Página 1 de 27 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Fajardo Departamento de Ciencias y Tecnología

Pruebas de Calidad de Agua Trasfondo ________________________________________________________________ La calidad del agua constituye un problema mundial de salud. Según la Organización Mundial de Salud (OMS), anualmente mueren sobre nueve millones de personas debido a enfermedades trasmitidas por el agua de consumo humano, la mayoría de las cuales ocurre en países en vías de desarrollo. Se ha proyectado que 38% de esas muertes ocurren a niños afectados por la diarrea. Más aún, la OMS estima que el 80% de todas las enfermedades infecciosas se deben al uso de aguas mal tratadas. Las infecciones más comunes son la cólera, giardiasis, hepatitis, shigellosis, tifo y enfermedades gastrointestinales aguadas. El tratamiento de las aguas ha existido por casi 150 años. Uno de los tratamientos que elimina los patógenos infecciosos es la clorinación. Sin embargo, a pesar de que el agua que se utiliza en Puerto Rico pasa por plantas de tratamiento, muchas de estas plantas han sido arrestadas por el gobierno federal por no producir la calidad de agua esperada. Para empeorar la situación todavía existen bolsillos en la isla que utilizan aguas de pozos que los usuarios mismos deben tratar antes de consumir. Otro problema que complica este panorama es la corrosión de la mayoría de los tubos que llevan agua a la ciudadanía. En Puerto Rico, las tuberías tienen más de 50 años de instaladas. La Autoridad de Acueductos y Alcantarillados no tiene un plan de reemplazo de dicha tubería y menos aún, los fondos para realizarlo. La corrosión de las tuberías crea un aumento en la formación de biocapa en dichas tuberías, lo que resulta en una mayor contaminación de los cuerpos de agua. En el 1999 un estudio realizado por la EPA reveló que 14 estados tenían más del 11% de sus aguas comunales en violación de los estándares máximos de contaminación. De 1997 a 1998, el CDC reportó 17 brotes de enfermedades trasmitidas por agua en 13 estados que resultaron en 2000 personas contagiadas. Después de Cryptosporidium parvum, el segundo agente más peligroso que puede trasmitirse a través del agua es Escherichia coli (E. coli sepa 0157). Aunque muchas cepas de E. coli son benignas y hasta beneficiosas a los humanos, cepas tales como E.coli 0157, sin embargo, producen toxinas potentes. Sus efectos son diarrea con sangre y, en casos severos, hasta daño renal y muerte. Aunque algunos casos de infección se atribuyen a cocinar

Página 2 de 27 inadecuadamente la carne, más de 11,000 casos cada año se asocian a la trasmisión por agua infectada. Además de agua de consumo insalubre, también pueden ocurrir infecciones por nadar en agua contaminada. Este tipo de contaminación parece estar aumentando. Se piensa que se debe a dos factores, resistencia al cloro hasta por siete días, y por exceso de personas en el agua especialmente durante los meses de verano. Estas infecciones ocurren mayormente en los ríos y lagos, sin embargo, las descargas de plantas de tratamiento de aguas usadas cerca de las desembocaduras de los ríos pueden ocasionar problemas similares en las playas que reciben directamente dichas descargas. Otros lugares donde ocurren brotes son los lugares con aguas termales. El monitoreo del agua es de vital importancia para la salud humana. Es importante recoger información continua de la calidad del agua para evitar los brotes. Los métodos más efectivos para monitorear el agua y los sedimentos incluyen: 1. medida de oxígeno disuelto y niveles de sedimentos suspendidos; 2. recoger datos estacionales de la abundancia de plantas y animales acuáticos; 3. condiciones generales del agua como pH, temperatura y color; 4. técnicas biológicas como cultivo y crecimiento en placas de posibles contaminantes del agua; 5. uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) para detectar microorganismos patógenos específicos). El PCR, una técnica que amplifica secuencias específicas del ADN (DNA), ha revolucionado todos los campos de biología. Se usa rutinariamente en la medicina y para identificar humanos. El PCR fue inventado en 1984 por el Dr. Kary Mullis de la Corporación CETUR obteniendo un premio Nobel en 1993. Se basa en la estabilidad térmica de la enzima Taq polimerasa capaz de replicar el ADN a altas temperaturas. El proceso de PCR se realiza en tres pasos: denaturación, hibridización (annealing) y extensión. Este proceso se repite de 20-40 ciclos en los cuales se dobla en número de las moléculas de la secuencia de ADN objetivo en cada ciclo sucesivo. A continuación se describe cada paso (figura 1): a. Denaturación: se calienta el ADN a 95°C para separar las hebras complementarias del ADN obtenido de los organismos bajo estudio (conocido como el templado). La mezcla de ADN contiene la enzima Taq polimerasa, los cuatro deoxinucleótidos necesarios para replicar el ADN (A, C, G y T) y una mezcla de iniciadores (primers) de ADN sintético de cadena sencilla, (necesarios para que se pegue la enzima en el lugar específico del ADN).

