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Prácticas de Biología Celular Profesores: Apoyo docente: Nombre alumno:
Grupo:
Índice
Contenido Práctica 1
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Búsqueda bibliográfica Objetivos
3
Material
3
Introducción
4
Apuntes del alumno
6
Actividades
7
Práctica 2
8
Fundamentos y manejos del microscopio óptico Objetivos
8
Material
8
Introducción
9
Apuntes del alumno
16
Actividades
17
Práctica 3
24
ImageJ Objetivos
24
Materiales
24
Introducción
24
Apuntes del alumno
29
Actividades
30
Práctica 4
31
Técnicas histológicas básicas: Estudio de extensiones celulares sanguíneas Objetivos
31
Materiales
31
Introducción
32
Apuntes del alumno
35
Actividades
36
Práctica 5
44
Estructura de los epitelios Objetivos
44
Materiales
44
Introducción
45
Apuntes del alumno
54
Actividades
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2º Curso Grado de Biotecnología •
Universidad Miguel Hernández
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Curso 2011-2012
Índice
Práctica 6
61
Tejidos de función trófica y mecánica Objetivos
61
Materiales
61
Introducción
62
Apuntes del alumno
63
Actividades
64
Práctica 7
67
Tejido nervioso Objetivos
67
Materiales
67
Introducción
68
Apuntes del alumno
73
Actividades
74
Práctica 8
76
División y ciclo celular. Mitosis y Meiosis Objetivos
76
Materiales
76
Introducción
77
Apuntes del alumno
87
Actividades
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2º Curso Grado de Biotecnología •
Universidad Miguel Hernández
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Curso 2011-2012
Práctica 1 BUSQUEDA BIBLIOGRÁFICA
Objetivos El alumno deberá manejar diestramente la búsqueda de información científica por internet, recurriendo a los principales buscadores o revistas de mayor relevancia. Materiales •
Ordenador
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Acceso a Internet
Introducción Actualmente, internet es la mayor herramienta de trabajo jamás utilizada. Una vez dentro podemos acceder a todo tipo de información y servirnos de esta en nuestro día a día. Las búsquedas bibliográficas son el pilar fundamental de cualquier trabajo científico, y para éstas se utilizan diversos buscadores de artículos y libros publicados, en formato online y escrito. Una vez dentro de los buscadores solo una parte del material encontrado estará realmente a nuestro alcance de forma gratuita. En la mayoría de los casos, para acceder al artículo o libro completo habrá pagar la cuota correspondiente. Es por ésto que se recomienda siempre acceder a dichos buscadores a través de las páginas de las universidades o del Ministerio de Ciencia ya que, son estos, quienes llegan a convenios económicos con los mismos y nos permitirán acceder a dicha información. En nuestro caso concreto para acceder a información codificada fuera de la red de la Universidad, deberemos conectarnos a la red virtual de la misma vpn.umh.es y disfrutar así de los privilegios de la misma. Algunos de los sitios web más conocidos, donde se puede acceder a libros de forma gratuita son: • La biblioteca Cervantes Virtual (www.cervantesvirtual.com) •
Librodot (www.librodot.com)
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ebookNet (www.ebooknet.com) 2º Curso Grado de Biotecnología
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Universidad Miguel Hernández
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Curso 2011-2012
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The On-Line Books Page (digital.library.upenn.edu/books)
Los principales buscadores de artículos científicos son los siguientes: •
PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)
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SCOPUS (http://www.scopus.com/home.url)
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WOK (http://www.accesowok.fecyt.es/)
Existen muchas más herramientas de búsqueda, algunas de las cuales aparecen en la siguiente página, perteneciente a la UMH: http://blogs.umh.es/biblioteca/biblioteca_digital/#Revistas-e Los buscadores de artículos de divulgación científica son en inglés, por lo que deberás utilizar dicha lengua en la búsqueda. Para acotar la información encontrada se utilizan los operadores, que permiten enfocar la búsqueda vinculando términos de búsqueda y definiendo la relación entre ellos. Existen varios tipos de operadores:
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Operadores de posición
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Operadores booleanos
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Operadores relacionales
Operadores de posición Los operadores de posición (SAME, WITH, NEAR, ADJ) localizan ideas en las que los términos están en proximidad. Se pueden utilizar para conectar palabras o frases dentro de un campo de búsqueda pero no entre campos de búsqueda.
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SAME: para localizar registros que se encuentran dentro del mismo campo, aunque no necesariamente en la misma frase. Por ejemplo, si se busca por "prion SAME adenine", sólo aparecerán aquellos artículos que contengan tanto "prion" como "adenine" dentro del mismo campo.
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WITH: para localizar artículos en los que aparecen los conceptos descritos dentro de una misma frase. Por ejemplo, si se busca por "retina WITH optic nerve", sólo se recuperarán aquellos artículos que contengan tanto "retina" como "optic nerve" dentro de la misma frase.
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NEAR: para localizar registros en los que un campo contiene todos los términos de búsqueda juntos; sin embargo, el orden de los términos no tiene que coincidir con el orden en que se hayan introducido. Por ejemplo, buscar "rat” NEAR “amacrine cells", en este caso sólo se recuperarán aquellos registros que contengan "rat" y "amacrine cells" juntos en el mismo campo.
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ADJ: para localizar registros en los que un campo contiene todos los términos de búsqueda juntos y en el orden en que se hayan introducido. Por ejemplo, si se busca por "fotorreceptors ADJ rabbit", sólo se recuperarán aquellos registros que contengan "fotorreceptors" e "rabbit" juntos en el mismo campo y con "fotorreceptors" en primera posición.
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Curso 2011-2012
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Además se pueden añadir varios operadores de posición NEAR y ADJ para limitar o ampliar la proximidad entre palabras.
Operadores booleanos Los operadores booleanos (AND, NOT, OR, XOR) localizan registros que contienen los términos coincidentes en uno de los campos especificados o en todos los campos especificados. •
AND para localizar registros que contengan todos los términos de búsqueda especificados. Por ejemplo, si se busca por "perros AND gatos", la bibliotecae localiza registros que contengan todos los términos especificados.
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OR para localizar registros que contengan cualquiera o todos los términos especificados. Por ejemplo, si se busca por "perros OR gatos", la biblioteca-e localiza registros que contengan el primer término o el segundo.
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NOT para localizar registros que contengan el primer término de búsqueda pero no el segundo. Por ejemplo, si se busca por "perros NOT gatos", la biblioteca-e localiza registros que contienen el primer término pero no el segundo.
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XOR (o exclusivo) para localizar registros que contengan cualquiera de los términos especificados pero no todos los términos especificados. Por ejemplo, si se busca por "perros XOR gatos", la biblioteca-e localiza registros que contienen cualquiera de los términos especificados pero no todos los términos especificados.
Operadores relacionales
Los operadores relacionales (, =, , =) permiten buscar expresiones numéricas. Utilizar los operadores relacionales encerrando un campo entre llaves { } y tecleando un operador relacional y un número.
Operador
Definición
<
menor que
>
mayor que
=
igual a
diferente de
=
mayor que o igual a
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Curso 2011-2012
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Apuntes del alumno
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Actividades Realiza una búsqueda sobre la enfermedad de Fibrosis quística, en que constite, tratamientos y último avances.
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Curso 2011-2012
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Práctica 2 FUNDAMENTOS Y MANEJO DEL MICROSCOPIO.
Objetivos El alumno deberá conocer los siguientes conceptos y habilidades: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Resolución, iluminación y magnificación. Formación de la imagen microscópica. Principio de Köehler. Componentes del microscopio. Manejo del condensador. Desplazamiento de la muestra. Enfoque. Uso del diafragma.
Material
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Microscopio de luz de campo claro
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Portaobjetos
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Retícula ocular
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Calculadora
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Muestras de cerebro
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Curso 2011-2012
Introducción Desde su invención, el microscopio ha sido una herramienta útil en el desarrollo científico. Aunque las lentes de aumento han sido conocidas a lo largo de la historia, no fue hasta la llegada del moderno microscopio compuesto (s. XVII-XVIII) cuando este instrumento comenzó a ser aplicado al estudio biológico. Si para la mayoría de biólogos, el microscopio es una herramienta de trabajo importante, para los biólogos celulares es indispensable. El microscopio compuesto está formado por dos elementos; un sistema primario de lentes de aumento y un segundo sistema de lentes, similar a un telescopio. La luz es forzada a pasar a través de la muestra y es enfocada con los sistemas de lentes primarias y secundarias. Si reemplazamos la fuente de luz por una fuente de electrones, el microscopio se convierte en un microscopio electrónico de transmisión. Si la luz es proyectada sobre la muestra y los sistemas de lentes captan la luz rebotada por la muestra el microscopio se convierte en un microscopio quirúrgico. Si son electrones los que son proyectados sobre la muestra, barriendo su superficie hablamos de un microscopio electrónico de barrido. La función de un microscopio es mejorar la resolución del ojo humano. El microscopio se usa para ampliar una imagen de un objeto de forma que podamos observar detalles que serían imposibles de observar a simple vista por el ojo humano. A causa de esta ampliación, la resolución se confunde a menudo con la magnificación o aumento que se refiere al tamaño de la imagen. En general, a mayor magnificación mayor resolución; aunque esto no siempre es cierto. Hay limitaciones de carácter práctico en el diseño de las lentes que pueden resultar en un incremento de la magnificación sin incrementar la resolución. El Aumento total (M): Es el producto de los aumentos del objetivo por los aumentos del ocular y los aumentos intermedios (por defecto 1). Puede obtenerse un rango de aumentos variable. Se calcula como: M = Mobjetivo x Mocular (x Mi)
Considerando la figura 1.1, si una imagen de una célula es aumentada desde 10x a 45x, la imagen es más grande; pero no necesariamente más nítida. La imagen de la izquierda está aumentada sin mejorar la resolución, mientras que la imagen de la derecha tiene los mismos aumentos, pero la resolución ha mejorado. Cuando la imagen es aumentada 10 veces (desde 10x a 100x) es imposible usar la imagen de la izquierda; sin embargo, la imagen de la derecha nos da una información más detallada. Sin resolución la cantidad de detalles observables es fija y, a pesar de incrementar el tamaño de la imagen, no se observan más detalles. En este punto se alcanza el límite de resolución o poder de resolución de las lentes objetivo (u objetivo). Esta propiedad de los objetivos viene fijada por su diseño y construcción. Para cambiar la resolución, la única solución a menudo es usar objetivos diferentes. La razón de la dicotomía entre magnificación y poder de resolución es la capacidad del ojo humano para diferenciar entre dos objetos próximos. Es necesario que dos objetos estén separados 0,1 mm, aproximadamente, cuando los mantenemos a 25 cm de los ojos para poder detectarlos como objetos diferentes. Si están a menos de 0,1 mm los percibimos 2º Curso Grado de Biotecnología
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como un único objeto. Si los dos objetos están separados 0,01 mm no podremos discriminarlos como dos objetos; a menos que aumentemos su imagen por 10x, con lo que hemos alterado eficazmente nuestra capacidad de resolución desde 0,1 mm a 0,01 mm o, inversamente, nuestro poder de resolución a aumentado en un factor de 10.
Figura 1.1. Magnificación frente a resolución.
Sólo magnificación
Magnificación y resolución
Así pues, una lente puede aumentar una imagen sin incrementar la resolución. Varios artefactos pueden ser inherentes al diseño de las lentes, provocando que el objeto aparezca con los límites desdibujados. Por lo que, incluso si aparecen separados 0,1 mm, los límites están tan desdibujados que perdemos la capacidad de diferenciar ambos objetos. Al igual que nos sucede al observar los optotipos oftalmológicos; podemos intuir las letras al incrementar el tamaño pero somos incapaces de identificarlas correctamente. Generalmente, se habla de la idoneidad de los objetivos microscópicos en términos de su magnificación o aumentos; mientras que el valor más importante es su resolución. Todos los microscopios poseen un objetivo que puede aumentar por 40x el tamaño normal de una muestra; pero sólo un objetivo de buena calidad permite observar correctamente una muestra. Como se ha mencionado el valor de la resolución puede ser determinado de dos formas:
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1. La distancia más pequeña entre dos puntos, que permite observarlos como distintos. Con esta medida, conforme disminuye la distancia aumenta la resolución. Siendo λ longitud de onda de la luz incidente (400 nm para la luz azul). Límite de resolución = (0,61·λ λ)/AN 2.
El poder de resolución es inversamente proporcional al límite de resolución. Así, la resolución aumenta conforme aumenta la distancia. Hoy en día en la mayoría de los microscopios usan la resolución para indicar la calidad de sus objetivos. Poder de resolución = AN/(0,61·λ λ)
El poder de resolución de los objetivos es una característica de sus propiedades físicas y de la longitud de onda de la luz que pasa a través de sus lentes. Las propiedades físicas se resumen en un valor conocido como apertura numérica (AN), mientras que la longitud de onda es determinada por el color de la luz utilizada. Apertura numérica (AN) = n·sen θ
Figura 1.2. Apertura numérica e índice de refracción.
Objetivo
θ n = 1.515
n = 1 (Aire) Cubreobjetos Muestra Portaobjetos
Con aceite de inmersión
Sistema seco
La apertura numérica de una lente depende de dos parámetros. Del ángulo de incidencia de la luz en la lente y del índice de refracción del material óptico de fabricación de la lente. La mitad del ángulo del cono de luz incidente se designa por el símbolo θ. La mitad del ángulo de incidencia de la luz se usa para calcular el ángulo de luz subtendida relativa al eje óptico del microscopio. El ángulo de incidencia de la luz y, por tanto, θ pueden ser modificado por el condensador situado debajo de la platina. Si el condensador es móvil, el ángulo de incidencia puede variarse; así, conforme el condensador está más cerca del objeto
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más grande es el ángulo de incidencia de la luz. Traduciéndose en una mejora de la resolución del microscopio. Figura 1.3. Apertura numérica y ángulo de incidencia de la luz.
Las propiedades refractivas de un objetivo se resumen en un valor conocido como índice de refracción (IR ó n). El índice de refracción está en función de la distorsión de la luz al pasar del aire a la lente y viceversa. En un microscopio, el material de fabricación de la lente está especialmente formulado para incrementar su índice de refracción; sin embargo, una vez fabricado esta propiedad no puede ser cambiada. Aunque el medio alrededor del objetivo (lentes objetivo) si puede ser modificado; sustituyendo el aire entre el objetivo y el portaobjetos por aceite de inmersión, con índice de refracción superior al del aire.
Considerando lo anterior, en la práctica la máxima resolución se puede aumentar optimizado de tres formas: a) El método más fácil es aumentar el ángulo de la luz incidente, alterando la posición y/o diseño del condensador, situado debajo de la platina. b) El índice de refracción puede ser mejorado mediante el uso de lentes especialmente fabricadas y/o mediante el control del medio a través del cual pasa la luz, usando aceite de inmersión en objetivos diseñados para este propósito. c) Disminuir la longitud de onda de la luz usada. Por razones prácticas, la modificación de la longitud de onda tiene mayor efecto sobre la resolución del microscopio que cambios en el ángulo de incidencia de la luz (θ) o el índice de refracción (n). En microscopía óptica de campo claro es conveniente trabajar en el rango de luz visible y la longitud de onda más corta del espectro de luz visible es el azul. Por lo que, los microscopios incorporan un filtro azul en su diseño; que se conoce como filtro de luz día, generalmente.
