Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010

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Práctica 2. Preparación de extensiones celulares Introducción Se entiende por extensión o frotis celular, a la formación de una fina película de células sobre un portaobjetos, de tal manera que las células no se superpongan entre sí. Se utilizan para la visualización de células en suspensión (p. ej., células sanguíneas), para lo cual tras la extensión de la muestra procederemos a su tinción; entendiendo por tal, la coloración diferencial de las distintas células presentes en la suspensión celular. Un diagnóstico válido no puede ser establecido más que sobre frotis perfectamente extendidos y teñidos. Las preparaciones de extensiones celulares se utilizan fundamentalmente para el estudio morfológico de las células y la obtención de fórmulas de recuento celular. Fundamento El uso de suspensiones celulares de sangre entera permite observar de forma rápida, fácil, económica y nítida diferentes tipos celulares con características morfológicas peculiares y con una notable heterogeneidad nuclear y citoplásmica. Estos tipos celulares se ponen fácilmente de manifiesto con técnicas histológicas de microscopía óptica, que por su metodología y sistemática suponen un entrenamiento ideal para el estudio de suspensiones celulares de cualquier tipo; ya que raramente se trabaja con suspensiones celulares con una diversidad celular tan elevada. Para teñir las extensiones de sangre se emplean compuestos derivados de anilina, por los que tienen una gran afinidad los distintos orgánulos de las células sanguíneas. Según la naturaleza química de estos colorantes, distinguimos tres tipos: ácidos, básicos y neutros. Los colorantes ácidos tiñen estructuras celulares básicas, tales como la hemoglobina, los gránulos de los eosinófilos, etc.; los elementos celulares que se tiñen se denominan acidófilos o eosinófilos (un colorante ácido típico es la eosina). Los colorantes básicos por el contrario, tiñen estructuras celulares ácidas, tales como el ADN nuclear y el ARN; denominándose las estructuras así teñidas basófilas (entre los más utilizados está el azul de metileno). Finalmente, los colorantes neutros son los más utilizados en hematología, están formados por la combinación de un colorante ácido y otro básico y su afinidad tintorial es el resultado de la combinación de los anteriores. La sangre es un tejido que posee diversas células suspendidas en un medio fluido denominado plasma. Las células sanguíneas son fundamentalmente de tres tipos: Células rojas, eritrocitos o hematíes,

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células blancas o leucocitos y plaquetas o trombocitos. Que con microscopía óptica muestran la siguiente apariencia:

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Eritrocitos: Esta célula anucleada (en la mayoría de mamíferos) se tiñen de color rosado debido a su alto contenido en hemoglobina. La zona central pálida, escasamente teñida, es el resultado de su forma de disco bicóncavo, poco frecuente. Es el componente celular mayoritario de la sangre, 4-6 millones/ml.

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Neutrófilos: Son el tipo de leucocito más frecuente en sangre. El detalle más característico es su núcleo multilobulado. En los neutrófilos maduros existen generalmente 5 lóbulos conectados por finas bandas de materia nuclear, pero en los neutrófilos inmaduros el núcleo generalmente es poco lobulado. En los neutrófilos de las hembras, el cromosoma X inactivo o cuerpo de Barr aparece formando un pequeño apéndice en forma de palillo de tambor, condensado, en uno de los lóbulos del núcleo. Se ve en el 3% de los neutrófilos de las hembras. El citoplasma de los neutrófilos está ligeramente punteado con gránulos de color púrpura que se denominan gránulos azurófilos, que se corresponden con lisosomas primarios grandes.

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Eosinófilos: Son menos frecuentes que los neutrófilos. Los eosinófilos poseen, como dato morfológico característico, un núcleo bilobulado y un citoplasma repleto de granos grandes, eosinófilos (de color rosado oscuro) y de tamaño uniforme.

