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RELACION ENTRE INFECCIONES QUIESCENTES DE Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Y LOS DIFERENTES ESTADOS FENOLÓGICOS DEL FRUTO DE MANGO (Magnifera indica L) VARIEDAD HILACHA
LORENA PARRA AYA
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de
Microbiólogo Agrícola y veterinario
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTA 2008
NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia".
RELACION ENTRE INFECCIONES QUIESCENTES DE Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Y LOS DIFERENTES ESTADOS FENOLÓGICOS DEL FRUTO DE MANGO (Magnifera indica L) VARIEDAD HILACHA
LORENA PARRA AYA
APROBADO
____________________________ Mª Clemencia Forero de la Rotta Ingeniera Agrònoma M.Sc. Directora
________________________ José Salvador Montaña Biólogo M.Sc.
_____________________________ Sandra Gómez Ingeniera Agrónoma M.Sc.
RELACION ENTRE INFECCIONES QUIESCENTES DE Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Y LOS DIFERENTES ESTADOS FENOLÓGICOS DEL FRUTO DE MANGO (Magnifera indica L) VARIEDAD HILACHA
LORENA PARRA AYA
APROBADO
________________________ INGRID SHULER Bióloga Ph.D Decana Académica
________________________ JANETH ARIAS PALACIOS Bacterióloga M.Sc-M.Ed Directora de Carrera
Agradecimientos
A Dios.
A mis padres Arnulfo Parra y Betty de Parra por darme la oportunidad de estudiar y ser una persona de bien, a mis hermanas Johana, Natalia y Maria Camila por el apoyo que me brindaron.
A mi novio Julian por todo el tiempo, colaboración, dedicación y apoyo para poder realizar con éxito este proyecto.
Maria Clemencia Forero de la Rotta, por la confianza, por su colaboración, por sus enseñanzas y por guiarme en este proyecto.
A Jairo Osorio por la oportunidad y la confianza de dejarme realizar este trabajo.
A Juan Clímaco Hío y Erika Patricia Martínez. Laboratorio de Fitopatología. CORPOICA. Por su apoyo y colaboración.
A Carlos y Dimas. Laboratorio de Fitopatología. CORPOICA Nataima. Por sus colaboraciones.
A Johana Rozo por su apoyo, colaboración y su amistad.
A mis amigas de la universidad, Silvia Duarte, Irene Chabur, Carmen Pinzon y Diana Valbuena por estar ahí.
RESUMEN
La antracnosis cuyo agente causal es Colletotrichum gloeosporioides, es considerada la enfermedad mas limitante en cultivos de mango variedad hilacha ocasionando numerosas pérdidas en su producción, incitando a la búsqueda de alternativas de manejo iniciando por un conocimiento pleno del agente causal y su relación parasítica con el hospedero. Se obtuvieron aislamientos de Colletotrichum gloeosporioides de frutos aparentemente sanos de Mango variedad Hilacha, en los diferentes estados fenológicos (E1, E2, E3 y E4) desde fruto en desarrollo hasta fruto maduro. Las infecciones quiescentes se presentaron con mayor frecuencia en estados fenológicos iniciales (E1 y E2), comparados con los estados de desarrollo avanzado, debido probablemente al efecto del pH del fruto.
Se realizaron pruebas biológicas para determinar la patogenicidad del hongo y confirmar la especie de Colletotrichum que se presenta en los frutos de esta especie. Las pruebas de sensibilidad al Benomyl, la prueba cualitativa de la proteaza y el medio selectivo para Colletotrichum spp. determinaron la presencia de la especie C. gloeosporioides como el agente causal de la antracnosis. La patogenicidad de los aislamientos se evaluó inoculando bloques de agar sobre los frutos. Se demostró que todos los aislamientos causan infección en los frutos.
Palabras Claves: Antracnosis, pH, Fenología e Incidencia.
