurosas) especialmente en las regiones anóxicas, participando en la producción primaria, ciclo de elementos e interacciones tróficas (Pfennig, 1967; Hurley y Watras, 1991). Las microalgas y cianobacterias bénticas se encuentran en el fondo de la columna de agua de lagos y ríos, y están asociados directamente con los sedimentos, incluyendo rocas, lodo y detritos orgánicos, convirtiéndose en los organismos con mejor crecimiento sobre superficies inorgánicas o detritos formando tapetes mixtos con bacterias, hongos y con los invertebrados presentes (Bellinger y Sigee, 2010).

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1.1.1. Fitoplancton. El término fitoplancton se refiere a un grupo diverso de algas que habitan en cuerpos de agua como lagos, lagunas y arroyos. Y se clasifican en 4 grupos dependiendo del tamaño: picoplancton (0,2 - 2 µm), nanoplancton (2 - 20 µm), microplancton (20 - 200 µm) y macroplanton (> 200 µm) (Bellinger y Sigee, 2010). Los organismos fitoplanctónicos tienen poco control sobre su posición en la columna de agua debido a que depende de la corriente. Sin embargo, algunos taxones como Criptofitas y Crisofitas son flagelados y durante períodos de baja penetración de luz (debajo de la capa de hielo) estas algas se mueven a la superficie de la columna de agua y absorben la luz que penetra la nieve y el hielo realizando la fotosíntesis (Pienitz et al., 2004). En la Antártida, los sistemas acuáticos son oligotróficos debido a la limitación especialmente de micronutrientes como el hierro; sin embargo, en ciertas regiones se ha observado una alta biomasa de fitoplancton (Mendes et al., 2012). Estas zonas con alta cantidad de biomasa son de gran importancia como sitios de alimentación y juegan un rol crucial en el ciclo biogeoquímico de los nutrientes; por lo que el estudio del fitoplanton y las características medioambientales son vitales para conocer la composición de grupos o especies y así evaluar cambios en el ecosistema a corto y largo plazo.

1.1.2. Microfitobentos. El microfitobentos está constituido por organismos unicelulares microscópicos autótrofos, principalmente diatomeas y cianobacterias que viven en la interfase sedimento/agua en los primeros milímetros del sedimento (MacIntyre et al., 1996; Cahoon, 1999) y contribuyen significativamente a la productividad primaria de los lagos y suministro de energía para la cadena alimenticia cuando el microfitobentos está resuspendido en la columna de agua (MacIntyre et al., 1996; Skowronski et al., 2009), por lo que también es importante conocer acerca de la comunidad microfitobéntica para entender los ecosistemas acuáticos. El microfitobentos es activo en los primeros milímetros superficiales del sedimento, la cual es una región con fuertes gradientes en propiedades físicas, químicas y biológicas (Whalen et al., 2013). Pueden bioestabilizar el sedimento por medio de la formación de tapetes microbianos (Dodds, 2003) o liberar polímeros extracelulares, modular el flujo de nutrientes en la interfase sedimento-agua por medio de la asimilación y mineralización. Además, la producción de oxígeno fotosintético de la microflora béntica impacta indirectamente en la movilidad de los nutrientes alterando la distribución espacial de las actividades microbianas. Las comunidades de microorganismos fotosintéticos están representadas por Cianobacterias, Criptofitas, Crisofitas, Clorofitas y Bacilariofitas, siendo los géneros más abundante en la

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Antártida, las cianobacterias Oscillatoria, Nostoc, Leptolyngbya, Chroococcus, Phormidium, Calothrix, Schizothrix, las Bacilariofitas Navicula, Luticola, Hantzschia, Diadesmis, Pinnularia y las Clorofitas Kentrosphaera, Pleurococcus, Binuclearia (Borghini et al., 2011). Dentro de este grupo de microalgas, las Bacilariofitas son las más representativas ya que habitan en ambientes marinos y ecosistemas de agua dulce y son un componente importante en las comunidades microbianas de la Antártida. Las diatomeas se encuentran en gran cantidad en los tapetes microbianos bénticos y planctónicos que crecen cerca de la costa y en el fondo de los lagos y lagunas en la zona costera (Cavacini et al., 2006). Muchas especies de diatomeas son capaces de producir sustancias poliméricas extracelulares y, en particular, las diatomeas bénticas pueden contribuir a la estabilización del sedimento (Franks et al., 2010). Las diatomeas están presentes en zonas húmedas, semi-secas, y algunos hábitats congelados de las islas de la Península Antártica y del continente. Al igual que en muchas otras regiones del mundo, las diatomeas son a menudo uno de los pocos organismos que están bien conservados como subfósiles siendo de gran utilidad como indicadores de cambios ambientales (Spaulding et al., 2010).

1.2. Tapetes Microbianos. Los tapetes microbianos funcionan como un consorcio cooperativo de manera coordinada que forman arreglos complejos bióticos y abióticos (Davey y O'toole, 2000), y producen sustancias poliméricas extracelulares (SPE) las cuales se extienden desde la célula para formar una matriz compleja de fibras. Las características de organización de un tapete, permiten que sus microorganismos puedan mantener condiciones en la interfase de la superficie del mismo totalmente diferentes de aquellas del medio ambiente externo (de los Ríos et al., 2003). Los tapetes microbianos se definen como estructuras laminadas verticales que se desarrollan en las capas del sedimento superficial y en la superficie del suelo (van Gemerden, 1993). Estos ecosistemas consisten de una matriz de mucílago en la cual están embebidos fotótrofos oxigénicos (microalgas y cianobacterias), bacterias heterótrofas aeróbicas, bacterias quimiotróficas sulfurosas, bacterias fotótrofas sulforosas y bacterias sulforeductoras (de los Ríos et al., 2004). Debido a su estructura y organización, los tapetes microbianos son un modelo ideal para estudiar la conversión bioquímica de la materia orgánica en los sedimentos (Canfield y Des Marais, 1993). La morfología, estructura y color de los tapetes microbianos están determinado por las especies dominantes, características del sedimento y otros factores ambientales (de los Ríos, 2004; Komárek y Komárek, 2010). Estos tapetes se encuentran en un amplio rango de ambientes,