Página 3 de 27 b. Hibridización (annealing): se baja la temperatura entre 50 y 70°C para que los iniciadores se peguen al ADN. Los iniciadores se sintetizan de manera que sean complementarios a los extremos de las secuencias que se quieren amplificar. En el caso de microorganismos acuáticos se diseñan los iniciadores para amplificar un gene exclusivo al microorganismo que se desea estudiar. c. Extensión: La temperatura se eleva a 72°C para que la Taq polimerasa se pegue a la región del ADN donde esta pegado el iniciador y extienda el fragmento utilizando los deoxinucleótidos provistos y el ADN obtenido como templado. Después del PCR, el ADN amplificado de los controles positivos y negativos se pasan por electroforesis de gel. Se puede utilizar agua estéril como control negativo. Si hubo amplificación de ADN en el control negativo (visto en forma de bandas en la gel) entonces los reactivos u otros materiales utilizados estaban contaminados y hay que descartar el resultado. Figura 1: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Descripción del experimento _______________________________________________________ Los estudiantes probarán muestras de agua para detectar la presencia de E. coli. E. coli es una bacteria conocida como coliforme que vive normalmente en

Página 4 de 27 los intestinos de mamíferos y que es eliminada en las heces fecales. La presencia de coliformes fecales en muestras de agua es indicador de heces fecales en el agua. Se utiliza para indicar la posibilidad de la presencia de otros organismos patógenos tales como Giardia y Cryptosporidium en la muestra. Los estudiantes obtendrán muestras de agua para este experimento a las cuales se le ha añadido E. coli bajo condiciones de laboratorio. Se aislará ADN bacterial y se amplificará por PCR utilizando iniciadores específicos para E. coli. Los productos del PCR se analizarán por electroforesis de gel de agarosa. Este mismo experimento se utilizará para el proyecto de ambiental utilizando muestras de agua del río Fajardo. Los controles serán muestras de agua estéril.

Objetivos _______________________________________________________ 1. Formular una hipótesis respecto a la determinación de la calidad utilizando a E.coli como indicador. 2. Desarrollar la destreza de tomar una muestra de agua en un cuerpo de agua dulce. 3. Manipular aparatos de medir pH, temperatura, oxígeno disuelto y turbidez en cuerpos de agua. 4. Utilizar la técnica de PCR para determinar la calidad del agua y detectar y monitorear la presencia de contaminantes bacteriales en los cuerpos de agua. 5. Desarrollar las destrezas siguientes: a. aislamiento de ADN b. medir la concentración del ADN utilizando medidas de absorbancia en un espectrofotómetro. c. preparar reacciones para PCR d. separar los productos de PCR por electroforesis de gel de agarosa. e. teñir y observar una gel en un iluminador. 6. Analizar los resultados del experimento y llegar a conclusiones.

Antes del experimento _______________________________________________________ 1. Lee el trasfondo y todas las instrucciones antes de comenzar el experimento. 2. Escribe una hipótesis que refleje el experimento y predice los resultados del mismo en tu libreta de laboratorio. 3. Resume el procedimiento en tu libreta de laboratorio. 4. Contesta las preguntas siguientes y estúdialas para la prueba corta. a. ¿Por qué se utiliza E.col como indicador de contaminación? b. Enumera las medidas de monitoreo que se utilizan para conocer la calidad del agua. c. ¿Para qué se utiliza el PCR? d. Enumera los tres pasos del PCR y describe brevemente cada uno.

Página 5 de 27 e. ¿Cuáles son las tres partes principales de este experimento (señaladas en números romanos)?

Pre-evaluación _______________________________________________________ 1. Evalúa tu habilidad para formular una hipótesis para este experimento utilizando una escala del 1 al 5 según se indica. Marca con X. Valor 1 2 3 4 5

Significado No tengo idea de dónde empezar Puedo sólo señalar las variables del experimento. Puedo identificar las variables del experimento pero desconozco cómo hacer inferencias o predicciones con éstas. Sólo puedo señalar las variables y hacer una hipótesis en forma de pregunta. Puedo formular una hipótesis que recoja las variables que considerará el experimento y unos resultados esperados.

Auto preevaluación

2. Evalúa tu habilidad para aislar ADN, amplificar el ADN aislado por PCR y separar los productos por electroforesis con geles de agarosa antes de empezar el experimento. Coloca una marca de X bajo la alternativa que mejor describe tu habilidad o dominio de la destreza.

Destrezas Postevaluación: Grado de Dominio de la Destreza 1. No tengo idea de cómo realizar la tarea. El tiempo para realizar la tarea no me es suficiente. Suelo cometer errores continuamente. El resultado no es el esperado o no tengo resultados. 2. Aunque completo la tarea me toma más tiempo del asignado.

Preparación de soluciones

Uso de micropipetas

Aislar ADN bacterial

Preparar y correr una reacción para PCR.

Montar y operar aparatos horizontales de electroforesis.

Cargar muestras en pozos de geles para electroforesis

Teñir y desteñir geles.

Manejo de un espectrofotómetro

Análisis Estadístico de datos

Página 6 de 27 Cometo muchos errores y los resultados son ambiguos. 3. Realizo la tarea completa dedicándole más tiempo que los demás compañeros. Cometo algunos errores pero los resultados son más o menos aceptables. 4. Puedo realizar la tarea esperada y en el tiempo máximo asignado. Los resultados son buenos y no suelo comentar errores. 5. Domino la tarea en un tiempo mínimo. Los resultados son excelentes. Me siento seguro(a) realizando la tarea.

Medidas de seguridad Trabajarás con organismos que pueden definirse como patógenos pero que realmente son oportunistas. Esto significa que pueden causar daño bajo ciertas circunstancias. Ejemplo: Staphylococcus aureus es una bacteria oportunista. Normalmente viven en la piel humana lo que evita que otras bacterias colonicen las áreas que ella ocupa. Sin embargo, si la piel se quema o se corta los estafilococos colonizan el área cortada causando infección. Para evitar infección debes tomar las siguientes precauciones: 1. Utiliza bata de laboratorio, zapatos cerrados, guantes y lentes protectores. 2. No utilices la boca para pipetear reactivos, utiliza bombas o perillas.