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Monocitos: Son los elementos mayores de todas las células de la serie blanca. Se caracterizan porque poseen un gran núcleo, situado excéntricamente, que se tiñe menos intensamente que los otros leucocitos. El núcleo generalmente es dentado haciéndose más dentado a medida que la célula madura y adopta finalmente una morfología de herradura o aspecto bilobulado. El amplio citoplasma está ocupado por pequeños lisosomas que con microscopía óptica, le dan el típico aspecto de “vidrio mate”.

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Basófilos: Son los leucocitos menos frecuentes. En general el núcleo bilobulado está eclipsado por numerosos gránulos grandes, intensamente basófilos (azul oscuro).

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Linfocitos: Son las células más pequeñas de la serie blanca, presentando un tamaño ligeramente mayor que los hematíes. Se caracterizan porque tienen un núcleo redondeado, muy teñido, y un pequeño anillo de citoplasma agranular, ligeramente basófilo. La cantidad de citoplasma varía según el estado de actividad de la célula; así, se observan linfocitos pequeños, medianos y grandes.

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Plaquetas: Son pequeñas células anucleadas (en el hombre), que se forman en la médula ósea a partir de los megacariocitos, su número varía de 150.000-400.000/ml. Son discos biconvexos redondos u ovales. En los frotis sanguíneos suelen aparecer agrupadas y el citoplasma teñido de púrpura, tiene aspecto granular debido a la gran cantidad de orgánulos que se disponen en el centro de la célula, el citoplasma periférico se tiñe muy poco y por eso es apenas visible.

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Material

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Microscopio.

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Suspensión celular de sangre entera con anticoagulante.

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Portaobjetos.

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Extensor o portaobjetos esmerilado.

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Cubreobjetos.

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Cubetas de tinción.

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Capilares.

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Metanol.

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Colorante de tinción.

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Medio de montaje.

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Papel de filtro.

Procedimiento Se distinguen tres etapas: A. Preparación de los portaobjetos Antes de su empleo, los portaobjetos deben ser tratados para eliminar posibles impurezas de su proceso de fabricación y manipulación (desengrasado) aplicando el siguiente tratamiento: 1. Lavar con agua y detergente. 2. Una vez aclarado con agua corriente, se depositará en un recipiente que contenga una de las tres soluciones: -

Mezcla sulfocrómica.

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Etanol.

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Etanol-eter (1:1).

3. Se mantienen 10-15 minutos, tras lo cual, si hemos usado mezcla sulfocrómica los aclararemos con agua destilada, mientras que con las otras simplemente dejaremos evaporar el disolvente. 4. Finalmente, los secaremos con papel de filtro o en estufa.

B. Confección de las extensiones 1. Colocamos los portaobjetos sobre una superficie plana y con ayuda de un capilar depositamos una gota de suspensión celular en un extremo (aproximadamente a 0,5 cm).

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2. Con los dedos pulgar e índice de la mano izquierda, se sostiene los dos ángulos de la parte izquierda del portaobjetos. Con la mano derecha, se coge el portaobjetos esmerilado, colocamos el pulgar en uno de los bordes y el índice sobre el otro. Situar este último portaobjetos esmerilado delante de la gota de sangre, de forma que ambos portaobjetos formen un ángulo de 45º aproximadamente. El grosor de la preparación depende del ángulo (a menor ángulo menor espesor, y viceversa). El portaobjetos esmerilado nunca debe pasar por encima de la muestra al hacer la extensión. Figura 2.1. Esquema de la realización de un frotis sanguíneo por el método de los dos portaobjetos. La flecha indica la dirección en la que debe deslizarse el portaobjetos esmerilado.

Punto de colocación de la muestra .

3. Se hace retroceder el portaobjetos esmerilado en dirección a la gota de la suspensión celular. Tan pronto como ambos entren en contacto, la sangre comenzará a extenderse sobre el borde del portaobjetos esmerilado. 4. Cuando la sangre, por capilaridad, llega hasta aproximadamente 2 mm de los bordes del portaobjetos esmerilado, efectuar un movimiento suave y rápido de éste sobre toda la longitud del portaobjetos horizontal. 5. Dejar el frotis secar a temperatura ambiente y en posición horizontal durante un mínimo de 10 minutos. 6. Fijar las extensiones introduciendo el portaobjetos en alcohol metílico durante 5 minutos y dejar secar a temperatura ambiente. 7. Teñir durante 30 minutos con una solución de Giemsa al 10% en agua destilada (preservar de la luz). 8. Lavar las extensiones celulares con abundante agua destilada. 9. Dejar secar a temperatura ambiente y montar con medio de montaje.

