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Corazza, Nora I.;Aquilano, Daniel R.;Scaglia, Hugo E. La concentración del cortisol en saliva es más representativa de la fracción biodisponible que de la libre del cortisol circulante Bioquímica y Patología Clínica, Vol. 71, Núm. 3, 2007, pp. 13-19 Asociación Bioquímica Argentina Argentina Disponible en: http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=65112133002

Bioquímica y Patología Clínica ISSN (Versión impresa): 1515-6761 [email protected] Asociación Bioquímica Argentina Argentina

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REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 Nº 3 2007 Trabajo: págs 13 | 19

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La concentración del cortisol en saliva es más representativa de la fracción biodisponible que de la libre del cortisol circulante Nora I. Corazza1 Daniel R. Aquilano2 1 Hugo E. Scaglia 1 Bioquímico 2 Dr. en Bioquímica

Lugar de Trabajo: Instituto de Análisis Bioquímicos de Endocrinología Calle 59 Número 969 (1900) La Plata

Enviar Correspondencia a: Hugo E Scaglia e-mail: [email protected]

RESUMEN El objetivo del presente trabajo es determinar si el CS está en equilibrio con la fracción del cortisol libre (CL) circulante. Se evaluó el cortisol total (CT) en el suero de 14 normales extraídos a las 8:00 y a las 23:00 y el CS a las 23:00. En las mismas muestras de suero se determinó la capacidad de unión de la CBG al cortisol-H3. La distribución del cortisol en las fracciones unida a la CBG (C-CBG), CL y biodisponible (C-bio) se calcularon por el programa TRANSPORT. La capacidad de unión de la CBG no fue diferente a las 8:00 y 23:00 (397.8±62.2 y 412.5±88.3 µg‰, respectivamente). El CT a las 8:00 fue significativamente mayor que el de las 23:00, indicando un ritmo circadiano normal (128±33 y 42.5±22.2 ng/ml, respectivamente). A las 8:00 el C-CBG (121±31 ng/ml), fue significativamente mayor que a las 23:00 (41±21), indicando que la disminución del CT indujo estas diferencias. El CS a las 8:00 y las 23:00 fue de 8.7±3.7 y 1.15±0.36, ng/ml, respectivamente, que fueron similares al C-bio en esos mismos tiempos (6.8±2.7 y 1.6±1.0 ng/ml, respectivamente), pero significativamente diferentes del CL (2.4±1.0 ng/ml a las 8:00 y 0.6±0.4 ng/ml a las 23:00). Si bien se ha postulado que el CS representa al CL circulante, este trabajo constituye la primera demostración de que el CS se correlaciona mejor con el C-bio que con el CL. Palabras claves | cortisol salival, cortisol libre, esteroides biodisponibles, estroides en saliva

SUMMARY The aim of the present study was to determine whether salivary cortisol (SC) correlates with circulating Free Cortisol (FC). Total Cortisol (TC) was mesaured in 14 normal individuals at 8:00 and 23:00, and SC at 23:00. In same serum samples the CBG binding capacity for 3H-C was determined. Distribution of C among its fractions CBG-bound (C-CBG), FC, and bioavailable (bioC), were calculated with the computer program TRANSPORT. CBG binding capacity was similar at 8:00 and 23:00 (397.8±62.2 and 412.5±88.3 µg‰, respectively). TC at 8:00 was significantly higher than that at 23:00, indicating a normal circadian rythm (128±33 and 42.5±22.2 ng/ml, respectively). C-CBG was significantly higher at 8:00 (121±31 ng/ml) than at 23:00 (41±21), indicating that the fall in TC induced these differences. SC at 8:00 and 23:00 were 8.7±3.7 and 1.15±0.36, ng/ml, respectively, similar to those of bio-C (6.8±2.7 and 1.6±1.0 ng/ml, respectively), although significantly different from FC (2.4±1.0 ng/ml at 8:00, and 0.6±0.4 ng/ml at 23:00). Despite the notion that SC represents the circulating FC, this study is the first demonstration that SC correlates better with bio-C than with FC. Keywords | slivary cortisol, free cortisol, bioavailable steroids, salivary steroids