ABSTRACT
The anthracnose whose causative agent is Colletotrichum gloeosporioides, is considered the most limiting disease in mango crops causing numerous losses in their production, prompting the search for alternative management by initiating full knowledge of the causative agent and its parasitic relationship with
the
accommodation
provider.
The
Insulation
of
Colletotrichum
gloeosporioides earned of fruits apparently of healthy Mango variety stringless, at different phenological stages (E1, E2, E3 and E4) from developing fruit until ripe fruit. The results showed that quiescent infections were presented with greater frequency in phenological stages initials (E1 and E2), compared with the advanced stages of development, probably due to the effect of pH of the fruit.
Biological tests were conducted to determine the pathogenicity of the fungus and confirm the kind of Colletotrichum occurring in the fruits of this kind. Evidence of sensitivity to Benomyl, the qualitative evidence from the proteaza and selective medium for Colletotrichum spp. determined the presence of the species C. gloeosporioides as the causal agent of anthracnose. The pathogenicity of the isolates were evaluated by inoculating agar blocks on the fruits. It showed that all isolates cause infection in the fruits.
Key Words: Anthracnose, pH, Phenology and incidents.
CONTENIDO
Pag 1. INTRODUCCIÓN
14
2. MARCO TEORICO
16
2.1 Mango común o Hilacha (Mangifera indica L.)
16
2.1.1 Botánica y Descripción
16
2.1.2 Condiciones Agroecológicas
18
2.1.3 Plagas y Enfermedades
19
2.2 Agente Causal
19
2.2.1 Taxonomía
20
2.2.1.1 Estado Telemorfo
20
2.2.1.2 Estado Anamorfo
20
2.3 Generalidades
21
2.4 Desarrollo de la Enfermedad
22
2.4.1 Infecciones quiescentes
24
2.5 Síntomas
28
2.6 Condiciones Epidemiológicas
29
2.7 Métodos de Diagnóstico
31
2.8 Control
32
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
33
4. OBTETIVOS
35
4.1. Objetivo general
35
4.2. Objetivos específicos
35
5. MATERIALES Y METODOS
36
5.1. Localización de la Investigación
36
5.2. Muestreos de frutos.
37
5.3. Detección de infecciones quiescentes
39
5.4. Aislamiento de Colletotrichum sp.
39
5.4.1. Purificación de Aislamientos
40
5.5. Pruebas Biológicas
41
5.5.1. Medio selectivo para Colletotrichum sp.
41
5.5.2 Pruebas de Patogenicidad
42
5.5.3 Prueba de tolerancia al Benomyl
44
5.5.4. Prueba de la Proteasa
44
5.6. Determinación del pH en los diferentes estados del fruto de Mango.
45
6. RESULTADOS Y DISCUSION
47
6.1 Aislamientos de Colletotrichum sp.
47
6.2 Detección de Infecciones Latentes en frutos asintomáticos de Mango.
49
6.3 Medio selectivo para Colletotrichum sp.
52
6.4 Prueba de Benomyl
53
6.5 Prueba de la Proteasa.
54
6.6 Pruebas de Patogenicidad
56
6.7 Determinación de pH en Frutos sanos y Enfermos de Mango.
57
7. CONCLUSIONES
63
8 RECOMENDACIONES
65
9. REFERENCIAS
66
ANEXOS
74
TABLA DE FIGURAS Pag Figura 1. Ciclo de vida de la enfermedad de Antracnosis causada por Glomerella cingulata y Colletotrichum gloeosporioides.
22
Figura 2. Proceso de las infecciones quiescentes en Mango.
24
Figura 3. Eventos entre el patógeno y el hospedero dentro de la infección quiescente en frutos por C. gloeosporioides.
27
Figura 4. Frutos de Mango.
28
Figura 5. Estados Fenológicos de Mango. E1, E2, E3 y E4.
37
Figura 6. Frutos de Mango sanos con y sin bloques de agar con micelio del microorganismo.
42
Figura 7. Características microscópicas de C. gloeosporioides.
46
Figura 8. Aislamientos de Colletotrichum sp.