Página 7 de 27 3. Antes de remover geles, tubos, etc de aparatos eléctricos apagan la corriente primero y luego desconecta el equipo. 4. Todo equipo eléctrico que no esta en uso debe estar apagado y desconectado. 5. Si observas salideros en la gel o en el aparato de electroforesis en general debes apagar inmediatamente el equipo y dejar de utilizarlo. Debes informarlo al personal de inmediato. 6. Siempre lávate las manos con jabón y agua después de utilizar reactivos y materiales biológicos.

Procedimientos experimentales Muestreos Materiales para el muestreo Mapa del río a muestrear Tres tubos de ensayo con tapa estériles o tres frascos de cristal con tapa hervidos previamente* Etiquetas para los tubos Lapiz marcador permanente color negro punta fina (Sharpie o similar) Metro o regla de tres pies Un metro de pH o papel de pH entre 6 y 8* Un metro de temperatura o termómetro* Una neverita portátil Hielo Disco Secchi o lata pequeña pintada de blanco con soga atada* Cámara digital Nota: Los equipos marcados pueden improvisarse según se indican para el taller de destrezas. Los estudiantes del laboratorio presencial deben ir al laboratorio a buscar los equipos y materiales el día antes de tomar las muestras. Recuerden traer su tarjeta de estudiante.

Métodos 1. Los muestreos pueden hacerse en grupos de dos o más si lo autoriza la instructora. 2. Busca en Internet un mapa del río de donde traerás las muestras de agua para analizar en el laboratorio. Imprime el mapa y guarda el mapa en tu computadora para el informe de laboratorio. 3. Visita el río y escoge tres puntos de muestreo según se indica: a. Cerca del nacimiento del río (rió arriba). b. Parte media c. Desembocadura (cerca del mar)

Página 8 de 27 4. Marca en el mapa los tres puntos. Anota puntos de referencia como kilómetro y hectómetro, casas, negocios, etc. 5. Toma las muestras el día antes del Taller o Laboratorio temprano en la mañana (7-9 AM) o en la tarde (4-6 PM). Todas las muestras deben tomarse a las mismas horas en cada muestreo que hagas. 6. En cada muestreo sigue las instrucciones a continuación: a. Viste adecuadamente. Lleva botas y pantalones largos metidos dentro de las medias. b. Escoge un punto donde puedas entrar a una profundidad de 1 metro mínimo cada lugar de muestreo. Anota la profundidad para que puedas entrar a la misma profundidad la siguiente vez. c. Marca de antemano los tubos con la fecha y el lugar de muestreo. d. Toma la muestra a un metro de profundidad. Introduce el tubo o frasco tapado y al llegar a la profundidad abre el mismo bajo el agua. Ciérralo bajo el agua una vez lo llenes. e. Introdúcelo dentro de la neverita con hielo inmediatamente y mantén las muestras en hielo hasta que llegues al laboratorio. Asegúrate mantener la nevera con hielo hasta llegar al laboratorio. f. Toma la temperatura y el pH. g. Con el disco Secchi o el pote con la tapa pintada de blanco introdúcelo al agua hasta que no veas lo veas. Anota la profundidad marcando la soga y luego midiendo la misma. Esta medida es visibilidad. Debes restar la visibilidad a la profundidad que es un metro para determinar la turbidez. 7. Anota en cada punto las condiciones en las áreas circundantes y dentro del agua como por ejemplo si hay casas muy cerca, tubos de desagüe que llegan al agua, basura, reces, industrias o talleres cercanos. 8. Retrata los puntos de muestreo y las condiciones circundantes. 9. Anota la apariencia del agua y las condiciones del tiempo de ese día y los días previos. 10. Recoge los datos del muestreo en la siguiente tabla: Parámetros Muestreos pH Temperatura Turbidez Condiciones del tiempo: a. Soleado b. Nublado c. Lluvia leve d. Lluvia fuerte Condiciones durante la semana del muestreo Otras observaciones de las condiciones circundantes

1

Nacimiento 2 3

1

Medio 2

3

Desembocadura 1 2 3

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Procedimientos en el laboratorio Especificaciones de la gel La gel a utilizarse requiere las siguientes especificaciones: 1. Tamaño recomendado de gel: 2. Número de muestras por pozo: 3. Localización de la peinilla: 4. Concentración de agarosa:

7 X 15 cm (bandeja larga) 6 por gel primera fila de muescas 1.0%

Aislamiento de ADN Equipo y Materiales Microcentrífuga Baño de María a 56°C Bloque de calentar a 95°C Cronómetro Estante para microtubos Agitador (vortex) Microtubos Marcador

Micropipetas (200, 50 o 100, 10 o 20 μl) Puntas de micropipetas Agua estéril Tubos PCR Hielo Solución de lisis Tubos microcentrífuga Agua contaminada

Aislamiento de DNA bacterial de muestras de agua preparada 1. Identifica el tubo que contiene el agua contaminada con tus iniciales, el cultivo de E.coli (control positivo) y el agua destilada (control negativo). Nota: se preparará un control negativo y positivo por gel. Solo un tubo de cada uno.

