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Cañete, Martín; González, Sergio Javier; Roveto, Silvana Enfermedad tiroidea autoinmune, ctla-4 y cd 28 Bioquímica y Patología Clínica, vol. 74, núm. 1, 2010, pp. 25-29 Asociación Bioquímica Argentina Buenos Aires, Argentina Disponible en: http://www.redalyc.org/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=65121041004

Bioquímica y Patología Clínica ISSN (Versión impresa): 1515-6761 [email protected] Asociación Bioquímica Argentina Argentina

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REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 74 Nº 1 2010

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Enfermedad tiroidea autoinmune, ctla-4 y cd 28 Cañete Martín, González Sergio Javier, Roveto Silvana. Dirección postal: Av. Combatientes de Malvinas 3150. II cuerpo, 1er piso Mail: [email protected]

RESUMEN La enfermedad tiroidea autoinmune (AITD) incluye, principalmente, la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Hashimoto. Afecta al 5 % de la población general. Su desarrollo está dado por la interacción entre la susceptibilidad genética y factores ambientales. Una característica de la enfermedad es la activación de la inmunidad humoral (producción de anticuerpos anti-peroxidasa tiroidea y anti receptor de TSH), y de la inmunidad celular (principalmente CD8 citotóxicos), que conduce a daño celular y sus consecuencias clínicas (hipo o hipertiroidismo). Además de los mecanismos autoinmunes mencionados, existen otros moleculares involucrados en la etiología de la enfermedad, que incluyen polimorfismos en inmunomodulares como CD28 y CTLA4, y en genes candidatos (HLA, CD40 y PTPN22) que generan susceptibilidad a desarrollar AITD. El objetivo de esta revisión es describir en forma detallada los aspectos genéticos y moleculares que participan en el desarrollo de AITD. Palabras clave: CTLA-4, CD-28 y enfermedad tiroidea autoinmune

SUMMARY Autoimmune thyroid disease (AITD) includes mainly the Graves’ disease and Hashimoto’s thyroiditis, affecting 5 % of the general population. Its development is given by interaction between genetic susceptibility and environmental factors. A feature of the disease is the activation of the humoral immunity ( production of thyroid peroxidase antibodies and TSH receptor) as well as the activation of the cellular immunity (mainly CD8 cytotoxicity) developing the cellular damage and its clinical consequence (hypo or hyperthyroidism). There are other molecular aspects that should be in mind whenever the ethiology of the diseases are described. Those mechanisms include polymorphism of immunomodulator molecules like CD28 and CTLA4 and also polymorphism of candidate’s genes (HLA, CD40 and PTPN22) in the susceptibility of the AITD. Considering the above mentioned, the objective of the present review is to describe the genetic and molecular aspect involve in the origin of the autoimmune thyroid disease. Keywords: CTLA-4, CD-28 and AITD.

Revista ByPC. Incorporada al Latindex. ISSN 1515-6761 Código Bibliográfico: RByPC Fecha de aceptación: 14/06/2010

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INTRODUCCIÓN ¿Qué es la enfermedad tiroidea autoinmune (AITD)? Comprende un grupo de desórdenes complejos, que comparten la respuesta inmune humoral y celular contra la glándula tiroides (1). Es la enfermedad autoinmune más prevalente y afecta hasta el 5 % de la población general; el 4 % de las mujeres, el 1 % de los hombres y se incrementa con la edad superando el 10 % de los sujetos mayores de 75 años (2 y 3). AITD es un conjunto de enfermedades que clásicamente incluye enfermedad de Graves (GD) y tiroiditis de Hashimoto (HT). Las variantes adicionales son: tiroiditis posparto, hipotiroidismo primario, tiroiditis inducida por drogas (INFα), tiroiditis asociada a síndrome poliendócrino autoinmune y presencia de anticuerpos antitiroideos sin enfermedad clínica aparente (4). Los principales autoantígenos en AITD son la peroxidasa tiroidea, la tiroglobulina y el receptor de TSH. La interacción entre susceptibilidad genética y factores externos (dieta, infecciones, estrés, etcétera) pueden iniciar la respuesta inmune contra autoantígenos tiroideos. Tanto la GD como la HT involucran infiltración de linfocitos T y B reactivos, producción de anticuerpos antiantígenos tiroideos y, consecuentemente, manifestaciones clínicas. Las moléculas CD (del inglés, cluster designation) 28 y el CTLA-4 (del inglés, citotoxic T cell lymphocyte associated molecule 4), comparten sus ligandos, expresados en la superficie de células presentadoras de antígenos (APC). Pero poseen diferente expresión en membrana y afinidades; generando respuestas opuestas, por ejemplo en cuanto a la producción de IL2 a partir de los linfocitos T (5). PATOGÉNESIS DE AITD Si bien la etiología exacta es aún desconocida, existe actualmente sólida evidencia de la influencia genética en el desarrollo de AITD Factores genéticos y ambientales permitirían la interacción entre autoantígenos y la acumulación de APC en la glándula tiroides. Consecuentemente, debido a la pérdida de tolerancia inmune, células autorreactivas activadas por APC invaden la glándula tiroides e interactúan con el tirocito donde comienza una “batalla” para sobrevivir. La activación de la ruta apoptótica a través de receptores de superficie y ligandos tiene un gran significado en esta “batalla” y desempeña un papel en la expresión clínica de AITD. Esta ruta apoptótica puede desregularse por citoquinas producidas por linfocitos T activados intratirocito. Las citoquinas predominantemente inflamatorias de Th1 y la infiltración de linfocitos citotóxicos que expresan FasL y Bcl-2 producen la apoptosis celular en HT. Otra hipótesis (Giordano y col. [6]) sugiere que la apoptosis observada en tiroides de pacientes con HT es una consecuencia de la expresión simultánea de Fas y FasL por el tirocito, que resulta en un fraticidio celular. Este hecho está basado en que el FasL se expresa en forma