Aberraciones Las distorsiones o aberraciones cromáticas y esféricas son inherentes al diseño de las lentes; debido a que las lentes son esféricas y proyectan una imagen esférica. Sin embargo, la teoría óptica se basa en imágenes planas. Además, las diferentes longitudes de onda de luz 12
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son refractadas distintamente; la imagen esférica se distorsiona incluso en múltiples imágenes, debido a que cada longitud de onda forma una imagen separada. Una lente que está corregida para producir campos planos en vez de curvos se conoce como lente “plan”, mientras que una lente corregida para campo plano y aberración cromática se denomina lente “plan achromat”. Si la lente está corregida para aberraciones cromáticas para el rojo y azul, mientras que la corrección esférica es sólo para el verde, es una lente “achromat”.
Angulo de incidencia Aunque el ángulo θ puede ser alterado, hay un límite teórico a este ángulo que permite a la luz pasar a la lente. Para cada objetivo hay una posición idónea del condensador en la que se presenta la luz al objetivo con un ángulo apropiado, permitiendo un máximo de intensidad de luz, mientras mantiene θ tan grande como sea posible. En los microscopios buenos se puede ver el diafragma del condensador en el campo de luz y permiten un ajuste preciso (vertical y horizontal) del condensador a su posición ideal. El diafragma de iris se usa para corregir las aberraciones esféricas de las lentes y debe ser ajustado para cada objetivo. No deben ser usados para controlar la intensidad de luz a menos que la resolución no sea importante para el observador.
Alineación Un uso correcto de un microscopio requiere que la óptica y la fuente de luz estén correctamente alineadas en el eje óptico. Todas las correcciones de aberraciones dependen de una adecuada alineación del microscopio. Generalmente, se usan dos técnicas para alinear el microscopio: a) La primera, y quizás la principal, se conoce como iluminación crítica. En este proceso una imagen de la fuente de luz (filamento de la lámpara) es proyectada en el plano del objeto, superponiéndose la imagen de la fuente de luz en el objeto. Sin embargo, tiene la desventaja de que exige el uso de una fuente de luz uniforme plana; lo que realmente no es posible con el filamento de una lámpara de tungsteno. b) El segundo procedimiento de alineación es conocido como iluminación Koehler y es el más común. En este procedimiento, una imagen del diafragma de campo se proyecta en el plano del objeto. Este procedimiento requiere un condensador de campo equipado con un diafragma de iris móvil (o centrable). Figura 1.4. Iluminación Koehler. Fuente: http://www.olympusmicro.com 2º Curso Grado de Biotecnología
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Partes y manejo del microscopio óptico
Sistema óptico •
Ocular: sistema de lentes convergentes situado en la parte superior del tubo.
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Objetivos: son tubos que albergan sistemas de lentes convergentes que proporcionan aumentos hasta 100x. Los objetivos están montados sobre una pieza base, llamada revólver, que permite intercambiarlos sobre la preparación. Cada objetivo lleva impresas sus características ópticas (aumentos, apertura numérica, etc.).
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Condensador: es un sistema de lentes convergentes situado inmediatamente por debajo de la platina (en el caso del microscopio óptico, es fijo y se desplaza junto con la platina). Su función es concentrar los rayos luminosos sobre la preparación.
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Diafragma: palanca montada en la misma pieza del condensador, que regula la entrada de luz a éste y a la preparación. Al igual que en las cámaras fotográficas, un diafragma abierto proporciona más luz pero menor profundidad de campo (nitidez del enfoque a diferentes niveles horizontales de la preparación).
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Fuente luminosa: es una lámpara de tungsteno, montada en el interior del pie.
Sistema mecánico
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Pie de soporte o estativo: alberga la fuente de iluminación.
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Brazo: continuación del pie donde están insertadas el resto de piezas.
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Tubo: cilindro hueco por donde circulan los rayos luminosos. En la parte inferior tiene un revólver con los sistemas de lentes, llamados objetivos, y en la superior porta la lente llamada ocular.
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Platina: superficie horizontal para colocar la preparación microscópica. Ésta se sujeta mediante una pinza, y puede moverse sobre la platina mediante un carro accionado por tornillos, en un plano inferior. Cualquier punto de la preparación puede ser fijado por el observador, tomando sus coordenadas con los nonios que porta el carro. La platina puede desplazarse en sentido vertical gracias a dos pares de tornillos situados a derecha e izquierda sobre el brazo. Mediante el desplazamiento de la platina se consigue el enfoque de la preparación.
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Tornillos o mandos de enfoque: Macrométrico que permite movimientos rápidos para aproximar el enfoque y micrométrico que permite movimientos finos que consiguen el enfoque correcto.
Manejo del microscopio óptico 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x. 4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo (4x) a la preparación empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y cuando se observe algo nítido en la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. 6. Para quitar la preparación del microscopio: Cambiar en primer lugar al objetivo de menor aumento (4X), seguidamente bajar la platina con el tornillo macrométrico y finalmente sacar la preparación de la pinza de la platina. 7. Una vez finalizado el uso del microscopio es obligatorio 1. 2. 3. 4. 5.
Poner el objetivo de menor aumento 4X. Bajar completamente la platina a la posición más baja. Apagar el interruptor de la iluminación. Desenchufar de la corriente. Tapar con su funda protectora. 2º Curso Grado de Biotecnología
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Apuntes del alumno
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Curso 2011-2012
Actividades
I. Identificar los componentes mecánicos del microscopio: estativo, platina y mandos de movimiento de la misma, tornillos o mandos de enfoque, interruptor de luz y potenciómetro. II. Identificar los componentes ópticos del microscopio: oculares, objetivos, condensador, diafragma del condensador y fuente de luz. (1) Estativo o base del microscopio (2) Control de la intensidad de luz (3) Condensador (4) Diafragma del condensador (5) Tornillo de centrado del condensador (6) Oculares (7) Diafragma de campo (8) Lente de campo (9) (10) Micrométrico (11) Distancia interpupilar (12) Objetivos (13) Encendido de la lámpara (14) Revolver (15) Pinza para sujeción de muestra (16) Platina (17) platina en eje Y (18) Mando movimiento platina en eje
III. Comprobar la magnificación y la apertura numérica de los objetivos que están en el revólver del microscopio y la magnificación de las lentes oculares. Estos valores están impresos en cada uno de los objetivos y de los oculares.
Figura 1.5. Características de los objetivos. http://www.medic.ula.ve
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Curso 2011-2012 2011
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En la tabla anotar los valores de magnificación para cada objetivo y ocular y la AN para cada objetivo y el condensador. Calcular la magnificación total y el límite de resolución para cada objetivo y el límite de resolución máximo del microscopio usando aceite de inmersión (AN = 1,5) y sin usarlo (AN = 1). Asumir que la luz que atraviesa la muestra tiene una longitud de onda de 400 nm.
Magnificación
Apertura Numérica Aumento Total Límite de Resolución Aceite Aire Aceite Aire Aceite Aire
Magnificación de los oculares Apertura numérica del condensador Indica el objetivo de mayor AN Límite de resolución máximo del microscopio (0,61xλ λ)/AN (µ µm) (µm)
IV. Utilizar una preparación para aprender la sistemática de uso del microscopio.
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Comprobar que el revólver se encuentra situado en el objetivo de menor aumento.
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Comprobar la posición del condensador.
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Introducir y fijar el portaobjetos en la platina.
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Encender la luz.
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Colocar la zona del portaobjetos en la que está el objeto a estudiar debajo del objetivo.
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Enfocar.
•
Utilizar, secuencialmente, los objetivos de menor a mayor aumento, enfocando con cada uno de ellos.
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Comprobar las diferencias de campo y de tamaño que se observan en la muestra con los distintos objetivos.
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Colocar el objetivo de menor aumento antes de quitar la muestra de la platina.
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Curso 2011-2012
V. Empleo de retículas oculares y portaobjetos calibrados en microscopía. Conteo celular. Para realizar medidas directas sobre muestras microscópicas usando el microscopio se emplea una retícula ocular, que sirve como regla. Es simplemente un disco de cristal sobre el que se han grabado divisiones espaciales iguales. Para usar la retícula del ocular tiene que ser calibrada frente a una regla de dimensiones conocidas, micrómetro o portaobjetos calibrado. Los más comunes son de 2 mm de largo con subdivisiones cada 0,01 mm (10µm). La retícula ha de ser calibrada independientemente para cada objetivo. "b"
"a"
"c"
Figura 1.6 •
Colocar un portaobjetos calibrado en la platina del microscopio, y usando la magnificación más baja (4x), enfocar la regla calibrada del portaobjetos.
•
Rotar el ocular con la retícula hasta alinearla con la escala del micrómetro, desplazar la platina hasta superponer las líneas de la retícula del ocular sobre las del portaobjetos calibrado. Con las líneas coincidiendo en un extremo de los campos, contar los espacios de la retícula hasta un punto en el que las líneas de la retícula y del portaobjetos calibrado coincidan otra vez.
•
Cada división de la escala del portaobjetos calibrado mide 10 µm y cada división de la retícula del ocular es equivalentes a una división del portaobjetos calibrado. Por lo tanto, se puede calcular el número de µm de cada espacio de la escala del ocular.
•
Repetir para cada uno de los objetivos la misma operación y anotar los resultados en la siguiente tabla : Microscopio
Longitud (µ µm)
Valor de cada unidad de la retícula ocular a 4x Valor de cada unidad de la retícula ocular a 10x Valor de cada unidad de la retícula ocular a 40x
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Usando el portaobjetos calibrado, determinar la longitud más pequeña que se puede resolver con cada objetivo. Esta medida es el límite de resolución para cada objetivo usando la retícula. Anotar los resultados en la tabla siguiente. Comparar estos valores con el correspondiente límite de resolución teórico del microscopio para cada objetivo, calculado en la tabla anterior. Aumentos Límite de resolución teórico Límite de resolución práctico (µ µm) (µ µm) 4x 10x 40x
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Realizar a continuación la calibración completa de la retícula, midiendo las zonas acotadas que se indican en el esquema de la retícula de la figura 1.6 y calcula los parámetros que se piden en la siguiente tabla: 4x
10x
40x
Longitud de “a” (mm) Longitud de “b” (mm) Longitud de “c” (mm) Superficie de la cuadrícula pequeña (mm2) Superficie de la cuadrícula mediana (mm2) Superficie de la cuadrícula grande (mm2)
•
La región útil de la retícula es su cuadrante central compuesto a su vez por subdivisiones menores de 2x2 y de 8x8 cuadrantes (cuadrantes medianos y menores, respectivamente). La región a analizar de la preparación debe estar dentro de los límites de esta área. Es muy importante calcular el número de cuadrantes en los que debe realizarse el recuento celular para poder referir el número de células a una superficie de 1mm2.
•
Estudiar la preparación suministrada y localizar las zonas indicadas en el esquema de la figura 1.7. Se pretende conocer la densidad celular media en esas regiones. Para ello hay que calcular el número de células/mm2. Es necesario repetir, al menos, 5 veces el recuento celular dentro del área de la zona a muestrear, para obtener una medida estadísticamente significativa.
Figura 1.8. Recuento celular. Sólo las células que están dentro del cuadrado y las que tocan los lados superior e izquierdo del cuadrante se contabilizan (círculos blancos).
Área Células/mm2 (± ±σ) Células/mm2 (± ±σ) (Individual)
(Grupo)
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Figura 1.7. Secciones de cerebro. A) Sección coronal. B) Sección sagital. 1
A) 3
2
4
B)
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Preguntas: •
Considerar las ventajas y/o desventajas que implica el uso de magnificaciones elevadas o bajas en el conteo.
•
Indicar las regiones de mayor y menor densidad celular.
•
Ordena en sentido decreciente de densidad células las regiones estudiadas.
•
Comparar las densidades celulares entre las diferentes zonas.
•
¿Qué zonas tienen una densidad similar?
•
¿A qué crees que se debe este hecho?
•
¿Qué zonas tienen una densidad claramente diferente y porqué?
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VI. Medida de las dimensiones en los ejes X, Y, y Z en microscopía. •
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Medidas en el eje Z El tornillo micrométrico está diseñado para que una una vuelta completa de éste eleve o descienda la platina 0,2 mm. mm Contiene 100 divisiones, de modo que cada división equivale a 0,002 mm ó 2 µm de desplazamiento vertical de la platina (eje Z). Esta escala puede usarse para determinar el espesor de las muestras y estructuras microscópicas examinadas. Medidas en los ejes X e Y Ell margen de desplazamiento de la pletina es de 50 mm x 75 mm, aproximadamente, aproxima lo que nos permite realizar medidas comprendidas dentro de esos márgenes y localizar áreas de interés en la preparación mediante el sistema de coordenadas. coordenadas Las escalas ubicadas en la parte frontal posterior y lateral izquierda proporcionan respectivamente ivamente las lecturas para los ejes X e Y del plano horizontal de la preparación. La escala principal (“m”) está graduada en milímetros, y la escala vernier (“n”) corresponde a: 1 división de “n” = (9 divisiones de “m”)/10
En la figura 1.8 se muestra un ejemplo de uso de un nonio. El valor 0 de la escala vernier nier (n) se sitúa entre 12 y 13 de la escala principal (m). Tomamos omamos el menor valor de la escala m, 12, como valor entero de la medición. Para calcular los decimales nos fijamos en la escala n y comprobamos cual es la menor de sus divisiones que coincide con una división de la escala m, en nuestro caso la división número 8 de la escala n es la primera en coincidir coincidi con una división de la escala m,, el 20. 20 Por lo que consideramos 0,8 como el valor decimal de nuestra medida. Obteniéndose un valor total de 12,8 mm. • •
Escala vernier “n”
Figura 1.8. Escala de la pletina.
Colocar la preparación en la platina del microscopio. Enfocar correctamente el límite superior de la preparación. preparación. Anotar la marca de escala indicada en el tornillo micrométrico. Cuidadosamente, gira el tornillo de enfoque micrométrico y cuando la imagen este enfocada anotar en la siguiente tabla la lectura que se registra en el tornillo micrométrico. Posición
Profundidad
Límite superior Posición media Límite inferior Grosor de la preparación (Límite Límite superiorsuperior Límite inferior) 22
Escala principal “m”
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(media ± σ) (µ µm)
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Localizar las regiones indicadas en la figura 1.9 y con ayuda de la retícula y las escalas del portaobjetos mecánico de la platina, acota las muestras calculando el tamaño de cada uno de las distancias que se indican en dicha figura. Anotar los resultados en la tabla: Segmento
Medida (± ±σ) (mm)
Segmento
A B C D E F
Medida (± ±σ) (mm)
g h i j k l
Figura 1.9 Secciones de cerebro. A) Sección sagital. B) Sección coronal. A)
c
d
b e a f
B)
g h l
k
i j
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Práctica 3 IMAGE J
Objetivos El alumno deberá aprender el uso y manejo del software ImageJ, demostrando dicha habilidad en el análisis de las imágenes proporcionadas.
