PROPEDÉUTICO DE ODONTOLOGÍA

BIOQUÍMICA BÁSICA 2012 Dagmar Stojanovic de Malpica Ph D Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, U.C.V.

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UNIDAD IV. ENZIMAS

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Relación entre el ∆G´o y la K´eq en una reacción química

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Ejemplos de cambios de energía libre de varias reacciones bajo condiciones estándares Reacción

∆G´o kJ/mol

ATP + H20 → ADP +Pi

-30,5

ATP + H20 → AMP + PPi

-45,6

PPi + H2 0 → 2Pi

-19,2

Glucosa + 6 O2 → 6CO2 + 6 H2 0

-2840

Palmítico + 23 O2 → 16CO2 + 16 H2 0

-9770

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¿El cambio de energía libre se relaciona con la velocidad de las reacciones químicas?

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El cambio de energía libre de una reacción no está relacionado con la velocidad de la reacción Una reacción con un valor de ΔG´ o negativo: ü  No indica que ocurre instantáneamente ü  Indica que la reacción es termodinámicamente favorable ü No indica la duración ( el tiempo) de la reacción

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La velocidad de una reacción química depende de la energía libre de activación ü  La velocidad de una reacción química depende de una barrera energética conocida como energía de activación (energía libre de activación: ΔG┼) ü  Este concepto aplica tanto para reacciones exergónicas como reacciones endergónicas ü  Citemos el siguiente ejemplo: la hidrólisis del ATP

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La energía libre de activación de la hidrólisis del ATP La reacción de hidrólisis del ATP es una reacción exergónica: ATP + H20 → ADP +Pi

∆G´o = - 30,5 kJ/mol ΔG┼ = +300 kJ/mol

ü Tiene un ΔG┼ alta, lo cual indica que la reacción bajo condiciones estándares es lenta ü La hidrólisis del ATP es termodinámicamente favorable, no obstante, es cinéticamente estable ü Observe que la reacción inversa (síntesis de ATP) es endergónica (∆G´o = + 30,5 kJ/mol) también presenta una ΔG┼ no obstante es superior al de la hidrólisis del ATP, por lo que es aún más lenta

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La mayoría de las reacciones químicas tienen una energía libre de activación

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La mejor manera de comprender este concepto es por medio del análisis gráfico del cambio de energía libre durante el curso de una reacción química (coordenada de reacción ó avance de reacción)

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Gráfico de coordenada de reacción ü Es un diagrama que describe los cambios de energía libre durante el curso de una reacción química ü La energía libre (eje de la Y) se grafica en contra del avance de la reacción (coordenada de reacción) ü Por conveniencia nos referiremos a la reacción S→P

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Diagrama de energía libre durante el curso de una reacción ΔG┼ (Energía libre de activación) ΔG┼ : S → P

S ΔG┼: S ← P

P

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Número de moléculas

Solo una pequeña fracción de la moléculas de una población de moléculas dada posee una energía igual o mayor a la energía libre de activación

25oC

Energía libre de activación de una reacción dada

Moléculas que reaccionan

Energía

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La energía libre de activación (ΔG┼) Se define

como la cantidad de energía libre

requerida en calorías para que todas las moléculas contenidas en un mol de una sustancia a una temperatura dada (T ) puedan pasar al tope de la barrera energética (estado de transición)

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El estado de transición ü Se define como el punto máximo de energía libre a lo largo de la coordenada de reacción ü En este punto los reactantes se encuentran en formas reactivas (especies reactivas) que conducen a la formación de productos ü El estado de transición del (los) reactante (s) es una especie hipotética intermedia en la conversión de reactante a producto ü Es inestable y breve D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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La velocidad de una reacción es directamente proporcional al número de especies en el estado de transición

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¿Cómo se puede aumentar la fracción de moléculas en el estado de transición? Hay dos maneras de aumentar la velocidad de una reacción: ü  Aumentando la Temperatura ü Agregando un catalizador químico

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El aumento de la temperatura ü Un incremento en la temperatura aumenta la energía cinética de los reactantes, lo que hace que una fracción mayor de moléculas pueda alcanzar el tope de la barrera energética ü Por cada aumento de 10oC se duplica la velocidad de la reacción ü El aumento de la temperatura puede degradar o alterar los reactantes, lo cual es una limitación

