RECONOCIMIENTO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO RESUMEN El microscopio es una herramienta indispensable en la investigación cientÃ−fica, especialmente en el campo de la biologÃ−a y las ciencias que se derivan de ella. Hace siglos hubieran sido impensables el hecho de observar objetos diminutos, impercibibles por el ojo humano, hoy, gracias al gradual avance cientÃ−fico es posible realizar tal hazaña a través de objetos tales como el microscopio, que permiten visualizar objetos minúsculos y estudiarlos con gran profundidad. A través de la utilización de algunos materiales y la realización de ciertos procedimientos, se logra aprender rápidamente la utilización y el óptimo manejo de tal complemento útil aparato. La utilidad del microscopio es indiscutible e infinita, es la herramienta por excelencia al estudiar organismos vistos tales como células, bacterias, hongos y todos aquellos cuya observación se vea limitada por el ojo humano. INTRODUCCIà N Microscopio. (De micro-, pequeño y el gr. Skopein, observar.) Es un instrumento óptico destinado a observar de cerca objetos extremadamente diminutos. La combinación de sus lentes produce el efecto de que lo que se mira aparezca con dimensiones extraordinariamente aumentadas, haciéndose perceptible lo que no lo es a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene una o varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopÃ−a. En general, cualquier microscopio requiere los siguientes elementos: una fuente (como un haz de fotones o de electrones), una muestra sobre la que actúa dicha fuente, un receptor de la información proporcionada por la interacción de la fuente con la muestra, y un procesador de esta información (en general, un ordenador). Historia del microscopio Microscopio compuesto fabricado hacia 1751 por Magny. Proviene del laboratorio del duque de Chaulnes y pertenece al Museo de Artes y Oficios, ParÃ−s. El microscopio fue inventado hacia los años 1610, por Galileo, según los italianos, o por Zacharias Jansen, en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la Accademia dei Lincei, una sociedad cientÃ−fica a la que pertenecÃ−a Galileo y que publicaron un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja. Sin embargo, las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopÃ−a aparecen en 1660 y 1665, cuando Malpighi prueba la teorÃ−a de Harvey sobre la circulación sanguÃ−nea al observar al microscopio los capilares sanguÃ−neos y Hooke publica su obra Micrographia. En 1665 Robert Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y notó que el material era poroso. Esos poros, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de cajas a las que llamó células. Hooke habÃ−a observado células muertas. Unos años más tarde, Marcelo Malpighi, 1

anatomista y biólogo italiano, observó células vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio. A mediados del siglo XVII un comerciante holandés, Anton Van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación cientÃ−fica, puede considerarse el fundador de la bacteriologÃ−a. Tallaba él mismo sus lupas sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milÃ−metro (su campo de visión era muy limitado, de décimas de milÃ−metro). Con estas pequeñas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la sangre, bacterias y protozoos; examinó por primera vez los glóbulos rojos y descubrió que el semen contiene espermatozoides. Durante su vida no reveló sus métodos secretos y a su muerte, en 1723, 26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres. Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por asociación de vidrios flint y crown obtenidos en 1740 por H. M. Hall y mejorados por Dollond. De esta época son los estudios efectuados por Newton y Euler. En el siglo XIX, al descubrirse que la dispersión y la refracción se podÃ−an modificar con combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al mercado objetivos acromáticos excelentes. Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso aunque no se desarrollaron por el momento mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teorÃ−a del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejora la microscopÃ−a de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000. A principios de los años 1930 se habÃ−a alcanzado el lÃ−mite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo estos aumentos superiores a 500X o 1000X. Sin embargo, existÃ−a un deseo cientÃ−fico de observar los detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.). El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) fue el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000 X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM). MATERIALES Y Mà TODOS Materiales: • Microscopio óptico • Estereoscopio • Láminas porta y cubre-objetos • Goteros • Toallas • Papel absorbente • Hilos de diferentes colores • Algodón • Papel milimetrado • Cuchillas • Pedazos de papel impreso • Código de barras Métodos: • Visualización de la imagen invertida movimiento y poder de resolución. 2