Revista ByPC. Incorporada al Latindex. ISSN 1515-6761 Código Bibliográfico: RByPC Trabajo Recibido: 06-08-07 Aceptado: 24-09-07

INTRODUCCIÓN

La concentración del Cortisol en saliva es más representativa de la fracción biodisponible que de la libre del Cortisol circulante

La saliva es producida por un grupo de glándulas exócrinas, las glándulas salivares, situadas en la cavidad bucal. Es un líquido incoloro, acuoso y mucoso, compuesto básicamente por agua, además de diversas proteínas, enzimas, glucoproteínas, glúcidos y electrolitos. Tiene un pH comprendido entre 5,6 y 7. Es un fluído hipertónico producto de tres pares de glándulas salivares: parótidas: se sitúan a nivel de las mejillas y vierten la saliva en la boca a través del conducto de Stenon, submaxilares: a ambos lados del suelo de la boca, que vierten la saliva a través del conducto de Wharton, y sublinguales: se sitúan en la parte anterior y central del suelo de boca, vierten la saliva por los conductos de Rivinus y Bartholin. Otras glándulas que también segregan saliva son las glándulas palatinas, situadas en el paladar blando, así como otras glándulas más pequeñas situadas en la lengua y en las mucosas de la boca. La unidad básica de las glándulas salivares está formada por acinos, conductos intercalares, conductos estriados y el conducto excretor. Los acinos glandulares están rodeados por una red capilar, desde donde llegan los esteroides que luego serán evaluados en la saliva. La secreción de la saliva se encuentra, en su mayor parte, bajo el control del sistema nervioso autónomo. En condiciones basales, la secreción es de 0.5 ml/min pudiendo aumentar hasta 6-7 ml/min. Un adulto secreta de 600 a 1500 ml de saliva por día. Del total del volumen de saliva, las glándulas submandibulares segregan un 60%, las parótidas un 25% y el resto las sublinguales. Los esteroides en general circulan unidos a proteínas de poca capacidad y gran afinidad, por ejemplo para el cortisol la CBG (Cortisol binding globulin), a proteínas de gran capacidad y baja afinidad como la albúmina y una pequeña parte libre, 1-3 %, de libre difusión por los capilares sanguíneos. La fracción unida a la albúmina por su baja afinidad tiene una velocidad de disociación menor de 20 segundos, tiempo de tránsito de una molécula de un vaso aferente a un capilar, por lo cual esta fracción más la libre ha sido considerada como biodisponible. Por otro lado la unida a la CBG, por su alta afinidad, la velocidad de disociación es superior a los 20 segundos y está impedida de llegar a los órganos blancos por simple difusión. En el año 1983 se demuestra que la fracción de esteroides no conjugados, neutros y liposolubles no unida a proteínas transportadoras de alta afinidad y la libre, por ejemplo el cortisol, se difunde a través de la ruta intracelular y son captados por el acino glandular para luego excretarse en saliva. Esa difusión es independiente del flujo salival (1). Contrariamente los esteroides conjugados, tal como el sulfato de DHEA, entran a la saliva vía ultrafiltración, por los espacios entre las células acinares y su concentración en la saliva, dependiendo de la velocidad del flujo (2). En los últimos años numerosos estudios han validado el uso de la saliva para evaluar las hormonas esteroideas porque es un ultrafiltrado natural de la sangre y en consecuencia los esteroides no unidos a proteínas de la circulación san-