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Número de moléculas

Efecto de la temperatura sobre la energía de activación (EA) de una reacción dada

300oK

EA 500oK

Energía Con el incremento de la temperatura aumenta el número de moleculas que poseen una energía igual o mayor a la energía de D. Stojanovic de Malpica, Ph D activación

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Adición de un catalizador químico ΔG┼ (Energía libre de activación) ΔG┼ sin catalizador

S

ΔG ┼ con catalizador

P

ü  El catalizador químico ofrece una ruta alternativa (mecanismo) con una energía libre de activación menor ü  El catalizador se combina transitoriamente con el reactante S y forma un estado de transición que tiene una energía libre de activación menor que la la reacción en ausencia del catalizador ü  Esto aumenta la fracción de moléculas de una población determinada que puedan reaccionar por unidad de tiempo, a una temperatura dada

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Los catalizadores químicos ü  Son compuestos que aceleran la velocidad de una reacción química ü  No son específicos ü  Se combinan reversiblemente con el compuesto a modificar ü  No modifican la constante de equilibrio de la reacción ü  No se consumen durante el curso de la reacción ü  Se recuperan al finalizar la reacción ü  El catalizador puede repetir la reacción numerosas veces; se requieren pequeñas cantidades D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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El catalizador no modifica la constante de equilibrio de la reacción ΔG┼ (Energía libre de activación) ΔG sin catalizador

S

ΔG con catalizador

P

∆G´o = ∆G´o P - ∆G´o S ∆G´o = -RT 2,3 log K´eq

kJ/mol

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LAS ENZIMAS

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Cantidad de producto ( P) formado

Las enzimas son los catalizadores biológicos de las reacciones químicas celulares Con enzima

Reacción S ↔ P

Reacción sin enzima Tiempo D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Características de las reacciones químicas celulares ü  La mayoría de las reacciones químicas celulares presenta elevada energía libre de activación ü  En consecuencia las reacciones químicas en las células son muy lentas, por lo que los reactantes (biomoléculas) son muy estables ü  Las enzimas aceleran las reacciones según las necesidades de la célula

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Las enzimas presentan propiedades similares a los catalizadores químicos ü  Se combinan reversiblemente con el reactante (sustrato) ü  Disminuyen la energía libre de activación ü  No modifican la constante de equilibrio de la reacción (Keq) ü  No se consumen durante la reacción ü  Se requieren en pequeñas cantidades D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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ΔG┼ (Energía libre de activación) ΔG en ausencia de enzima

S

ΔG en presencia de enzima

P

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Las enzimas se distinguen de los catalizadores químicos por: ü  Su naturaleza química (Proteína o ARN) ü  Son altamente específicas, seleccionan el reactante (una enzima un reactante) ü  Disminuyen la energía de activación (105 hasta 1017 veces) en proporciones mayores ü  Su actividad puede ser regulada ü  Las enzimas son producidas por las células mediante la expresión de los genes en el ADN

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Naturaleza de las enzimas ü La mayoría son proteínas, algunas son ARN (p.e, la ribozima) ü Presentan estructura primaria, secundaria y terciaria ü Pueden presentar estructura cuaternaria ü Presentan una conformación nativa biológicamente activa a pH fisiológico

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Algunas enzimas requieren cofactores en el sitio activo para efectuar su actividad biológica Holoenzima: Apoenzima + cofactor Porción proteica de una enzima

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Cofactores: Pueden ser de dos clases: ü  Elemento inorgánico: Fe2+, Mg2+, Cu2+ ü  Molécula orgánica(Coenzima): FMN. FAD, NAD+ CoASH Algunas enzimas requieren ambos tipos de cofactores Cualquiera de los dos cofactores pueden estar unidos: ü  Débilmente (cosustrato) ü  Fuertemente a la enzima (grupo prostético)

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Las coenzimas funcionan como transportadores transitorios de grupos funcionales específicos Coenzima

FMN

FAD

NAD+ Coenzima A

Grupo químico que transfieren

Precursor en la dieta

Transferencia de dos átomos de hidrógeno

Riboflavina (vitamina B2)