47
Figura 9. Porcentaje de infección quiescente de C. gloeosporioides en los diferentes estados fenológicos de frutos de mango.
49
Figura 10. Prueba de Benomyl.
52
Figura 11. Prueba de la Proteasa.
54
Figura 12. Frutos de Mango con síntomas de antracnosis iniciales y avanzadas.
55
Figura 13. Efecto de Antracnosis sobre el pH en mesocarpio y exocarpio y sobre tejido tomado en el fruto.
60
LISTA DE TABLAS Pag Tabla 1. . Etapas fenológicas de los frutos de Mango, de acuerdo con
37
la edad, dimensiones, peso y otras características. Tabla 2. Clasificación de las especies según los medios de
41
evaluación biológica. Tabla 3. Periodo de Incubación de los Diferentes Estados
48
Fenológicos de Frutos de Mango. Tabla 4. Valores de pH de Frutos Sanos de Mango.
56
Tabla 5. Valores de pH de Frutos Enfermos de Mango.
57
LISTA DE ANEXOS Pag ANEXO 1. Preparación de Agar Agua.
73
ANEXO 2. Preparación de PDA.
74
ANEXO 3. Protocolo de Cámaras Húmedas.
75
ANEXO 4. Protocolo Monospóricos.
77
ANEXO 5. Medio para evaluar la reacción de la proteasa producida por Colletotrichum acutatum.
80
ANEXO 6. Protocolo Medio Suplementado con base Benomyl.
81
ANEXO 7. Protocolo Medio Suplementado con Hidróxido de Cobre y Estreptomicina.
83
ANEXO 8. Incidencia de Infecciones Quiescentes en los estados fenológicos de frutos de Mango.
85
ANEXO 9. Pruebas de Validación, Normalidad y comparación de promedios en la incidencia de infecciones quiescentes en los estados fenológicos de frutos de mango.
88
ANEXO 10. Características Morfológicas de los Aislamientos.
91
ANEXO 11. Prueba de Benomyl con 2 repeticiones.
92
ANEXO 12. Prueba de la Proteasa con 2 repeticiones.
93
ANEXO 13. Prueba de medio selectivo para Colletotrichum sp.
94
ANEXO 14. Presencia de síntomas iniciales de Antracnosis en los tratamientos de Patogenicidad.
96
ANEXO 15. Efecto de la Enfermedad sobre el pH en áreas sanas y enfermas de frutos enfermos y en frutos sanos.
97
ANEXO 16. Pruebas de Validación, Normalidad y comparación de promedios en el efecto de la enfermedad sobre el pH.
111
1.
INTRODUCCIÓN
El mango es una de las frutas tropicales considerada de gran importancia socioeconómica en Colombia junto con el banano y los cítricos, ya que constituye una alternativa productiva de alto potencial en el mercado nacional y de exportación.
En Colombia existen alrededor de 13.900 hectáreas sembradas con este frutal, que producen aproximadamente 170.000 toneladas de frutas al año. Los departamentos de mayor producción son Tolima y Cundinamarca. Debido a la expansión del mercado interno y a las posibilidades de exportación se requiere la utilización de tecnología para optimizar y mejorar los rendimientos. Dentro de la tecnología demandada el mayor interés se centra en el manejo de la antracnosis, por ser el problema fitosanitario más limitante de la producción de mango.
La antracnosis es causada por el hongo Colletotrichum gloeosporioides (Penz), afecta frutos y otras estructuras de la planta. Las pérdidas por esta enfermedad durante la cosecha se han calculado aproximadamente en un 40%; no obstante, los daños en poscosecha como consecuencia de infecciones quiescentes hacen de la enfermedad una verdadera amenaza para la competitividad de los sistemas productivos. Actualmente en Colombia el manejo de la enfermedad en mango se fundamenta en la aspersión programada de fungicidas durante la fase productiva, de esta forma se hacen entre 8 y 12 aspersiones, lo cual resulta muy costoso y perjudicial para los seres vivos y el medio ambiente; en muchos casos no se obtienen resultados favorables. Debido a la importancia económica de esta enfermedad es conveniente conocer la incidencia de las infecciones quiescentes de C. gloeosporioides (Penz.) a lo largo del
13
desarrollo del fruto y simultáneamente establecer una posible relación entre ellos, para llegar a enfocar de manera adecuada programas de control integrado que presenten menor grado de contaminación al ambiente.