Utilizar guantes y gafas protectoras todo el tiempo

2. Coloca 2,000 uL de agua en cada tubo. Los tubos de las muestras de rio se harán en duplicado (A y B). Ejemplo Punto 1 A y Punto 1 B. Centrifuga en microcentrífuga a velocidad máxima por 15 minutos. 3. Remueve 350uL de sobrenadante (líquido superior) del tubo A y colócalo en un tubo separado. Del tubo B descarta todo el sobrenadante. Remover el sobrenadante de cada tubo con una pipeta y con cuidado. 4. Añade 175 μl del sobrenadante del paso anterior al bolo (pellet) del tubo A y 175 uL al B de cada muestra. 5. Resuspende el bolo mezclando con el agitador (vortex).

Página 10 de 27 B. Aislamiento de ADN Bacterial para PCR 1. Mezcla el tubo que contiene la solución de lisis (amortiguador o buffer, agente quelante + proteinasa K) invirtiendo varias veces. a. Corta la punta del tip de la micropipeta con tijeras para mezclar más fácilmente. b. Continúa mezclando la solución de lisis con una pipeta pipeteando hacia arrriba y hacia abajo varias veces. c. Añade rápidamente 50 μl de la solución de lisis a cada tubo con el sobrenadante. d. Mezcla en vortex o invirtiendo varias veces. 2. Coloca la muestra a 56°C por 30 minutos. Este paso digiere la pared bacterial y libera el ADN. 3. Coloca la muestra en baño de agua hirviendo o bloque de calentamiento a 95°C por 10 minutos. Este paso destruye la proteinasa K. 4. Permite que la muestra se enfríe a temperatura de salón por 2 minutos. 5. Centrífuga el tubo a velocidad máxima por 5 minutos. 6. Remueve el sobrenadante y coloca tu muestra en un tubo limpio. Coloca el tubo en hielo. Se unen los dos tubos A y B del mismo punto. NOTA: Asegúrate que el quelante (chelex) no se transfiera en el tubo de PCR. Esto inhibe el proceso de PCR. Una segunda centrifugación puede ser necesaria. Para realizar espectrofotometría 7. Diluye tu ADN bacterial 1:100 antes de hacer el PCR. Las diluciones deben prepararse con agua destilada y colocada en hielo según prepara el PCR. 8. Determina la concentración del ADN siguiendo los pasos en el anejo 1 al final de este experimento. Completa la siguiente tabla. Recuerda convertir la concentración en μg/μL multiplicando el resultado por 10-3. 9. El DNA aislado puede ser congelado y utilizado luego para PCR.

Mes: Lecturas de absorbancia (ABS) ____________ Puntos de 1 2 3 muestreo Nacimiento Medio Desembocadura

Punto opcional para parar

Promedio ABS.

Concentración μg/μL

Página 11 de 27 Protocolo Aislamiento de ADN Rotular:

+

-

(Control: Agua + E. coli)

1

2

Control Agua

3

Muestras del río

Añadir 2,000 uL de muestra a cada uno (en duplicado, A y B)

↓ Centrifugar (velocidad máxima, vm X 15 min)

↓ Remover 350 uL sobrenadante y colocar en un tubo separado

↓ Añadir 175 μl de sobrenadante al bolo (pellet) del tubo original (A y B)

↓ Vortex

↓ Añadir 50μl Solución lisis a cada tubo

↓ 56°C X 30 min

↓ 95°C X 10 min

↓ Enfriar a temperatura de salón (rt) X 2 min

↓ Centrifugar X 5 min a velocidad máxima (VM)

↓ Remover y guardar sobrenadante y colocar en otro tubo

↓ Poner muestra en hielo

↓ Diluir 1:100 con agua estéril (100μl) (espectrofotometría)

↓ Hielo o congelador si no se usa el mismo día

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Amplificación del ADN bacterial Materiales y equipo Tubos PCR Solución de iniciadores ADN bacterial Microcentrífuga

Pipetas (20 o 50, 10 o 5 μl) Puntas de pipetas Máquina de PCR 10X Gel Loading Solution

A. Prepara las muestras para las reacciones de PCR 1. Identifica los tubos con las reacciones para el PCR. 2. Golpea el tubo de reacción para asegurar que el bolo esta en el fondo del tubo. Para preparar la reacción añade lo siguiente al bolo: a. Solución de iniciadores ‘primers‘ 20.0 μl b. DNA bacterial 5.0 μl 3. Mezcla suavemente la reacción de PCR y centrifuga brevemente para coleccionar toda la muestra en el fondo del tubo. Asegúrate que el bolo de PCR esta completamente disuelto. B. Controles opcionales 4. Grupo 1: Control negativo- Rotula un tubo de PCR “control negativo”. Añada lo siguiente al bolo: a. Mezcla de iniciadores 20.0 μl b. Agua estéril 5.0 μl 5. Grupo 2: Control positivo- Rotula un tubo de PCR “control positivo”. Añade lo siguiente al bolo: a. Mezcla de iniciadores 20.0 μl b. ADN de E. coli 5.0 μl 6. Mezcla suavemente los tubos de control y centrifuga brevemente para coleccionar toda la muestra en el fondo de los tubos. Asegúrate que el bolo de PCR esté disuelto totalmente. C. Prepara las reacciones para el PCR 7. Rotula el tubo que contiene el bolo de PCR con tus iniciales. 8. Golpea suavemente el tubo para que el bolo se vaya al fondo. Para preparar la reacción de PCR añade lo siguiente al tubo con el bolo: a. Mezcla de iniciadores 20.0 μl b. ADN bacterial 5.0 μl 9. Suavemente mezcla la reacción en el tubo y centrifuga brevemente para que la muestra se vaya al fondo del tubo. Asegúrate que el bolo de PCR se disuelva totalmente. 10. Pasa todas las muestras a tubos de PCR más pequeños. Selle todos los tubos de PCR con papel de parafina y colócale una cinta adhesiva

Página 13 de 27 de un color distinto por cada grupo y rotule los mismos en la cinta adhesiva. D. Reacción de cadena de polimerasa (PCR) 11. Cada grupo debe colocar su tubo en el ciclador termal (máquina de PCR) para los ciclos automáticos según señalados:. Denaturación Inicial 30 ciclos @ Extensión Final 95° por 5 min. 94°C por 45 seg. 72°C por 7 min. 50°C por 45 seg. 72°C por 90 seg. 12. Después que se completen todos los ciclos añade 5 μl de la solución para cargar la gel (10X Gel Loading Solution). Guarda la solución en hielo.