Material •
Ordenador
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Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/)
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Imágenes proporcionadas por el profesor
Introducción
Una de las partes fundamentales de la investigación es la correcta interpretación de los resultados obtenidos tras los ensayos. Para ello nos hacemos valer de diferentes softwares libres o privados que agilicen dicha tarea. En esta práctica se aprenderá a utilizar uno de los programas más comunes de análisis de imágenes, el ImageJ.
ImageJ es un programa java de dominio público para el procesamiento de imágenes. Muestra, edita, analiza, procesa, guarda e imprime imágenes de 8-bits, 16 bits y 32 bits. Además, es capaz de trabajar con muchos formatos de imagen TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS...Es posible calcular el área y las estadísticas de píxeles de valor definidos por las selecciones del usuario. Puede medir distancias y ángulos. Se pueden crear histogramas de densidad y gráficos de líneas de perfil. Es compatible con las funciones estándar de procesamiento de imágenes tales como la manipulación del contraste, nitidez, suavizado, detección de bordes y el filtrado de mediana. Realiza transformaciones geométricas tales como transformaciones de escala, rotación y giros. ImageJ puede ser reducido hasta 32:1 y ampliado hasta 1:32. Todas las funciones de análisis y procesamiento están disponibles en cualquier factor de aumento. El 24
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programa es compatible con cualquier número de ventanas (imágenes) de forma simultánea, limitado solamente por la memoria disponible. Dispone de calibración espacial para proporcionar medidas reales, en unidades tales como milímetros. La densidad o la calibración de escala de grises también están disponibles.
ImageJ fue diseñado con una estructura abierta que permite la extensibilidad mediante plugins de Java. Se pueden desarrollar plugins personalizados para la adquisición, análisis y procesamiento, que permiten resolver casi cualquier problema de procesamiento de imágenes o de análisis de cada usuario. Conceptos básicos Ventana En la parte superior contiene una barra de menús desplegables, la barra de herramientas, la barra de estado y una barra de progreso. Los resultados de las mediciones se muestran en la ventana de "resultados". Las imágenes, histogramas, perfiles de línea, etc. se muestran en ventanas adicionales. Las ventanas se pueden arrastrar por la pantalla y cambiar de tamaño. Los histogramas y los gráficos que aparecen en las ventanas adicionales son imágenes que se pueden copiar en el portapapeles, editar, imprimir y guardar.
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Barra de herramientas La barra de herramientas contiene iconos para hacer selecciones, zoom, desplazar las imágenes y/o cambiar el color de dibujo. Al pasar el ratón sobre alguna de las herramienta se mostrará una descripción de su función. Las herramientas y los menús en la parte derecha de la barra de herramientas se crean usando macros definidas en el archivo de ImageJ / macros / StartupMacros.txt.
Barra de estado Cuando el cursor se encuentra sobre una imagen, la barra de estado muestra las coordenadas de píxel y los valores. Después de ejecutar un filtro, se muestra el tiempo transcurrido y velocidad de transformación de píxeles/segundo. Haga clic en el estado y se mostrará (como se muestra abajo) la versión ImageJ, la versión de Java, la memoria en uso, la memoria disponible y el porcentaje de memoria utilizada.
Barra de progreso La barra de progreso, que se encuentra a la derecha de la barra de estado, muestra el progreso del tiempo consumido en la ejecución de la orden. No aparecerá si la operación requiere menos de un segundo aproximadamente.
Imágenes ImageJ permite que múltiples imágenes se muestren en la pantalla al mismo tiempo. La ventana activa tiene la barra de título resaltada. Todas las operaciones se llevarán a cabo en la imagen activa. ImageJ soporta 8 bits, 16 bits y 32 bits (real) en escala de grises y 8 bits y 32 bits en imágenes a color. Las imágenes de 16-bit y 32-bit en escala de grises no se pueden mostrar directamente en los monitores de un ordenador, ya que normalmente sólo puede mostrar 256 tonos de gris. Por lo tanto, los datos se reasignan a los 8-bits mediante ventanas. La ventana define el rango de valores de gris que se muestran, los valores por debajo de la ventana pasan a negro, mientras que los valores por encima de la ventana serán de color blanco. La ventana se define por unos valores mínimo y máximo que se puede modificar mediante: Image>Adjust>Brightness/Contrast
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Secuencia ImageJ puede mostrar múltiples imágenes relacionadas, espacial o temporalmente, en una sola ventana. Las mágenes que componen una secuencia se denominan cortes. Todas las rebanadas de una secuencia deben ser del mismo tamaño y profundidad de bits. Una barra de desplazamiento proporciona la capacidad de moverse a través de los cortes. ImageJ abre múltiples archivos de imagen TIFF como una secuencia y las guarda como archivos TIFF multi-imagen. File>Import>Raw : este comando abre otra multi-imagen a partir de archivos sin comprimir. File>Import>Image Sequence: Importa una secuencia de imágenes. File>New>Image: crea una nueva secuencia, estableciendo el número de imágenes deseadas con un valor mayor de uno. Image>Stacks: submenú que contiene comandos para operaciones comunes a una secuencia de imágenes.
Selecciones Las selecciones son las áreas definidas por el usuario o las líneas de una imagen. Sólo una selección puede estar activa a la vez. Para seleccionar una zona se usan el rectángulo, la elíptica, la selección poligonal y la mano alzada. Cada selección se puede medir (Analyze>Measure) filtrar, rellenar (Edit>Fill) o dibujar (Edit>Draw). La selección de líneas se crea utilizando las herramientas de línea recta, segmentada y selección a mano alzada. Utilice la opción Edit>Draw de dibujo para dibujar la línea en el color actual. Las selecciones se pueden mover haciendo clic y arrastrando. La barra de estado muestra las coordenadas en la esquina superior izquierda de la selección. Observe que el cursor cambia a una flecha cuando está dentro de la selección. Para mover el contenido de una selección rectangular, haga clic en la selección y arrastre. Utilice las teclas de flecha para desplazar una selección de píxeles a la vez en cualquier dirección. Las selecciones rectangulares y elípticas pueden cambiar de tamaño. A medida que la selección cambia de tamaño, la anchura y altura se muestran en la barra de estado. Utilice las teclas de flecha con la tecla ALT para estirar las selecciones rectangulares o elípticas un pixel a la vez.
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Para eliminar una selección, seleccione una de las herramientas de selección y haga clic fuera de la selección, o utilizar la opción Edit>Selection>Select None. Utilice la opción Edit>Selection>Restore Selection para restaurar una selección de nuevo después de haberlo eliminado. Una selección puede ser transferida de una a otra ventana de imagen mediante la activación de la ventana de destino y el uso de Edit>Selection>Restore Selection. Las selecciones se pueden guardar en el disco utilizando File>Save As>Selection y restaurado con File>Open.
Formatos de archivo El comando File>Open abre imagenes TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM y FITS. También abre las tablas de búsqueda y selección. Además, el submenú File>Import proporciona acceso a plugins para leer "en crudo" archivos, imágenes en formato ASCII, y para cargar las imágenes en la red mediante una dirección URL. Para importar un archivo RAW (en crudo) es necesario conocer cierta información sobre el diseño, incluyendo el tamaño de la imagen y el desplazamiento de los datos de imagen. Los archivos pueden guardarse en formato TIFF, GIF, JPEG, PNG texto, PGM, FITS, delimitado por tabuladores y formatos RAW. Además se puede añadir soporte para formatos adicionales al descargar o escribir plugins.
Plugins La funcionalidad de dicho software puede ampliarse mediante el uso de plugins escritos en Java. Los plugins pueden añadir soporte para nuevos formatos de archivo o pueden filtrar o analizar imágenes. Los plugins presentes en la carpeta “plugins” de ImageJ se instalan automáticamente en el menú o se pueden instalar en otros menús mediante Plugins/HotKeys/InstallPlugin. Los plugins pueden ser creados o modificados mediante Plugins/Edit. Más de 150 plugins se puede descargar desde el sitio web de Image.
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Apuntes del alumno
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Actividades I.
Abre las siguientes imágenes de retina de rata y con la ayuda del segmento graduado de calibración y el software ImageJ rellena la siguiente tabla, en relación al grosor de las capas celulares que conforman la retina:
Procedimiento: • Abrir la foto de la regla, para establecer en el programa la escala que vamos a utilizar para realizar las medidas. o File open elegir archivo • Establecer a que tamaño corresponde esta regla, en este caso, la distancia entre las dos líneas verticales más largas son 1mm o Seleccionar la herramienta de línea recta “straight” o Realizar una línea recta entre las 2 marcar verticales más largas o Analyze Set Scale Aquí aparece la medida de nuestro segmento, elegimos el valor que va a representar (en este caso 1) y la unidad (mm). Para vitar realizar este proceso para cada fotografía marcamos la opción de Global.
• • • •
A continuación, abrir la imagen que deseamos medir. Elegirlos parámetros a medir, los cuales nos mostrará el programa. o Analyze Set measurements. Seleccionar la herramienta “straigth” y marcar el grosor de una de las capas, para saber su tamaño pulsar: Control+M. Aparecerá una ventana nueva donde se mostrarán los valores de cada medida, guardar dicho archivo. Capa ̅
Desviación estándar
Max
Min
Mediana
Fotorreceptores Nuclear externa Plexiforme externa Nuclear interna Plexiforme interna 30
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Realizar también un recuento de las células ganglionares presentes en las fotos. Para ello reelegir los parámetros a medir y mediante la herramienta “Oval” y el zoom rellenar la siguiente tabla: Foto
Nº de células ̅
Desviación estándar
Max
Min
Mediana Perímetro
Recuerda que puedes modificar la forma y tamaño del óvalo situando el curso encima del mismo.
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Práctica 4 TÉCNICAS HISTOLÓGICAS BÁSICAS: ESTUDIO DE EXTENSIONES CELULARES SANGUÍNEAS
a: eritrocitos b: neutrófilos c: eosinófilos d: linfocito
Department of Histology, Jagiellonian University Medical College
Objetivos El alumno deberá reconocer: 1. 2. 3. 4. 5.
El concepto de frotis o extensión celular y su ejecución. Los tipos de tinciones y su función. Los tipos de células sanguíneas y sus morfologías. El concepto de cámara de Neubauer y los cálculos derivados de su uso. El concepto de porcentaje de viabilidad y su representación gráfica.
Material
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Microscopio.
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Suspensión celular de sangre entera con anticoagulante.
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Portaobjetos y portaobjetos esmerilado
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Cubreobjetos.
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Cubetas de tinción.
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Capilares.
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Metanol.
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Colorante de tinción y solución azul tripán al 0.2%.
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Medio de montaje.
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Cámara de recuento y cubrecámara.
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Suspensión celular.
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Pipetas Pasteur y micropipetas
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Solución salina (5x) (5 veces concentrada). 2º Curso Grado de Biotecnología •
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Introducción
Habitualmente los tejidos de organismos se pueden disociar en sus componentes celulares, a partir de los cuales pueden purificarse diferentes tipos celulares individuales, los cuales pueden utilizarse para su análisis bioquímico o para establecer cultivos celulares. Frecuentemente es necesario conocer el número exacto de células en suspensión que hay en un medio biológico, para lo que se emplean técnicas de recuento celular.
Se entiende por extensión o frotis celular, a la formación de una fina película de células sobre un portaobjetos, de tal manera que las células no se superpongan entre sí. Se utilizan para la visualización de células en suspensión (ej., células sanguíneas), para lo cual tras la extensión de la muestra procederemos a su tinción, entendiendo por tal, la coloración diferencial de las distintas células presentes en la suspensión celular. Las preparaciones de extensiones celulares se utilizan fundamentalmente para el estudio morfológico de las células y su recuento.
Tipos de colorantes Los colorantes ácidos tiñen estructuras celulares básicas, tales como la hemoglobina, los gránulos de los eosinófilos, etc.; los elementos celulares que se tiñen se denominan acidófilos o eosinófilos (un colorante ácido típico es la eosina). Los colorantes básicos por el contrario, tiñen estructuras celulares básico, tales como el ADN nuclear y el ARN; denominándose las estructuras así teñidas basófilas (entre los más utilizados está el azul de metileno). Finalmente, los colorantes neutros son los más utilizados en hematología y están formados por la combinación de un colorante ácido y otro básico y su afinidad tintorial es el resultado de la combinación de los anteriores.
Recuento y viabilidad celular Las cámaras de recuento (figura 2.1) se utilizan para determinar el número de partículas (células) por unidad de volumen de un líquido. Las partículas (ej., células sanguíneas, bacterias, esporas, polen, protozoos, etc.) se cuentan visualmente con ayuda de un microscopio.
Figura 2. 1. Cámara de recuento celular o de Neubauer 2º Curso Grado de Biotecnología
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La cámara de recuento está hecha de vidrio especial y tiene el tamaño de un portaobjetos. Las ranuras fresadas en la superficie de la placa base la dividen en dos zonas anchas exteriores y tres campos pequeños interiores. A diferencia de las zonas exteriores, que se utilizan para la rotulación, los campos interiores están esmerilados y pulidos. En el campo central (equivalente al fondo de la cámara) están grabadas dos cuadrículas de recuento, que están separadas una de otra por una ranura. El número de células en una muestra puede ser determinado contando el número de células en uno o más de los cuadrantes. El cuadrante a usar depende del tamaño del objeto a ser contado. Para células enteras se usarían los cuadrantes grandes, usando el objetivo de 10x. Para mitocondrias aisladas se usarían los cuadrantes medianos con el objetivo de 40x. El fondo de la cámara del campo central es 0,1 mm más bajo (equivale a la profundidad de la cámara). Entre el campo central y la cubrecámara (o cubreobjetos) colocado encima existe, por tanto, una ranura de 0,1 mm. Existen distintos diseños de cuadrículas de las cámaras dependiendo del uso. Para facilitar el recuento de células vivas, sin fijar, se usan los denominados colorantes vitales; que permiten discriminar entre poblaciones de células vivas y muertas en una determinada suspensión celular. El azul tripán es un colorante vital que es activamente eliminado por las células vivas. Sin embargo, penetra y tiñe las células muertas. Por tanto, las células teñidas de azul son células muertas. La diferencia entre el número total de células y el número de células muertas sería el número de células viables en una determinada alícuota de un cultivo. El azul tripán sobrestima el número de células viables, de hecho, aproximadamente un 30% de las células contabilizadas como viables con azul tripán no son capaces de sobrevivir más allá de un periodo de 24 horas. Extensiones celulares sanguíneas El uso de suspensiones celulares de sangre entera permite observar de forma rápida, fácil, económica y nítida diferentes tipos celulares con características morfológicas peculiares y con una notable heterogeneidad nuclear y citoplásmica. Estos tipos celulares se ponen fácilmente de manifiesto con técnicas histológicas de microscopía óptica, que por su metodología y sistemática suponen un entrenamiento ideal para el estudio de suspensiones celulares de cualquier tipo, ya que raramente se trabaja con suspensiones celulares con una diversidad celular tan elevada. Para teñir las extensiones de sangre se emplean compuestos derivados de anilina, por los que tienen una gran afinidad los distintos orgánulos de las células sanguíneas. Según la naturaleza química de estos colorantes, distinguimos tres tipos: ácidos, básicos y neutros. La sangre es un tejido que posee diversas células suspendidas en un medio fluido, denominado plasma.