14
2.
MARCO TEORICO
2.1. Mango común o Hilacha (Mangifera indica L.)
El mango es una de las frutas más importantes en el trópico, se cultiva en todos los países que se encuentran en esta área. Se conoce hace mas de 4000 años en la India, donde en la actualidad existen mas de 800.000 hectáreas cultivadas con este frutal. (Salazar, 1992).
Es originario de la India, de donde se distribuyó por todo el suroeste de Asia y el archipiélago malayo. A América llegó por dos vías: de Asia fue llevado por los portugueses al sur de África y luego a las costas brasileñas, en el siglo XVI. Los españoles lo introdujeron a México en los siglos XV y XVI, mediante el comercio que se estableció con Filipinas. (Salazar, 1992).
Colombia cuenta con extensas zonas aptas para su cultivo: la costa Atlántica, los Llanos Orientales, todo el valle del Magdalena, Cauca (Patía), Guajira, Tolima y Huila. La gran aceptación de esta fruta tanto en el mercado nacional como en el internacional, hace que el cultivo a escala comercial en Colombia sea una empresa rentable y de gran porvenir para el país (Páez, 2006).
2.1.1. Botánica y Descripción
El mango Mangifera indica L. pertenece a la familia de las anacardiáceas, el género Magnifera tiene 62 especies arbóreas, de las cuales 16 producen fruto comestible. Forman parte del orden de las terebintales. (Salazar, 1992).
15
Es un árbol de gran porte que puede llegar a medir 30 m de altura y de gran longevidad. El tronco es grueso con una corteza parda oscura, áspera, de ramas separadas; la forma del árbol depende de varios factores: propagación, podas, variedad y medio ambiente. El sistema radicular presenta un amplio desarrollo pudiendo penetrar las raíces principales de 6 a 8 metros, mientras que se extienden en un radio de 10 metros, esta distribución le permite resistir épocas de baja humedad. (Salazar, 1992).
Las hojas al principio tienen un color rojizo o púrpura, que del cual cambian a verde claro y luego a verde oscuro. Durante estos estados su actividad fotosintética cambia dado a la acumulación de clorofila en los tejidos. Las ramas de un mismo árbol no crecen al tiempo por lo cual es corriente ver el árbol en diferentes estados de desarrollo y florecido todos los años. (Salazar, 1992).
La flor se presenta en paniculas ramificadas, provenientes de yemas terminales; el número de flores por panicula puede variar de 300 a 2.000, dependiendo de la variedad. Las flores tienen un pedúnculo muy corto: el cáliz se forma de 5 sépalos libres, verdosos, de 2 a 4 mm de largo y de 1 a 2 mm de ancho; los pétalos también libres y caedizos miden de 3 a 6 mm de largo por 1 a 2 mm de ancho y tienen ápice agudo y curvo. Los árboles provenientes de semilla florecen de 6 a 8 años después de sembrados, mientras que los injertados florecen en la mitad del tiempo. La floración en mango tiende a ser alterna o bianual. (Cartagena, 2001).
El fruto es una drupa con endocarpio duro, del cual salen fibras que se extienden a través de la pulpa. Varía considerablemente en tamaño, color, forma, sabor y olor, así como en la cantidad de fibra en la pulpa y en sus características químicas. El mesocarpio es firme, con jugo dulce y de un
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exquisito sabor, su color varía de amarillo cremoso a naranja oscuro. (Cartagena, 2001).