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algunos de los cuales son considerados extremos, tales como lagos y estanques hipersalinos, aguas termales, desiertos secos y calientes y en ambientes fríos de las zonas polares (Vincent, 2002) debido a su tolerancia a la desecación, ciclos de congelamiento-descongelamiento, radiación solar continua y defensa contra el daño causado por los rayos UV (Sabbe et al., 2004). La biomasa y morfología de los tapetes microbianos en la Antártida son afectadas por la duración, espesor y transparencia de la cubierta de hielo, características del sedimento, profundidad y química del agua (Hodgson et al., 2004; Sabbe et al., 2004); así como por la intensidad de la radiación solar de los veranos antárticos. Siendo la luz y la temperatura los principales factores que intervienen en el proceso metabólico y por lo tanto en la producción primaria y respiración de las comunidades fotótrofas. Se ha reportado un incremento en la temperatura en la Antártida en los últimos años, así como el flujo de rayos ultravioleta B a través del agujero en la capa de ozono (Wynn-Williams, 1996) por lo que varios estudios se han enfocado en analizar los efectos de la radiación UV en la estructura y la productividad de las comunidades en ambientes acuáticos (Vincent et al., 1993, Quesada et al., 1995; Wynn-Williams 1996, Nadeau et al., 2001), así como las estrategias de adaptación que tienen las cianobacterias frente a la radiación UV, debido a que estos microorganismos pueden ajustar el contenido de su pigmento y su capacidad fotosintética para optimizar su crecimiento en un amplio rango de temperaturas (Buffan-Dubau et al., 2001; Gao et al., 2007; Zakhia et al., 2008; Chacón, 2010). Las presencia ubicua de los tapetes de cianobacterias así como su composición taxonómica y las actividades fisiológicas en riachuelos, charcas, lagos y agua de deshielo de distintos lugares en la Antártica continental ha sido bien documentada (Howard-Williams y Vincent, 1989; Broady y Kibblewhite, 1991; Vincent et al., 1993; Ellis-Evans, 1996; Fernández-Valiente et al., 2001; de los Ríos et al., 2004; Sabbe et al., 2004). Sin embargo en el área de la Antártida peninsular, solo en la isla Rey Jorge y Livingston se han estudiado tapetes microbianos, mientras que en el resto de las islas se tienen pocos o ningún reporte de estos microecosistemas (Fernández-Valiente et al., 2007; Laybourn-Parry y Pearce, 2007; Komárek y Komárek, 2010).

1.2.1. Cianobacterias. Las cianobacterias son bacterias oxigénicas fotosintéticas que de acuerdo al record fósil, la mayoría de la diversidad morfológica actual data de hace 2,3 billones de años (Vyverman et al., 2010). Estos microorganismos fotosintéticos se encuentran en la mayoría de ambientes de agua dulce y marinos de regiones tropicales y temperadas. Las cianobacterias se pueden presentar de manera filamentosa, cocoides unicelulares o colonias. Las formas picoplanctónicas miden de 1-2

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µm de diámetro y las filamentosas forman colonias con un tamaño que está sobre los 2 mm (Jeffrey et al., 2011). Las cianobacterias poseen los fotosistemas I y II, los cuales están localizados en las membranas de los tilacoides (excepto en el género Gloeobacter). Las células usualmente tienen una coloración azul-verdosa debido a los pigmentos ficocianina y aloficocianina (azul) sumado a la clorofila a, aunque algunas otras especies pueden tener adicionalmente ficoeritrina que confiere color rojo. En pocos taxas, se puede observar clorofila b y d y algunas cianobacterias son capaces de fijar nitrógeno atmosférico (Zakhia et al., 2008). La estratificación de estas comunidades puede ser reconocida a menudo por el grado de coloración vertical debido a la diferente pigmentación de los microorganismos fotosintéticos (FernándezValiente et al., 2007). La mayoría de cianobacterias de los tapetes microbianos que se desarrollan en la Antártida pertenecen al Orden Oscillatoriales, las cuales comprenden filamentos cianobacterianos, poca o no formación de vainas, pérdida de ramificación verdadera, sin heterocistos y acinetos (Broady, 1991; Comte et al., 2007; Vincent, 2007). Este grupo tradicionalmente incluye los géneros Oscillatoria, Phormidium y Lyngbya, pertenecientes a la familia Oscillatoriaceae (Rippka et al., 1979). En estudios realizados en áreas libre de hielo en Victoria Land, Mc Murdo e Isla Rey Jorge se demostró el desarrollo de floraciones de cianobacterias de los géneros Oscillatoria, Phormidium, Leptolyngbya y microalgas, especialmente en suelos que tienen nutrientes derivados de aves marinas, donde las algas cocoides y filamentosas como Chlorella spp., Chorococcum spp. y Stichoccus spp. son los grupos dominantes (Colacevich et al., 2009; Callejas et al., 2011). Estudios recientes apoyan la hipótesis que para el crecimiento de los tapetes microbianos, no solo la temperatura óptima es importante para el crecimiento y metabolismo óptimo de la comunidad, sino que también es determinada por las interacciones complejas dentro de los tapetes microbianos (Pringault et al., 2001). Broady et al. (1984) realizaron un estudio en condiciones de cultivo sobre la morfología de aislados de esta familia de cianobacterias que habitan en la Antártida, a partir del cual se logró aislar algunas cepas tomando en cuenta características microscópicas morfológicas relacionadas a la forma del tricoma, la naturaleza de la vaina mucilaginosa y detalles de la morfología de las células.

1.3. Pigmentos Fotosintéticos. Los pigmentos fotosintéticos son usados como indicadores de la composición algal y bacteriana de una comunidad (Tabla I), interacciones en la cadena trófica, acidificaciones de cuerpos de agua, cambios en la estructura física de los lagos y sus variaciones (Lyons, et al., 1997; Borghini y Bargagli, 2004; Hodgson et al., 2004; Bargagli, 2005; Vincent y Laybourn-Parry, 2008). Así

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también, los pigmentos han sido utilizados como indicadores de una gran variedad de impactos antropogénicos en los ambientes acuáticos, incluyendo eutroficación, prácticas de uso del suelo y cambio climático (Leavitt et al., 1993; Hall et al., 1999).