• Recortar una letra impresa asimétrica (a o e), observar a simple vista la uniformidad de la tinta. Siguiendo los pasos descritos para realizar un montaje, se compara la observación al microscopio con objetivos de 4x, 10x y 40x; a simple vista, la tinta parece uniforme, pero al observarla con el objetivo de 4x, el borde aparece un poco irregular, y al ir aumentando el valor de los objetivos (10x y 40x), el borde de la letra aparece mucho más irregular y se puede apreciar la textura y la tinta en el papel. La tinta de la letra no es uniforme, esto se debe a que el papel es poroso, lo que asegura una distribución irregular de la tinta en el mismo. Vista normal Objetivo 4x Objetivo 10x Objetivo 40x • . Al invertir el porta-objeto de modo que la letra queda invertida al mirarla a simple vista a través del ocular, al colocar el objetivo de 4x, la letra parece estar al derecho, a pesar de que el porta-objeto está invertido. Vista normal Vista invertida • . Movimiento del carro Movimiento horizontal del carro: Al girar el tornillo del carro hacia la derecha, el carro se mueve también hacia la derecha, pero la imagen parece moverse hacia la izquierda; mas cuando se gira el tornillo hacia la izquierda, parece moverse la imagen en sentido contrario. Movimiento vertical del carro: Al girar el tornillo del carro hacia la derecha, el carro se mueve hacia adelante, mas la imagen da la impresión de moverse hacia atrás; y cuando el tornillo se gira hacia la izquierda, el carro se mueve hacia atrás, pero da la impresión de moverse hacia adelante. En conclusión, el desplazamiento de la imagen no coincide con el desplazamiento que se hace al carro. Esto se debe a que al mover el carro en un sentido u otro, se ve el desplazamiento de la imagen en sentido contrario. • . Siguiendo los pasos descritos para la realización del montaje, se realiza uno para los códigos de barras: Objetivo 4x Objetivo 10x Objetivo 40x Al realizar el montaje propuesto, se ve, con el objetivo de 4x, la marca de la impresión del código de barras y el borde de los números y las barras se ve irregular. Al cambiar el objetivo de 4x por el de 10x, se observa más claramente el borde de los números y las barras; la tinta está esparcida por todo el papel; es decir, salpicó toda la fibra. Cuando se cambia al objetivo de 40x, se puede ver la porosidad del papel y la distribución no uniforme de la tinta; a pesar de que a simple vista, el borde parece perfectamente uniforme, en realidad es un efecto óptico que produce la distancia del ojo del papel.

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• Visualización del poder de aumento. Siguiendo los pasos para realizar un montaje, se observa un pequeño pedazo de cabello utilizando los objetivos de 4x, 10x y 40x. Con el objetivo de 4x se observa la superficie del mismo, a simple vista, es relativamente uniforme, aunque al seguir aumentando el valor de los objetivos, se aprecia la superficie escamosa y fibrosa del mismo. Objetivo 4x Objetivo 10x Objetivo 40x Debido a que el Poder de aumento es el valor del ocular por del valor del objetivo, el poder de aumento es directamente proporcional a los valores de los objetivos utilizados, ya que al aumentar el valor del objetivo (manteniendo el Valor del Ocular constante), aumenta también el valor del Poder de Aumento. • Visualización del grosor y profundidad. Siguiendo la técnica previamente descrita, se observa el montaje de tres hilos de diferentes colores entrecruzados (azules, amarillos y violetas), las fibras de los hilos son minúsculas y están entrecruzadas entre sÃ−. Objetivo 4x Objetivo 10x Objetivo 40x Fibras de algodón: Se observa claramente que el algodón está constituido por pequeñas y diminutas fibras entrelazadas mutuamente. Objetivo 4x Objetivo 10x Objetivo 40x • Mediciones microscópicas: La unidad de longitud más frecuentemente usada es la MICRA, cuyo sÃ−mbolo es la letra griega “µ” que equivale a una milésima de milÃ−metro (1mm = 1000 micras) o a una millonésima parte de un metro. Para hacer mediciones micrometriÃ−tas se usa el ocular micrométrico o micrómetro, el cual permite determinar la longitud y anchura de determinada estructura que aparezca en el campo visual. Si no se dispone de un micrómetro es posible estimar el tamaño de los objetos microscópicos en observación si se conoce el diámetro del campo visual. Para determinar el diámetro del campo visual proceda de la siguiente forma:

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• Recortar un pedazo de papel milimetrado y realizar el respectivo montaje. • Enfocar con menor aumento tratando que uno de los vértices del cuadrado escogido concuerde con el borde del campo visual y cuente las cuadrÃ−culas que logre observar. De esta forma usted obtiene el diámetro del campo correspondiente del objetivo del menor aumento en milÃ−metros y por conversión en micras. Con el dato anterior determinar el diámetro del campo visual correspondiente a los objetivos de mayor aumento, para lo cual divida el diámetro encontrado por la razón entre las magnificaciones del objetivo de mayor aumento. 4000µ 4000µ D=------------- = -------------- = 400µ 40/4 10 • Microscopio estereoscopio: 5.1 Al observar el desplazamiento de la preparación en varios sentidos mientras se observa a través de los oculares del microscopio se deduce claramente que el desplazamiento de la imagen coincide perfectamente con la dirección hacia la cual se dirige. Ejemplo: al mover la preparación hacia la derecha, la imagen se mueve también hacia la derecha y viceversa. Microscopio estereoscópico El diseño de este instrumento es distinto al del diagrama de más arriba y su utilidad es diferente, pues se utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios estereoscópicos, por definición, deben ser binoculares (con un ocular para cada ojo), por lo que a veces se confunden ambos términos. Existen dos tipos de diseño, denominados respectivamente convergente (o Greenough) y de objetivo común (o Galileo). El diseño convergente consiste en usar dos microscopios idénticos inclinados un cierto ángulo uno con respecto a otro y acoplados mecánicamente de tal forma que enfocan la imagen en el mismo punto y con el mismo aumento. Aunque es un diseño económico, potente y en el que las aberraciones resultan muy fáciles de corregir, presenta algunas limitaciones en cuanto a modularidad (capacidad de modificar el sistema para poner accesorios) y la observación durante tiempos largos resulta fatigosa. El microscopio estereoscópico es apropiado para observar objetos de tamaños relativamente grandes, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver, (laminar) ni tampoco lo es que la luz pase a través de la muestra. Este tipo de microscopios permite una distancias que van desde un par de centÃ−metros a las decenas de ellos desde la muestra al objetivo, lo que lo hace muy útil en botánica, mineralogÃ−a y en la industria (microelectrónica, por ejemplo) como en medicina (microscopios quirúrgicos) e investigación, fundamentalmente en aplicaciones que requieren manipular el objeto visualizado (donde la visión estereoscópica es esencial). En la fotografÃ−a se aprecia una concha de 4 cm de diámetro. RESULTADOS 1. TIPOS DE MICROSCOPIO • Microscopio binocular. El que va provisto de dos oculares para poder efectuar observaciones con ambos ojos. 5

• Microscopio centrÃ−fugo. Variante del microscopio ordinario para observar preparaciones sometidas a centrifugación. • Microscopio compuesto. Es el constituido por uno o más lentes. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas: • El sistema mecánico está constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes, que permiten el movimiento para el enfoque. • El sistema óptico comprende un conjunto de lentes, dispuestas de tal manera que producen el aumento de las imágenes que se observan a través de ellas. • El sistema de iluminación comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observación a través del microscopio. • Microscopio de contraste de fase. Es el modificado para resaltar detalles de muestras no coloreadas, mediante las diferencias de fase que éstas producen en la luz que las atraviesa. • Microscopio de emisión de campo. Instrumento basado en el efecto de emisión de campo de electrones; proyecta directamente la imagen sobre una pantalla fluorescente, sin lentes. Su uso está limitado al estudio estructural de algunos metales. • Microscopio de fluorescencia. Variante del microscopio ordinario que permite observar la luz emitida por fluorescencia por la preparación sometida a la luz azul-violeta o ultravioleta. Se emplea especialmente en el estudio de microorganismos y moléculas orgánicas. • Microscopio de interferencia. Permite observar imágenes de interferencia entre rayos que atraviesan la muestra y otros que no lo hacen. • Microscopio de polarización o polarizante. microscopio al que se le han añadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador),el material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol dejando pasar únicamente la luz que vibra en un único plano (luz polarizada). Algunos compuestos orgánicos responden al efecto de la luz, éstos tienen un alto grado de orientación molecular (sustancias anisótropas), que hace que la luz que lo atraviesa pueda hacerlo en determinados planos vibratorios atómicos. El prisma de Nicol permite el paso de luz en un solo plano, asÃ− el cuarzo gira la posición de polarización, facilitando la identificación de sustancias que extinguen la luz. Al fenómeno de extinción de luz causado por estos planos atómicos y orientaciones moleculares se llama birrefringencia. Este tipo de microscopio se usa para poder identificar mejor sustancias cristalinas o fibrosas (como el citoesqueleto), sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales de uratos, queratina, sÃ−lice, y otras de origen exógeno. • Microscopio de rayos X. Aquel en el que se utilizan rayos X; como éstos tienen una longitud de onda menor que el de la luz, posee mayor poder de resolución. • Microscopio de reflexión. Microscopio cuyo objetivo, en lugar de una lente, está constituido por un sistema de dos espejos. • Microscopio electrónico. Es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones. El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quiénes se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones. Tipos de microscopios electrónicos 6

Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido. • Microscopio electrónico de transmisión. El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces. Microscopio electrónico de barrido En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectado en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie. • Microscopio invertido. Es el que lleva el objetivo y el ocular debajo de la platina. • Microscopio Protonico. Instrumento similar al microscopio electrónico y que al emplear protones en lugar de electrones, logra un poder separador mayor en la investigación de la estructura de metales, fibras, etc. 2. La imagen del microscopio óptico aparece invertida porque el lente de los objetivos es convexo, lo cual invierte la imagen por la difracción de las ondas de luz. 3. El campo de observación es inversamente proporcional al aumento de los objetivos, ya que al aumentar el valor del objetivo, disminuye el valor del campo de observación. 4. La fibra del papel es porosa, al aplicar tinta la impresora, estos poros la absorben, garantizando la fijación de la tinta en el papel; debido a la ya citada porosidad del papel, se crea en las impresiones un borde irregular que solo es visto con ayuda de lupas o microscopio, ya que nuestros ojos no tienen tal nivel de enfoque, vemos el borde de las impresiones totalmente uniforme. 5. 6. El microscopio invertido es el que lleva el objetivo y el ocular debajo de la platina. 7. Como todas las invenciones cientÃ−ficas, el microscopio electrónico también tiene sus limitaciones : • El limitado diámetro de la apertura no permite que la información detallada alcance la imagen, limitando de este modo la resolución. • El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe al contraste de difracción, provocado por la pérdida de electrones del rayo. Es un contraste dominante en especÃ−menes gruesos. • El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste dominante en especÃ−menes finos. • Existen también distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmática, esférica y cromática 7

• El problema de la función de transferencia de contraste (CTF): la CTF describe la respuesta de un sistema óptico a una imagen descompuesta en ondas cuadráticas. El material biológico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vacÃ−o y la transferencia de energÃ−a. Para resolverlos, se utilizan distintas técnicas dependiendo del tamaño de la muestra: • Para muestras grandes como órganos, tejidos o células, se utilizan tres técnicas: • La fijación quÃ−mica o la criofijación • La inclusión en resinas (criosustitución) • La réplica metálica • Para muestras pequeñas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes técnicas:â“ • La tinción negativa: los agentes de tinción más usados son el molibdato amónico, el fosfotungstato sódico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las siguientes propiedades: interactúan mÃ−nimamente con la muestra y son estables en la interacción con los electrones, son altamente solubles en agua, presentan una alta densidad que favorece el contraste, tienen un punto alto de fusión, tienen un tamaño de grano pequeño. • La réplica metálica: para construir la réplica metálica se evapora el metal (estaño), que se deposita sobre la muestra a la vez que esta, por el vacÃ−o, se disuelve. 8. En quÃ−mica, se llama colorante a la sustancia colorida usada en tinciones para resaltar diferentes microorganismos. Denominaciones de los colorantes: • denominación genérica • denominación quÃ−mica • código del "Colour Index 1924 (1ª edición) • código del "Colour Index 1956 (2ª edición) • código del Schultz • número de la CEE • otro tipo de denominaciones, como las de cada paÃ−s, la comercial de los fabricantes, etc. BIBLIOGRAFIA • http://es.wikipedia.org/wiki/microscopio • Salvat editores, S.A. 1988. Diccionario enciclopédico Salvat. Carvajal S.A Barcelona

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