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C. Examen de la extensión celular Como es lógico el examen microscópico variará dependiendo de la muestra procesada. Seguidamente, describiremos el examen de una extensión sanguínea, por ser un tipo de muestra que con frecuencia se tiene que realizar y de gran aplicación en diferentes áreas científicas. Además, sirve de referencia para el estudio microscópico de otros tipos de suspensiones celulares; por estar normalizada su realización y examen microscópico. 1. En primer lugar examinaremos la preparación mediante el objetivo de 4x ó 10x. Las células deben estar homogéneamente distribuidas en el frotis, de lo contrario lo desecharemos. 2. Seguidamente pasamos a examinar la muestra a 40x. Realizaremos un recorrido por la preparación tal y como se indica en la figura 2.2 dentro de las zonas ideales de la extensión; identificando correctamente los distintos tipos celulares que aparecen en la preparación, con ayuda de la descripción morfológica (ver introducción). Estudiando con detalle su morfología. Figura 2.2. Esquema de un frotis sanguíneo de las diferentes áreas que lo componen y la distribución celular de las mismas. La líneas punteada indica la dirección a seguir en el recuento diferencial de leucocitos (n=100).

Origen Zona de linfocitos

Sentido de la extensión

Zona de neutrófilos y monocitos

Zona ideal de recuento

3. Una vez identificados los distintos tipos celulares proceder a realizar la fórmula leucocitaria de la muestra. Esta fórmula consiste en un recuento diferencial de los leucocitos o células de la serie blanca de la sangre. Para ello realizar un recuento de 100 leucocitos, moviéndonos por la preparación, buscar en la región ideal del frotis (tal y como se indica en la figura 2.2), identificar cada uno de los tipos y anotar su número. Para poder determinar el porcentaje de cada tipo de leucocito en el total de la muestra. Indicando su porcentaje en la tabla 2.1.

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Suponiendo que la población total de leucocitos de la muestra analizada es de 9.170 leucocitos/ml. ¿Cuántas células/ml de cada unos de los tipos de leucocitos hay en la muestra?. Indicar los resultados en la tabla 2.1. 4. Responder a las siguientes preguntas: a. ¿Qué función tiene el baño previo de metanol a la tinción con Giemsa en las extensiones de sangre? b. ¿Las estructuras basófilas son de naturaleza ácida o básica? c.

¿Qué función tiene el mantener los portaobjetos en un baño de etanol-éter antes de usarlos para realizar extensiones celulares?

d. ¿Qué es el cuerpo o corpúsculo de Barr? e. ¿A que orgánulo corresponde la ligera granulación púrpura citoplásmica de los neutrófilos? f.

Ordena de menor a mayor espesor los siguientes frotis según el ángulo de inclinación aplicado al portaobjetos esmerilado con el que se hizo la extensión: a) 45º; b) 30º; c) 55º; d) 35º; e) 60º.

g. En la raza humana en estado de salud normal los eritrocitos son anucleados. ¿Existen especies con eritrocitos nucleados, en caso afirmativo enunciarlas?. ¿Si existen, que significados funcional y/o evolutivo puede tener la presencia de núcleo en los eritrocitos?

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Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 Tabla 2.1. Esquema de los distintos tipos celulares característicos de sangre humana.

Tipos celulares

Tamaño (µ m)

Plaquetas 2-3

Monocitos 14-17

Linfocitos 7-8

Basófilos 9-10

Eosinófilos 10-12

Neutrófilos 10-12

Eritrocitos 6-8

Recuento leucocitario

Células/ml