Punto opcional para parar Las muestras pueden guardarse en el ciclador termal a 4°C o congeladas después de añadir el 10X Gel Loading Solution hasta estar listos para la electroforesis.

Electroforesis Materiales y equipo Molde de gel Peinilla Amortiguador Agua estéril Agarosa Matraz 100 ml Microondas Aparato de electroforesis Amortiguador concentrado (50X) Matraz de 250 ml Baño de María a 50°C Escalera de DNA Pipetas 50 o 100 μl Fuente de energía (Power Supply)

Espátula grande Papel plástico Pipeta Pasteur Tarjeta de tinción InstaStain Beaker 5 ml (2) Cronómetro Transiluminador Equipo protector UV Bolsa Biohazard Cámara Polaroid Base piramidal de cámara Hielo Micropipeta (25 o 50 μl) Muestras de ADN (en hielo)

A. Preparación del molde de la gel 1. Cierra los extremos de un molde de gel con la represa de goma o cinta adhesiva. a. Represa de goma: 1) Coloca la represa de goma en cada extremo del molde de acrílico. 2) Asegúrate que la goma cae firmemente con el molde

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2. Coloca la peinilla en el primer juego de muescas al final del molde. Asegúrate que cae firmemente y de manera pareja sobre el molde. B. Moldeando la gel de Agarosa 1. Utiliza un matraz de 250 ml para preparar la gel. Añade los siguientes componentes según especificado en tu experimento (Vea tabla A). a. Amortiguador concentrado b. Agua destilada c. Agarosa Tabla A: Preparación de gel de Agarosa al 1% Tamaño de molde (cm)

Agarosa (g)

7X7 7 X 14

0.3 0.6

Amortiguador (buffer) concentrado (ml) 0.6 1.2

Agua destilada (ml) 29.4 58.8

Volumen total (ml) 30 60

2. Mueve suavemente la mezcla para dispersar los grumos de agarosa. 3. Marca el nivel de la solución en la parte externa del matraz con un marcador. 4. Calienta la mezcla para disolver el polvo de agarosa. La solución debe verse clara como el agua y sin partículas. a) Microondas 1) Cubre con papel plástico para evitar la evaporación. 2) Calienta en high por 1 min. 3) Mueve la mezcla y vuelve a calentar por 25 seg cada vez hasta que desparezcan los grumos. b) Plato caliente: 1) Cubre el matraz con un beaker pequeño para evitar la evaporación. 2) Calienta la mezcla hasta que hierva moviendo ocasionalmente. Hierve hasta que se disuelva la agarosa totalmente. 5. Enfría la agarosa a 55°C moviendo suavemente. Si bajó el volumen, echa agua hasta el nivel marcado originalmente. 6. Echa la agarosa en el molde colocado sobre una superficie firme y a nivel.

Página 15 de 27 7. Espera a que se solidifique totalmente (20 min. aproximadamente). C. Preparando la gel para la electroforesis 1. Mientras la gel se solidifica prepara el amortiguador de electroforesis. Sigue la tabla B: Tabla B: Dilución de Amortiguador de Electroforesis Modelo Cámara Edvotek

Amortiguador concentrado (50X) en ml

Agua destilada (ml)

M6+ M12 M36 (azul) M36 (clara)

6 8 10 20

294 392 490 980

Volumen total 300 400 500 1000

2. Luego de que la gel esté totalmente solidificada, remueve cuidadosamente las represas de goma o cinta adhesiva. 3. Remueve suavemente la peinilla levantándola directamente hacia arriba. 4. Coloca la gel con su molde en la cámara de electroforesis (los pozos deben estar en el lado negativo ya que las cargas negativas del DNA hace que éste migre hacia el lado positivo). 5. Llena el aparato de electroforesis con el volumen adecuado de amortiguador diluído que preparaste en el paso C.1. 6. Asegúrate que la gel esté completamente cubierta con el amortiguador. D. Cargando las muestras de DNA 1. Pon el baño de María o bloque de calentar (heating block) a 50°C para calentar los tubos con DNA antes de cargar la gel. 2. Calienta la escalera (ladder) de DNA de 200 bp y muestras de PCR por dos minutos a 50°C. Permite que las muestras se refresquen por unos minutos colocando los tubos de DNA en hielo por dos minutos. 3. Carga las muestras completas (25 μl) de las muestras en la secuencia de la tabla C:

Página 16 de 27 Tabla C: Secuencia de cargado de gel Carril 1 2 3 4 5 6

Muestra Escalera 200 bp ADN E. coli control positivo Control negativo (agua destilada) Muestra de agua 1 Muestra de agua 2 Muestra de agua 3