Transferencia de dos átomos de hidrógeno

Riboflavina (vitamina B2)

Transferencia de iones hidruro (:H-) + H+

Acido nicotínico (niacina)

Transferencia de grupos acetil (CH3-CO-)

Acido pantoténico y otros compuestos D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE LAS ENZIMAS

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El sitio activo: región 3D de la enzima donde se une el sustrato y ocurre la conversión del sustrato en producto

Sitio Activo

El sitio activo representa sólo una pequeña fracción del área de D. Stojanovic de Malpica, Ph D superficie de la enzima

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Formación del sito activo: encuentro de grupos laterales R de residuos de aminoácidos provenientes de diferentes regiones del polipéptido

Los grupos R son responsables de la catálisis (conversión del sustrato en producto) D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Especificidad del sitio activo ü  Se refiere a la capacidad de selección del sustrato por la enzima ü  Varios factores contribuyen a esta propiedad: la 3D del sitio activo, características químicas del sitio activo y la estructura del sustrato ü  Las enzimas son absolutamente específicas para el (los) sustrato (s) de la reacción que catalizan ü  Cada reacción química celular es catalizada por una enzima específica ü  Por lo general se considera “una reacción, una enzima” ü  Muchas enzimas presentan estereoespecificidad, esto es, reconocen un solo tipo de estereoisómero del sustrato ü  Dentro de una célula hay cientos de enzimas distintas ü  La especificidad hace que dentro de un mismo compartimento subcelular puedan tener lugar, a la vez, cientos de reacciones distintas sin que se confundan D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Ejemplo ilustrativo de la especificad del sitio activo de una enzima (La glucoquinasa) La glucoquinasa cataliza la siguiente reacción: Glucosa + ATP Glucosa 6-fosfato + ADP

A: Sitio activo de la enzima mostrando los grupos R que enlazan a la Glucosa

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La enzima también puede reconocer a la Galactosa, no obstante la velocidad de fosforilación es muy lenta: Galactosa + ATP Galactosa 6-fosfato + ADP

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Complementariedad de superficies entre el sustrato y el sitio activo ü  La superficie del sitio activo no es del todo complementaria a la superficie del sustrato ü  No es una interacción tipo llave-cerradura como originalmente pensaba Emil Fisher (1890) ü  La interacción entre la enzima y el sustrato ocurre por interacciones no covalentes débiles (puentes de hidrógeno; hidrofóbicas y/o atracción electrostática) ü  La interacción inicial entre el sitio activo y el sustrato es relativamente débil ü  No obstante, las interacciones inducen cambios de conformación en la enzima que refuerzan el enlazamiento y promueven una máxima complementariedad (ajuste inducido) que se alcanza en el estado de transición D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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El modelo del ajuste inducido

Sustrato + Sitio Activo

Complejo Enzima-Sustrato (ES)* Enzima *La máxima complementariedad del complejo ES se alcanza en el estado de transición D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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¿CÓMO LA ENZIMA DISMINUYE LA ENERGÍA DE ACTIVACIÓN DE UNA REACCIÓN CELULAR DADA?

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Eventos que deben ocurrir para que un sustrato se convierta en producto ü Aumento en la frecuencia de colisiones de moléculas reactivas ü Eliminación de las capas de solvatación del reactante con el agua ü Distorsión de enlaces químicos ü  Alineación de enlaces ü  Reacomodación de enlaces ü Ruptura y formación de enlaces

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La energía de enlazamiento es la principal fuerza conductora de la catálisis ü  Formación del complejo [ES]: intervienen múltiples interacciones individuales débiles no covalentes que liberan una pequeña cantidad de energía libre (exergónicas ; ΔG valor negativo) ü  La suma de la energía libre de todas las interacciones débiles individuales suministra una cantidad significativa de energía libre, conocida como energía de enlazamiento ü  Esta energía de enlazamiento es la principal fuente de energía libre utilizada por las enzimas para bajar la energía de activación de las reacciones ü  Explica la enorme velocidad que alcanzan las reacciones catalizadas por las enzimas ü  Las múltiples interacciones débiles en el estado de transición son las que contribuyen mayoritariamente con la catálisis y son responsables de la especificidad de la enzima por su sustrato D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Catálisis enzimática ü  Se refiere al estudio cinético de una reacción catalizada por una enzima ü  Este estudio revela el mecanismo por el cual la enzima convierte el sustrato en producto ü  Requiere de la formación de un complejo [ES] ü  El complejo [ES] pasa al estado de transición [ES] ┼ ü  El complejo [ES]┼ se transforma en [EP] ü  La enzima se disocia del producto