El mango se caracteriza por una elevada caída de flores completas y frutos jóvenes, llegando a ser hasta del 99%. Algunos autores aseguran que solo el 0.1% de las flores bisexuales llegan a producir fruto maduro. La mayor caída de frutos se presenta en las tres primeras semanas. (Cartagena. 2001). El mango común o hilacha tiene un fruto alargado que se caracteriza por tener la pulpa fibrosa. Es conocido también como Hilaza, brechoso, mango de puerco, dependiendo de la zona de producción. (ICONTEC, 2002).
2.1.2. Condiciones Agroecológicas
El mango puede prosperar en zonas subtropicales, donde la temperatura promedio es de 15°C, es muy sensible a bajas temperaturas mostrando una reducción de crecimiento. Los suelos muy alcalinos dañan el cultivo, los límites del pH para el cultivo de mango están entre 5.5 y 7.5. Por tener un sistema radicular profundo, las características del subsuelo y el nivel freático se deben tener en cuenta. (Salazar, 1992).
El mango fructifica en zonas en donde la precitación varía de 240 a 1500 mm. No es tan importante la cantidad de agua ni el volumen final del año, sino su distribución durante el año. La humedad relativa es uno de los factores limitantes para el mango porque favorece el desarrollo de enfermedades; por esta razón se debe desarrollar en climas secos, donde la humedad relativa sea baja. Todos estos aspectos de altura, temperatura, humedad relativa y precipitación indican que el cultivo de mango es exigente en radiación solar para el buen desarrollo de los frutos, de manera que presenten excelente calidad y color. (Cartagena, 2001).
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Los suelos de Tolima y Huila sembrados con mango son arenosos con un pH que oscila entre 6.5 y 7.2 y su fertilidad es medianamente alta. Estas regiones se encuentran ubicadas entre los 380 y 600 m.s.n.m., la temperatura promedio es de 28°C y la humedad relativa promedio es de 68%, el promedio de lluvias está entre 1000 y 1300 mm anuales. (Cartagena, 2001).
2.1.3. Plagas y Enfermedades
En la actualidad el cultivo de mango se ve afectado por innumerables plagas y enfermedades, las plagas mas importantes que afectan el cultivo de mango son: Mosca de la fruta Anastrepha sp., el falso piojo blanco Aulacaspis tubercularis, la escama articulada Selenaspidus articulatus y los comedores de hoja Megalopyge lanata. Entre las enfermedades fungosas se encuentra la antracnosis que es la principal enfermedad que ataca los mangos en Colombia y el agente causal es C. gloeosporioides (ICA, 1996).
2.2. Agente Causal de la Antracnosis
Colletotrichum sp., es considerando el principal agente causal del deterioro en precosecha y poscosecha de muchos frutales tropicales y subtropicales (Bernstein et al., 1995); de acuerdo con numerosas investigaciones, la gran mayoría de estas enfermedades se atribuyen a ataques del hongo C. gloeosporioides (Zulfiqar et al, 1996), sin desconocer que también causa daños en otros tejidos de la planta; sin embargo es durante la poscosecha donde mayores pérdidas económicas se generan en todo el mundo (Ploetz, y Prakash, 1997).
18
2.2.1. Taxonomía
Según Arauz, (2000) la antracnosis en mango es causada por el hongo Colletotrichum
gloeosporioides
(Penz.)
Penz.
&
Glomerella cingulata (Telemorfo) Spauld. & H. Schrenk.
2.2.1.1. Estado Telemorfo
REINO
Fungi
SUBDIVISION
Ascomicotyna
CLASE
Pyrenomicetos
ORDEN
Sphaeriales
GENERO
Glomerella
ESPECIE
cingulata
2.2.1.2. Estado Anamorfo
REINO
Fungi
SUBDIVISION
Deuteromicotina
CLASE
Deuteromycetes
ORDEN
Melanconiales
GENERO
Colletotrichum
ESPECIE
gloeosporioides
19
Sacc
(anaformo),
2.3. Generalidades
Colletotrichum es un habitante muy común en cultivos y con frecuencia no ocasiona síntomas de enfermedad en los órganos de la planta; en los frutos de algunas especies frutales solo se manifiesta cuando el pericarpio es debilitado, o cuando ocurren aumentos en los niveles de etileno como resultado de procesos de maduración de los frutos. (Adoskaveg y and Hartin, 1997).