4. Anota en tu libreta la fuente y posición de tus muestras en la gel para identificar luego. E. Corriendo la gel 1. Después de cargar la muestra ponle la tapa al aparato con los terminales eléctricos. Asegúrate que el lado positivo y negativo estén en la posición correcta. (Lado negativo en el lado de los pozos). 2. Inserta el enchufe negro en la fuente de energía (power supply) en el lado negativo. 3. Inserta el enchufe rojo en el lado positivo de la fuente de energía. 4. Programa la fuente de energía con el voltaje y el tiempo requerido. Vea Tabla D. Tabla D: Tiempo y voltaje requerido Voltaje 125 70 50

Mínimo 45 min 1 hr 15 min 2 hr

Máximo 1 hr 15 min 3 hr 5 hr

5. Coteja que la corriente este fluyendo. Debes observar burbujas en los electrodos. 6. Permite que el tinte migre 4.5 cm en la gel corta y 7 cm en la gel larga para que se separe adecuadamente las bandas de ADN. Debes terminar la electroforesis antes de que el tinte llegue al final de la gel. 7. Luego de completar la electroforesis apaga la fuente de energía y desconéctale los cables para remover tapa del aparato de electroforesis. 8. Remueve la gel del molde para teñirla.

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F. Tiñiendo la gel 1. Asegúrate que tienes los guantes y los protectores de ojos puestos. 2. Coloca la gel sobre un papel plástico sobre el banco. 3. Humedece la gel con unas gotas de amortiguador de electroforesis (ver figura de la derecha). 4. Saca el plástico protectivo de la tarjeta de tinción InstaStain®Ethidium Bromide. 5. Coloca el lado no impreso de la tarjeta sobre la gel. 6. Pasa tus dedos varias veces sobre la superficie de la tarjeta. Hazlo varias veces. 7. Coloca el molde con un vaso (beaker) vacío sobre el mismo para presionar sobre la gel. 8. Déjalo en esa posición por 15 minutos. 9. Después de 15 min remueve la tarjeta. 10. Transfiere la gel a un transiluminador UV para observar las bandas. 11. Asegúrate utilizar equipo protector de UV para los ojos antes de prender el transiluminador. 12. Si las bandas no se ven claramente vuelve a teñir por 15 min. adicionales. 13. No disponga de la tarjeta echándola en el zafacón. La disposición de las tarjetas de tinte deben seguir las normas para la disposición de las substancias peligrosas. G. Foto-documentación del ADN 1. 2. 3. 4.

Utiliza tu cámara digital o la cámara del laboratorio si no tienes. Coloca una bolsa plástica negra que cubra el cristal de extractor. Prende el transiluminador y toma la foto. Si no sale bien claras las bandas haz un dibujo en tu libreta de laboratorio de la gel con la posición exacta de cada banda. 5. Imprime la foto y coloca la misma en la libreta con cinta adhesiva. 6. Si la cámara es del laboratorio pasa la foto a tu USB para tu portafolio. Envíate las fotos por correo electrónico para que tengas una copia adicional. Al llegar a tu computadora guarda la foto bajo Gel de calidad de agua para tu portafolio e informe. 7. Haz tu informe de laboratorio según se indica a continuación. Nota: No incluyas el laboratorio completo. Entrégalo en la fecha estipulada en el calendario.

Post-evaluación _______________________________________________________

Página 18 de 27 1. Evalúa tu habilidad para aislar ADN, amplificar el ADN aislado por PCR y separar los productos por electroforesis con geles de agarosa después de realizar el experimento. Coloca una marca bajo la alternativa que mejor describe tu habilidad o dominio de la destreza.

Post-evaluación: Grado de Dominio de la Destreza

1. No tengo idea de cómo realizar la tarea. El tiempo para realizar la tarea no me es suficiente. Suelo cometer errores continuamente. El resultado no es el esperado o no tengo resultados. 2. Aunque completo la tarea me toma más tiempo del asignado. Cometo muchos errores y los resultados son ambiguos. 3. Realizo la tarea completa dedicándole más tiempo que los demás compañeros. Cometo algunos errores pero los resultados son más o menos aceptables. 4. Puedo realizar la tarea esperada y en el tiempo máximo asignado. Los resultados son buenos y no suelo comentar errores. 5. Domino la tarea en un tiempo mínimo. Los resultados son excelentes. Me siento seguro(a) realizando la tarea.

Pre-paración de solucio-nes

Uso de micropipetas

Aislar ADN bacterial

Preparar y correr una reacción para PCR.

Destrezas Montar y operar aparatos horizontales de electroforesis.

Cargar muestras en pozos de geles para electroforesis

Teñir y desteñir geles.

Manejo de un espectrofotómetro

Análisis estadístico de datos

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Anejo 1 Laboratorio 7: Cuantificación de Ácidos Nucleicos Objetivos 1. 2.

Determinar la concentración y cantidad de ácidos nucleicos, especialmente ADN. Determinar la pureza del ADN aislado.