guínea difunden libremente en la saliva. Ha sido postulado que el cortisol en saliva está en equilibrio con el cortisol libre circulante y es independiente del flujo de producción de saliva (3-5). Sin embargo no existen estudios realizados en muestras obtenidas en sangre periférica y en saliva simultáneamente que establezcan la correlación de la concentración del cortisol en saliva con las distintas fracciones circulantes del mismo. El objetivo del presente estudio fue determinar si el cortisol en saliva correlaciona con el libre (CL) o el biodisponible (Cbio) circulante. Para la realización de este trabajo desarrollamos las siguientes metodologías: 1) Un método para determinar cortisol en suero y saliva por unión competitiva del esteroide con el cortisol tritiado a la CBG del suero de mujeres en el tercer mes de embarazo. 2) Determinar en cada muestra de sangre la máxima capacidad de unión de la CBG por el cortisol empleando el método de Scatchard 3) Con el valor del cortisol, la capacidad de unión de la CBG y los niveles de albúmina empleando el programa de Dunn, Nisula y Roadbard (6) calculamos la concentración del cortisol unida a la CBG (C-CBG), a la albúmina (C-Alb) y el CL. El Cbio resultó la suma de estas últimas 2 fracciones. 4) Los valores de las distintas fracciones circulantes del cortisol se correlacionaron con las concentraciones en saliva en muestras obtenidas simultáneamente. Los resultados del presente estudio proveen evidencias que el cortisol en saliva correlaciona mejor con el Cbio que con el CL circulante.

MATERIALES Y MÉTODOS Se extrajo una muestra de sangre obteniéndose el suero a las 09:00 y 23:00 hs en 14 personas normales, voluntarias de tomar parte en este estudio. Fueron incluidos en el protocolo aquellas personas que no tenían patología endócrina ni no endócrina manifiesta, ni que tomaran medicación por lo menos 6 meses antes de intervenir en este protocolo por las siguientes características, entre otras, debido a que los anticonceptivos orales y la levotiroxina compiten con la proteína transportadora; los antihistamínicos, inhibidores de la MAO, antidepresivos, parasimpaticolíticos, ííticos, modifican la concentración circulante del Cortisol. Enfermedades como parotiditis, deshidratación y otras de causas psicógenas, modifican el flujo salivar. Finalmente deben descartarse enfermedades que produzca hiposalivación, como el síndrome de Sjöegren, granulomatosis, amiloidosis, alcoholismo crónico, entre otras. Los resultados de bioquímica clínica general y determinaciones hormonales de los distintos ejes fueron normales en todos los casos. Antes de la extracción de sangre de las 23 horas se colectó una muestra de saliva según las siguientes características: a) El paciente debe cenar a las 20 hs. o pasadas las 23 hs.

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(después de la toma de muestra de la saliva). b) La recolección de la muestra se realiza por emisión espontánea debiendo recogerse como mínimo un volumen de 3 ml. en tubos de polipropileno, material inerte, irrompible, que puede ser esterilizado. c) Hay que evitar el cepillado de dientes previo a la toma de muestra de saliva, para evitar contaminación de la misma con sangre, lo cual aumentaría los valores reales del analito en saliva. En cuanto al efecto de la contaminación de la saliva con sangre, se ha demostrado que hasta 2 g/l de Hemoglobina no afectaría la determinación. d) La muestra de saliva, se centrifuga, en centrífuga común 20 min. a temperatura ambiente, para precipitar la mucina y otras proteínas de la saliva. Para la determinación del cortisol debe obtenerse un sobrenadante límpido pudiendo repetirse varias veces la centrifugación si fuera necesario. El sobrenadante de la saliva y el suero se conservan a -20ºC hasta el momento de realizar las diferentes determinaciones. En el sobrenadante de la saliva y en el suero de ambas extracciones de sangre se determinó cortisol, y en ambas muestras de sangre la capacidad de unión de la CBG al cortisol. Se emplearon como controles para el método de la capacidad de unión de la CBG una mezcla de sueros de hombres y embarazadas normales. Determinación del cortisol por unión competitiva a la CBG del suero de mujeres embarazadas del tercer trimestre. A 100 µl de suero y 1 ml de sobrenadante de saliva se extraen por duplicado con 10 veces su volumen con cloruro de metileno por agitación durante 1 minuto. Se descarta la fase acuosa y el solvente se evapora a sequedad en un baño a 45 o C, pudiendo facilitar la evaporación por pasaje de Nitrógeno. El extracto del suero y de la saliva se disuelve en 0.3 ml de buffer fosfato 0.1M. Se prepara una curva estándar de cortisol no marcado isotópicamente en concentraciones de 100 hasta 0.39 ng/tubo en diluciones al medio, realizadas en buffer fosfato 0.1M en un volumen de 0.3 ml. Se prepara una mezcla de suero de mujeres embarazadas del tercer trimestre para ser empleados sin purificación previa, como fuente de CBG. Se titula este suero para emplearse a una dilución que una aproximadamente el 50% de 0.1 ml de una solución de cortisol tritiado (C3H) de 18.000 cpm, con una actividad específica (ae) de 70 Ci/mmol. Se agrega 0.1 ml de la dilución apropiada del suero de embarazadas (CBG) a las diluciones de la curva estándar y a los extractos disueltos en el buffer de los sueros y del sobrenadante de la saliva y 0.1 ml de la solución de C3H. Se prepara un 100% de unión con 0.3 ml de buffer y 0.1 ml de la solución del C3H y de la CBG y un tubo de unión no específica con 0.4 ml de buffer y 0.1 ml de C3H. Se incuba a 45 oC durante 20 min y a 4 oC, 20 min. La fracción unida de la libre se separa por agregado a todos los tubos 0.1 ml de Carbón