Las células sanguíneas son fundamentalmente de tres tipos: Células rojas, eritrocitos o hematíes • Eritrocitos: Estas células enucleadas (en la mayoría de mamíferos) se tiñen de color rosado debido a su alto contenido en hemoglobina. La zona central 34
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pálida, escasamente teñida, es el resultado de su forma de disco bicóncavo, poco frecuente. Es el componente celular mayoritario de la sangre, 4-6 millones/ml.
Células blancas o leucocitos • Neutrófilos: el tipo de leucocito más frecuente en sangre. Posee un núcleo multilobulado. En los neutrófilos maduros existen generalmente 5 lóbulos conectados por finas bandas de materia nuclear, pero en los neutrófilos inmaduros el núcleo generalmente es poco lobulado. En los neutrófilos de las hembras, el cromosoma X inactivo o cuerpo de Barr aparece formando un pequeño apéndice en forma de palillo de tambor, condensado, en uno de los lóbulos del núcleo. Se ve en el 3% de los neutrófilos de las hembras. El citoplasma de los neutrófilos está ligeramente punteado con gránulos de color púrpura que se denominan gránulos azurófilos que se corresponden con lisosomas primarios grandes. • Eosinófilos: poseen como dato morfológico característico, un núcleo bilobulado y un citoplasma repleto de granos grandes (de color rosado oscuro) y de tamaño uniforme. • Monocitos: son los elementos mayores de todas las células de la serie blanca. Se caracterizan porque poseen un gran núcleo, situado excéntricamente, que se tiñe menos intensamente que en los otros leucocitos. El núcleo generalmente es dentado haciéndose más dentado a medida que la célula madura y adopta finalmente una morfología de herradura o aspecto bilobulado. El amplio citoplasma está ocupado por pequeños lisosomas que con microscopía óptica, le dan el típico aspecto de “vidrio mate”. • Basófilos: los leucocitos menos frecuentes. En general el núcleo bilobulado está eclipsado por numerosos gránulos grandes (azul oscuro). • Linfocitos: son las células más pequeñas de la serie blanca, presentando un tamaño ligeramente mayor que los hematíes. Se caracterizan porque tienen un núcleo redondeado, muy teñido, y un pequeño anillo de citoplasma agranular, ligeramente basófilo. La cantidad de citoplasma varía según el estado de actividad de la célula; así, se observan linfocitos pequeños, medianos y grandes.
Plaquetas o trombocitos • Plaquetas: pequeñas células enucleadas (en el hombre), que se forman en la médula ósea a partir de los megacariocitos, su número varía de 150.000400.000/ml. Son discos biconvexos redondos u ovales. En los frotis sanguíneos suelen aparecer agrupadas y el citoplasma teñido de púrpura, tiene aspecto granular debido a la gran cantidad de orgánulos que se disponen en el centro de la célula, el citoplasma periférico se tiñe muy poco y por eso es apenas visible.
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Apuntes del alumno
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Actividades
I. Frotis sanguíneo Procedimiento • Preparación de los portaobjetos Antes de su empleo, los portaobjetos deben ser tratados para eliminar posibles impurezas de su proceso de fabricación y manipulación (desengrasado) aplicando el siguiente tratamiento: 1. Lavar con agua y detergente. 2. Una vez aclarado con agua corriente, se depositará en un recipiente que contenga una de las tres soluciones: - Mezcla sulfocrómica. - Etanol. - Etanol-eter (1:1). 3. Se mantienen 10-15 minutos, tras lo cual, si hemos usado mezcla sulfocrómica los aclararemos con agua destilada, mientras que con las otras simplemente dejaremos evaporar el disolvente. 4. Finalmente, los secaremos con papel de filtro o en estufa. • Confección de las extensiones 1. Colocamos los portaobjetos sobre una superficie plana y con ayuda de un capilar depositamos una gota de suspensión celular en un extremo (aproximadamente a 0,5 cm). 2. Con los dedos pulgar e índice de la mano izquierda, se sostiene los dos ángulos de la parte izquierda del portaobjetos. Con la mano derecha, se coge el portaobjetos esmerilado, colocamos el pulgar en uno de los bordes y el índice sobre el otro. Situar este último delante de la gota de sangre, de forma que ambos portaobjetos formen un ángulo de 45º aproximadamente. El grosor de la preparación depende del ángulo (a menor ángulo menor espesor, y viceversa). El portaobjetos esmerilado nunca debe pasar por encima de la muestra al hacer la extensión.
Punto de colocación de la muestra
Figura 2.1. Esquema de la realización de un frotis sanguíneo. La flecha indica la dirección en la que debe deslizarse el portaobjetos esmerilado. 2º Curso Grado de Biotecnología
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3. Se hace retroceder el portaobjetos esmerilado en dirección a la gota de la suspensión celular. Tan pronto como ambos entren en contacto, la sangre comenzará a extenderse sobre el borde del portaobjetos esmerilado. 4. Cuando la sangre, por capilaridad, llega hasta aproximadamente 2 mm de los bordes del portaobjetos esmerilado, efectuar un movimiento suave y rápido de éste sobre toda la longitud del portaobjetos horizontal. 5. Dejar el frotis secar a temperatura ambiente y en posición horizontal durante un mínimo de 10 minutos. 6. Fijar las extensiones introduciendo el portaobjetos en alcohol metílico durante 5 minutos y dejar secar a temperatura ambiente. 7. Teñir durante 30 minutos con una solución de Giemsa al 10% en agua destilada (preservar de la luz). 8. Lavar las extensiones celulares con abundante agua destilada. 9. Dejar secar a temperatura ambiente y montar con medio de montaje.
• Examen de la extensión celular El examen microscópico variará dependiendo de la muestra procesada. En este caso dicho examen consta de los siguientes pasos: 1. Observar la preparación con el objetivo de 4x ó 10x. Las células deben estar homogéneamente distribuidas, de lo contrario lo desecharemos. 2. A continuación, examinar la muestra a 40x. Realizar un recorrido por la preparación tal y como se indica en la figura 2.2, identificando correctamente los distintos tipos celulares que aparecen en la preparación. Origen
Zona de linfocitos
Sentido de la extensión
Zona de neutrófilos y monocitos
Zona ideal de recuento
Figura 2.2. Esquema de un frotis sanguíneo. La líneas punteada indica la dirección a seguir en el recuento diferencial de leucocitos (n=100). 3. Una vez identificados los distintos tipos celulares realizar la fórmula leucocitaria de la muestra. Para ello buscar 100 leucocitos, moviéndose por la preparación, e identificar cada uno de los tipos y anotar su número. Así se determinará el porcentaje de cada tipo de leucocito en el total de la muestra. 38
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Suponiendo que la población total de leucocitos de la muestra analizada es de 9.170 leucocitos/ml. ¿Cuántas células/ml de cada unos de los tipos de leucocitos hay en la muestra?
Tamaño (µ µm)
Tipos celulares
Plaquetas
Monocitos
Linfocitos
Basófilos
Eosinófilos
Neutrófilos
Eritrocitos
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Recuento leucocitario
Células/ml
2-3
14-17
7-8
9-10
10-12
10-12
6-8
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Responder a las siguientes preguntas: • ¿Qué función tiene el baño previo de metanol a la tinción con Giemsa en las extensiones de sangre?
• ¿Las estructuras basófilas son de naturaleza ácida o básica?
• ¿Qué función tiene el mantener los portaobjetos en un baño de etanol-éter antes de usarlos para realizar extensiones celulares?
• ¿Qué es el cuerpo o corpúsculo de Barr?
• ¿A qué orgánulo corresponde la ligera granulación púrpura citoplásmica de los neutrófilos?
• Ordena de menor a mayor espesor los siguientes frotis según el ángulo de inclinación aplicado al portaobjetos esmerilado con el que se hizo la extensión: a) 45º; b) 30º; c) 55º; d) 35º; e) 60º.
• En la raza humana en estado de salud normal los eritrocitos son anucleados. ¿Existen especies con eritrocitos nucleados? En caso afirmativo enunciarlas.
¿Si existen, que significados funcional y/o evolutivo puede tener la presencia de núcleo en los eritrocitos?
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II. Recuento y viabilidad celular. Procedimiento • Agitar bien la suspensión celular celu y hacer diluciones seriadas desde 1/10 a 1/1.000. 1/1.000 • Diluir 4 partes de la solución “stock” de azul tripán en 1 parte de solución salina (5x). • Depositar con una micropipeta una muestra de 100µl 100 l de cada dilución seriada en un tubo de vidrio y añadir 100 µl de azul tripán diluido. Mezclar. • Coger la cámara de recuento y pegar egar el cubrecámara sobre el centro de la cámara humedeciendo ligeramente los bordes del mismo. • Usar sar una pipeta Pasteur para transferir una pequeña alícuota de la dilución a la cámara de recuento (comenzar con la dilución 1/10), colocando la punta de la pipeta dentro de la excavación en forma de “V” y permitir así a la suspensión suspensi celular fluir por capilaridad hasta que la cámara de recuento este llena (figura (figura 2.3). 2. Evitar que rebose la cámara y la presencia de burbujas de aire.
Suspensión celular
Figura 2.3. Colocación de la muestra en la cámara de recuento. • Añadir una muestra similar de la suspensión celular en la cara opuesta de la cámara de recuento y esperar aproximadamente un minuto antes de comenzar el recuento, para evitar que las células se muevan y permitir que las células se distribuyan homogéneamente por la l cámara. • Contar en el microscopio las células teñidas y no teñidas que estén en el interior del cuadrante a contar (considerando onsiderando que sólo se cuentan las células que tocan dos de las 4 aristas,, como se vio en la práctica 1). 1 • Tener en cuenta el diagrama de la cámara de recuento de la figura 2.4 y considerar lo siguiente: • El cubreobjetos está a 0,1 mm sobre la retícula, y las líneas grabadas en la retícula están a las dimensiones indicadas. • Los cuatro cuadrantes, marcados 1-4, 1 4, cubren un volumen de 10-4 ml. • El cuadrante interno, marcado como 5, también cubre un volumen de 10-4 ml, pero está subdividido en 25 cuadrantes medianos. El volumen sobre cada uno de esos 25 cuadrantes es 4x10-6 ml • Cada uno de esos 25 cuadrantes está a su vez subdividido en 16 cuadrantes, que son la graduación más pequeña de la cámara de cuadrantes, recuento. El volumen sobre esos cuadrantes más pequeños es 0.25x10-7 ml.
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Figura 2.4 Esquema de una cámara de recuento con sus medidas acotadas. • Los cuadrantes marcados 1-5 son todos de 1 mm2. Las retículas 1-4 están subdivididas en 16 cuadrantes más pequeños (de 0,25 mm por lado), el cuadrante 5 está dividido en 25 cuadrantes (de 0,2 mm de lado). Cada uno de estos 25 cuadrantes está subdividido en 16 cuadrantes más pequeños de 0.05mm de lado. • Para los cuadrantes marcados 1-4, el área de cada uno es 1 mm2, y el volumen es 0,1 mm3. Considerando que 0,1 mm3 es igual a 10-4 ml, para calcular el número de células/ml se toma la media de células/mm2 y se multiplica por 104. • Para los 25 cuadrantes medianos del centro de la cámara, marcados con el número 5, cada cuadrante pequeño mide 0,04 mm2 y su volumen es 0,004 mm3. Para las células más pequeñas u organelas, el número de partículas/ml equivale a la media de partículas/cuadrante más pequeño multiplicado por el número de cuadrantes (25) y por 104 veces para una determinada dilución de la muestra.
Para una determinada suspensión celular, contar el número de células en 5 de los cuadrantes medianos del cuadrante. Para que el contaje tenga validez estadística, el número de células por cuadrante debe estar entre 10 y 100. Si el contaje es superior o inferior, limpiar el hemocitómetro y usar la dilución siguiente o previa de la serie, según corresponda. 42
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Anotar la dilución usada, y el número de células en los cinco cuadrantes contados. Promediar los contajes, multiplicando por el factor de dilución, y calcula el número de células/ml en la suspensión celular. Anotar los resultados obtenidos en la siguiente tabla. Dilución: Cuadrante
Nº células totales Nº células viables Nº células muertas
1 2 3 4 5 Media Nº células/mm2 = [(media)x25]
Calcular el número de células de la muestra según las siguientes fórmulas, teniendo en cuenta: • El volumen correspondiente a la región contada en la cámara de recuento es de 0.1mm3, por lo tanto, se multiplica el número de células por 10.000 •
Considerar que el nº de células/cm3 es igual que el nº de células/ml.
•
El factor de dilución es igual a (dilución del cultivo) x (dilución con el azul tripán).
Nº células viables/ml (células vivas/mm2) x 10.000 x factor de dilución Nº células totales/ml (cél. vivas/mm2 + cél. muertas/mm2) x 10.000 x factor de dilución Porcentaje de Viabilidad [(células vivas/ml)/(células totales/ml)] x 100 Área de cada cuadrante mediano (mm2) Volumen de cada cuadrante: (área de cada cuadrante) x (0.1 mm de profundidad)( mm3) Nº medio de células por mm3
Realizar en la siguiente gráfica una curva de viabilidad celular. Considerando que un 30% de las células contabilizadas como viables no son capaces de sobrevivir por encima de un periodo de 24 horas, representar el porcentaje de células viables y muertas frente al tiempo, considerando un periodo de 7 días, a partir del número de células obtenido en la suspensión celular. 2º Curso Grado de Biotecnología
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Porcentaje de células
Células viables
Células muertas
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
1
2
3
4
5
6
7
Días
Responder a las siguientes cuestiones: • ¿Para qué sirve el azul tripán en el recuento celular y en que se basa su uso?
• ¿Por qué se tiene en cuenta el factor de dilución para calcular el número de células de una suspensión celular?
• ¿Qué finalidad tiene tras haber puesto la muestra en la cámara de recuento el esperar un tiempo antes de iniciar el recuento?
• ¿Por qué multiplicamos por 10.000 para calcular el número de células/ml?
• ¿Por qué multiplicamos por 25 para obtener el número de células/mm2?