Introducción Frecuentemente deseamos saber cuánto ADN tenemos en nuestra muestra para poder llevar a cabo estudios posteriores, tales como correr una electroforesis u otras aplicaciones. Además, muchas veces necesitamos información sobre la concentración de ADN y si el mismo está contaminado con proteínas. Esta información la podemos obtener midiendo la absorbancia del ADN disuelto en el espectrofotómetro y calculando la concentración. El ADN tiene un pico de absorbancia a 260 nm. A ese largo de onda, una absorbancia de 1 equivale a una concentración de 50 µg ADN de cadena doble/mL. La lectura de la absorbancia de una muestra de ADN disuelto nos dará una idea aproximada de la concentración de ADN presente, y entonces podemos corroborar la información haciendo una electroforesis en agarosa. En este ejercicio de laboratorio vamos a determinar la concentración y cantidad de DNA que obtuvimos en ejercicios anteriores. Supongamos que tenemos una muestra de 100 µL de ADN y queremos conocer su concentración y cantidad. Para esto, debemos calibrar el espectrofotómetro con TE buffer o agua dd libre de ADNasas (el mismo buffer o agua en el que está diluido el ADN). Eso pone la lectura en A260= 0. Debemos entonces tomar 1µL de la solución de ADN y diluirlo 1:700, usando agua doblemente destilada (agua dd - libre de ADNasas), añadiendo a la celda 699 µL de agua dd. Si la lectura de de A260 es 0.23, podemos aplicar la siguiente fórmula para calcular la concentración de ADN. [ADN] = A260 x 50 µg/mL x factor de dilución En nuestro ejemplo, [ADN] = 0.23 x 50 µg/mL x 700 [ADN] = 8,050 µg/mL

Página 20 de 27 Esa concentración debe ser expresada en µg/µL, por lo que hay que dividir por 1,000 (o rodar el punto decimal tres lugares a la izquierda) para hacer la conversión. En nuestro ejemplo, [ADN] = 8.05 µg/µL Por supuesto, si esa es la concentración de ADN y tenemos 100 µL, entonces tenemos una cantidad total de 805 µg de ADN en el tubo. Para determinar la pureza de tu ADN, debes calcular la razón A260/A280. También puedes leer esta razón directamente del espectrofotómetro. La absorbancia a 260 nm nos indica la concentración de ácidos nucleicos y la absorbancia a 280 nm nos indica la concentración de proteínas. Si la razón A260/A280 está cerca o es mayor de 2, el DNA en la muestra está bastante puro.

Tomado de: Manual de Laboratorio BIOL 2013, Laboratorio de Destrezas II; Segunda Edición, 2006; Recinto Metropolitano, UIPR, pgs. 59-60*. *Auspiciado por el Proyecto TEN (#P031S010036) del Programa Título V del Departamento d educación de los Estados Unidos de América.

Página 21 de 27 Nota: Envía como informe la parte bajo las líneas entrecortas únicamente

-------------------------------------------------------------------------------------------Informe de laboratorio _______________________________________________________

Calidad de agua Nombre: _______________________________ Número de estudiante: ___________________ Fecha:

_______________________________

Hipótesis: Redacta una hipótesis basada en las variables del experimento. Piensa en qué varía una muestra de otra e indica que esperas que suceda con la cantidad de E. coli en cada lugar.

_______________________________________________________ _______________________________________________________ Resultados y Análisis _______________________________________________________ A. Coloca en esta sección una figura o mapa del lugar de muestreo con los puntos de muestreo marcados. Figura 1: Mapa del Río ________________ con los puntos de muestreo marcados.

Fuente: _________________________________ B. Incluye en esta sección una foto de la gel. Si no sale clara la foto haz un dibujo que incluya la escalera y las bandas que observas en cada carril y su localización.

Página 22 de 27 Figura 2: Foto de la gel de ADN de E. coli en el Río _______________ del muestreo del mes de _________________.

C. Incluye los datos que obtuviste en la tabla de la sección B de Aislamiento de ADN que encontrarás a continuación. Cada mes que hagas el muestreo completa la parte correspondiente en la tabla. Si tomas los cursos en línea los datos te serán provistos para que hagas el análisis completo y escribas el artículo. Tabla 1: Concentración de ADN de E. coli en el Río __________ Durante los Meses de ________ a ____________ del ________ en μg/μL Mes

Nacimiento

Parte media

Desembocadura

enero febrero marzo

D. 1. Pasa los datos de la tabla 1 en Xcel utilizando el formato indicado. Haz la tabla en el extremo superior izquierdo de la hoja electrónica y sin dejar espacios. Escribe los meses que correspondan según el semestre. 2. Prepara una gráfica marcando la tabla y luego yendo a Insert → Chart → Line. Identifica los ejes (horizontal: punto de muestreo y vertical o Z: Concentración μg/μL). Ponle el título que sigue. Inserta la Gráfica aquí. Figura 3: ADN de E. coli del Río ___________ en los meses de _______ , _______ y ________.

E. Con los datos de concentración de ADN provistos por la instructora haz un análisis estadístico de los datos. Busca el promedio, la varianza y la desviación estándar de los datos provistos. 1. Añade a la tabla 1 en Xcel las palabras promedio, varianza, desviación estándar y análisis de varianza (prueba F) entre los distintos puntos de muestreo según se indica:

Página 23 de 27 Tabla 2: Análisis estadístico de la concentración de ADN del Río _________ Mes

Nacimiento (1)

Parte media (2)

Desembocadura (3)