Este hongo presenta un micelio septado de coloración hialina o castaña clara, los acérvulos separados tienen forma de disco o cojín, de textura cerosa y puede ubicarse en forma subepidermal, epidermal o subcuticular. Típicamente presenta setas o espinas negras en los bordes o entre el conidióforo; los acérvulos están formados por pseudoparénquima con paredes
delgadas
o
gruesas,
conidióforos
simples,
elongados
con
numerosas conidias. Las conidias son hialinas, curvadas y fusiformes, y por lo general un acérvulo setoso. Las conidias son producidas en estructuras especializadas llamadas acérvulos, que se forman en la superficie de los tejidos infectados. (Barnett ,1998 y Holliday, 1995). El género Colletotrichum tiene enorme variación ecológica, morfológica y patológica, las diferentes formas en la naturaleza varían desde saprofito a cepas parasíticas con un estrecho rango de hospederos (Mena, 1999).
Las conidias son producidas en masas mucilaginosas típicamente hundidas, de color rosado y con un contorno irregular en las lesiones necróticas, este tipo de lesiones que con frecuencia se observa sobre las hojas, frutos y ramas son las conocidas como antracnosis; sin embargo en algunos frutos también es frecuente observar lesiones como chancros, cicatrices, verrugas o costras con relieve. (Mena, 1999).
20
Una característica de algunas especies de Colletotrichum, es que pueden causar
infecciones
latentes
o
quiescentes
sobre
los
frutos,
que
posteriormente se desarrollan durante la fase de maduración. Las diferentes especies sobreviven por largos periodos sobre los desechos vegetales o en el suelo; el patógeno mas común en los trópicos es Colletorichum gloeosporioides. (Holliday, 1995).
Las infecciones quiescentes en el contexto de enfermedades de poscosecha involucra la inhibición del desarrollo del patógeno a través de condiciones fisiológicas impuestas por el hospedero hasta que se lleva a cabo el estado de maduración. Una vez el hongo penetra la capa exterior del fruto, este permanece allí en estado de quiescencia o dormancia hasta que ocurren cambios en la superficie del fruto los cuales proporcionan las condiciones adecuadas para permitir una infección (Contreras, 2006).
2.4. Desarrollo de la enfermedad
El inóculo del microorganismo que ha sobrevivido en hojas, frutos y ramas afectadas causa las infecciones de los frutos por la dispersión de las conidias transportadas en el agua. (Adoskaveg y Hartin, 1997). Una vez dispersas las conidias se adhieren a la superficie del hospedero y germinan en un periodo de 12 a 24 horas y luego produce tubo germinal que penetra la cutícula directamente. Las fuentes de inóculo son las conidias producidas en acérvulos o las ascosporas producidas y liberadas en el peritecio. (Figura 1.). La hifa infectiva penetra directamente la cutícula colonizando la pared celular de las células de hospedero (Kuo, 1999). Existen varias formas de penetración, una de ellas es a través de aberturas naturales como estomas, lenticelas y otras por penetración directa o a través de pequeñas heridas.
21
Figura 1. Ciclo de vida de la enfermedad de Antracnosis causada por Glomerella cingulata y Colletotrichum gloeosporioides. Tomado de Agrios 2002.
La infección se puede desarrollar casi en cualquier tejido de la planta. Una vez el microorganismo penetra la cutícula, se pueden presentar dos estrategias de infección: la primera es conocida hemibiotrofía intracelular y la segunda necrotrofía subcuticular e intramural. (Agrios, 2002).
