CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS DEL NOROESTE, S. C.

Programa de Estudios de Posgrado

Detección de agentes virales en ostión Japonés (Crassostrea gigas)

T E S I S Que para obtener el grado de

Doctor en Ciencias Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales (Orientación en: Biotecnología) p

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Valérie Barbosa Solomieu La Paz, B. C. S.,(Junio-2004)

CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS DEL NOROESTE, S. C. Programa de Estudios de Posgrado Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales (Orientación en Biotecnología)

DETECCION DE AGENTES VIRALES EN OSTION JAPONES (Crassostrea gigas) TESIS

Que para obtener el grado de Doctor en Ciencias presenta

Valérie Barbosa Solomieu La Paz, B. C. S. (Junio de 2004)

COMITE TUTORIAL

Dr. Ricardo Vázquez Juárez

(co-director)

CIBNOR, La Paz, Mexico

Dr. Felipe Ascencio Valle

(co-director)

CIBNOR, La Paz, Mexico

Dr. Tristan Renault

(tutor)

IFREMER, La Tremblade, France

Dr. Ralph Elston

(tutor)

AQUATECHNICS, INC., Seattle, USA

Dr. Jorge de la Rosa Vélez

(tutor)

UABC, Ensenada, Mexico

COMISION REVISORA

Dr. Ricardo Vázquez Juárez

CIBNOR

Dr. Felipe Ascencio Valle

CIBNOR

Dr. Tristan Renault

IFREMER, France

Dr. Ralph Elston

AQUATECHNICS, INC., USA

Dr. Jorge de la Rosa Vélez

UABC

JURADO

Dr. Ricardo Vázquez Juárez

CIBNOR

Dr. Felipe Ascencio Valle

CIBNOR

Dr. Ralph Elston

AQUATECHNICS, INC.

Dr. Humberto Villarreal Colmenares

CIBNOR

Dr. Dariel Tovar Ramírez

CIBNOR

Suplente Dr. Pedro Enrique Saucedo Lastra

CIBNOR

PROLOGO Y DEDICATORIA

A mi madre, por estar siempre presente, a pesar de las distancias y los oceános… A mi padre, con quién habría querido compartir estos momentos y muchos más. A mis abuelos, quienes nunca han dejado de apoyarme, con todo mi cariño. A mi hermano y su esposa, parte de nuestra pequeña y dispersa familia. A todos aquellos que estuvieron a lo largo de este camino para iluminarlo con una sonrisa o una mano tendida. A quienes llenaron de magia y de alegría estos años. A quienes sabían que los sueños no están ahi para cumplirse sino para enseñarnos el camino hacia algo más grande aún. A la suerte que tengo de poder dedicarme a esto Que me hace tan feliz… A la dicha de haber llegado al final de este viaje donde se abre el horizonte y comienza otro camino… A lo impalpable e imprescindible.

Le debo una canción A lo imposible A la mujer, A la estrella Al sueño que nos lanza Les debo una canción indescriptible Como una vela inflamada En vientos de esperanza…