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Práctica 5 ESTRUCTURA DE LOS EPITELIOS EP
Objetivos El alumno deberá reconocer: reconocer 1. Identificar y describir cada una de las variedades morfológicas del tejido epitelial: epitelios simples (plano, cúbico, cilíndrico y pseudoestratificado) y estratificados. 2. Identificar car las características morfológicas que permiten su clasificación 3. Correlacionar las características histológicas de cada epitelio con la función que realiza. Diferenciar las glándulas exocrinas y endocrinas
Material • • • • • • • •
Microscopio de luz de campo claro Portaobjetos Batería de tinción Espátula de Ayre Epitelio simple columnar: Vesícula biliar: Tinción Hematoxilina-eosina Hematoxilina eosina Epitelio plano estratificado: Piel: Tinción Hematoxilina-eosina Hematoxilina Epitelio plano simple: Vena y arteria: Tinción Hematoxilina-eosina Hematoxilina Epitelio elio Glandular: Glándula salivar: Tinción Hematoxilina-eosina Hematoxilina
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Introducción La histología animal estudia los aspectos morfofuncionales de las células eucariotas animales, de su organización en tejidos y de la organización de éstos en órganos. A partir de una única célula, el cigoto, terminan por formarse todos los órganos de cada individuo. Así pues, órganos tan diferentes como el riñón o el pulmón, básicamente están formados por células con diversas especializaciones y por las sustancias sintetizadas por ellas. Sin embargo, incluso en órganos muy diferentes, se aprecian agrupaciones celulares muy semejantes; áreas en las que resulta difícil decir de de qué órgano se trata, si no se sale de ellas durante el examen microscópico. Ésto quiere decir que entre la célula y el órgano existe un nivel de organización morfofuncional especializado al que se denomina tejido. El concepto de tejido no sólo incluye los tipos celulares que se agrupan para formar una estructura microscópica bien definida. Cada tejido comprende también un medio intercelular integrado por un líquido tisular que contiene sustancias de diverso tamaño, algunas visibles al microscopio óptico, otras sólo al electrónico, y otras únicamente detectables con técnicas histoquímicas o métodos de estudio molecular. Estos componentes constituyen un medio ambiente de importancia fundamental que determina tanto las propiedades del tejido como el comportamiento de las propiedades del tejido, como el comportamiento de las células contenidas en él, afectando a su diferenciación y desarrollo, proliferación, migración, forma y funciones metabólicas. La estructura microscópica del tejido es la manifestación morfológica de las interacciones entre diversas células y componentes tisulares que determinan una especialización morfofuncional.
Clasificación de los tejidos animales Se suele considerar que los tejidos fundamentales de los organismos animales, distinguibles por sus características, son: Tejido epitelial Se puede definir como un conjunto de células estrechamente unidas que cubren o revisten un órgano o sistema. Excepcionalmente, como ocurre con las glándulas endocrinas, un grupo de células que haya perdido la conexión con el epitelio que las originó puede quedar incluido en otro tejido. Las funciones de los epitelios pueden ser muy variadas: protección ante la pérdida de la humedad, erosión mecánica y agentes químicos, recepción sensitiva, absorción, secreción y excreción. Las características citológicas de las células epiteliales son muy variadas dependiendo del tipo de epitelio. En todos los casos los epitelios presentan una serie de propiedades que pueden resumirse en dos: • Cohesión: entre las células epiteliales el espacio intercelular es muy escaso y se observan estructuras de unión entre células adyacentes.
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• Polaridad: existencia de variaciones morfofuncionales tanto en las diferentes superficies celulares, como en las diversas porciones del citoplasma. Especializaciones de la superficie apical, basal y del citoplasma.
Las características de las células epiteliales difieren incluso dentro de un mismo epitelio, de acuerdo con las funciones propias que realiza cada tipo celular. Se clasifican en: células banales de revestimiento, secretoras, con contenidos especiales, ciliadas, relacionadas con procesos de absorción, relacionadas con procesos de regulación osmótica de la excreción, nerviosas y sensitivas. Clasificación de los epitelios • Epitelios de revestimiento: Recubren o revisten un órgano. Se clasifican según su aspecto morfológico, teniendo en cuenta los siguientes criterios: - Número de capas celulares: Simples: Una sola capa de células. Estratificados: Dos o más capas de células. Pseudoestratificados: Con apariencia de más de una capa aunque realmente sólo hay una. De transición: La altura y el número de capas se modifica aparentemente. - Altura de las células: Plano: Células más anchas que altas. Cúbico: Células tan altas como anchas, aparecen como cuadrados en sección. Cilíndrico o prismático: Células más altas que anchas, aparecen como rectángulos apoyados sobre una de las caras pequeñas en sección. - Especializaciones superficiales: Ciliado: Con cilios en la mayoría de células. Menos frecuente es el flagelado. En chapa: Con ribete superficial de microvellosidades.
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Con cutícula: En la epidermis epitelios derivados del ectodermo de algunos invertebrados. De acuerdo con los criterios expuestos, y combinándolos entre sí, resultan los siguientes tipos de epitelio: Plano simple. Cúbico simple. Prismático (cilíndrico) simple. Plano estratificado: presenta varias capas de células pero sólo las más superficiales son de células planas. Estratos basal o germinativo, espinoso y estrato córneo. Cúbico estratificado. Prismático (cilíndrico) estratificado. Prismático pseudoestratificado. De transición o urinario. Otros tipos especiales: Seminífero, sincitial, hundido, musculares. • Epitelios glandulares: Si los epitelios de revestimiento se invaginan en el órgano que revisten o recubren y estas células producen una secreción, forman los epitelios glandulares. La porción glandular puede quedar unida al epitelio de revestimiento por una porción epitelial no glandular denominada conducto, es el caso de las glándulas exocrinas. En otros casos ha desaparecido el conducto y las glándulas quedan aisladas del epitelio que las originó; su secreción se vierte entonces a la sangre, se llaman glándulas endocrinas.
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- Glándulas exocrinas, se clasifican de acuerdo con: La forma de las porciones secretoras de la glándula: o Tubulares: Rectas. Contorneadas. o Acinares. o Alveolares. La sencillez o ramificación del conducto excretor: o Simples: el conducto excretor no está ramificado. Al término simple se añade el calificativo de ramificada si la porción glandular (no el conducto se ramifica). o Compuestas: el conducto es ramificado. Clasificación de las glándulas exocrinas según su producto de secreción: o Mucosas. o Serosas. o Seromucosas (mixtas). o Otros tipos de secreción: Sudor, sebo y leche. Clasificación de las glándulas exocrinas según el modo de secreción: o Holocrina: conlleva la eliminación total de la célula. o Apocrina: comporta la eliminación de una parte de la célula con la secreción. o Merocrina: sólo se vierte el producto segregado. o Iónica o molecular: el producto de secreción se libera por transporte membranal. En sentido amplio se consideran también glándulas las células secretoras (individuales o asociadas) que forman parte de un epitelio de revestimiento, sin necesidad de invaginarse y, por tanto carentes de conducto, se las denomina intraepiteliales: o Glándula unicelular intraepitelial. o Glándula pluricelular intraepitelial. - Glándulas endocrinas, se disponen en islotes o cordones entre los que se encuentran numerosos capilares sanguíneos a los que vierten la secreción. Se clasifican según el producto segregado: Polipéptidos o proteínas, glucoproteínas y esteroides.
Tejido conectivo o conjuntivo Se caracteriza porque sus células no se encuentran adosadas entre sí, sino englobadas en una matriz o sustancia fundamental blanda. Realiza múltiples funciones, como el soporte y protección de órganos formando su armazón y recubrimiento, la difusión de sustancias, el soporte de vasos y nervios, y la ubicación de las células de defensa del organismo que forman el sistema inmunitario. El tejido conjuntivo alcanza particular desarrollo y variedad en vertebrados. En invertebrados se conocen poco sus variantes.
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Los componentes de este tejido son: • Células: - Células fijas o propias. Residen habitualmente en él. Elaboran su matriz. Células mesenquimáticas. Células reticulares. Fibroblastos. - Células móviles o errantes. Vienen de otros tejidos y sólo se encuentran temporalmente, extendiéndose a otras localizaciones. Participan en la defensa del organismo. Macrófagos. Células cebadas o mastocitos. Células del sistema de defensa: Monocitos, linfocitos, células plasmáticas, neutrófilos y eosinófilos. Células pigmentadas. • Matriz: - Fibras. Su proporción y distribución determina el tipo de conjuntivo. No todas se encuentran siempre: Fibras colágenas. Fibras reticulares o de reticulina. Fibras elásticas. - Sustancia fundamental. En ella están embebidas las células y fibras del conjuntivo. La proporción fibras/sustancia fundamental determina la variedad de tejido conjuntivo: Proteínas. Glucoproteínas: Fibronectina, tenascina, laminina y entactina. Proteoglucanos. Variedades de tejido conjuntivo: De acuerdo con la proporción y características de las fibras, células y sustancia fundamental, se diferencian las siguientes variedades de tejido conjuntivo: • Mesoglea de invertebrados. • Mesénquima. • Conjuntivo mucoide. • Conjuntivo reticular. • Conjuntivo laxo o areolar. • Conjuntivo denso o fibroso. • Conjuntivo elástico.
Tejido adiposo Se puede considerar una variante de tejido conjuntivo altamente especializado en el almacenamiento de lípidos. Está presente tanto en vertebrados como en invertebrados. Las células principales son los adipocitos, que se encuentran en una malla de fibras reticulares. Variantes: tejido adiposo pardo, cuerpo graso gonadal de anfibios y cuerpo graso del abdomen de insectos.
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Tejido cartilaginoso Es un tejido conjuntivo de sostén con sustancia fundamental gelatinosa, firme y elástica, capaz de un rápido crecimiento, manteniendo la consistencia, lo que le hace comparable al plástico. Está constituido por células y matriz (fibras y sustancia fundamental), predominando la matriz sobre las células. Sus principales funciones son la de soporte de estructuras flexibles, permitir la articulación de los huesos y servir de molde sobre el que se formará el tejido óseo. Los principales tipos celulares son: condroblastos, condrocitos y condroclastos. Variedades de tejido cartilaginoso Este tipo de tejido es propio de vertebrados, aunque también existe en algunos invertebrados, como moluscos. • Cartílago hialino. • Cartílago articular. • Cartílago fibroso. • Cartílago elástico. Tejido vesicular (condroide) En muchos invertebrados existen células con grandes vacuolas llenas de líquido, que recuerdan una fase de la histogénesis del cartílago y a las que se les atribuye una función esquelética.
Tejido cordal Constituye la notocorda de los cordados. Dependiendo del grupo de cordados presenta una estructura diferente.
Tejido óseo Se compone de células y matriz. Esta última consta de fibras y sustancia fundamental, impregnada de sales de calcio, lo que le confiere dureza y resistencia al hueso. Proporciona el soporte para la forma y movimiento del organismo gracias a la inserción de los músculos, protege al sistema nervioso central y en el interior de muchos huesos, se forman las células sanguíneas. El tejido óseo sólo se encuentra en vertebrados (aunque falta en ciclóstomos y elasmobranquios). Los componentes de este tejido son: • Células: - Células osteoprogenitoras. - Osteoblastos. - Osteocitos. - Osteoclastos. • Matriz: - Fibras. - Sustancia fundamental: 2º Curso Grado de Biotecnología
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Proteoglicanos. Glucoproteínas y proteínas. Sales minerales. Organización del tejido óseo • Hueso esponjoso. Formado por una red tridimensional de espículas o trabéculas óseas ramificadas que delimitan un laberinto de espacios intercomunicados ocupados por médula ósea. • Hueso compacto. Forma una masa sólida, con espacios sólo perceptibles al microscopio óptico.
Sangre En sentido amplio puede considerarse un tejido en el que la sustancia fundamental es líquida (plasma sanguíneo). En el aparato respiratorio capta el O2 necesario para la respiración y lo difunde por todo el organismo, junto con las sustancias que se requieren para la nutrición de las células. Retira el CO2, que es expulsado por el aparato respiratorio, y las sustancias de desecho que se excretan en el sistema excretor. Además de esta función nutritiva, sus células intervienen en el sistema de defensa inmunitaria y en la coagulación. Para poder efectuar el transporte de O2, los animales han desarrollado pigmentos respiratorios especializados. Estos pigmentos están presentes en la mayoría de los animales celomados, pero han alcanzado un alto grado de eficacia en los vertebrados. En la mayoría de los invertebrados, los pigmentos respiratorios se encuentran generalmente en forma de solución coloidal en la hemolinfa, mientras que el pigmento respiratorio de los vertebrados es transportado en células circulantes especializadas de la sangre, los eritrocitos. Las células que tienen misión defensiva del organismo se denominan leucocitos (vertebrados) y hemocitos (invertebrados), estos últimos pueden tener también una función de almacenamiento de lípidos y proteínas. Finalmente las células encargadas de la coagulación se denominan trombocitos (vertebrados no mamíferos) y plaquetas (mamíferos). En invertebrados esta función se atribuye a algunos de los hemocitos.
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Tejido muscular Está constituido por células muy especializadas que se caracterizan por su contractilidad y conductividad. Son esenciales para los movimientos del cuerpo, tanto del esqueleto como de los órganos. Ultraestructuralmente se caracterizan por presentar miofilamentos, actina y miosina. Variedades de tejido muscular De acuerdo con las características de sus células, pueden considerarse dos grandes variedades de tejido muscular: • Músculo estriado: Incluye un grupo heterogéneo de tejidos musculares que difieren entre sí en diversos aspectos pero guardan una semejanza básica. Los miofilamentos se disponen ordenadamente formando unidades morfológicas y funcionales denominadas sarcómeros, cuyo resultado es una estriación transversal de las células musculares. Los miofilamentos se disponen de modo que las bandas transversales que determinan la estriación son perpendiculares al eje longitudinal de la célula. Fisiológicamente son de contracción rápida. Dentro de este grupo pueden establecerse tres grandes grupos, cada uno de ellos con varios tipos de músculo estriado: - Músculo esquelético de vertebrados. Conforman la musculatura somática de vertebrados y se contraen de modo voluntario. - Músculo cardíaco. Forma la pared muscular (miocardio) del corazón de vertebrados. Sus células difieren en ciertos aspectos del músculo esquelético y su contracción es involuntaria. - Músculo estriado de invertebrados. Sus células son similares a las del músculo esquelético y cardíaco de vertebrados aunque difieren de ambos en múltiples aspectos estructurales. • Músculo sin estriación: Estas células carecen de estriación transversal y son de contracción lenta e involuntaria. Grupos: - Músculo liso de vertebrados. Sin estriación aparente. Constituyen la musculatura de los vasos sanguíneos y órganos huecos de vertebrados e invertebrados. - Músculos lisos y de estriación oblicua de invertebrados. En invertebrados, existe una amplia variedad de músculos sin estriación típica, y que difieren entre sí en cuanto a la organización de los miofilamentos. Esta organización va desde un músculo con mayor proporción de filamentos gruesos, lo que determina un mayor nivel de organización, hasta un músculo denominado de estriación oblicua, en el que los miofilamentos se organizan formando bandas transversales que forman un ángulo no recto con el eje longitudinal de la célula.