1.3.1. Pigmentos Sedimentarios. Los sedimentos de los lagos a menudo preservan un amplio rango de carotenoides, clorofilas y compuestos fotoprotectores y otros pigmentos lípido-solubles de organismos fotótrofos que están en el lago o sus alrededores. Los pigmentos están presentes en todos los organismos fotosintéticos y funcionan principalmente como agentes captadores de luz para la fotosíntesis y para fotoprotección (Moratta y Renaud, 2008). La preservación de los pigmentos en el sedimento está favorecida por la alta producción del plancton, altas tasas de sedimentación y anoxia, por lo que los pigmentos sedimentarios son usados en estudios a corto y largo plazo de cambios en los ecosistemas acuáticos así como en la producción de materia orgánica, eutrofización y florecimiento de cianobacterias (Hodgson et al., 1998; Moratta y Renaud, 2008). La clorofila a es común para todas las especies algales, mientras que otros pigmentos accesorios están presentes en distintos organismos y a menudo tienen una distribución taxonómica restringida (Morata y Renaud, 2008) y debido a que algunos grupos de fotoautótrofos habitan nichos ecológicos específicos, su presencia también permite reconocer características del paleoambiente (Squier et al., 2002). La clorofila a y feofitina son pigmentos ampliamente distribuidos y son indicadores de la abundancia algal total, mientras que los carotenoides aloxantina, luteína, equinenona, fucoxantina y peridinina son más usados para cambios históricos en las clases algales (divisiones) o grupos funcionales (Jeffrey et al., 1997). Así mismo, los derivados de clorofilas y carotenoides son indicadores importantes de las características de la columna de agua y del sedimento que regulan las transformaciones de los pigmentos tales como pastoreo, anoxia, estratificación y luz, siendo indicadores claves de cambios del ambiente biótico y físico de los lagos (Hodgson et al., 1998; Leavitt y Hodgson. 2001).

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Tabla I. Pigmentos que identifican a cada grupo de microorganismos fotosintéticos.

Pigmento Clorofila a Feofitina a Feoforbide a Clorofilida a Derivados de clorofila a Clorofila b Clorofilida b Derivados de clorofila b Clorofila c1 Clorofila c2 Bacterioclorofilas Scytoneminas Carotenoides Fucoxantina Diadinoxantina Mixoxantófila Diatoxantina Anteraxantina Luteína Zeaxantina Nostoxantina Equinenona Cantaxantina α caroteno β caroteno

Microorganismo Todas las clorofitas y cianobacterias Todas las clorofitas y cianobacterias Todas las clorofitas y cianobacterias Todas las clorofitas y cianobacterias Todas las clorofitas y cianobacterias Clorofita, Euglenfita, plantas superiores Clorofita, Euglenfita, plantas superiores Clorofita, Euglenfita, plantas superiores Algas cromofitas Algas cromofitas Bacterias aeróbicas, incluyendo facultativas Cianobacterias Cianobacterias Bacilariofita, Crisofita Bacilariofita, Crisofita Cianobacterias Bacilariofita, Dinofita, Crisofita Clorofita Clorofita Cianofita, Clorofita Cianobacterias Cianobacterias Cianobacterias Clorofita Clorofita, Cromofita, algunas bacterias fototróficas, Cianobacterias.

Modificada de Hodgson et al., 2004.

Los sedimentos también contienen derivados de la mayoría de los pigmentos más comunes, incluyendo alómeros, epímeros, productos de pirólisis y varias modificaciones estructurales asociadas al oxígeno, metil y glicosídicas que son específicas de cada pigmento (Leavitt y Hodgson, 2001; Reuss et al., 2005). Los microorganismos fotosintéticos, a través de sus pigmentos marcadores, proveen un registro indirecto de cambios ambientales, porque estos almacenan cambios en las comunidades autótrofas que responden a condiciones físicas y químicas de ambientes acuáticos y sedimentarios (Borghini et al., 2007). En estos ecosistemas se desarrollan comunidades planctónicas y bentónicas cuya característica común es la de estar formadas principalmente por microorganismos, ya sean bacterias, pequeños animales, que suponen la diversidad de la vida en estos ambientes, mientras que entre las comunidades bénticas cabe resaltar los tapetes microbianos, formados

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principalmente por cianobacterias, cuyo pigmento marcador es la zeaxantina y constituyen los principales productores primarios bénticos en la Antártida (Vincent et al., 1989; Wynn-Williams, 1990, Bonilla et al., 2009). Las clorofilas, carotenoides y otros pigmentos de algas y de bacterias fototróficas son los compuestos orgánicos naturales en aguas y sedimentos, siendo biomarcadores de distintos taxas y la transformación de sus productos son indicadores de las interacciones tróficas (Leavitt y Hodgson 2001; Borghini et al., 2007). Así, estos biomarcadores representan datos valiosos de los organismos y procesos biológicos, y permite la evaluación de condiciones cambiantes en el tiempo (Squier et al., 2004). Algunos grupos de fotoautótrofos habitan nichos ecológicos específicos, su presencia también permite reconocer las características de ese ambiente actual y del pasado. Por ejemplo bacterioclorofilas c, d y e ocurren en Clorobiaceae, anaerobios obligados y por lo tanto son biomarcadores ideales para zonas fóticas anóxicas. Además, diferencias estructurales en estas bacterioclorofilas reflejan diferencias en condiciones de crecimiento (Squier et al., 2005; Borghini et al., 2010). Pigmentos de diatomeas y crisofitas (fucoxantina y c-forbinas) son más lábiles que aquellos originarios de algas verdes como luteína y b-forbinas, cianobacterias (zeaxantina, a-forbinas) o criptofitas (aloxantina) (Leavitt, 1993).