Muchas especies de Colletotrichum presentan procesos infectivos en dos fases: la fase asintomática inicial, donde el patógeno se establece en los tejidos sin matar las células y son consideradas especies biotróficas (hemibiotrofia
intracelular)
y
la
fase
22
destructiva
visible
(necrotrofía
subcuticular e intramural), donde el patógeno crece bajo la cutícula y disuelve extensamente la matriz péptica de las células epidermales (Bailey, 1992). El desarrollo intramular se asocia a la hinchazón y disolución de las paredes celulares (O´Connell et al., 2000).
En condiciones favorables, el hongo puede crecer rápidamente en la planta y causar diversos síntomas muy rápidamente, pero en otras circunstancias el hongo puede permanecer quiescente dentro de los tejidos por un largo periodo, que en algunos casos solo se evidencia después de la cosecha (Figura 2.). Pero también durante periodos de condiciones ambientales extremas, puede permanecer en latencia por algún tiempo en el suelo o permanecer por largos periodos sobre tejido vegetal muerto (CABI-EPPO, 1996).
2.4.1. Infecciones quiescentes
Una de las características destacadas de Colletotrichum sp., es su capacidad de sobrevivir en estado de dormancia o quiescencia cuando las condiciones ambientales o fisiológicas del hospedero le impiden desarrollarse (Figura 2.). Los cambios bioquímicos que ocurren durante la maduración el fruto, se creen que son los que permiten que la infección continué su curso. En aguacate, el cambio en los compuestos antifúngicos llamados dienes, son importantes en la regulación de la quiescencia de la antracnosis. (Prusky, 1996).
23
Figura 2. Proceso de las infecciones quiescentes en Mango. Tomado de (Arauz, 2000).
24
Según Yerhoeff (1974), una relación parasítica latente o quiescente, se define como una condición en la cual el patógeno reduce su actividad metabólica, deteniendo el proceso de infección por un periodo considerable durante la vida del hospedero, que se reactiva cuando las circunstancias fisiológicas o ambientales específicas lo permitan. De Lapeyre (2000), define el estado quiescente del hongo como la circunstancia en la cual una espora que entra en contacto con la superficie del fruto, germina y forma un apresorio que se melaniza y permanece inactivo hasta la maduración del fruto.
Según Swimburne (1983), un organismo se puede tornar quiescente en cualquiera de las siguientes etapas de su vida: en germinación, elongación del tubo germinativo, formación del apresorio y penetración. Un punto de infección se desarrolla cuando la hifa penetra la cutícula y la pared celular del hospedero, con la ayuda de enzimas cutinasas y celulolíticas. La fase latente puede ser corta como ocurre en las enfermedades de floración, y de dos o tres semanas a varios meses, como ocurre en frutos. (Bailey, 1992). En la permanencia de la latencia del patógeno dentro del hospedero hay una dinámica de equilibrio entre el hospedero, el patógeno y el ambiente; de tal manera que los cambios fenológicos y fisiológicos en el hospedero, en el ambiente o en ambos, conllevan a la pérdida del equilibrio establecido y permiten que el patógeno continué su ataque. (Jarvis, 1994).
Flaishman y Kolattukudy (1994) indican que la participación del etileno en la terminación de la quiescencia, se debe a la habilidad de Colletotrichum sp. para desarrollar un mecanismo donde usa la hormona de la maduración del hospedero como señal para reactivar el proceso de infección. Este mecanismo evita el contacto del patógeno con tejidos del hospedero que tienen altos niveles de compuestos antifúngicos (Figura 3.)
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INFECCIONES QUIESCENTES
PATÓGENO
INTERACCIÓN
HOSPEDERO
RESISTENCIA
Desarrollo del fruto
Infección Invasión Quiescencia Reducción en Compuestos Antifungoso
Estimulo Reactivación del Patógeno
Etileno
Fruto en maduración Periodo Climatérico
Factores Nutricionales
Fruto maduro Invasión
ENFERMEDAD
Figura 3. Eventos entre el patógeno y el hospedero dentro de la infección quiescente en frutos por C. gloeosporioides. Adaptación de Arauz, 2000.