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Tejido nervioso Es el más especializado, ya que actúa como centro que capta información, la almacena, la procesa, y envía nueva información a los músculos y vísceras, para dirigir y regular sus funciones. Es el tejido funcionalmente más complejo y de alguna manera, interviene en el control de todos los demás tejidos. En animales superiores, se considera dividido en: sistema nervioso central (SNC) y periférico (SNP). El primero consiste en una masa centralizada de tejido nervioso puro que controla y coordina las recepciones y respuestas ante diferentes estímulos conscientes o inconscientes. Está constituido por neuronas y células gliales. El sistema nervioso periférico constituye una prolongación de los elementos principales del sistema nervioso central, las neuronas, por todo el organismo, de manera que pueda captar los estímulos y transmitir las respuestas. Sus componentes son proyecciones citoplasmáticas de las neuronas, rodeadas por unas células acompañantes (células de Schwann) y tejido conjuntivo. Componentes celulares • Neurona. Es una célula altamente diferenciada. Su principal característica es la excitabilidad de la membrana plasmática, lo que produce la transmisión del estímulo nervioso. Pero la neurona no sólo conduce y transporta impulsos nerviosos, también almacena información, de modo que puede considerarse como una célula especializada en recibir información, integrarla, relacionarla e informar nuevamente. Para cumplir con tan variado programa ha sufrido una definida adaptación morfofuncional. • Neuroglía o glía. Son las células que acompañan a las neuronas en el sistema nervioso central y periférico. Clasificación: - Glía del sistema nervioso central: Oligodendrocitos: proporcionan soporte estructural y metabólico a los axones. Células ependimarias Astrocitos Microglia - Glía del sistema nervioso periférico Células de Schwann: proporcionan soporte estructural y metabólico a los axones. Células Capsulares Células de Muller Análisis crítico del concepto de tejido Una de las principales tendencias en la evolución de animales, y vegetales, ha sido la especialización y división del trabajo entre las células componentes. Cada tipo celular se especializa en ciertas funciones, dentro de un mismo órgano. Ésta especialización permite que las células sean más eficaces pero también, implica una dependencia entre las partes del organismo. La lesión o destrucción de una parte del cuerpo puede significar la muerte total del mismo. 54
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Actividades I. Realizar el frotis de epitelio bucal • Obtener por raspado mediante la espátula de Ayre, muestra del epitelio bucal. •
Realizar una extensión del material en el porta, atendiendo a las indicaciones dadas.
•
Fijar la extensión por medio de un spray con solución fijadora.
•
Teñir mediante el método de Papanicolaou: Modus operandi (método rápido): - Alcohol 96%......................1 minuto - Alcohol 50%......................10 inmersiones - Agua destilada........…………10 inmersiones - Hematoxilina de Harris......3 minutos - Agua corriente..................10 inmersiones - Agua destila......................1 minuto - Alcohol 96%......................10 inmersiones - Alcohol 96%......................10 inmersiones - Orange G...........................2 minutos - Alcohol 96%......................10 inmersiones - Alcohol 96%......................10 inmersiones - EA 50 (eosina)...................3 minutos - Alcohol 96%......................10 inmersiones - Alcohol 96%......................10 inmersiones - Alcohol 100%....................10 inmersiones - Alcohol 100%....................10 inmersiones - Xilol...................................3 minutos
•
Montar cubreobjetos con Eukitt.
•
Estudiar la preparación en el microscopio identificando las siguientes estructuras (realizar un dibujo):
• células del epitelio escamoso - características generales de las células (tamaño, forma, etc.) - características morfológicas de los núcleos (número, forma, tamaño, coloración, distribución de la cromatina, etc.) - características del citoplasma (coloración, presencia o no de elementos formes visibles, etc.)
• leucocitos: - características: forma, tamaño, características del núcleo, citoplasma… • bacterias: forma, número, tamaño. • otros elementos.
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Dibujar los diferentes tipos celulares utilizando el objetivo de 40X
Responder a las siguientes cuestiones: •
¿A qué tipo de epitelio pertenecen las células?
•
¿Son iguales todas las células epiteliales?, ¿por qué?
•
¿Por qué no todos los citoplasmas tienen la misma apetencia tintorial?
•
¿Qué es un núcleo picnótico?
•
¿Son iguales todos los leucocitos que se identifican en la extensión? Indica los diferentes tipos que has observado
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II. Epitelio de vesícula biliar humana (Tinción Hematoxilina-eosina ) • Observar la figura de los diferentes tipos de epitelio que aparece al principio de la práctica e identificar en la preparación a cuál de ellos corresponde. •
Observar la morfología celular con los núcleos ubicados basalmente.
•
Observar la fuerte unión entre las células.
•
Diferenciar la lámina basal que sustenta a la capa celular.
Usando el objetivo de 40X haz un dibujo a color de este epitelio nombrando sus partes
Responder a las siguientes cuestiones:
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•
¿Cuántas capas de células tiene?
•
¿Qué dimensiones de las células predominan, la anchura o la altura?
•
¿Donde están ubicados los núcleos celulares?
•
¿Porqué en algunas zonas aparece como estratificado?
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III. Piel Humana (Tinción Hematoxilina-eosina) • Estudiar los tres tejidos que conforman la piel humana. •
Diferenciar cada uno de los estratos de la epidermis: córneo, espinoso, basal etc.
•
Describir el tipo de epitelio de la epidermis de la piel.
•
Observar el tejido conjuntivo denso e irregular de la preparación.
•
Observar los vasos, pelos, glándulas y terminaciones nerviosas de la dermis.
•
Describir las características de la hipodermis.
Dibuje la dermis e hipodermis a 40X
Dibuje la epidermis a 40X indicando cada una de sus capas
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IV. Epitelio plano simple: Endotelio de venas y arterias (Tinción Hematoxilina-eosina) • Estudiar las tres túnicas que forman los vasos sanguíneos •
Diferenciar el tipo de epitelio que conforma la túnica íntima.
•
Señalar las diferencias que se observan entre las venas y las arterias en cuanto al grosor del músculo liso y las láminas elásticas.
Dibuje y describa un corte de la arteria elástica y de la vena señalando las características de las diferentes capas
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V. Epitelio glandular: Glándula salivar (Tinción Hematoxilina-eosina) • Identificar la estructura de la glándula túbuloacinar. •
Observar los acinos serosos y mucosos
•
Estudiar la estructura de los conductos secretores
•
Estudiar la clasificación de los epitelios glandulares
Utilizando el objetivo de 40X dibuje e identifique los acinos serosos, mucosos y los conductos secretores.
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Práctica 6 TEJIDOS DE FUNCIÓN TRÓFICA Y MÉCANICA
Objetivos El alumno deberá alcanzar los siguientes puntos: 1. 2. 3. 4.
Estudiar las características de los tejidos de función trófica y mecánica. Reconocer la estructura histológica del tejido adiposo. Identificar y comparar la organización de la fibra colágena en el tejido conjuntivo. Estudiar la matriz y las células del tejido óseo y su organización histológica.
Materiales • Microscopio de luz de campo claro • Tejido adiposo de mamífero (Tinción Hematoxilina-eosina, Tinción negro Sudán) • Tendón humano: Tinción H/E • Hueso humano: Tinción H/E
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Introducción Denominamos tejidos de función trófica y mecánica a las asociaciones celulares de los metazoos, caracterizadas por poseer células separadas e inmersas en una importante matriz extracelular constituida por fibras y sustancia fundamental. Células de los tejidos de función trófica y mecánica Las células de este grupo de tejidos son extraordinariamente variadas tanto en su morfología y origen, como desde el punto de vista de su actividad funcional, dependiendo del tipo de tejido de procedencia. Sin embargo, las células más importantes, son las encargadas de producir la matriz extracelular (sustancia fundamental y fibras de la matriz extracelular). Dichas células están representadas por los fibroblastos/fibrocitos y células similares a ellos, como los condroblastos/condrocitos, osteoblastos/osteocitos, etc. Además de los fibroblastos y las células similares a estos, los tejidos de función trófica y mecánica cuentan con otros tipos celulares, siendo el tejido conectivo laxo el que posee una mayor representación de estos otros tipos celulares. Células especializadas en la secreción de la matriz extracelular De naturaleza epitelial • Ameloblastos del diente. • Células del plano semilunar del aparato vestibular del oído. • Células interdentales del órgano de Corti del oído interno. De naturaleza no epitelial • Tejido conectivo - Células mesenquimatosas. - Fibroblastos Tejido conectivo o mucoso o laxo o reticular o denso o elástico Tejido adiposo. Tejido conectivo pigmentario. - Pericitos • Tejido esquelético Cementoblastos/cementocitos. Odontoblastos/odontocitos. Condroblastos/condrocitos o Del cartílago hialino o Del cartílago elástico o Del fibrocartílago Osteoblastos/osteocitos. Células madre osteprogenitoras. 2º Curso Grado de Biotecnología
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• Otras variedades Hialocito del humor vítreo del ojo. Célula estrellada del espacio perilinfático del oído. Tipos de células en los tejidos de función trófica y mecánica Fijas: fibroblastos, adipocitos, condroblastos, osteoblastos… Móviles: los procedentes de la sangre, como neutrófilos, basfilos, esosinófilos, linfocitos, mastocitos, macrófagos, monocitos…
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Apuntes del alumno
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Actividades I.
Tejido adiposo de mamífero (Tinción Hematoxilina-eosina (1); Tinción negro Sudán (2). •
Identificar los tabiques conjuntivos (de distintos tamaños) y vasos sanguíneos.
•
Identificar y dibujar el tejido adiposo, dispuesto entre los tabiques conjuntivos.
•
Observar y dibujar los adipocitos. Identificar el escaso citoplasma que aparece teñido restringido a la periferia, y el núcleo. La mayor parte del citoplasma aparece ópticamente vacío al estar ocupado "in vivo" por lípidos, que se extraen en el proceso de inclusión de la pieza de la biopsia.
•
Identificar las gotas lipídicas teñidas de color negro. Esta tinción es exclusiva para la grasa, por lo que obtenemos una imagen complementaria a la preparación anterior.
Dibuje y nombre los diferentes componentes de este tejido (20X)
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II.
Tendón humano (Tinción Hematoxilina-eosina (3)). •
Observar el tejido conjuntivo denso regular y describir las diferencias con el denso irregular.
•
Diferenciar los núcleos y la disposición de los fibroblastos de este tejido.
Usando el objetivo de 40X dibuje lo que observa, nombre cada componente y haga un esquema de la disposición de las fibras colágenas comparándolas con las observadas en la dermis.
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III.
Hueso humano (Hematoxilina/eosina (4)). •
Identificar la osteona.
•
Buscar los conductos de Havers y de Volkmann.
•
Visualizar los osteocitos contenidos en las lagunas.
•
Buscar los canalillos de unión entre los osteocitos.
Dibuje la estructura del hueso a 4x señalando los distintos tipos de conductos.
Dibuje la estructura del hueso a 40x señalando la organización de la matriz y las células que se observan.
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Práctica 7 TEJIDO NERVIOSO
Objetivos 1. Apreciar diferentes métodos de tinción usados en el tejido nervioso: tinción de Golgi, tinción de Nissl. 2. Observar preparaciones de cerebelo con diferentes métodos de tinción: tinción de Golgi y tinción de Nissl. 3. Identificar motoneuronas, interneuronas y fibras sensoriales en la médula espinal. 4. Identificar todos los tipos celulares explicados en preparaciones de cerebelo con tinción de Golgi. 5. Observar la estructura del nervio periférico.
Materiales •
Microscopio de luz de campo claro
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Nervio Periférico: Tinción de tetróxido de osmio
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Médula de ratón: Tinción de Nissl
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Cerebelo de rata: Tinción de Nissl
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Cerebelo de rata: Tinción de Golgi
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Introducción El sistema nervioso se divide en: • SNC (sistema nervioso central): formado por cerebro y médula espinal. • SNP (sistema nervioso periférico): constituido por los tejidos situados fuera del SNC.
Tejidos nerviosos centrales El sistema nervioso central está formado por el cerebro y la médula espinal, que a su vez están constituidos por sustancia blanca y sustancia gris. Esta última está compuesta de cuerpos neuronales y sus axones, además de una masa de células de soporte (neuroglía). Por otro lado, la sustancia blanca posee los tractos de las fibras nerviosas, algunos de los cuales están mielinizados. La neuroglia forma casi la mitad de la masa total del SNC y está compuesta por oligodendrocitos, astrocitos, microglía y células ependimarias (como se muestra en la práctica 5).
Hemisferios cerebrales Encéfalo anterior Diencéfalo
Tálamo Hipotálamo
Cerebro
Mesencéfalo Tronco encefálico
Protuberancia Bulbo raquídeo
Cerebelo
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El cerebelo es el encargado de mantener la postura y el equilibrio y coordina la actividad muscular. Consta de una corteza formada por sustancia gris y una zona central de sustancia blanca. La corteza cerebelosa forma una serie de hendiduras onduladas profundas o folia, sostenidas por una medula central ramificada de sustancia blanca. Está constituida por 3 capas: • Capa molecular, es la más externa y posee pocas neuronas y muchas fibras sin mielinizar. • Capa intermedia, formada por una sola capa de neuronas gigantes conocidas como células de Purkinje. Se caracterizan además de por su tamaño, por poseer un árbol dendrítico muy elaborado y un gran número de espinas dendríticas
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Capa granular, es la más interna y posee muchísimas células como su propio nombre indica.
Médula espinal Es la encargada de llevar los impulsos nerviosos a los 31 pares de nervios raquídeos, comunicando el encéfalo con el cuerpo mediante dos funciones básicas: la aferente, conduciendo los impulsos sensitivos hacia el cerebro, y la eferente guiando los impulsos motores desde el cerebro hacia los efectores. Entre sus funciones también se encuentra el control de movimientos inmediatos y vegetativos, como el acto reflejo, el Sistema Nervioso Simpático y el Parasimpático. El diámetro de la médula espinal varía en función de la región, por ejemplo, en las regiones cervical y lumbar, el volumen de sustancia gris es mayor debido a la inervación sensorial y motora de los miembros, lo que se traduce en un mayor grosos de la médula. En una sección transversal de médula ósea la masa central en forma de mariposa corresponde a la sustancia gris y el resto a la sustancia blanca. La sustancia gris de la médula se presenta en el centro y sus pares son: • Astas dorsales: o posteriores, contienen cuerpos celulares procedentes de las pequeñas neuronas sensoriales. Comprenden el núcleo posteromarginal, la sustancia gelatinosa y el núcleo propio. • Asta intermediolateral: contiene los cuerpos celulares de las neuronas aferentes simpáticas, preganglionares. Solo se encuentra en los segmentos torácicos y lumbares superiores de la médula. • Astas ventrales: o anteriores, son las más prominentes y se componen de los cuerpos celulares de las grandes neuronas motoras (motoneuronas). • Zona intermedia: contiende el núcleo dorsal de Clarke y un gran número de interneuronas. Asta dorsal Asta intermediolateral
Zona intermedia
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Asta ventral
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Tejidos nerviosos periféricos Son estructuras anatómicas que pueden contener cualquier combinación de fibras nerviosas. Cada nervio está formado como mínimo por un fascículo de fibra nerviosa (axón). Dichos fascículos poseen células de Schwann rodeadas te tejido laxo llamado endoneuro, los espacios existentes entre dichas células se conoces como nodos de Ranvier. A su vez, a los fascículos los envuelve una capa de denso tejido colágeno llamada perineuro. Si el nervio está formado por más de un fascículo, estos están unidos a través de una capa de tejido colágeno laxo, conocido como epineuro. Existen puntos del axón donde hay estrechos canales de citoplasma retenido, que conectan el cuerpo principal del citoplasma de una célula de Schwann con la estrecha zona de citoplasma de otra célula de Schwann adyacente. Estas regiones no compactas se denominan: incisuras o hendiduras de Schmidt Lanterman.