1.4. Identificación de los microorganismos fotosintéticos. La composición de los pigmentos es dependiente del tipo de organismo fotótrofo presente y es una información importante cuando se trata de caracterizar la distribución microbial en ambientes naturales. El valor informacional del espectro de absorción determina el tipo y concentración de las especies de microorganismos presentes. El análisis completo de la mezcla requiere una técnica de separación, usualmente con el uso de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) para investigar el tipo de pigmento presente e identificación de los taxones dominantes en los ecosistemas de agua dulce de la Antártida, ya que HPLC es un método muy sensible y selectivo para la caracterización de pigmentos fotosintéticos. El HPLC es una técnica que representa la mejor vía para estudiar pigmentos sedimentarios, porque ésta permite la separación y cuantificación de varias clorofilas, carotenoides y sus productos de degradación, para lo cual existe una metodología ya establecida que se ha aplicado en diferentes ambientes tanto en la Antártida como en otros continentes (Frigaard et al., 1996; Brotas y Plante-Cuny, 2003; Borghini et al., 2007). Esta técnica cromatográfica ha sido aplicada para estudios de fitoplancton a principios de 1980 (Rowan, 1989) y consiste en utilizar columnas de diámetro pequeño, tamaño de las partículas

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delgadas y con una rápida velocidad de flujo (Brotas y Plante-Cuny 2003). El método quimiotaxonómico basado en los pigmentos permite el análisis de picoplacton y nanoplancton que a menudo no se observan en el microscopio, incluso con un microscopio electrónico, especialmente en ambientes oligotróficos donde el 80% de las especies de microorganismos fotosintéticos son de < 3 µm (Higgins et al., 2011). A diferencia del HPLC, la espectrofotometría sobreestima las concentraciones de clorofila a por la sobreposición de las bandas de absorción y fluorescencia de las clorofilas b y c, productos de degradación de las clorofilas y pigmentos accesorios (Bidigare et al., 2005). Mientras que la observación al microscopio óptico tiene la desventaja de que es una técnica que necesita más tiempo y experticia al momento de identificar los microorganismos que estén presentes en las muestras y los biovolúmenes se calculan utilizando fórmulas geométricas relacionadas con la forma de la célula y convertidas a carbono celular usando la proporción carbono: volumen. La microscopía puede producir identificación confiable de células grandes, pero a menudo células de pico y nanoplancton no se pueden identificar o incluso se los ignoran (Montagnes et al., 1994; Mender-Deur y Lessard, 2000). Además, se han desarrollado nuevas técnicas para monitorear las comunidades de microorganismos incluyendo el FlowCAM, un citómetro de flujo de imágenes continua, adecuada para células de gran tamaño y la sonda fluorométrica la cual mide la fluorescencia y distribución del fitoplancton de los mayores grupos algales. Estos métodos al igual que la microscopía son incapaces de distinguir algunas clases algales y el método quimiotaxonómico muestra superioridad en identificar al nanoplancton y haptofitas (Higgins et al., 2011). La mayoría de los estudios relacionados a microorganismos fotosintéticos a través de sus pigmentos específicos en la Antártida como marcadores de cambios ambientales se han limitado a ciertas regiones como Victoria Land, Larsemann Hills y valles de Mc Murdo (Hodgson et al., 2001, 2006; Squier et al., 2002) y algunas islas del archipiélago Shetland del Sur como Rey Jorge y Livingston. Mientras que en las islas Greenwich, Dee y Barrientos que pertenecen a este conjunto de islas, se han realizado muy pocos estudios para obtener información acerca de los microorganismos fotosintéticos en el agua de deshielo, sedimento y tapetes microbianos. Debido a su ubicación y geomorfología, las islas Shetland del Sur han sufrido cambios en sus sedimentos en respuesta a cambios tectonoclimáticos y del nivel del mar. Así también, debido a que la cubierta del glaciar ha cambiado progresivamente en los últimos 20 años (Azhar y Santana, 2007) por lo que estudios de los microorganismos que habitan en los diferentes ambientes pueden proveer información sobre los cambios que están ocurriendo. A través del desarrollo de este estudio se generará información valiosa sobre línea base ambiental acerca de la diversidad y distribución de microorganismos fotosintéticos en las Islas Greenwich, Dee y Barrientos, lo que será de gran utilidad para futuras evaluaciones de impacto ambiental en la

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Antártida y podrá estar disponible para otros investigadores en la base de datos de biodiversidad del Comité Científico para la Investigación en la Antártida (SCAR, por sus siglas en inglés).

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2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo General. Estudiar los microorganismos fotosintéticos en aguas, sedimentos y tapetes microbianos de las islas Greenwich, Dee y Barrientos, Antártida, como indicadores de cambios ambientales.

2.2. Objetivos Específicos: •

Estudiar la comunidad de microorganismos fotosintéticos a través de pigmentos fotosintéticos en cuerpos de agua de deshielo, sedimentos y tapetes microbianos de las islas Greenwich, Dee y Barrientos.

•

Determinar la variación espacial de los microorganismos fotosintéticos en Isla Greenwich.

•

Examinar las relaciones entre la composición de pigmentos y parámetros físico-químicos ambientales.

•

Evaluar el crecimiento de algunos microorganismos fotosintéticos bajo condiciones experimentales.

•

Crear una base de datos sobre composición y distribución de microorganismos fotosintéticos y parámetros fisicoquímicos que sirvan de línea base para futuras evaluaciones ambientales en la isla Greenwich.

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3. METODOLOGÍA

3.1. Área de estudio. Muestras de agua y sedimento superficial fueron colectadas durante el desarrollo de la XVI Expedición Ecuatoriana y V Expedición Científica de Venezuela al Continente Antártico en el verano austral 2012. El muestreo se realizó en la Isla Greenwich, en las adyacencias de la Estación Científica “Pedro Vicente Maldonado” de Ecuador. Estas muestras se recolectaron en un total de 9 sitios (Figura 1). En la Tabla II se describen los lugares de muestreo, indicando el tipo de muestra y las coordenadas UTM, las cuales fueron registradas con un GPS modelo 76CSX (Garmin).

Figura 1. Área de estudio y tipos de muestras colectadas durante el verano austral 2012.

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Tabla II. Coordenadas geográficas de los sitios de estudio y tipo de muestra colectadas durante el verano austral 2012 en la isla Greenwich.