1y2

2y3

1y3

enero febrero marzo promedio varianza desv estándar Prueba F Puntos de muestreo

2. a. Coloca el cursor bajo la columna nacimiento y marca Insert → Function. b. En el encasillado “Or select a category” escoge “All” y marca “average” para el promedio. c. En el encasillado que aparece en pantalla escribe B2:B4 para el nacimiento del río y OK y te saldrá el promedio del nacimiento. d. Ahora coloca el cursor al lado de Varianza y bajo nacimiento. Sigue el mismo procedimiento y escoge “var”. e. Repite el procedimiento para desviación estándar seleccionando “Std dev”. f. Completa los tres encasillados para la parte media (C2:C4) y desembocadura (D2:D4). g. Pasa a buscar el valor de F o la probabilidad de que la varianza entre dos puntos de muestreo no sea significativa. Repite el procedimiento anterior pero escogiendo ahora la función “FTest”. (1). En la columna de nacimiento vas a comparar la varianza ente el nacimiento y la parte media (1 y 2) por lo que en el “array 1” marca B2:B4 y en el “array 2” marca C2:C4. (2). En la columna Parte media vas a comparar la varianza entre la parte media y desembocadura por lo que el “Array 1” es C2:C4 y el “Array 2” es D2:D4. (3). Bajo la columna de desembocadura vas a comparar las varianzas entre el nacimiento y la desembocadura (“array 1” B2-B4 y “array 2” D2:D4). F. 1. Pasa a analizar si hay una correlación entre el pH, la temperatura y la turbidez del agua. Para ello, una vez tengas los datos de los tres muestreos prepara tres tablas en Xcel, una para temperatura, otra para pH y la tercera para turbidez. Haz la tabla según se te indica a continuación.Entra los datos en la tabla. Tabla 3: Correlación entre cambios en pH y concentración del Rio ________ durante los meses de ______, ______ y _______.

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Mes pH

Nacimiento Conc.

pH

Punto media Conc.

pH

Desembocadura Conc.

Enero Febrero Marzo Correlación

2. Haz un análisis de correlación entre el pH y la concentración de ADN. Para ello coloca el cursor en el encasillado al lado de correlación y bajo nacimiento en Xcel. Marca Insert → Function. En el encasillado “Or select a category” escoge “All” y marca “CORREL”. Luego marca los datos de las coluimnas de pH y de concentración de ADN y marca OK. Si la correlación es mayor de 0.90 entonces hay una correlación entre la cantidad de E. coli y el pH en ese punto de muestreo. Haz lo mismo con el punto medio y la desembocadura. 3. Pasa a analizar si hay una correlación entre la temperatura y la concentración de ADN. Sigue el mismo procedimiento de la sección anterior. Tabla 4: Relación entre la concentración de ADN y la temperatura del Rio ________ durante los meses de ____, _____ y _______. Mes

Nacimiento Conc. Temp.

Parte media Conc. Temp.

Desembocadura Conc. Temp.

Enero Febrero Marzo Correlación

4. 4. Determina la relación entre la turbidez del agua y la concentración de ADN. Resta la medida de visibilidad a la profundidad (1 metro). Si la visibilidad es 1 metro entonces la turbidez es 0. Procede de la misma manera que hiciste los análisis anteriores. Tabla 5: Relación entre la concentración de ADN y la turbidez del Rio ________ durante los meses de ____, _____ y _______. Mes

Nacimiento Conc. Turbidez

Parte media Conc. Turbidez

Desembocadura Conc. Turbidez

Enero Febrero Marzo Correlación

5. Si encuentras una relación entre alguno de los parámetros de pH, temperatura o turbidez entonces escoge uno de los puntos donde haya una correlación para cada parámetro y presenta una gráfica en Xcel para ilustrarlo.

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Discusión _______________________________________________________ 1. Compara los resultados de tu gel respecto al control positivo. ¿Ves alguna banda en tu muestra del mismo tamaño del DNA del control positivo?

2. Si observas una banda del mismo tamaño del control en la gel ¿qué significa?

3. Por otro lado, si no observas en la gel una banda del mismo tamaño del control positivo, ¿qué significa?

4. Si tienes bandas en el control negativo (agua destilada), ¿qué pudo haber pasado?

5. ¿Qué punto de muestreo mostró mayor concentración de ADN?

6. ¿Qué condiciones prevalecen en ese punto que podrían explicar esas concentraciones?

7. Examina el valor de F entre los distintos puntos de muestreo e indica si la diferencia entre los puntos es estadísticamente significativo (F>0.95). ¿Es significativo en todos los puntos? ¿Qué condiciones pueden hacer que sea significativo en esos dos puntos?

8. ¿Qué punto mostró la menor concentración de ADN? ¿A qué atribuyes este resultado?

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9. ¿Existe alguna correlación entre el pH, la temperatura o la turbidez y la cantidad de ADN? ¿Cuáles y en qué puntos?

10. Coteja la literatura científica en Pubmed y determina si otros investigadores encontraron resultados similares al tuyo. Cita estos estudios en esta parte indicando quienes, en que año, dónde y lo que encontraron.

11. Busca en Internet la concentración máxima de ADN de E. coli que se potable el agua y concluye si el río estudiado es potable. Nota: Recuerda que aislaste ADN de 2 mL de agua (2000 μL).

12. Analiza tus resultados y acepta o rechaza tu hipótesis.

13. Escribe aquí las referencias completas de los artículos citados.

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Avalúo ______________________________________________________________

Marca en la tabla que sigue tu autoevaluación de este laboratorio antes y después del experimento. Destrezas

Antes

Autoevaluación Después

Preparación de soluciones Uso de micropipetas Aislar ADN bacterial Preparar y correr una reacción para PCR. Montar y operar aparatos horizontales de electroforesis Cargar muestras en pozos de geles para elec.troforesis de geles de agarosa (horizontales). Teñir y desteñir geles Manejo de un espectrofotómetro Análisis estadístico de datos Suma de valores antes y después Promedio = Suma / 9

Escribe una reflexión sobre lo que dominas y no dominas y cuánto ganaste en destrezas durante el taller.

Describe en tus propias palabras y en forma resumida cada una de las destrezas aprendidas.

YRG:12-07rev MLGL:09-03-14 rev