S↔ [ES] ↔ [ES]┼ ↔ [EP] ↔ P + E D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Mecanismo de acción de una enzima: estudios de cinética enzimática Se refiere al estudio de la velocidad de una reacción y los cambios en la velocidad de una reacción en respuesta a cambios experimentales El método más sencillo para estudiar el mecanismo de acción de una enzima es estudiar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción

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Modelo cinético de Michaelis-Menten k1

k2

S + E ↔ [ES] ↔ E + P k-1 Unión del sustrato

Catálisis

La transformación del S en P se divide en dos pasos: ü El primer paso es rápido, consiste en la formación del complejo [ES] reversible ü El segundo paso de la reacción es lento, consiste en la conversión del [ES] en P + E; se considera el paso limitante de la reacción ü k1, k2, k-1: se refieren a las constantes de velocidad de la reacciones individuales señaladas en el modelo

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Velocidad inicial de la reacción: Aparición del producto en función del tiempo

Ensayo para medir el efecto de la [S] sobre la velocidad de una reacción catalizada por una enzima (S ↔ P)

Concentraciones crecientes de sustrato Concentración fija de enzima

[ S ] mM

q  q  q 

Los tubos de ensayo se incuban por un tiempo corto en condiciones óptimas de pH y temperatura La reacción se detiene Para cada concentración de sustrato se determina la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (velocidad inicial de la reacción: Vo)

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Velocidad inicial, Vo µMoles/min

Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción catalizada por una enzima

La enzima se satura con el sustrato

Concentración de sustrato [S] mM

El grafico muestra una hiperbóla rectangular la cual tiene una expresión matemática conocida como la ecuación de D. Stojanovic de Malpica, Ph D Michaelis-Menten

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Saturación de la enzima con el sustrato

Vo

Vmax D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Ecuación de Michaelis-Menten

Vo: es la velocidad inicial Vmax: velocidad máxima de la reacción [S]: concentración del sustrato Km: constante de Michaelis, es una relación matemática de las tres constantes de velocidad (k1 k2 y k-1); Km es igual a la [S] cuando la Vo = Vmax/2; se expresa en concentración molar

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Análisis gráfico de la ecuación de Michaelis-Menten

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¿Porqué Km es igual a la [S] cuando la Vo es la mitad de la Vmax?

Despejando Km: Km+ [S] = 2 [S] Km = 2 [S] –[S] Km= [S] D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Significado biológico de Km En términos prácticos la Km es una medida de la afinidad de la enzima por su sustrato: ü Mientras más pequeño es su valor mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato ü Mientras más alto es su valor menor es la afinidad de la afinidad por su sustrato ü Las enzimas con una Km muy baja (10-6-10-8M) son importantes en el metabolismo ü Si una reacción tiene dos o mas sustratos (A +B →productos), la enzima tiene dos Km uno para cada sustrato; lo mismo ocurre para Vmax

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Valores de Km para algunas enzimas y sus sustratos Enzima Catalasa

Sustrato

Km (mM

H 20 2

25

D-Glucosa

0.05

D-Fructosa

1.50

HC03-

26

D-Lactosa

4

Hexoquinasa (cerebro)

Anhidrasa carbónica β-Galactosidasa

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Relacíón entre Vmáx y la concentración total de enzima [E] en exceso de sustrato Vmáx = k2 [E] [E]: concentración total de enzima k2: constante de velocidad del segundo paso de la reacción: [ES] ↔ P + E ü La única manera de incrementar la Vmax de una reacción en un mismo ensayo (ejemplo anterior) es aumentando la cantidad total de enzima; la Km queda igual ü  k2 se conoce como kcat ó número de recambio D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Eficiencia de la enzima: número de recambio (kcat)

