QBIIA - Organización y Función Celular 2016 MODULO I: Arquitectura celular

Motores moleculares

Christiaan Huygens, siglo XVII

Transporte intracelular

-las redes de MT, MF y FI representan un impedimento para libre difusión -microinjección de dextranos indica difusión muy baja para partículas mayores de 500 kD -transporte subceular es mediado por MOTORES MOLECULARES

La dinámica intracelular DEPENDE de la actividad constante de motores moleculares

Los motores moleculares son enzimas mecanoquímicas: consumen ATP generando trabajo mecánico -transporte de partículas y organelas (cromosomas, RNPs, organelas de membrana) -tensión para cambios morfológicos, fagocitosis, migración celular. -contracción muscular -depolimerización de microtúbulos

Kinesinas Dineínas Miosinas

ATPasa: liberación de Pi provoca cambio conformacional, que es amplificado por el “brazo” del motor molecular

Kinesinas: se dirigen al extremo + de MT (excepciones, KIFC entre otras)

Dineínas: se dirigen al extremo – de MT Miosinas: se desplazan sobre microfilamentos (extremo + en gral.) Transporte intracelular de corta distancia: dispersión local Existen centenares de KIFs, miosinas y subunidades de dineínas No se conocen motores moleculares capaces de desplazarse sobre filamentos intermedios. Tal vez debido a la falta de polaridad de estas fibras

Experimentos pioneros de transporte axonal: Transporte axonal rápido y lento

Velocidad promedio Rápido (vesículas): FAT (Fast Axonal Transport) 1-10 cm/día (~1-10 um/min) Lento (tubulina y filamentos intermedios): 0.01-0.1 cm/día (~0.01-0.1 um/min) Intermedio (mitocondrias)

Videos de transporte vesicular in vitro: (axoplasma de calamar y otros) - en tiempo real se observan pausas en el movimiento Velocidad instantánea >>> Velocidad macroscópica: ~ 5-50 um/min transporte axonal rápido (vesículas) (~1-10 um/min) - a lo largo de microtúbulos y sobre “vías” invisibles (posteriormente se confirmó que el movimiento continuaba sobre microfilamentos) - Frecuentemente bidireccional: una misma vesícula /carga-no-vesicular puede experimentar movimiento anterógrado y retrógrado intermitentemente

FAT anterógrado y FAT retrógrado en axoplasma de calamar

Transporte de mitocondrias en axones de Drosophila

-Procesividad: distancia máxima sin detenerse -Velocidad instantánea

Kinesinas 0.02-3 um / seg

vs

dineínas max:14 um / seg

Cómo identificar/aislar proteínas motoras que funcionan sobre MT?

Cómo identificar/aislar proteínas motoras que funcionan sobre MT?

LA PRIMER KINESINA (KINESINA CONVENCIONAL/ KINESINA 1/KIF5) Fue aislada como una MAP con actividad ATPásica (queda retenida en MT en presencia de AMPPNP)

Cabezas globulares con actividad ATPasa, se unen a los microtúbulos mientras que las colas se unen a componentes celulares. Este es el “diseño básico” para todos los motores moleculares: kinesinas, dineínas y miosinas.

“Kinesina I”

o “kinesina convencional” o “KIF5”

Motores moleculares a escala humana

microscopía electrónica

www.mpasmb-hamburg.mpg.de/ktdock/

ADP

ATP ADP

ATP

ADP

Múltiples kinesinas: KIFs (por homología) 15 familias en vertebrados (1;2;3;…;14A; 14B) -aprox 500 486 KIFs agrupadas en familias -familias 16 y 17 están presentes en organismos o células con cilias o flagelos

Nomenclatura: Kinesin 1 /Kinesina convencional /KIF5 (ubicua)

KIF (N, C y M) Clasificación de Hirokawa, según la posicion del dominio motor.

“kinesina” /kinesina 1

Kin 13 retrógradas!!!

KIF (N, C y M) Clasificación de Hirokawa, según la posición del dominio motor.

(-)

Kin 13 retrógradas!!!

(+)

KIF 5: tetramérica

Monoméricas ??

Tetraméricas Triméricas ???

Diméricas

-Hirokawa et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2009 (tabla kin-cargo) -Hirokawa & Tanaka Ex Cell Res 2015

Dineína: se desplaza al extremo –. Complejo 1000kD, diversidad de DHC, DIC y DLC

Citosol: Homodimeros (DHC1, DHC2, varias DLCs y DICs) Cilios y flagelos: Heterotrímeros y heterodímeros

Dominio motor: 6(7) dominios AAA (ATPase Asociada a diversas Actividades celulares) en anillo. Unen ATP y ADP, no todos los AAA tinen actividad enzimática acoplada al movimiento

/KIF5

dynein KIFC2

ER-Golgi

Herramientas experimentales : -Drogas: existen pocas anti-motores (son ATPasas), diversas anti-CSK -Anticuerpos (algunos inhibitorios contra kinesinas específicas) -Dominantes negativas (motores o dominios de unión a cargo aislados), -Sobrexpresión de moléculas adaptadoras: ej p150/Glue; p50/dinamitina) -RNAi Dineína

p50

Cargo

Sobreexpresión de p50/dinamitina

p50 p50 p50

Dineína

p50

p50 p50 p50

Cargo

La integridad/posición del aparato de Golgi y de las mitocondrias dependen de Dineina (DHC1) y kinesina 1b/ KIF5B, respectivamente.