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Apuntes del alumno
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Actividades I.
Identificar el nervio periférico (Tinción de tetróxido de osmio). •
Identificar en una fibra nerviosa el axón neuronal.
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Describir la asociación de la célula de Schwann con el axón.
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Identificar los nodos de Ranvier y los espacios internodales. Dibuje una fibra nerviosa, identificando cada elemento a 40x.
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II.
Médula de ratón (Tinción de Nissl (2)). •
Observar la estructura medular, la sustancia blanca y la sustancia gris medular.
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Diferenciar las astas anteriores y posteriores de la sustancia gris.
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Buscar y pintar las grandes motoneuronas del asta ventral.
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Observar los gránulos de Nissl dentro del soma neuronal.
Dibuje a 4x la estructura de la médula espinal, indicando cada una de sus partes.
Dibuje a 40x motoneuronas del asta ventral señalando el núcleo, nucleolo y los gránulos de Nissl.
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III.
Identificar la zona sombreada en amarillo en las siguientes imágenes como: sustancia gris, sustancia blanca, capa molecular y capa granular del cerebelo.
Capa/ Sustancia _____________ ___
Capa/ Sustancia Capa ______________
Capa/ Sustancia _______________
Capa/ Sustancia Capa ______________
Señala con flechas las capas identificadas en la figura superior y señalar además dónde se encuentra la capa de células de Purkinje.
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IV. Observar a bajos aumentos la estructura de la laminilla cerebelosa diferenciando las tres capas que lo forman, diferenciando la sustancia blanca y la gris.
Dibuje a 4x, 10x y 20x ó 40x la estructura de la laminilla cerebelos identificando las distintas capas si es posible.
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V. Ejemplos de tinción de Golgi: 1) Imagen de la célula de Purkinje en la corteza cerebelosa de ratón adulto joven. Nótese la impregnación casi completa de la célula. Aumento x 175 2) Imagen a mayor aumento de la neurona anterior en la cual se observa la fineza de la impregnación al aparecer un gran número de espinas dendríticas. Aumento x 525. 3) En esta fotografía se aprecia la fineza de la impregnación de las ramas dendríticas de las células estrelladas profundas de la corteza cerebelosa de ratón joven. Aumento x 112. 4) Neuronas bipenachadas del hipocampo. Obsérvese la gran cantidad de dendritas en ambos extremos que aparecen impregnadas. Aumento x 140.
Dibuje a 20x una célula de Purkinje.
Dibuje a 40x la glía de Bergman.
Observar la estructura de los vasos sanguíneos con esta tinción. 1. Dibuja las células de Purkinje señalando el árbol dendrítico con sus espinas dentríticas, el soma, el cono axonal y el axón. 2. Dibujar alguna célula estrellada de la capa molecular. 3. Identificar las células grano con sus dendritas en forma de garra de ave. 4. Identificar la glía de Bergman.
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2.
3.
4.
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Práctica 8 DIVISIÓN Y CICLO CELULAR. MITOSIS Y MEIOSIS.
Objetivo El objetivo de esta práctica es estudiar con microscopía óptica las distintas fases del ciclo celular en células eucariotas y las características celulares en los diferentes estadios de la meiosis. Reconociendo cada una de las diferentes fases, ordenándolas secuencialmente y cuantificando cada una de ellas.
Material • • • • • • • • •
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Raíz de cebolla. Previamente a la práctica, se deja crecer durante varios días la cabezuela con raíces de una cebolla en un vaso de agua. Pinzas y bisturí o cuchilla. Fijador: Etanol/ácido acético (3:1 v/v). Macerador: Ácido clorhídrico/etanol (1:1 v/v). Solución lavadora: Acido acético 45% (v/v). Orceína acética: 2% (p/v) en ácido acético al 45% (v/v). Portaobjetos y cubreobjetos. Rejilla ocular calibrada. Microscopio.
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Introducción El desarrollo de una sola célula, el huevo fecundado, hasta la etapa de constitución de un organismo multicelular, necesita de fenómenos tales como la división celular, el crecimiento y la progresiva especialización para la realización de diferentes funciones. El mecanismo de la división celular se conoce como mitosis en todas las células excepto en el caso de las células germinativas que se conoce como meiosis. La mitosis o división mitótica de una sola célula origina dos células hijas genéticamente idénticas a la célula progenitora. Después de la fase de mitosis, las células hijas entran en un periodo de crecimiento y de actividad metabólica antes de que se dividan de nuevo. El intervalo de tiempo que transcurre entre las divisiones mitóticas, es decir, el ciclo de vida de cada célula, se denomina ciclo celular. A medida que el desarrollo del huevo fertilizado progresa, para producir un organismo multicelular, los tipos celulares y sus descendientes se especializan progresivamente hasta formar tejidos con funciones específicas diferentes. El proceso mediante el cual las células se especializan se denomina diferenciación. En el organismo completamente desarrollado, las células diferenciadas de algunos tejidos, tales como las neuronas del sistema nervioso, pierden la capacidad de dividirse; mientras que determinados tipos celulares de otros tejidos, como las células epiteliales que revisten el aparato gastrointestinal, presentan durante toda la vida ciclos continuos de divisiones mitóticas. Entre estos dos extremos, otras células, como las del hígado, no presentan mitosis en los organismos adultos aunque retienen la capacidad de entrar en mitosis si las necesidades así lo exigen. La meiosis es una característica básica de la vida de todos los eucariotas con reproducción sexual. Mediante dos divisiones celulares seriadas, el número diploide de cromosomas se reduce a un número haploide en los gametos. Sin esta reducción, habría una duplicación progresiva del número de cromosomas en sucesivas generaciones en la fertilización. Además de asegurar que el número de cromosomas permanezca constante, la meiosis genera diversidad genética en la naturaleza mediante la elección independiente de cromosomas y la recombinación genética.
Mitosis El proceso de división de las células somáticas, o mitosis, sucede en la fase M del ciclo celular y dura entre 30 y 60 minutos en los mamíferos. La mitosis tiene dos funciones principales: primero es la fase en la cual los cromosomas duplicados en la fase S se distribuyen de manera idéntica y equitativa entre las dos células hijas; este fenómeno se conoce como cariocinesis. En segundo lugar, la mitosis es la fase en la cual la célula que se divide se segmenta en dos células hijas genéticamente idénticas por división citoplasmática o citocinesis. Aunque la cariocinesis es siempre igual y simétrica, la citocinesis puede, en algunas situaciones, dar lugar a la formación de dos células hijas con cantidades desiguales de citoplasma o de orgánulos citoplasmáticos. Ciclo celular 2º Curso Grado de Biotecnología
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Históricamente sólo se reconocían dos fases del ciclo celular: la fase durante la cual tiene lugar la mitosis, que sucede generalmente durante un tiempo relativamente corto, y la fase durante la cual no existe división. Esta segunda fase, denominada interfase, ocupa generalmente la mayor parte del ciclo de vida de la célula. Con el desarrollo de las técnicas de marcaje nuclear, se vio que las células que van a sufrir división tienen un periodo discreto durante la interfase en el que se duplica el ADN; esta fase, descrita como la fase de síntesis o fase S del ciclo celular, se completa algo antes de que se inicie la mitosis (también llamada fase M). Esta interfase se puede dividir en tres fases separadas. Entre el final de la fase M y el comienzo de la fase S,, está la fase G1; ésta es generalmente mucho más larga que las otras fases del ciclo. Durante la fase G1 las células crecen y realizan las funciones especializadas que les corresponden de acuerdo con el tejido al que pertenecen. El intervalo entre el final fina de la fase S y el comienzo de la fase M, es la fase G2,, que es relativamente corta y constituye el periodo en el cual las células se preparan para la división mitótica. Algunos tipos de células progresan de una manera continua a través del ciclo celular celula en situaciones donde existe crecimiento de los tejidos o recambio celular. Las células que pierden la capacidad de dividirse, como las nerviosas, abandonan el ciclo después de la fase M y entran en un estado funcional prolongado que se conoce como fase G0. G Algunos tipos celulares entran en esta fase pero retienen la capacidad de reentrar al ciclo celular cuando se estimulan de manera conveniente. Algunas células hepáticas pueden entrar a una fase G2 prolongada en donde permanecen como células funcionales a pesar de la presencia de una dotación de ADN doble o triple de la normal. La fase M es relativamente corta y es el periodo en el cual el ADN, duplicado durante la fase S, se distribuye de una manera equitativa entre las dos células hijas cuando tiene lugar l la división celular. En general, las fases S, G2 y M del ciclo son de duración relativamente constantes, y necesitan de varias horas para completarse mientras que la fase G1 es muy variable, durando en algunos casos varios días. La fase G0 puede durar durante toda la vida de una célula. El ciclo celular, y por tanto el ritmo de división celular, está controlado por factores intrínsecos y extrínsecos. Las hormonas son factores extrínsecos que regulan los ciclos celulares de muchas células y coordinan así así el crecimiento y la función de los tejidos. Hasta ahora se sabe poco de los factores intrínsecos que regulan el ciclo celular. Una buena comprensión de todos los factores que controlan el ciclo celular parece ser un prerrequisito para elucidar los efectoss primarios que ocurren en condiciones de división celular incontrolada, como sucede en el cáncer.
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La mitosis es un fenómeno dinámico continuo que tradicionalmente se ha dividido en fases o períodos: profase, prometafase, metafase, anafase y telofase, cada cada una de las cuales se reconoce rápidamente con el e microscopio óptico (figura 3.1). ). En las células eucariotas, la cariocinesis y la citocinesis necesitan de la presencia de una estructura denominada aparato o huso mitótico.. Esta estructura posee microtúbulos dispuestos longitudinalmente que se extienden entre dos centros organizadores, denominados centriolos,, colocados en los dos polos de la célula que se va a dividir. El huso mitótico se hace visible dentro del citoplasma solamente durante la fase M del ciclo celular, ya que se despolimeriza rápidamente después de terminar la mitosis.
mitosis Figura 3.1. Esquema de los principales estadios de la mitosis. • Profase:: El inicio de esta fase de la mitosis viene dado por el momento en el que los cromosomas replicados, constituidos por dos cromátidas hermanas, se hacen visibles dentro del núcleo. Durante los estadios siguientes de la profase, los cromosomas se hacen más condensados, se acortan y el núcleo desaparece. La disolución de la membrana nuclear marca el final de la profase. Durante la profase, 2º Curso Grado de Biotecnología
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los dos pares de centriolos (duplicados en la interfase) emigran a los polos opuestos de la célula. Los centriolos permanecen unidos por numerosos microtúbulos longitudinales que constituyen en conjunto el denominado huso mitótico; los túbulos alargados del huso, como los centriolos, se mueven independientemente. • Prometafase: Empieza súbitamente con la rotura de la envoltura nuclear. Los cromosomas se unen a los microtúbulos del huso mediante sus cinetocoros y experimentan un desplazamiento activo. • Metafase: Se completa el huso mitótico y los cromosomas se disponen en el ecuador del huso, región conocida como placa metafásica o ecuatorial. En esta fase las dos cromátidas de cada cromosoma permanecen unidas por el cinetocoro. • Anafase: Este estadio de la mitosis se caracteriza por la separación sincrónica de las dos cromátidas de cada cromosoma, las cuales emigran luego gracias al huso hasta los polos opuestos de la célula, asegurándose una exacta distribución del material genético duplicado. Hacia el final de la anafase se encuentran reunidos en los polos opuestos celulares dos grupos de cromosomas idénticos (las primitivas cromátidas). • Telofase: Durante la fase final de la mitosis, los cromosomas empiezan a desempaquetarse y a adoptar la configuración que presentan en la interfase. Se restituye la membrana nuclear y reaparecen los nucléolos. El fenómeno de la citocinesis también se desarrolla en esta fase; el plano de división citoplasmática viene dado por la posición del ecuador del huso, originándose de esta forma dos células del mismo tamaño. La membrana plasmática que rodea el ecuador del huso se invagina hasta constituir un surco circunferencial que rodea a la célula, el surco de clivaje, el cual progresivamente estrangula a la célula hasta que se divide en las dos células hijas. En células animales, se presenta un anillo de microfilamentos inmediatamente por debajo de la superficie del surco de clivaje y se piensa que la citocinesis tiene lugar como resultado de la contracción de este anillo filamentoso. En células vegetales la citocinesis promueve la formación de una nueva pared celular entre las dos células hijas. Al inicio de la fase G1, el huso mitótico se despolimeriza y en numerosos tipos celulares el par de centriolos únicos comienza a duplicarse en previsión de la siguiente división mitótica.
Cromosomas mitóticos En general, el núcleo de todas las células posee una misma dotación fija de ADN, cantidad denominada genoma. El genoma es idéntico en todas las células (excepto en las células germinativas y algunas otras excepciones) del mismo individuo. El ADN del genoma está asociado íntimamente con proteínas, denominadas nucleoproteínas, y dispuesto en forma de determinado número de filamentos discretos denominados cromosomas. Las células de cada especie tienen un número fijo de cromosomas (número diploide) conocido 84
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como cariotipo (46 en el hombre). Los cromosomas funcionan en pares, denominados pares homólogos, y cada miembro del par posee una longitud y una estructura similar de ADN. Durante la interfase, los cromosomas están como una masa desespirilizada dentro del núcleo; esta disposición puede facilitar la expresión genética, fenómeno que tiene lugar especialmente dentro de las fases G1 y G0 del ciclo celular. Histológicamente, los cromosomas no son visibles dentro del núcleo de las células en interfase. Durante la fase S, cada cromosoma se duplica y los dos cromosomas idénticos permanecen unidos. En el comienzo de la mitosis, los cromosomas duplicados se empaquetan (espiralizan) fuertemente y se condensan, de tal manera que se hacen visibles con el microscopio de luz. Esta disposición de los cromosomas durante la mitosis es simplemente un mecanismo de empaquetamiento del genoma duplicado que se puede entonces distribuir de manera idéntica y equitativa entre las dos células hijas durante la mitosis.
