…..Es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a radiaciones de baja longitud de onda y alta energía (UV – Rx). Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo), son transformadas en luz visible, o sea de una longitud de onda mayor a la incidente.
Como se produce la fluorescencia? La absorción de luz por parte de la molécula de fluorocromo la eleva a un estado de exitación en el cual contiene mayor energía. La molécula permanece en el estado de exitación por un período de tiempo muy corto. El retorno a un nivel de energía menor es acompañado por emisión de luz (fluorescencia)
Inmunofluorescencia Directa El procedimiento se realiza en un paso básico de reacción. La muestra clínica que presuntamente contiene antígenos del microorganismo bajo estudio es puesta en contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contra dicho microorganismo conjugado con fluoresceína. Si el antígeno esperado está presente se formará un complejo antígeno-anticuerpo. La reacción positiva en forma de fluorescencia verde manzana puede verse con la ayuda de un microscopio de fluorescencia.
Esquema de la técnica
Inmunofluorescencia Indirecta Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo El proceso consta de dos etapas: Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el substrato conocido específico (células que contiene virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre él se coloca el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos específicos, si la reacción es positiva se dará formación de complejo antígeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado Segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionará con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa.
Inmunofluorescencia Indirecta La técnica se realiza en dos etapas PRIMERA ETAPA
SEGUNDA ETAPA
Microscopio de inmunofluorescencia Fuente de luz (lámpara de mercurio) Filtros Espejo dicroico
Excitación - Emisión
Tipos de filtros
Fluorocromos Sustancias que emiten un fotón cuando son excitados por un fotón incidente. Formen uniones con las proteínas (Ac) pero sin afectar los grupos de combinación específica del anticuerpo. La reacción de unión ocurre entre los grupos amino y carboxilo de la proteína y los grupos tiocianato o cloruro de sulfonilo de los colorantes El pH afecta la fluorescencia y por esta razón se debe trabajar a pH estable y adecuado dependiendo del colorante : fluoresceína (pH 8), rodamina (pH 7), DANS (pH 1.6-14)
PARÁMETROS DE FLUORESCENCIA Afinidad Selectividad Especificidad Intensidad (brillo) Estabilidad Competitividad
Ventajas y desventajas VENTAJAS
- Se pueden obtener resultados rápidos. -No es necesario realizar cultivos. -Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto. -Determina la identidad de un organismo muerto. Es sensible.
Nota: La figura muestra un ejemplo de fagocitosis.
DESVENTAJAS -Costos en reactivo y equipo -Debe ser realizado por personal muy especializado. -Los resultados no son 100% específicos
Photobleaching Es la disminución de la intensidad de emisión de la muestra debido a la descomposición irreversible de la fluorescencia de las moléculas. Este fenómeno esta directamente relacionado con la intensidad de excitación y y con el tiempo durante el cual estamos excitando la muestra. Para reducir este efecto podemos utilizar “anti fading” (glicerina) en la preparación de la muestra.
Detección de Anticuerpos AntiCándidas por Inmunofluorescencia 1 -Colocar 10 µl de una suspensión de 106 cándidas en cada wells de un portaobjeto de 7 wells. Dejar secar. 2- Agregar 20µl de suero diluído 1/16- 1/32- 1/ 64- 1/128- 1/2561/512- negativo en cada wells. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda. 3- Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes. 4- Agregar 20ul de suero anti Fc- FITC (dilución 1/100). Incubar 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad en cámara húmeda. 5- Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes. 6- Montar con 1 gota de glicerina bufferada. 7- Observar en microscopio de Inmunofluorescencia. La imagen es positiva si permite ver fluorescente el contorno de la levadura.
Para recordar…..
APLICACIONES Técnicas analíticas (cuali-y cuantitativas) en Química y Bioquímica. Métodos inmunológicos de diagnóstico médico. Procedimientos microscópicos en Microbiología, Genética, Histología, Histoquímica, Biología Celular, Biología Molecular, Biología del Desarrollo, Patología (sondas vitales, ensayos de viabilidad, indicadores, inmunofluorescencia, FISH). Análisis poblacional de células (citofluorimetría de flujo).
APLICACIONES
Treponema Pallidum agente etiológico de la Sífilis. Determinación por inmunofluorescencia donde se observa la forma de espiroqueta
Dengue Las células fluorescentes representan células infectadas con el virus dengue. Infección evidenciada con anticuerpos monoclonales para cada serotipo.
Biopsias renales :
Anticuerpos contra Membrana basal glomerular de tipo IgG
Virus Respiratorios
Virus Influenza B (IFD detección de antígeno)
Serotipificación
Anticuerpos anti Toxoplasma gondii, agente etiológico de la toxoplasmosis. El sustrato antigénico utilizado es una suspensión de Toxoplasma gondii. Detecta antígenos de membrana .