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constitutiva en el tirocito y la IL1 producida por la infiltración de células inmunes, induce la expresión de Fas sobre la misma célula tiroidea. En cambio, en GD está favorecida la inmunidad humoral y se incrementan los títulos de anticuerpos antirreceptor de TSH (TRAB); que generalmente activan el receptor causando hiperplasia e hiperfunción tiroidea. Las citoquinas inflamatorias responden fundamentalmente al tipo Th2 [IL4 y 5] (7) PEROXIDASA TIROIDEA COMO AUTOANTÍGENO La peroxidasa tiroidea es la enzima involucrada en la biosíntesis de hormonas tiroideas y es la llave autoantigénica en HT. Los anticuerpos antiperoxidasa tiroidea (TPO), que también están presentes en GD, revelan un punto crítico en AITD. La respuesta autoinmune antiperoxidasa (1ra hipótesis de Bottazzo y col. [8]) es consecuencia del comportamiento del tirocito como APC que induce células T autorreactivas contra peroxidasa tiroidea y expresión de TPO séricos. ESTRUCTURA DE LA PEROXIDASA TIROIDEA Es una proteína de membrana asociada a la superficie apical del tirocito. Contiene un grupo prostético y un homodímero glicosilado. La peroxidasa humana es 42 % homóloga a la mieloperoxidasa del granulocito. Las células T reconocen un pequeño péptido lineal (8-20aa) de la proteína, procesado y unido al MHC clase II (CD4+) o clase I (CD8+). La interacción entre células T y B es crucial en muchas enfermedades autoinmunes. Actualmente se acepta la hipótesis que el tirocito es un importante presentador de antígeno para la inducción de células T autoinmunes antiperoxidasa específicas y la consecuente producción de TPO (9). CARACTERÍSTICAS DE LOS TPO Son predominantemente de tipo IgG; solo en algunos individuos son IgA específica e IgE. Los TPO son policlonales y se observa la presencia de varias subclases de IgG (principalmente IgG 1, 2 y 4) con cadenas livianas predominantemente kappa. ¿PUEDEN LOS TPO CONTRIBUIR A LA DISFUNCIÓN TIROIDEA? Los TPO contribuyen al hipotiroidismo al inhibir la actividad enzimática, activar el sistema complemento y producir daños al tirocito por mecanismo de citotoxicidad (10). Los TPO séricos son marcadores de disfunción tiroidea y reflejan infiltración linfocitaria de la glándula tiroidea, aun en enfermedad subclínica, representan un marcador importante en la tiroiditis posparto y en la disfunción tiroidea inducida por INF en el tratamiento de hepatitis C. La incidencia de hipotiroidismo, en individuos con TPO positivos, es de 2 % por año. Cambios en los niveles de TPO acom-