/Dextrán (1.25 y 0.125 gr %). Se incuban a 4 oC, 5 minutos se centrifuga y el sobrenadante se vuelca en 2.0 ml de líquido centelleo y se cuenta la radioactividad en un contador de Centelleo Líquido Packard con una eficiencia del 70% para 3 H. La concentración de Cortisol se calcula por interpolación con la curva estándar corrigiendo por el volumen extraído. Determinación de la máxima capacidad de unión de la CBG por el cortisol Se colocan en 8 tubos 0.1 ml de suero de la mezcla de hombres, mujeres embarazadas y de cada una de los sueros obtenidos a las 08:00 y 23:00 hs. Se agrega a los tubos 2 a 8 tubo 0.1 ml de cortisol no marcado isotópicamente en concentraciones de 50 a 0. 8 ng. A todos los tubos se agrega 0.1 ml de buffer fosfato 0.1M. Al tubo 1 se completa el volumen con el agregado de 0.1 de buffer. A todos los tubos se agregan 0.1 ml de solución de C3H (ae: 70 Ci/mmol) de aproximadamente 10.500 dpm, equivalente a 0.235 ng de Cortisol. Paralelamente se preparan por triplicado las cuentas totales (0.3 ml de buffer y 0.1 ml de la solución de C3H) y la unión no específica (0.2 ml de buffer y 0.1 ml de C3H). Se incuba a 18 o C durante 18 hs y la fracción libre de la unida se separa por agregado a todos los tubos excepto a las cuentas totales, 0.1 ml de carbón/dextrán (1.25 y 0.125 gr%). Se incuban a 4 oC, 5 minutos, se centrifuga y el sobrenadante se vuelca en 2.0 ml de líquido centelleo y se cuenta la radioactividad en un contador de centelleo líquido Packard con una eficiencia del 70% para 3H. La masa total en cada tubo será la correspondiente a la del C 3H + la agregada en cada tubo. La radioactividad unida en cada tubo corresponderá a la determinada en el sobrenadante del Carbón /Dextrán menos la de la unión específica. Con ese valor se determina el % de unión para cada concentración de Cortisol agregado respecto al tubo 1, y se calcula la masa unida (B), la libre (F) y la relación B/F para cada tubo. Se grafica en un sistema X (B para concentración de Cortisol) en función de Y (relación B/F para cada concentración de B). La intersección en el eje X representa la máxima capacidad de unión de la CBG para nuestra ensayada, según la ecuación de Scatchard (7). Se realiza un procedimiento similar en forma individual para cada persona y para cada suero obtenido a las 08:00 y 23:00 horas, con la única diferencia que las concentraciones de Cortisol no marcado fueron de 12,5, 25 y 50 ng. Distribución del Cortisol circulante La distribución del Cortisol circulante se realizó empleando el programa “TRANSPORT” TRANSPORT” cedido gentilmente por el Dr. Roadbard del NIH, USA y adaptado por el Dr. Juan Carlos Calvo a nuestro sistema de computación (8,9). Este programa permite con el valor del Cortisol total y de la CBG calcular el cortisol unido a CBG, a la albúmina y el libre. La suma del CAlb + CL corresponde al cortisol biodisponible (C-bio)