Zona

A

B

Código

Tipo de muestra

A1 A2

Agua y sedimento Agua

Coordenadas (UTM) 21E 358054 3072882 21E 358269 3072922

A3

Agua

21E 358374 3072793

A4

Sedimento

21E 358372 3072839

B1 B2

Sedimento Sedimento

21E 358927 3072654 21E 358939 3072642

B3 B4

Agua y sedimento Agua y sedimento

21E 358963 3072631 21E 359026 3072570

B5

Agua

21E 359166 3072594

Durante el desarrollo de la XVII Expedición Ecuatoriana y VI Expedición Científica de Venezuela al Continente Antártico durante el verano austral 2013 se colectaron muestras de agua, sedimento y tapetes microbianos. El muestreo se realizó en la Isla Greenwich, en las adyacencias de la Estación Científica “Pedro Vicente Maldonado” de Ecuador, y en las islas Dee y Barrientos (Figura 2). Estas 3 islas se encuentran en la parte central del archipiélago Shetland del Sur, separadas de isla Robert por el Norte y de isla Livingston por el Sur por estrechos canales. Las islas Shetland del Sur están localizadas a 120 Km al norte de la península Antártica separadas por el Estrecho Bransfield y del continente Americano por el Paso Drake Se muestrearon un total de 27 sitios, en 22 de los cuales se colectó agua, en 19 se colectó sedimento y los tapetes microbianos en 7 sitios. En la Tabla III se describen los lugares de muestreo indicando el tipo de muestra y las coordenadas UTM, las cuales fueron registradas con un GPS modelo 76CSX (Garmin). En la isla Greenwich (21E 358256 3071559) los sitios de muestreo se localizaron en Punta Fort Williams, en 2 regiones previamente establecidas, denominadas como Zona A y B y al oeste en Punta Ambato. Los lugares muestreados fueron pequeños reservorios de aguas temporales que se forman del deshielo del Glaciar Quito ya que esta isla en su mayor parte está cubierta de hielo.

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Figura 2. Área de estudio y tipos de muestras colectadas durante el verano austral 2013.

La isla Dee (21E 356244 3076306) está localizada a 850 m al norte de la Isla Greenwich. Los sitios de muestreo fueron en la zona baja de la isla, en pequeños charcas y arroyos producto de deshielo. La isla Barrientos (21E 356163 3078161) ubicada a aproximadamente 7 Km de isla Greenwich, localizada entre las islas Robert y Greenwich. Los lugares de recolección de las muestras se ubicaron en una pequeña laguna localizada al oeste de la isla. Las muestras de aguas, sedimentos superficiales y tapetes microbianos se colectaron por triplicado, manualmente en arroyos y lagunas formadas por agua de deshielo

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Tabla III. Coordenadas geográficas de los sitios de estudio y tipo de muestra colectadas durante el verano austral 2013. Isla

Zona

Código A1 A2 A3

A

Greenwich

B

Punta Ambato Dee

Laguna Dee

Barrientos

Laguna Barrientos

A4 A5 A6 A7 A8 A9 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B R/C Amb1 Amb2 Amb3 Dee1 Dee2 Dee3 Barr1 Barr2 Barr3 Barr4 Barr5

Tipo de muestra Agua, sedimento y tapetes microbianos Agua y sedimento Agua, sedimento y tapetes microbianos Agua Agua y tapetes microbianos Agua y tapetes microbianos Agua y tapetes microbianos Tapetes microbianos Tapetes microbianos Agua y sedimento Agua y sedimento Agua y sedimento Agua y sedimento Sedimento Sedimento Agua Agua y sedimento Agua y sedimento Agua y sedimento Agua y sedimento Agua y sedimento Agua y sedimento Agua y sedimento Agua y sedimento Agua y sedimento Sedimento Agua

Coordenadas (UTM) 21E 358398 3072837 21E 358393 3072851 21E 358405 3072850 21E 358622 3072819 21E 358513 3072786 21E 358508 3072787 21E 358494 3072795 21E 357949 3072551 21E 357952 3072553 21E 359308 3072879 21E 359342 3072693 21E 359369 3072713 21E 359303 3072859 21E 359319 3072804 21E 359371 3072706 21E 359415 3072698 21E 355953 3073410 21E 355910 3073382 21E 355848 3073346 21E 355430 3074957 21E 355685 3074821 21E 355704 3074702 21E 357305 3077374 21E 357340 3077347 21E 357365 307732 21E 357520 3077174 21E 357454 3077228

3.2. Medición de Parámetros Fisicoquímicos. En cada uno de los sitios donde se colectó agua, se midieron in situ los parámetros fisicoquímicos tales como temperatura, pH, oxígeno disuelto (OD), sólidos totales disueltos (TDS), potencial reducción oxígeno (ORP), salinidad y conductividad del agua utilizando una sonda multiparamétrica HORIBA, Modelo UX22.

3.3. Procesamientos de muestras de agua. Se colectaron 3 litros de agua por sitio de muestreo en envases plásticos estériles y se filtraron en porciones de 1 litro usando filtros de fibra de vidrio GF/F con un poro de 0,47µm y 47 mm de diámetro, a través del sistema de filtración Millipore. Los filtros con el filtrado se almacenaron a -20 °C en el Laboratorio de la Estación Pedro Vicente Maldonado (Antártida), para su posterior

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procesamiento en el laboratorio del Centro de Oceanología y Estudios Antárticos, IVIC. Los filtros se cortaron en pedazos de 2 mm aproximadamente, se le añadió 10 ml de 100% acetona grado HPLC. Luego se sonicaron por 30 segundos y se almacenaron a 4 °C para que se diera el proceso de extracción. Después de 24 horas, se centrifugaron a 3000 rpm por 10 minutos, el sobrenadante se pasó por un filtro de nylon de 0,2 micras y se colocaron en viales ámbar a los que se les añadió una atmósfera de nitrógeno para evitar la oxidación de los pigmentos (Borghini et al., 2007). Los viales fueron almacenados a -80 °C para su posterior análisis mediante HPLC.

3.4. Procesamiento de muestras de sedimento y de los tapetes microbianos. Mediante un tubo de PVC de 3 cm de diámetro x 15 cm de largo se tomó un núcleo de sedimento por cada sitio de muestreo y con la ayuda de un émbolo se obtuvo aproximadamente 1 cm de sedimento superficial. Este material se lo colocó en tubos Falcon estériles de 15 ml. La recolección de los tapetes microbianos se realizó utilizando una espátula de plástico. Estos fueron colocados en tubos Falcon estériles de 50 ml. Los tubos con el sedimento y tapetes microbianos fueron congelados a -20 °C en el laboratorio de la Estación en la Antártida hasta ser transportados al IVIC. En el laboratorio del Centro de Oceanología y Estudios Antárticos (COEA) se liofilizó aproximadamente 2 g de sedimento superficial y tapetes microbianos por 24 horas. Transcurrido ese tiempo se realizó la extracción con 6 ml de 100% acetona grado HPLC siguiendo el mismo procedimiento aplicado a los filtros con las muestras de agua.