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pañan a los TRAB en pacientes con GD tratados con drogas antitiroideas o radio yodo. CD 28 y CTLA-4; SU PAPEL EN LA AITD Las moléculas CD28 y CTLA-4 presentan homología en el 30 % de la secuencia de aminoácidos, esto les permite reconocer los mismos ligandos, expresados en la superficie de APC; el 70 % restante, difiere en sus secuencias y permite que se unan con distinta afinidad a los ligandos y generen respuestas opuestas. El CD28 también está involucrado en la cooperación T-B y se encuentra presente en el 95 % de las células CD4+ y en el 50 % de las células CD8+. Provee una potente señal coestimulatoria de los linfocitos T regulando la producción de IL-2. CTLA-4 se expresa en células T luego de la activación, y envía señales que inhiben la transcripción de la IL-2 y la progresión de las células T en el ciclo celular. El efecto directo es la inhibición de la señal generada por la molécula CD28. Mutaciones que alteren la función o expresión del CTLA-4 pueden producir una activación exagerada de las células T, el desarrollo del fenómeno autoinmunitario y establecer la susceptibilidad para padecer AITD (11). ESTRATEGIAS EXPERIMENTALES Y TÉCNICAS Evidencia directa: mediada por anticuerpos (circulantes, complejos inmunes) y mediada por células. Evidencia indirecta: reproducción de la enfermedad autoinmune por inmunización experimental, utilización de modelos animales espontáneos y modelos animales producidos por la desregulación del sistema inmune. Evidencia circunstancial: presencia de autoanticuerpos, estudios de ligamiento, asociación genética con otras enfermedades autoinmunes (12). BASES GENÉTICAS Los datos disponibles respecto a las causas de la enfermedad sugieren una etiología multifactorial, que incluye factores genéticos y ambientales. El componente genético en la enfermedad es sugerido por los valores de riesgo familiar (mayor en gemelos monocigóticos que en dicigóticos). Los estudios genéticos y familiares indican un modo de herencia poligénica (13 y 14). Los análisis de ligamiento y los de asociación permiten conocer los genes implicados en el desarrollo de la enfermedad. Los análisis de ligamiento están basados en el hecho de que genes que se encuentran próximos en los cromosomas se segregan juntos debido a la baja probabilidad que existe de recombinación en el espacio que los separa. En consecuencia, si contamos con la presencia de un marcador cercano al/a gen/es implicados en el desarrollo de la enfermedad, cosegregarán y permitirá al investigador reconocer la zona en la cual se encuentran los genes responsables de la enferme-

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dad. Los análisis de asociación son más sensibles que los de ligamiento. Se basan en comparar la frecuencia del alelo estudiado en pacientes comparados con controles sanos. Si el alelo estudiado se encuentra asociado al desarrollo de la enfermedad, aparecerá más frecuentemente en los pacientes que en los controles sanos. De acuerdo con resultados obtenidos por análisis de ligamiento del genoma completo y análisis de asociación de genes candidatos, se han identificado 6 genes que producen susceptibilidad a desarrollar AITD: HLA-DR, CD 40, CTLA-4 PTPN22 (del inglés, protein tyrosine phosphatase-22), Tg (tiroglobulina) y TSHR ( del inglés, thyrotropin receptor). Algunos genes codifican para moléculas de células T que forman parte de la sinapsis inmunitaria. Para iniciar la activación de células T se necesitan dos señales, la primera surge del reconocimiento del péptido antigénico presentado por las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que se encuentran en las APC unidas a receptores de células T y B, la segunda está dada por moléculas coestimuladoras de APC que interactúan con CD28, expresado en células T en forma constitutiva. Estas señales conducen a la síntesis de IL2 que induce la proliferación de células T (expansión clonal). Si esta vía no ocurre, la célula T va hacia la anergia y apoptosis. El MHC contiene los genes correspondientes al antígeno leucocitario humano (HLA); está localizado en el cromosoma 6p21 y codifica para moléculas inmunorreguladoras. La susceptibilidad genética para la autoinmunidad tiroidea y adrenal en humanos es aportada por genes correspondientes al HLA y por otros genes candidatos localizados en el cromosoma 2q33. Esta región contiene el gen de CTLA-4 que codifica un receptor de células T y el de CD 28 que compiten por la unión a B7, ligando natural de CTLA-4 que no es expresado por el tirocito pero sí por la APC intratiroides. Los macrófagos tienen alta densidad de B7 en su superficie comparado con monocitos de sangre periférica (15). Sabiendo que el linfocito T es el principal mediador de la autoinmunidad tiroidea, el fenotipo de CTLA-4 puede afectar la función celular y estar involucrado en la patogénesis de la AITD. Utilizando ensayos con modelos animales, se demostró una región inmunodominante (IDR) en la enzima peroxidasa, reconocida por anticuerpos monoclonales humanos antiperoxidasa tiroidea. Ratones inmunizados con TPO + MHC clase II + fibroblastos, desarrollan títulos moderados de anticuerpos que reaccionan con epitopes IDR de la peroxidasa (16 y 17) Estudios de asociación del HLA con GD (diseño caso-control) mostraron que los alelos del MHC clase I, con una alta frecuencia de HLA-B8 estaban asociados a pacientes con GD (47 %) al compararlos con controles (21 %). Otros trabajos en población caucásica han mostrado consistente asociación entre GD y alelos del MCH claseII, HLA-DR3, con un riesgo relativo entre 2.5 y 5 (18). Investigaciones de asociación de MHC con hipotiroidismo autoinmune (HA) revelaron resultados menos consistentes con respecto a estudios en GD. En población caucásica se ha