Silvio Rodríguez

AGRADECIMIENTOS

Antes que nada, quisiera expresar mi agradecimiento a todos aquellos que en un principio hicieron posible mi entrada al programa de Doctorado del CIBNOR : a la dirección de estudios de Posgrado, a los miembros de la comisión presente durante mi entrevista, a los compañeros que me asesoraron, al CONACYT por la beca que me otorgó durante estos largos años… Al Dr. Guy Nonnotte de la y al Pr. Patrick Jégo que ayudaron para los trámites sin los cuales no habría obtenido esa beca. Gracias, por supuesto, al Dr. Ricardo Vazquez, sin el cual jamas habria dirigido mis pasos hacia La Paz. Ciertas coincidencias de la vida resultan muy afortunadas y me alegro de contar con su amistad y su confianza. Gracias al Dr. Felipe Ascencio, quien aceptó ser mi co-director sin conocerme y quien ha estado presente en momentos clave, a su manera. Gracias al Dr. Ralph Elston, por haberme enseñado un poquito de lo mucho que sabe sobre patología de moluscos. Al Dr. Jorge de la Rosa por su disponibilidad y sus palabras de aliento. Al Dr. Tristan Renault quisiera dedicarle unas líneas con especial gratitud, cariño y admiración. Le agradezco haberme permitido compartir su espacio, su tiempo, su entusiasmo, su sencillez y su increíble capacidad de trabajo. Por dos inolvidables años de aprendizaje, por haberme ayudado a darle un rumbo nuevo a mi proyecto y por tantas y tantas risas… Mil gracias al Dr. Trevor Williams y al M.C. José Manuel Mazón Suástegui, por su desinteresada ayuda para la revisión de ciertas secciones de esta tesis. A la M.C. Olimpia Chong por su fantástico trabajo de edición en un tiempo récord y su buenisima vibra. Gracias a la Dra. Norma Hernández, por sus clases de Ingeniería Genética y su asesoria en asuntos de biologia molecular. A ella y a Arturo Sierra por haberme abierto las puertas. A todas las personas de la Unidad del CIB de Guaymas que tan lindo recibimiento me dieron. A Philippe Danigo y Carlos Reyes por su apoyo para el muestreo en Laguna San Ignacio. A todos los productores de Sonora que me echaron la mano… Mil gracias a todos aquellos que en el CIB me ayudaron con su tiempo, su experiencia, sus contactos, su asesoria técnica: Carmen Rodriguez, Tere y Sofi, de histología, Sandra Morales , Martin Ramirez, a la Chula, Miguel Robles, José Manuel Mazón, Teodoro Reynoso… A la Maestra Reina Romero por haberme dado la oportunidad de dar clases en el Tec, fue una experiencia fantástica. A toda la gente de redes y de informatica, de la biblioteca, de la administración… Gracias tanto al Dr. Sergio Hernández como a la Dra. Castellanos que tanto apoyo me brindaron en la medida de sus posibilidades y de la flexibilidad del reglamento… A toda la banda de Posgrado, a la Lic. Osvelia Ibarra, a pesar de los múltiples regaños, a la Lic. Lety Gonzalez, a Betty, a Liz, a la Sra. Lupita, a Claudia, a Brenda…, por su paciencia y por tantos ratos de cotorreo. A Horacio Sandoval por su buen humor y sus múltiples operaciones de rescate con mi maquinita, a Manuel Melero por estar siempre dispuesto a ayudar…