Figura 3.2. Cromosomas mitóticos y cariotipo. La figura 3.2 ilustra los cromosomas de un cultivo de células humanas in vitro detenidas en la profase de la mitosis. Los cromosomas, tal como se ven en la mitosis, están duplicados y cada parte del cromosoma doble se conoce con el nombre de cromátida. Las dos cromátidas de cada cromosoma permanecen unidas en un punto denominado cinetocoro o centrómero, que tiene el aspecto de una constricción en cada cromosoma mitótico. Cada miembro de un par de cromosomas homólogos es similar en longitud, localización del cinetocoro y patrón de bandas. La técnica de bandeo de cromosomas constituye una técnica útil para la identificación de los cromosomas y, especialmente, para la investigación de anomalías cromosómicas.
Meiosis La meiosis se realiza mediante dos divisiones celulares especiales. La primera división meiótica se caracteriza porque de cada par de cromosomas homólogos duplicados uno emigra a un polo y el otro al opuesto; con ello se consigue reducir a la mitad el número de cromosomas (de 2n que es la dotación diploide, se pasa a n que es la dotación haploide).
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Antes de iniciarse la meiosis, la cantidad de ADN se ha duplicado (ha pasado de 2c a 4c) en el período S, igual que ocurre en las células somáticas que van a entrar en mitosis.
Mitosis
Meiosis
2n
2n
4c
4c
2n
2n
n
n
2c
2c
2c
2c
⇐
1ª División
⇐
2ª División
n
n
n
n
c
c
c
c
Figura 4.1. Diferencias conceptuales entre mitosis y meiosis. (n: dotación cromosómica, y c: cantidad de ADN). Al final de la primera división meiótica, cada célula hija tiene un contenido en ADN igual a 2c, como en las células hijas procedentes de la mitosis, ya que si bien hay sólo la mitad de los cromosomas en las células procedentes de la primera división meiótica, cada uno de éstos posee dos cromátidas. Las células hijas de la mitosis poseen dos dotaciones de cromosomas, pero cada cromosoma tiene una sola cromátida. Por tanto, mientras que en la mitosis, a partir de unas células con 2n cromosomas y 4c de ADN, se producen dos células hijas con 2n cromosomas y 2c de ADN, en la primera división meiótica se producen dos células hijas con n cromosomas y 2c de ADN. La reducción de esta cantidad de ADN a c (que es la que tendrá cada gameto) tiene lugar en la segunda división meiótica. De este modo, la meiosis es un mecanismo destinado a la distribución de las unidades hereditarias o genes, permitiendo la recombinación independiente y al azar. Primera división meiótica • Profase I: La profase de la primera división meiótica es mucho más larga que la profase mitótica. Existen cinco estadios: - Leptoteno: En este primer estadío de la profase I cada cromosoma es muy largo y se diferencia un patrón arrosariado de cromómeros, localizados en regiones de cromatina compacta. En el centrómero hay un grumo de cromatina condensada intensamente teñido, la heterocromatina centromérica que se observa durante los estadios tempranos de la profase I. Frecuentemente, los cromosomas se disponen polarizados con los telómeros pegados a la envoltura nuclear en la proximidad de los centriolos. Esta orientación en "bouquet" facilitaría el apareamiento inicial de los cromosomas homólogos. - Cigoteno: Comienza con el apareamiento de los cromosomas homólogos que hasta ese momento no estaban relacionados. El apareamiento del estadio de leptoteno era entre las cromátidas hermanas. En este estadio va a ocurrir un 86
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apareamiento entre cromosomas homólogos. Algunas veces los cromosomas homólogos empiezan a unirse por sus extremos polarizados y continúan apareándose hasta el otro extremo. Otras veces, la unión tiene lugar simultáneamente en varios puntos a lo largo del cromosoma. El apareamiento es exacto y específico; ocurre punto por punto y cromómero por cromómero en cada cromosoma homólogo y se ve favorecido por la polarización. - Paquiteno: Comienza cuando el apareamiento entre cromosomas homólogos es completo. A medida que avanza el proceso tiene lugar una contracción longitudinal de los cromosomas que se hacen más cortos y gruesos. En ese momento se aprecia la constitución doble (dos cromosomas homólogos) de cada bivalente (bivalente alude a cada par de cromosomas homólogos). Aunque, se ven los cromosomas homólogos, todavía no se distinguen las dos cromátidas de cada cromosoma. - Diploteno: En esta etapa es evidente que cada cromosoma homólogo de cada bivalente está constituido por dos cromátidas. Los cromosomas son aún más cortos que en la etapa anterior y las cromátidas adquieren aspecto laxo. El inicio de esta etapa viene marcado por el comienzo de la separación de los cromosomas homólogos de cada bivalente, como si se repeliesen. Los complejos sinaptonémicos van desapareciendo a medida que se produce la repulsión. Sin embargo, la separación no es completa ya que los cromosomas homólogos permanecen unidos en aquellos puntos donde se ha producido sobrecruzamiento (“crossing over”); estos puntos se denominan quiasmas. En los quiasmas persisten los complejos sinaptonémicos. Los quiasmas se observan en todos los animales y vegetales (salvo excepciones), y aunque su número es muy variable incluso en cromosomas pequeños al menos hay un quiasma por bivalente. La localización de los quiasmas varía de unas células a otras en el mismo cromosoma del mismo individuo. - Dictioteno: Es un estadio difuso que aparece generalmente en la ovogénesis y que puede ser de larga duración (en ovocitos humanos puede durar hasta 40 años). En este periodo la cromatina vuelve adquirir un aspecto laxo y es cuando se forman los cromosomas plumosos, estudiados principalmente en ovocitos de anfibios, pero que también aparecen en cromosomas humanos y en los de otras muchas especies. - Diacinesis: Es la última etapa de la profase I y es difícil distinguir cuándo empieza. Los cromosomas aparecen más condensados. Se observa que los quiasmas van desplazándose hacia los extremos del bivalente. El movimiento se inicia desde los centrómeros en ambas direcciones. Los bivalentes empiezan a perder quiasmas que se van desplazando hacia los extremos (fenómeno de terminalización) pero siempre quedan algunos quiasmas, al menos los terminales, hasta la metafase I.
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• Prometafase I: Viene marcada por la condensación al máximo de los cromosomas hasta mostrar la estructura del cromosoma metafásico, la disminución progresiva de tamaño del nucléolo hasta que desaparece (desintegración) y la desaparición de la membrana nuclear. Los microtúbulos del huso se unen a los cinetocoros. Con microscopía electrónica se ha observado que cada cromosoma homólogo tiene dos cinetocoros, uno por cromátida; por lo que cada bivalente o tétrada tiene cuatro. En la meiosis, los dos cinetocoros de cada homólogo quedan del mismo lado y no en lados opuestos, como en la mitosis. Cada homólogo queda unido por los microtúbulos a un polo y no a ambos polos como en la mitosis; por lo que ambas cromátidas se comportan en cada homólogo como una unidad funcional. Así, funcionalmente en la meiosis, hay un solo cinetocoro por cromosoma aunque estructuralmente haya dos colocados del mismo lado. • Metafase I: Los bivalentes se disponen en el ecuador, listos para separarse. Todavía hay algunos quiasmas y por supuesto, los terminales. Si el bivalente es largo presenta una serie de aberturas entre los quiasmas. Si es corto, una sola abertura de forma anular. • Anafase I: Los cromosomas homólogos de cada bivalente, unidos por su centrómero, se dirigen a los respectivos polos. Los cromosomas cortos, conectados casi siempre por un quiasma terminal, se separan rápidamente. Los cromosomas largos, con quiasmas intersticiales y no terminales, se retrasan en su separación. Vistos de perfil, los cromosomas anafásicos presentan forma de “V”, con brazos iguales o de longitud diferente según la posición del centrómero, que queda representado por el vértice de la “V”. Debido al intercambio de segmentos entre cromátidas homólogas, cuando los cromosomas homólogos se separan en la anafase poseen una composición genética diferente de los correspondientes maternos y paternos. Generalmente, ninguna de las dos cromátidas conserva su naturaleza inicial y ambas cromátidas del mismo cromosoma difieren entre sí. • Telofase I: Comienza cuando los grupos anafásicos llegan a sus respectivos polos. Los cromosomas pueden persistir condensados por algún tiempo, mostrando todos sus caracteres morfológicos. Aunque se admite que en la mayoría de los vegetales y animales, hay una verdadera interfase entre la primera y segunda división meiótica, estas células en interfase suelen ser difíciles de identificar morfológicamente. Se considera que la causa es el poco tiempo que permanecen en ese estado, ya que enseguida inician la segunda división meiótica. En esta interfase entre las dos divisiones meióticas no hay duplicación del ADN. El resultado de la primera división meiótica es la formación de dos núcleos hijos que sufrirán la segunda división meiótica. Los cromosomas se encuentran en número haploide, pero cada uno está constituido por dos cromátidas; luego tienen n cromosomas y 2c de contenido en ADN. Es decir, la mitad de los cromosomas que una célula postmitótica, pero la misma cantidad de ADN. La segunda división meiótica tiene como objeto separar esas dos cromátidas (2c) dejando dos células haploides (n) con un contenido en ADN igual a c. 88
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Cigonema
Metafase I
Leptonema
Profase I
Anafase I
Profase II Paquinema
Metafase II Diplonema
Anafase II Diacinesis
Gametos
Figura 4.2. Representación esquemática de las fases de la meiosis. Segunda división meiótica La segunda división meiótica es como una mitosis a la que las células llegan con una dotación haploide de cromosomas en vez de diploide. Se distinguen las siguientes etapas: • Profase II: Es corta y similar a la de la mitosis. No presenta los períodos señalados en la profase I. • Metafase II: Los cromosomas se disponen en el plano ecuatorial. • Anafase II: El centrómero se rompe separándose los cinetócoros, las dos cromátidas hijas se separan y se dirigen a los polos opuestos.
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• Telofase II: Se diferencia como una célula individual (gameto). Como en esta segunda división de la meiosis se han separado las mitades longitudinales (cromátidas) de cada cromosoma; cada uno de los cuatro núcleos de esta fase tendrá una cromátida de lo que inicialmente fue una tétrada. Esa cromátida diferirá genéticamente de cualquiera de las presentes en los correspondientes cromosomas paterno o materno pues éstos habrán intercambiado segmentos homólogos entre cromátidas homólogas. Cada núcleo posee un número haploide de cromosomas en el que cada cromosoma está representado una sola vez. Cada uno de los cuatro núcleos hijos tiene una composición genética diferente.
Figura 4.3. Comparación entre meiosis y mitosis.
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Actividades
I. Estudio de la mitosis celular. Procedimiento • Las células en mitosis deben observarse en los ápices de las raicillas de cebolla, por lo que se corta un centímetro de la punta de las raíces. •
Introducir en fijador durante 15 minutos para mantener el estado de división en el que se encuentren las células.
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Pasar al macerador durante 7 minutos para que eliminar la sustancia intercelular.
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Sumergir la raicilla en la solución lavadora durante 1 minuto para eliminar el exceso de etanol que podría modificar la tinción.
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Teñir con orceína acética. Los cromosomas se tiñen de color rojo oscuro.
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Colocar el material en un portaobjetos y cortar los 2 mm finales del ápice. Desechar el resto.
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Poner un cubre sobre los 2 mm de raicilla y repiquetear sobre el mismo suavemente con una lanceta o aguja enmangada para conseguir disgregar las células. Presionar el cubre para que todas las células queden en un mismo plano (técnica de "squash").
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Observar en el microscopio.
Realiza un muestreo y cuantifica cada una de los estadios del ciclo celular observado en la preparación. Indica el resultado en la siguiente tabla:
Profase Prometafase Metafase Anafase Telofase Citocinesis Interfase
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2º Curso Grado de Biotecnología •
Universidad Miguel Hernández
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Curso 2011-2012
Localizar células en cada una de las fases del ciclo celular. Realizar dibujos de ellas (indicar la magnificación) y especificar las estructuras que se observan.
2º Curso Grado de Biotecnología
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Universidad Miguel Hernández
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Curso 2010-2011
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Responder a las siguientes cuestiones: •
¿Cuál es el estadio que se observa más frecuentemente y por qué?
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¿Qué criterios has seguido para identificar microscópicamente cada una de las fases? Indícalos.
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Explica detalladamente la metodología de muestreo seguida en la cuantificación.
II. Estudio de la meiosis celular. En muchos organismos vegetales tiene lugar una doble generación de individuos: el individuo diploide o esporofito y el haploide o gametofito. Esto ocurre tanto en el sexo masculino como en el femenino. La meiosis ocurre en el esporofito y da como resultado inmediato esporas haploides que originarán el gametofito. Éste, sin necesidad de una nueva meiosis, mediante mitosis de un grupo de células especializadas y su diferenciación, forma los gametos. Al unirse gametos de diferente sexo se forma el cigoto que originará el esporofito y el proceso se repite. En las plantas superiores como las angiospermas, el gametofito es apenas aparente y queda reducido a su mínima expresión pues tan sólo consta del grano de polen (en el sexo masculino) o del saco embrional (en el sexo femenino). Además del correspondiente gameto, ambas estructuras comprenden una o varias células haploides no germinales que pueden considerarse el soma del gametofito. El órgano reproductor masculino de la flor de angiospermas es la antera. En su interior se encuentran las células madres de las microsporas en las que se realiza la meiosis. Cada una de éstas da lugar a cuatro microsporas. El órgano reproductor femenino de las angiospermas es el ovario. En su interior las células madres de las macrosporas o megasporas realizan la meiosis. Cada una de ellas da lugar a cuatro macrosporas o megasporas, de las que sólo queda una, desapareciendo las demás.
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2º Curso Grado de Biotecnología •
Universidad Miguel Hernández
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Curso 2011-2012
Localizar, dibujar y ordenar secuencialmente células en cada una de las fases de la meiosis.
2º Curso Grado de Biotecnología
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Universidad Miguel Hernández
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Curso 2010-2011
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Con la máxima magnificación examinar y dibujar las estructuras presentes en los cromosomas (quiasmas, centrómeros, cromómeros, etc.).
Localizar un grupo de células en metafase II. Contar el número de cromosomas para cada célula e indicarlo en la siguiente tabla:
Células Masculino Femenino 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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2º Curso Grado de Biotecnología •
Universidad Miguel Hernández
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Curso 2011-2012
Responder a las siguientes cuestiones: •
¿Son todos los cromosomas iguales (posición del centrómero) dentro de una misma célula en esta fase?
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¿Existe variación entre ambos sexos? ¿Cómo explicarías esa variación?
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Compara la morfología de este tipo de división celular con la división celular normal (mitosis). Indica las analogías y diferencias que encuentres entre ambos tipos de división celular a nivel de microscopio óptico.
2º Curso Grado de Biotecnología
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Universidad Miguel Hernández
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Curso 2010-2011
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