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reportado la asociación de HA con varios alelos de HLA, que incluyen B8, DR3, DR4, DR5, DQA1*0201/0301 y DQB1*03. De los genes identificados que generan susceptibilidad a desarrollar GD, CD40 es el único que desempeña un papel fundamental en la regulación de la respuesta por células B. Por medio de diferentes análisis se ha demostrado: asociación y ligamiento del locus CD40, con un polimorfismo C/T (alelo CC) en el extremo 5´ UTR del gen CD24, asociado al desarrollo de GD. Numerosos estudios evidenciaron que el gen CTLA-4 se encuentra ligado al desarrollo de todos los fenotipos de AITD (GD, HT, orbitopatía asociada a tiroides). El primer polimorfismo de CTLA-4 asociado al desarrollo de GD fue un microsatélite ubicado en el extremo 3´UTR del gen. Asociado al desarrollo de AITD se identificó otro polimorfismo de simple nucleótido (SNP) en la posición 49 (A/G) que resulta en un cambio de alanina/treonina produciendo un menor procesamiento de CTLA-4 en el retículo endoplasmático. Otro gen involucrado es PTPN22, que codifica LYP (del inglés, lymphoid tyrosine phosphatase), inhibidora de la activación de linfocitos T. Una sustitución de triptofano por arginina en el codón 620 de LYP produce asociación de PTPN22 con el desarrollo de GD y HT. Por medio de análisis de búsqueda de genomas completos se ha observado un fuerte ligamiento del gen Tg con el desarrollo de AITD. Recientemente se han identificado 2 nuevos microsatélites en el gen Tg que estarían asociados al desarrollo de AITD (19). La presencia de autoanticuerpos estimulantes del receptor de TSH (TSRAB) se sabe es patognomónico de la GD. Estudios realizados trataron de asociar diferentes polimorfismos del receptor con la evolución de GD y demostraron asociación entre 3 SNPs y GD. Moléculas pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas, tales como CD28 y CTLA-4, generan señales positivas y negativas respectivamente; entre APC y linfocitos T. La vía positiva genera activación, proliferación y diferenciación (B7-CD28) y la negativa (B7-CTLA-4) genera anergia, muerte celular y regulación de la expansión clonal T (20). La señal generada entre CD28- B7 contribuiría a gatillar la respuesta inmune y desencadenar la autoinmunidad. CTLA-4 desempeña un importante papel en el curso de AITD (21). CTLA-4 regularía positivamente la señal de transducción hacia un subtipo de célula Treg (reguladoras CD4+25+FOXP3+) al guiar la diferenciación intracelular y generar un cambio de la respuesta hacia la tolerancia. Existe una forma soluble de CTLA-4, dosable en plasma, presente en pacientes con diferentes enfermedades autoinmunes (LES, asma, esclerosis múltiples, artritis reumatoidea, diabetes mellitus) y con niveles séricos mayores comparados con un grupo control. En algunos reportes se observaron modificaciones en la expresión celular de esta molécula, la cual podría contribuir a la pérdida de tolerancia y, por ende, al desarrollo de autoinmunidad (22 y 23). Polimorfismos genéticos del CTLA-4 (-318 C/T y +49 A/G) y CD28 (IVS3+17 T/C) estarían asociados con mayor o menor

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intensidad según los grupos de estudios, con numerosas enfermedades autoinmunes. Varios trabajos mostraron que la presencia del alelo G aumenta el riesgo de padecer GD y HT (24 y 25). PROYECCIONES FUTURAS El papel de estas moléculas se torna de gran interés como un potencial terapéutico, como por ejemplo la administración de una CTLA-4 inmunoglobulina combinada con otros bloqueantes más la administración de algunas drogas inmunosupresoras específicas (26). La tolerancia inmunológica es una respuesta activa guiada por células T no respondedoras en presencia de un órgano transplantado, la cual se desarrollaría a través de algunos mecanismos que incluiría el bloqueo de la vía de coestimulación y la acción de células T reguladoras (Treg). La EAT (tiroiditis autoinmune experimental) es inducida en un modelo murino por inmunización con tiroglobulina y se caracteriza por infiltración linfocitaria en la tiroides. El tratamiento de EAT es a través de la inducción de células Treg. Por medio de este modelo y al administrar anticuerpos biespecíficos, que pueden unir simultáneamente TSHR y CTLA-4, se previene y suprime la EAT en ratón. El mecanismo es por supresión de linfocitos T efectores, que a su vez colaboran, con las células dendríticas semimaduras, requeridas para la generación de células Treg. Estos hallazgos tienen implicancia clínica y podrían ser aplicados al tratamiento efectivo de AITD (27).

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