A todos mis compañeritos, que me ayudaron a integrarme rápidamente al laboratorio y con los cuales compartimos dos años de chamba, baile, acampadas y cotorreo en la periquera : Peter, Deliecita y Nacho, al Toño (ojalá sigamos colaborando !!!), Vania, Hever, Adrián, José Luis, Susana, Ma Esther, Estrellita, Lili, Meliza, Daniel, Dariel, Angel, Gabriel, Pablo, Florecita, Reina, Edilmar, Carlos Ceceña… Y en mi segunda temporada en el CIB a Barbarita, Deni, Vero, Friedman, Rodolfo, Normita, a todos mis compañeritos de changarro por haberme soportado en este periodo de mucha presión… A todísima la gente del laboratorio de la Tremblade, que es un lugar muy pequeño y muy especial ! A los doctores Philippe Goulletquer y André Gérard que me permitieron llegar a trabajar alli… A Maeva por su ayuda cuando recién llegué, a Serge por su buenisima compañia en el laboratorio desierto, a Bruno a pesar de su genio, a Florence y Martine por su disponibilidad y eficiencia, a la Dra. Isabel Arzul por haberme facilitado su bibliografia y tantos documentos, y por la tesis que escribió que fue un pilar para mi trabajo, a Nicole por el órden que impuso y por su genial carácter… A Bénédicte y Grégoire con todo cariño. A mis super compañeritos de la maison des stagiaires : Noèlia por supuesto (ánimo con esa tesis, Catalana !), Guénaelle, Nicolas, Niklas, Marc…. A Frede por todo lo que compartimos, al molestoso de Jean Luc, a Jean Côme, Jean-Baptiste, Cyrielle, a Mélanie por sus rides al alba, a Jean Pierre por haberme aguantado en su oficina, a Pierre y Laurence por su colaboracion, a Jean François Pépin por su especial sentido del humor, a Patrick Soletchnik por su canto y las ramitas de mimosa, a Stéphane Robert por tanta energia, a Joëlle por su indefectible sonrisa, a Daniel, a Tim, Andrea y Lara por los ratos tan chidos en su casita… A todos los que estuvieron alli, haciendo de cada dia algo ensanchante y divertido. En especial a las Tristannettes que tánto me costó dejar : a mi querida hermanita académica Gaëlle (ojala encuentres un camino que te haga feliz), a la güera Beatrice (espero estar en tu examen), a Kasia la super enojona y encantadora Polaca. Pero también a Lionel, el más quejumbroso y gruñón del universo (suerte con esos ostiones post-doctorales !) y a la pequeña Céline a quienes les deseo mucho amor y felicidad… A mis gûeritos preferidos, Pascale y Raphaël por todos esos apéros hasta el amanecer…sigan en su vibra y sendero tan particular… A Nolwenn por nuestros relajos Indochinescos repentinos en el laboratorio…. Y para terminar un agradecimiento muy especial para a mis amiguitos del alma. A Nachito y a Delia. Por haberme recibido en su casa, por haber estado siempre alli, para reir y llorar y compartir las preocupaciones y las alegrías. Espero que las angustias hayan quedado atrás y que que vengan tiempos tranquilos. Con un chingo de cariño a Pedrito... Sin ti nada habría sido igual. Tuve mucha suerte de encontrarte ! Voy a extrañarlos muchísimo. Y las últimas líneas van para Ernesto. Por haberse aparecido en mi vida y seguir ahi. Por toda su ayuda. Por la magia compartida y por todo lo que venga, donde quiera que nos lleven nuestros pasos…

« Aie toujours présent à l’esprit

que la nature n’est pas Dieu,

qu’un homme n’est pas une machine,

qu’une hypothèse n’est pas un fait ;

Et sois assuré

que tu ne m’auras point compris

partout où tu croiras apercevoir

quelque chose

de contraire à ces principes. »

Diderot, (De l’interprétation de la nature, 1754)

RESUMEN Las infecciones virales, capaces de provocar mortalidades masivas de peces, camarón y bivalvos, constituyen una amenaza real para la producción acuícola. En los años setenta, enfermedades provocadas por iridovirus condujeron a la eliminación del ostión Portugués (Crassostrea angulata) de importantes zonas de cultivo en Europa. De manera más reciente, se han detectado infecciones por virus de tipo herpes en varias especies de moluscos alrededor del mundo. Este tipo de infecciones han sido asociadas con mortalidades elevadas en Ostrea edulis y Crassostrea gigas. La purificación del virus herpes de ostreidos (OsHV-1) permtió su caracterización y el desarrollo de diversas técnicas de detección específica entre las cuales destacan dos herramientas moleculares : la PCR y la hibridación in situ (HIS). Estos protocolos, si bien han demostrado su eficiencia, no han sido sometidos a un proceso de validación stricto sensu. Por tales motivos, se llevaron a cabo varias series de análisis de muestras de colección que contribuyen a la comparación y la evaluación de ambas técnicas. Los resultados obtenidos con tejidos fijados e incluídos en parafina revelaron que la técnica más eficaz para el diagnóstico de OsHV-1 es la PCR con primers que amplifican fragmentos pequeños (