La concentración del Cortisol en saliva es más representativa de la fracción biodisponible que de la libre del Cortisol circulante

RESULTADOS La figura 1 muestra la curva de titulación de la mezcla de sueros de mujeres embarazadas del tercer trimestre para la unión específica del C 3 H. La dilución 1:8 tuvo una unión del 50% de 18.000 cpm del esteroide marcado. Esta dilución se empleó para los ensayos donde se valoraron los sueros y los sobrenadantes de la saliva empleados en este estudio. Figura 1. Titulación de la CBG del suero de embarazo del 3er trimestre. La gráfica corresponde a la media ± DS obtenida por triplicado empleando una solución donde en 0.1 ml tenía entre 18.000 cpm .

Figura 2. Representación gráfica de la Curva de Cortisol obtenida por unión competitiva del estándar con el Cortisol Tritiado por la CBG del suero de una mezcla de sueros de mujeres embarazadas del tercer trimestre. Cada punto representa la media ± DS de 5 ensayos del % de desplazamiento de la radioactividad (total menos unión no específica) respecto a la máxima unión del esteroide Tritiado. Las concentraciones del estándar fueron de 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.390 ng/tubo. 100 90 80

100

70

90

% de unión

60

80 70

% de unión

60

50 40 30

50

20

40

10

30

0

20

0.1

0.5 1

5 10

50 100

Cortisol ( ng/tubo)

10 0 0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20

Inversa de la dilución de la mezcla de sueros de embarazo del 3 trimestre (CBG)

La figura 2 muestra la representación gráfica de la Curva de Cortisol obtenida por unión competitiva del estándar con el Cortisol Tritiado por la CBG del suero de una mezcla de sueros de mujeres embarazadas del tercer trimestre en 5 ensayos consecutivos. Los valores del coeficiente de variación para 0.39 ng de cortisol fueron menores del 20 %, constituyendo la sensibilidad funcional del método (10). Tomando la sensibilidad funcional como el límite de detección del método, los mínimos niveles aceptables estadísticamente fueron para el suero y saliva de 3.9 y 0.39 ng/ml, respectivamente. Los coeficientes de variación intra e interensayos fueron menores del 15% y del 20 %, respectivamente. La CBG une a la corticosterona y desoxicortisol con la misma afinidad que al cortisol, La reacción cruzada con estos glucocorticoides es igual, presenta un orden de magnitud de 10 veces menor con los andrógenos y progestágenos y prácticamente despreciables con el resto de los esteroides. Los niveles circulantes del cortisol son de alrededor de 150 ng/ml en horas temprana de la mañana y de 40 ng/ml a las 23 horas, los de Corticosterona de 4.0 ng/ml y 1.5 ng/ml y los de Desoxicortisol de 5.0 ng/ml y 1.0 ng/ml a la mañana y noche respectivamente. Estas concentraciones no influyen significativamente en la determinación del Cortisol, por lo tanto este método puede considerarse satisfactorio desde el punto de vista de la especificidad del mismo para la evaluación del cortisol.