Se refiere al número de moléculas de sustrato convertidas en producto por una molécula de enzima por unidad de tiempo cuando la enzima esta completamente saturada con su sustrato Número de recambio (kcat):

Vmáx = k2 [E]

k2 = kcat = Vmáx/[E] segundos-1

Enzima

Sustrato

kcat (seg-1)

Catalasa

H 20 2

40.000.000

Anhidrasa carbónica

HC03-

400.000

Acetilcolinesterasa

Acetilcolina

14.000

Fumarasa

Fumarato

800 D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Mayoritariamente las enzimas no regulatorias siguen una cinética de Michaelis-Menten ü Se refiere a las enzimas cuya actividad biológica no se puede regular (ni aumentar ni disminuir su actividad) ü Usualmente consisten de una sola cadena polipeptídica, que presenta una conformación nativa a pH fisiológico

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Factores que regulan la actividad enzimática

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Efecto del pH sobre la actividad enzimática ü  La mayoría de las enzimas son activas en una escala estrecha de pH ü  El pH en el cual la velocidad de la reacción es máxima se denomina pH óptimo ü  El pH óptimo de la mayoría de las enzimas en el hombre varía entre 6 a 8 ü  Es excepcional la pepsina, una enzima gástrica que funciona a un pH óptimo de 2, un pH muy ácido ü  Los cambios en el pH pueden modificar las cargas de los grupos R ionizables de los residuos de aminoácidos en el sitio activo de la enzima ü  También puede alterar los enlaces iónicos que contribuyen a la estabilización de la estructura terciaria o cuaternaria, con lo que se altera la conformación nativa de la proteína y por ende, la actividad de la enzima ü  La desnaturalización es irreversible en presencia de pH extremos ácidos o básicos D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Porcentaje de máxima actividad

Efecto del pH sobre la actividad enzimática

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Las enzimas poseen una temperatura óptima ü  Las enzimas poseen una temperatura óptima a la cual la velocidad de la reacción es máxima ü  Las enzimas en nuestro cuerpo, tienen una temperatura óptima entre 35 a 37° C ü  Con el incremento de la temperatura aumenta la energía cinética de las moléculas y las colisiones moleculares, por lo que favorece las reacciones enzimáticas dentro de límites determinados ü  Por encima de la temperatura óptima, se rompen los enlaces no covalentes que estabilizan la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria, esto conlleva a la pérdida de la conformación nativa y de la actividad de la enzima (desnaturalización de la enzima) D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

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Enzimas alostéricas ü Son proteínas que presentan estructura cuaternaria ü  Están compuestas por dos ó más subunidades ü Actúan como enzimas reguladoras del metabolismo (Unidad VI) ü Poseen una región llamada sitio alostérico, el cual se localiza en una región de la proteína diferente del sitio activo ü  Los compuestos que afectan la actividad enzimática mediante la unión a sitios alostéricos se denominan reguladores alostéricos D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Efecto de reguladores alostéricos sobre la actividad enzimática Sustrato Regulador positivo

Enzima menos activa

Enzima más activa

Complejo Enzima-Sustrato más activo

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Las enzimas alostéricas no presentan una cinética de Michaelis-Menten

ü  El estudio cinético de una reacción catalizada por una enzima alostérica muestra una curva sigmoidal ü  Este tipo de curva obedece a otra ecuación matemática, por lo que no se puede aplicar la ecuación de Michaelis-Menten ü  No obstante, presenta Vmax y la [S] para alcanzar la mitad de la Vmax se conoce como K 0.5 D. Stojanovic de Malpica, Ph D

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Efecto de los reguladores positivos (+) y negativos (-) sobre la actividad enzimática

ü  El regulador + disminuye la K0.5, por lo que, aumenta la afinidad de la enzima por el sustrato y en consecuencia, aumenta su actividad ü  El regulador - disminuye la K0.5, por lo que, disminuye la afinidad de la enzima por el sustrato y en consecuencia, se reduce la actividad de la enzima D. Stojanovic de Malpica, Ph D