PubMed (14/04/2016) Kinesin: 6538 artículos

Kinesin + neuron : 996 (15%) Kinesin + mitosis : 1076 (16%)

KIF / kinesinas en dendritas y axones

?  Distintos cargos son transportados por distintas kinesinas, las cuales tienen velocidades microscópicas similares pero distinta procesividad y distintos tiempos de reposo, dando lugar a transportes macroscópicos de distinta velocidad (axonal lento vs. axonal rápido (FAT)).  Hay mas de una molécula motora por cargo vesicular.

Transporte de mRNAs en dendritas

Muy frecuentemente bidireccional

ENCUESTA I:

Cómo llegan las vesículas sinápticas a la membrana plasmática en la pre-sinapsis? A- desplazándose por MT que están en contacto con la membrana en la sinapsis B- liberándose de los MT y “difundiendo” C- por algún otro mecanismo

ENCUESTA II:

La kinesina se desplaza al extremo + de los MTs. Como “regresa”?

A- desplazándose por MT de polaridad invertida B- es transportada retrógradamente por dineína C- no regresa: se degrada

Melanosomas agregados

dispersos

Adrenalina 5 min (bajo AMPc)

Los melanosomas experimentan transporte anterógrado (kinesin) y retrógrado (dineína), según el estímulo. Los motores se encienden/ apagan en forma regulada.

Cafeína 15 min (activa PKA)

PKA induce dispersión.

Functional Coordination of Microtubule and Actin Based Motility in Melanophores. V. I. Rodionov, A. J. Hope, T. M. Svitkina and G.G. Borisy Curr. Biol., 8(3): 165-168, 1998

DISPERSIÓN

AGREGACIÓN

MT MF

Los melanosomas se desplazan por microtúbulos para recorrer grandes distancias y por microfilamentos para cortas distancias. Esto es válido para otros tipos de carga, en donde los MT fincionan como “autopistas” y los MF como “calles laterales”. Ej: transporte de vesículas sinápticas a lo largo MT axonales y de MF corticales en la sinapsis propiamente dicha (KIFs y miosina V, respectivamente)

MIOSINAS: Cabezas globulares de estructura similar al dominio motor de kinesinas - ATPasa - liberación de Pi provoca cambio conformacional amplificado (lo mismo que en kinesinas)

Kinesinas

0.02-3 um / seg

vs

dineínas

max:14 um / seg

vs

miosinas

0.2-60 um/seg

Miosina I

Miosinas: distintas funciones, procesividad y longitud del paso

“Myosin madness” Mermall V, Post PL, Mooseker MS. Science (1998)

Contracción Muscular

MOTOR: miosina II

Miosina II (no muscular)

Funciones de la miosina II no muscular: generar tensión entre microfilamentos antiparalelos o entre microfilamentos y membranas Movilidad celular (migración, cambios morfológicos) +

-

-

+

+

-

fibras de estrés (contractiles, antiparalelos)

Funciones de la miosina II no muscular

Cambios morfológicos a nivel tejido

Miosina II durante mitosis Citokinesis: Anillos Contráctiles de F-actina

Contraste de fase

fluorescencia (myosin II)

-Cómo “saben” cuando arrancar y hacia donde dirigirse? -Cómo se coordinan los distintos motores (complejo kinesina-dineína-miosina) en una misma carga? -Cómo “saben” que carga transportar? (Cómo “sabe” el pasajero a qué transporte subirse?) En todos los casos, KIFs, Dyn y Myo, distintos dominios proteicos pueden unir distintas adaptadores o directamente las cargas. -Regulación de la unión al cargo? Frecuente control por fosforilación. Hay varios sitios de fosforilación en las distintas subunidades de KIFs, dineínas y miosinas.

Modificacion post-traduccionales de los MT controlan actividad de kinesinas y dineínas Vale, Nat. Cell Biol 2014

“The Tubulin Code”

(depolimeriza)

Dineina (1000 kD) Adaptador dinactina: une bicaudal y diversos proteínas de membrana adaptadoras

p150/ Glued

p50/ dinamitina

Bicaudal D molecules: transporte de vesìculas, de mitocondrias y de RNPs BICD1

mRNA

kinesin

RBP Bicaudal D dynein

DINEINA:

Vía adaptadores (dinactina)

directamente vía DLC

MIOSINAS: distintos receptores

KINESINA 1. Adaptadores: Kinectinas (muchas varias).

2. Repeticiones “Tetratricopeptide” (34 aa) en KLC (JIP además de funcionar como adaptador kinesina-cargo, lleva moléculas implicadas en transducción de señales).

Miro y Milton en transporte de mitocondrias en axones

La unión al cargo, la unión a MT y la actividad ATPásica son reguladas por fosforilación, involucrando diversas vias de señalización.

Existen proteínas que se asocian a los motores e inhiben su función (ej: KBP, Kinesin Binding Protein) (Kevenaar et al. Curr Biol 2016)

Se investiga actualmente:

-función de distintas kinesinas y miosinas y dineínas Redundantes?

Muy específicas?

-reconocimiento cargo/motor -estructura, cambios conformacionales -cordinación entre motores (KHC requerida para Retrógrado, DIC y KLC; MyoV y KHC interactúan)

-regulación de la actividad motora por patógenos y en neurodegenarción