La figura 3 muestra la gráfica de Scatchard para la cuantificación de la máxima capacidad de unión de la CBG para el cortisol en un a mezcla de sueros de hombres normales y de mujeres embarazadas del tercer trimestre. Los valores obtenidos de 520 y 1140 µg/litro son coincidentes con los reportados previamente (8) Estas mezclas de sueros fueron empleadas en cada ensayo como controles internos. La figura 4 muestra la máxima capacidad de unión de la CBG de los sueros de cada persona obtenidos a la 08:00 y 23:00 individualmente. La tabla I muestra la máxima unión de la CBG y la distribución del cortisol circulantes en las distintas fracciones; unido a la CBG, a la albúmina y libre en las muestras individuales de sangre obtenidas a las 08:00 y 23:00 horas en las 14 personas normales. La tabla muestra también las concentraciones de Cortisol obtenidas en la saliva de las 23 horas. Los valores de CBG obtenidos a las 08:00 y 23:00 fueron de 397.6±62.2 µg/litro y 412.5±88.3 µg/litro, respectivamente, los cuales no resultaron estadísticamente diferentes (p> 0.5). El Cortisol total a las 08:00 horas fue significativamente mayor (p< 0.01) que a las 23:00 horas, 128.6±33.1 ng/ml y 42.5±22.2 ng/ ml respectivamente. Como puede verse en la tabla dado las diferencias del cortisol entre la muestra matinal y vespertina y la no diferencia en la CBG el C-CBG, C-Alb y el CL resultaron estadísticamente superiores en la muestra matinal (p< 0.01 en todos los casos). La concentración del cortisol en la saliva de la 23:00 horas fue de 1.15±0.36 ng/ml (3.3±1.0 nM). Estos niveles resultaron significativamente a los reportados en la saliva de las 08:00 horas de 8.70±3.70ng/ml (25.0±10.6 nM) (11)

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Figura 3. Representación del gráfico de Scatchard obtenido para una mezcla de hombres y mujeres normales embarazadas del tercer trimestre. En ambos casos las concentraciones de Cortisol fueron de 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.6 y 0.8 ng. La intersección en el eje de las X representa la máxima unión de la CBG para ambos casos, los cuales corregidas por la dilución corresponde a 520 µg/litro y 1149 µg/litro para hombres y mujeres respectivamente.

Tabla I. Distribución del Cortisol circulante a las 8 y 23 horasobtenidas con el programa TRANSPORT (8) conociendo los niveles de Albúmina (Alb) CBG y Cortisol total. También se muestran los niveles de Cortisol determinadosen saliva obtenida a las 23 horas.

Pool Hombres Pool Embarazadas 10

Unido / libre (B / F)

Máxima Unión 52 ng/0.1 ml

Cortisol en suero

Cortisol en suero

No

100

23 horas

8 horas

CBG Total (g/litro) (ng/ml)

Unido CBG Alb Libre (ng/ml(ng/ml)(ng/ml)

Total CBG (g/litro) (ng/ml)

Unido CBG Alb Libre (ng/ml(ng/ml) (ng/ml)