3.5. Análisis de Pigmentos por Cromatografía Líquida de Alta Resolución. Para el análisis de los pigmentos fotosintéticos se utilizó el equipo HPLC Waters 1525 con Bomba Binaria, detector UV-VIS de arreglo de diodo 2998, desgasificador en línea, horno para columna e inyector manual (loop de 50 µl) controlado por el Software Enpower 3.0 en el Laboratorio de Productos Naturales del Centro de Química del IVIC con asesoría del Lic. Carlos Ibarra. Se aplicó el método de VanHeukelem y Thomas (2001) con algunas modificaciones (Tabla IV). Se usó una columna fase reversa ZORBAX Eclipse XDB-C18, 3 x 150 mm, (3,5 µm). La fase móvil consistió de un gradiente binario, solvente A: 70/30 Metanol/10mM tetrabutil acetato de amonio (TBA) y 50 mM de acetato de amonio con un pH de 6,5, y el solvente B: 100% metanol. Se utilizó un flujo de 0,4 ml/min y un volumen de inyección de 50 µl (40 µl de muestra y 10 µl de fase móvil). Los pigmentos fueron detectados entre los 250 a 800 nm. Todas las muestras fueron analizadas a 60 °C.

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Tabla IV. Condiciones del gradiente de las fases móviles utilizado para el análisis de pigmentos fotosintéticos, modificado de VanHeukelem y Thomas (2001).

Tiempo (min) 0 25 45 50 60

Fase móvil A (%)

Fase móvil B (%)

95 5 5 95 95

5 95 95 5 5

3.6. Identificación de los pigmentos. La identificación y cuantificación de los pigmentos se realizó mediante la comparación de picos obtenidos mediante HPLC con los estándares: clorofila a, clorofila b, clorofila c2 feofitina a, aloxantina, fucoxantina, diadinoxantina, equinenona, peridinina, luteína, prasinoxantina, violaxantina y zeaxantina los cuales se obtuvieron de DHI Lab Products en Dinamarca. El estándar de la bacterioclorofila a se obtuvo de Sigma, Aldrich.

3.7. Análisis Microscópicos. Para complementar la información que se generó con el análisis de HPLC, en el Laboratorio del COEA, se realizaron análisis microscópicos de las muestras de agua, sedimento y tapetes microbianos que fueron preservadas con formaldehído. De estas muestras fijadas se colocaron aproximadamente 2 gotas en las placas portaobjetos, con 5 repeticiones, para su posterior observación a través del Microscopio óptico Leica 2500. Para la identificación de los microorganismos fotosintéticos presentes se utilizó el sistema de clasificación de Anagnostidis y Komarek (1988) y Komarek y Anagnostidis (1989). 3.8. Ensayos de Crecimiento. De los tapetes microbianos de la zona A de isla Greenwich que estuvieron congelados a -80 °C, se sembró aproximadamente 7mm2 en placas y tubos de ensayo con el medio de BG-11, específico para cianobacterias (Rippka et al., 1979). Además, en algunos de los ensayos que se realizaron en las placas, se mezcló el medio BG-11 con sedimento estéril. El crecimiento de los tapetes microbianos bajo condiciones de laboratorio se realizó a 20 °C, iluminados con luz blanca e intensidad luminosa

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de 1149,08 lx, también se realizó el crecimiento a 15 °C con una intensidad lumínica de 1634,04 lx. Los fotoperiodos de luz fueron de 10 horas.

3.9. Análisis químicos de las muestras de agua. 3.9.1. Medición de Carbono Orgánico Total. Se filtraron 50 ml de las muestras de agua con un filtro de teflón de 0,45 µm Thomas Scientific y se almacenaron a 4 °C en el laboratorio de la Estación Pedro Vicente Maldonado hasta ser transportados al IVIC. Posteriormente en el Laboratorio de Ecología de Suelos del Centro de Ecología se analizó el carbono orgánico total (COT) de las muestras de agua utilizando un analizador de COT Teledyne Tekmar, modelo Apollo 9000.

3.9.2. Análisis de iones mayoritarios. Se filtraron 60 ml de las muestras de agua con un filtro de teflón de 0,45 µm Thomas Scientific y se almacenaron a 4 °C en el laboratorio de la Estación Pedro Vicente Maldonado hasta ser transportados al IVIC y posteriormente se determinaron los niveles de los cationes mayoritarios Ca+2, Mg+2, Na+1, K+1 utilizando un espectrómetro de absorción atómica Perkin Elmer AAnalyst 200 y los aniones Cl-1, NO3-1 y SO4-2 usando un cromatógrafo iónico Dionex ICS-2100 en el Instituto de Ciencias de la Tierra de la Universidad Central de Venezuela.

3.10. Análisis químicos de las muestras de sedimento. 3.10.1. Tamaño de las partículas del sedimento. Muestras secas de sedimento fueron pasadas a través de un tamiz de 2,0 mm para analizar el tamaño de las partículas mediante el analizador granulométrico Malvern Mastersizer 2000 con la unidad de dispersión Hydro 2000G.

3.10.2. Determinación de materia orgánica. Para calcular la materia orgánica presente en el sedimento se utilizó la técnica de pérdida por ignición, usando una combinación de ecuaciones (Dean, 1974; Heiri et al., 2001; Santisteban et al., 2004). Se colocó aproximadamente 5 g de sedimento húmedo en crisoles secos y se secaron a 110

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°C por toda la noche. Luego se pesaron los crisoles con la muestra seca para obtener la diferencia de la muestra húmeda menos la muestra seca. A continuación se secaron los crisoles a 550 °C por 4 horas para calcular el porcentaje de materia orgánica presente en las muestras.

3.10.3. Análisis elemental. Para determinar el porcentaje de Carbono, Hidrógeno, Nitrógeno y Azufre en los sedimentos, muestras secas de este sustrato fueron molidas para ser analizadas mediante el Analizador Eager 200 Stripchart en el Laboratorio de Análisis Elemental del Centro de Química.

3.11. Análisis Estadísticos. Se aplicó un Análisis canónico de correspondencia (CCA) a través del programa estadístico PAST versión 2.17c para determinar las diferencias en la distribución espacial de la composición de microorganismos fotosintéticos. Con el programa SPSS versión 19.0 se aplicó la prueba de Kruskall – Wallis para comprobar las diferencias significativas y la Correlación de Spearman con un grado de significancia de 0,05 y 0,01 para determinar la correlación de los diversos taxa con los parámetros fisicoquímicos de los ambientes muestreados.