Cortisol saliva (ng/ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

400 350 440 440 480 310 510 390 280 405 350 415 380 420

176.3 73.4 147.8 87.1 121.9 125.0 150.0 200.0 120.0 125.0 95.0 120.0 119.0 140.0

166.9 69.9 140.7 83.8 117.4 116.5 144.6 186.9 110.7 119.2 90.2 114.7 113.1 133.5

5.9 2.2 4.7 2.1 2.9 5.3 3.4 8.3 5.8 3.6 3.0 3.4 3.7 4.0

3.5 1.3 2.4 1.2 1.6 3.2 2.0 4.8 3.5 2.2 1.8 1.9 2.2 2.5

350 500 325 560 360 405 605 410 360 350 415 420 295 420

24.9 21.2 21.4 25.0 26.2 60.0 29.0 81.0 75.0 25.0 66.0 35.0 38.0 68.0

24.0 20.6 20.5 24.3 25.2 57.7 28.4 77.8 71.6 24.0 63.5 33.9 36.1 65.6

0.6 0.4 0.5 0.4 0.6 1.4 0.4 2.0 2.1 0.6 1.6 0.7 1.2 1.5

0.3 0.2 0.4 0.3 0.4 0.9 0.2 1.2 1.3 0.4 0.9 0.4 0.7 0.9

0.85 0.70 0.80 0.85 1.00 1.40 0.80 1.70 1.80 1.90 1.40 1.20 1.50 1.10

Media DS

397.8 62.2

128.6 33.1

121.8 4.4 31.2 1.7

2.4 1.0

412.5 88.3

42.5 22.2

40.9 21.2

1.0 0.6

0.6 0.4

1.15 0.36

114 ng/0.1 ml

1

Figura 5. Media ± DS de los niveles circulantes a las 23 horas del Cortisol Biodisponible (Cortisol unido a la albúmina + libre) y del Cortisol libre comparativamente a los del Cortisol en saliva tomada simultáneamente.

0.1 0 10 20

40

60

80

100

120

140

Unido (B) ng/0.1 ml de suero

2.5

2.0

Cortisol (ng / ml)

Figura 4. Capacidad máxima de unión de la CBG al cortisol en las muestras de sangre individuales obtenidas a las 08:00 y 23:00 horas. Los valores se obtuvieron intercalando la pendiente al eje de las X , corrigiéndolos por la dilución del suero utilizada. Las concentraciones de Cortisol empleadas fueron 12.5, 25 y 50 ng.

1.5

1.0

0.5

100

B máx: g/litro 1 negro: 400 2 marrón: 350 3 verde: 440 4 turquesa: 440 5 azul: 480 6 violeta: 480 7 verde obscuro: 510 8 gris: 390 9 gris obscuro: 360 10 rojo: 405 11 verde claro: 350 12 amarillo: 415 13 celeste: 380 14 violeta claro: 420

B/F

10

1

0.1

0

10

20

30

40

50

60

Unido (ng/0.1 ml de suero)

70

B máximo de la CBG en suero de las 23horas

1000

B máx: g/litro 1 negro: 400 2 marrón: 500 3 verde: 325 4 turquesa: 560 5 azul: 360 6 violeta: 405 7 verde obscuro: 605 8 gris: 410 9 gris obscuro: 280 10 rojo: 350 11 verde claro: 415 12 amarillo: 420 13 celeste: 295 14 violeta claro: 420

100

10

B/F

B máximo de la CBG en suero de las 8 horas

1

0.1 0

10

20

30

40

50

60

70

Unido (ng/0.1 ml de suero)

La figura 5 muestra la correlación entre los niveles circulantes del C-bio y CL con el cortisol en saliva en muestras obtenidas simultáneamente a las 23:00 horas. La media ± DS del C-bio fue de 1.60±1.0 ng/ml la cual no difiere significativamente del de saliva, 1.15±0.36 ng/ml, (p> 0.5) Ambas concentraciones resultaron significativamente mayores (p> 0.01) que la del CL, 0.60±0.36 ng/ml.

0.0

Biodisponible circulante

Saliva circulante

Libre

DISCUSIÓN Los resultados presentados en este trabajo demuestran que la determinación de cortisol en suero y en saliva por unión competitiva con el C 3H a la CBG del suero sin purificar de embarazadas del tercer trimestre, cumple con los requisitos de control de calidad, sensibilidad analítica y funcional, especificad, y reproducibilidad. Los valores obtenidos en el suero de sangre extraída a las 08:00 y 23:00 hs y los de la saliva a las 23:00 hs son coincidentes con los reportados previamente en la literatura empleando otros métodos de valoración, como enzima inmunoensayo, radio inmunoensayo o de mayor sensibilidad cono las de quimioluminiscencia o luminiscencia (12). Muchas son las ventajas en la utilización de la saliva como