3.12. Incorporación a base de datos. La información obtenida sobre la composición y distribución espacial de los microorganismos fotosintéticos se los está ingresando en la Red de Información de Biodiversidad Marina de SCAR (SCAR-MarBIN, por sus siglas en inglés).

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4. RESULTADOS

4.1. Área de estudio. En el verano austral del 2012 se registró una temperatura mínima de 0,72 °C y máxima de 2,88 °C (las otras variables ambientales medidas en el 2013 no fueron tomadas en el 2012 debido a la falta de equipos). Durante los días de muestreo del verano austral 2013 en la Isla Greenwich se registró una temperatura promedio de 1,21 °C, humedad relativa de 88,1%, presión atmosférica de 988,2 hPa, radiación solar de 157,83 w/m2 y radiación UV de 12,66 µm m-2S-1. La zona A en la isla Greenwich, estuvo descubierta de nieve, con presencia de musgos y pequeños riachuelos alimentados del agua de deshielo del glaciar Quito. Esta zona fue el único sitio donde se observaron los tapetes microbianos (Figura 3), cerca de la Estación “Pedro Vicente Maldonado”. Las características de los tapetes de cada sitio se presentan en la Tabla V.

Tabla V. Características físicas de los tapetes microbianos colectados en la Zona A de la Isla Greenwich.

A1 A3 A5

Sitio

Coloración marrón - verdosa verde marrón

A6

Marrón

A7

marrón

A8 A9

Marrón - anaranjado Marrón - anaranjado

Características Tapete con espesor de 3mm. Tapete con espesor de 3mm. Tapete en formación, con presencia de burbujas con un espesor aproximado de 2mm. Tapete en formación, con presencia de burbujas con un espesor aproximado de 2mm. Tapete en formación, con presencia de burbujas con un espesor aproximado de 1mm. Tapete con espesor de 5 mm Tapete con espesor de 5 mm

Durante el primer muestreo en la zona B (14/01/2013) casi toda la extensión de la zona estaba congelada o iniciando apenas el proceso de descongelación. En el siguiente muestreo (21/01/13) estuvo descubierta de hielo en su mayor parte con formación de pequeñas lagunas y riachuelos proveniente del río Culebra. La zona B se caracteriza por ser un terreno rocoso o pedregoso.

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A

B

Figura 3. Tapetes microbianos presentes en la zona A de isla Greenwich. A, tapete microbiano colectado en el sitio A1. B, tapete microbiano colectado en el sitio A9.

La zona de Punta Ambato correspondió a una laguna somera formada por el agua de deshielo de la parte norte del glaciar Quito. Esta laguna estaba localizada a 10 metros, aproximadamente, de la playa. Isla Dee El lugar de muestreo de la isla Dee estuvo descubierto de nieve en su mayor parte con la formación de lagunas someras de aguas de deshielo. Isla Barrientos En isla Barrientos, se muestreó en la parte oeste, zona que se caracterizó por estar cubierta de musgos y presencia de una laguna somera a 2 metros de la playa, en la cual se colectó agua y sedimentos.

4.2. Parámetros fisicoquímicos in situ y análisis químicos del agua y sedimento. 4.2.1. Parámetros fisicoquímicos in situ en el verano austral 2012. Los valores medios de las variables fisicoquímicas in situ registradas en el 2012 se muestran en la Tabla VI. El pH de los cuerpos de agua varió entre 5,01 en B5 y 6,5 en B2. La conductividad y temperatura más alta se registró en el sitio B5 (152 µS cm-1 y 12,2 °C, respectivamente) y las más bajas en B4 (48 µS cm-1 y 1,75 °C, respectivamente). Y el oxígeno disuelto (OD) estuvo en mayor concentración en A2 (13,2 mg l-1) y la más baja en B5 (10,1 mg l1 ).

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Tabla VI. Valores promedios de los parámetros fisicoquímicos in situ tomados en las muestras de agua de los sitios de estudio durante el verano austral 2012.

Sitio

pH 5,34

Conductividad (µS cm-1) 57

Temperatura (°C) 7,96

OD (mg l-1) 12,1

A1 A2

6,01

94

3,89

13,2

A3

5,57

72

9,6

11,9

A4 B1

5,57 5,85

72 55

9,6 10,27

11,9 11,2

B2

6,5

75

8,9

10,8

B3

6,3

104

9,3

10,6

B4

5,2

48

1,75

13,1

B5

5,01

152

12,2

10,1

4.2.2. Parámetros fisicoquímicos in situ en el verano austral 2013. Los valores medios de las variables fisicoquímicas in situ registradas en el verano austral 2013 se muestran en la Tabla VII. El pH de los cuerpos de agua varió entre 3,45 en Dee1 y 7,22 en Barr2 y la conductividad estuvo entre 47 µS cm-1 en la Zona A a 754,66 µS cm-1 en Barr2. El oxígeno disuelto (OD) registró valores entre 5,07 mg l-1 en B2 y 9,87 mg l-1 en B R/C. La temperatura varió entre 2,68 °C en Dee 1 y 7,76 °C en B R/C. La concentración de los sólidos totales disueltos (TDS) estuvo entre 0,003 en A1 y 0,49 g l-1 en Barr2 y el Potencial de óxidoreducción (ORP) entre 157mV en B1 y 334 mV en Dee1. Las concentraciones de pH, conductividad, temperatura, TDS y ORP presentaron diferencias altamente significativas (P < 0,01) entre los 5 sitos y el OD mostró diferencias significativas (P < 0,05).

4.2.3. Iones mayoritarios presentes en las muestras de agua del 2012. Los cationes mayoritarios Na+1, K+1 y Ca+2 tuvieron diferencias altamente significativas entre los dos sitios muestreados (P < 0,01) y el Mg+2 (P < 0,05), así también los aniones SO4-2 y NO3-1 (P < 0,01). Las concentraciones de los iones se muestran en la Tabla VIII. El catión con mayor concentración fue el Na+1 en los sitios A2.