La concentración del Cortisol en saliva es más representativa de la fracción biodisponible que de la libre del Cortisol circulante

diagnóstico, entre otras, que la saliva puede ser recolectada por procedimientos no invasivos, puede ser recolectada en sitios remotos y luego enviada al laboratorio, no se necesitan personal entrenado para su recolección, una vez recolectada es estable a temperatura ambiente por períodos prolongados de tiempo. Entre las desventajas podemos mencionar la falta de familiaridad con este medio, además la interpretación de los resultados es aún difícil porque a pesar de que los patrones diurnos – nocturnos generalmente muestran un gran paralelismo con los valores en suero, los rangos absolutos en diferentes estudios muestran una gran variabilidad (13). Los escasos niveles del cortisol en la saliva han requerido para su correcta evaluación en técnicas directas que sean de gran sensibilidad o emplear anticuerpos en el radioinmunoensayo a mayores diluciones para aumentar la sensibilidad del método (11). En el método propuesto en este trabajo, dada la extracción con solventes del esteroide nos permitió aumentar el volumen de la muestra de saliva para tener una concentración valorable en el rango de los niveles con sensibilidad analítica apropiada. La determinación de la máxima capacidad de unión de la CBG al cortisol ha sido previamente descripta empleando como soporte Concanavalina A Sefarosa para separar la fracción unida de la libre (8). En este trabajo empleamos carbón / Dextrán obteniendo resultados similares a los descriptos previamente (8) tanto en hombres como mujeres. La distribución del cortisol en las distintas fracciones circulantes empleando el programa TRANSPORT resultó que el % del CL, Cbio y C-CBG respecto al cortisol total tuvo un rango en el suero de las 08:00 hs de 1.31 a 2.91; 3.6 a 7.7 y de 89.39 a 97.99, respectivamente y en el de las 23:00 hs de 0.90 a 1.86; 2.0 a 5.0 y de 89.74 a 97.32, respectivamente. Las concentraciones del C-CBG, Cbio y CL disminuyeron significativamente (p< 0.01) a las 23:00 hs respecto a las 08:00 hs. Los valores obtenidos para esos dos tiempos de extracción de las muestras de sangre fueron para el C-CBG 42.5±22.2 ng/ml y 121.8±31.2 ng/ml, para el Cbio 1.6±0.9 ng/ml y 6.8± 1.9 ng/ml y para el CL 0.6±0.4 ng/ml y 2.4±1.0 ng/ml. La CBG no se modificó significativamente mientras que disminuyó significativamente los niveles circulantes del cortisol entre el suero obtenido a la 08:00 y 23:00hs, 128.6±33.1 ng/ml y 42.5±22.2 ng/ml, respectivamente. Estos resultados indican que la distribución porcentual del cortisol en sus distintas fracciones no se modifican a expensan de los cambios en la concentración del glucocorticoide. La concentración en saliva del cortisol resultó superior en todos los casos al CL circulante con un rango de 1.2 a 4 veces. Estos resultados demuestran que el cortisol en saliva no representa al CL circulante, como ha sido sugerido (3, 11, 14-17). Los niveles del cortisol en saliva se correlacionaron con el Cbio, demostrando que los niveles en saliva corresponden a la fracción del cortisol circulante no unida a la CBG, considerada como biológicamente activa. Ha sido comunicado que el cortisol en saliva correlaciona con

el Cortisol Libre Urinario (18) tanto en normales como en pacientes con Síndrome de Cushing. En un futuro investigaremos la correlación entre el cortisol en saliva, su distribución en suero y el cortisol libre en orina de las 23 horas. En síntesis podemos concluir que el cortisol en saliva es un método relativamente simple, no invasivo y confiable para la determinación de la función glucocorticoidea adrenal y permite su evaluación en horas de la noche factible de ser utilizado como screening en endocrinología clínica para el diagnóstico de los síndromes de Cushing y de Addison así como para la evaluación de algunas patologías psiquiátricas, para medicina del deporte y otras.

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REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 Nº 3 2007 Trabajo: págs 13 | 19

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