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Tabla VII. Valores promedios de los parámetros fisicoquímicos in situ tomados de en las muestras de agua de los sitios de estudio durante el verano austral 2013. Sitio A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 B1 B2 B3 B4 B R/C Amb1 Amb2 Amb3 Dee1 Dee2 Dee3 Barr1 Barr2 Barr3 Barr5

pH 5,19 ± 0,02 5,19 ± 0,02 5,19 ± 0,02 4,35 ± 0,06 5,73 ± 0,11 5,73 ± 0,11 5,73 ± 0,11 6,2 ± 0,18 4,78 ± 0,04 4,94 ± 0,04 5,25 ± 0,01 5,3 ± 0,12 5,48 ± 0,01 5,52 ± 0,1 5,71 ± 0,18 3,45 ± 0,02 3,71 ± 0,02 4,5 ± 0,04 6,1 ± 0,06 7,22 ± 0,16 6,52 ± 0,01 6,22 ± 0,005

Conductividad (µS cm-1) 47 47 47 176 ± 3,4 294,66 ± 3,51 294,66 ± 3,51 294,66 ± 3,51 185,3 ± 6,35 166,7 ± 3 168,7 ± 1,15 54 74 ± 0,608 212,3 ± 3,05 128 139 ± 2 223,7 ± 0,57 173 ± 0,57 193,7 ± 0,57 677,33 ± 6,8 754,6 ± 19,7 301,3 ± 5,13 267,3 ± 2,30

OD (mg l-1) 7,97 ± 0,25 7,97 ± 0,25 7,97 ± 0,25 7,57 ± 0,2 7,73 ± 0,28 7,73 ± 0,28 7,73 ± 0,28 5,5 ± 0,32 5,07 ± 0,21 5,4 ± 0,1 9,17 ± 0,15 9,87 ± 0,305 8 7,93 ± 0,11 8,17 ± 0,05 7,93 ± 0,05 7,97 ± 0,05 7,27 ± 0,057 8 ± 0,1 7,8 ± 0,17 8,07 ± 0,05 7,97 ± 0,05

Temperatura (°C) 7,59±0,07 7,59±0,07 7,59±0,07 3,34 ± 0,43 6,57 ± 0,17 6,57 ± 0,17 6,57 ± 0,17 4,57 ± 0,66 6,08 ± 0,66 5,46 ± 0,16 6,85 ± 0,03 7,76 ± 0,21 5,33 ± 0,02 5,09 ± 0,3 3,31 ± 0,11 2,68 ± 0,07 3,92 ± 0,02 6,75 ± 0,01 6,39 ± 0,03 6,08 ± 0,1 6,54 ± 0,07 5,94 ± 0,02

TDS (g l-1) 0,003 0,003 0,003 0,11 0,21± 0,04 0,21± 0,04 0,21± 0,04 0,12 0,11 0,11 0,04 ± 0,005 0,005 0,14 ± 0,005 0,08 0,09 0,15 ± 0,005 0,11 0,13 0,44 ± 0,02 0,49 ± 0,09 0,2 ± 0,005 0,17

ORP (mV) 308 ± 1 308 ± 1 308 ± 1 284 ± 5,56 202 ± 1,73 202 ± 1,73 202 ± 1,73 157 ± 3 239,67 ± 2,52 231,33 ± 2,52 306 ± 1 300 ± 1 242 247,67 ± 1,52 238 ± 1 334 ± 4 320,33 ± 1,52 278 ± 1 230 ± 1 170,66 ± 4,04 202 ± 1 220,33 ± 0,57

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y B3 (15,7 mg l-1) y el anión mayoritario fue el Cl -1 en el sitio B3 (19,45 mg l-1). El resto de iones estuvieron por debajo de 3 mg l-1.

Tabla VIIII. Iones mayoritarios (mg l-1) de las aguas colectadas en el 2012.

Sitio

Ca+2

Mg+2

Na+1

K+1

Cl-1

NO3-1

SO4-2

A1

0,268

0,551

9,043

0,389

10,276

0

1,307

A2

0,199

0,311

15,704

0,662

9,309

0,016

2,087

A3

1,027

0,787

9,571

0,361

10,037

0,016

1,441

B1

0,492

0,561

6,448

0,232

6,978

0,038

0,959

B2

0,86

1,175

9,368

0,329

10,858

0,125

1,357

B3

0,85

1,632

15,768

0,77

19,459

0,039

2,993

B4

1,062

0,511

4,54

0,144

6,762

0,018

0,589

B5

1,062

0,511

4,54

0,144

6,762

0,018

0,589

4.2.4. Iones mayoritarios y carbono orgánico total (COT) presentes en las muestras de agua del 2013. Los iones mayoritarios y el carbono orgánico total presentaron diferencias altamente significativas (P < 0,01) entre los sitios muestreados. Las concentraciones de cada uno de ellos se presentan en la Tabla IX. En todos los cuerpos de agua, el Cl-1 fue el anión más abundante, siendo los sitios A1, A2 y A3 con menor cantidad (9,63 mg l-1) y B1 con la mayor concentración (102,2 mg l-1). Así también el Na+1 fue otro de los cationes que estuvo presente en una cantidad considerable, Dee2 obtuvo la menor concentración (7,8 mg l-1) y Barr2 la más alta (48,4 mg l-1). Las muestras de aguas de isla Barrientos fueron las muestras más ricas en SO4-2 (9,25 – 13,5 mg l1 ) en relación al resto cuerpos de agua que tuvieron valores entre 1,26 a 7,4 mg l-1. Lo mismo sucedió para la concentración de NO3-1, en Barrientos, la cantidad de NO3-1 estuvo entre 2,23 a 5,1 mg l-1, aunque en Dee1 este ion tuvo una concentración de 3,87 mg l-1. En el resto de cuerpos de agua la cantidad de NO3-1 fue menor de 1 mg l-1. La concentración de los cationes Ca+2, Mg+2 y K+1 fue relativamente baja, Ca+2 (0,11 – 1,93 mg l-1), Mg+2 (4,28 – 0,09 mg l-1) y K+1 (4,05 – 0,36 mg l-1) en las aguas de isla Greenwich, Dee y Barrientos. Mientras que las concentraciones del COT varió entre 0,1 a 6,71 mg l-1, teniendo el valor más alto en las aguas de Barrientos.

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Tabla IX. Concentración de Iones mayoritarios y carbono orgánico total (mg l-1) presentes en el agua colectada durante el verano austral del 2013. Sitio

Ca+2

Mg+2

Na+1

K+1

Cl-1

NO3-1

SO4-2

COT

A1

0,11

0,29

8,55

0,66

9,63