Existen varias condiciones que promueven la quiescencia como condiciones físicas adversas como el inapropiado almacenamiento de frutos, daños físicos, mecánicos, plagas, estrés y cambios climáticos bruscos en campo; y condiciones fisiológicas como deficiencia nutricional y cambios fisiológicos en la maduración del fruto. (Swinburne, 1983). Las infecciones latentes han sido reportadas en frutas como cítricos (Zulfigar et al, 1996), en tomate de árbol (Rondón, 2003) y en mora de castilla (Forero de la Rotta, 2001). C. gloeosporioides, ha sido asociado con infecciones quiescentes y de poscosecha sobre frutos como mango, aguacate, papaya, maracuyá, guayaba, cítricos, uva, granadilla, manzana y mora. (ICA, 1996).
26
2.5. Síntomas
Colletotrichum sp. causa numerosas enfermedades en un amplio rango de plantas a nivel mundial, tanto en precosecha como en poscosecha. En poscosecha predomina en los trópicos, donde es un factor limitante en la calidad de los frutos ocasionando grandes pérdidas en la comercialización interna y en los mercados internacionales. El efecto del hongo en el rendimiento radica en el hecho que afecta frutos en todos los estados de desarrollo, los cuales se desechan en el momento de comercialización (Cartagena & Vega, 2001).
En plantas de mango (M. indica), se presentan primero en las panículas florales, con pequeñas manchas de color negras o cafés, que se van agrandando y pueden causar ennegrecimiento total de la inflorescencia y marchitamiento antes que el fruto inicie su formación. Los síntomas en la superficie del fruto son manchas hundidas de color negro (Figura 4.), presentando un alto grado de severidad después de periodos de clima húmedo (Allende-Molar y Cols, 2003).
27
B
A
Figura 4. Frutos de Mango. A: Fruto sano, B: Fruto con lesiones de antracnosis. (Foto L.Parra).
En los frutos jóvenes se producen pequeñas lesiones hundidas, mientras en los grandes (4-5 cm), por lo general no hay desarrollo de la enfermedad, pero el hongo permanece en estado de quiescencia hasta que los frutos maduran y aparecen las lesiones oscuras, necróticas, angulares o de forma irregular. En todos los casos el desarrollo de la enfermedad va acompañado de masas de conidias de color salmón
como consecuencia de la maduración del
acérvulo.
2.6. Condiciones epidemiológicas
Aunque se han realizado varias investigaciones acerca de la epidemiología de esta enfermedad en mango, dichos estudios se han concentrado en las relaciones entre variables del clima y la cantidad de la enfermedad en el cultivo. La infección ocurre cuando el fruto se desarrolla o durante los periodos de cosecha, pero por lo general permanece en estado de quiescencia hasta la maduración del fruto. En el cultivo, el desarrollo del hongo se ve favorecido por condiciones ambientales como humedad relativa
28
del 96% con temperaturas entre 10-30°C, ocasionando lesiones sobre hojas, ramas e inflorescencia momificadas. (Bailey, 1992).
Existe una correlación importante entre la precipitación en todo el año y el desarrollo de la enfermedad, demostrando que el hongo es dependiente de la precipitación y la humedad relativa para su germinación, desarrollo y dispersión. (Álvarez, 1996). Para el desarrollo de la enfermedad se requiere agua durante todas las etapas, de esta manera la esporulación no solo necesita altos niveles de humedad (95%), sino que la liberación y dispersión de las esporas es dependiente del agua libre y se requiere de aproximadamente cuatro horas mas de humedad a temperaturas óptimas de 20-25°C; la ubicuidad de la fuente de inóculo tiende a sobrepasar cualquier restricción en el desarrollo de la enfermedad que pueda imponer el agua. (Álvarez, 1996).
La variabilidad en la latencia del patógeno representa una adaptación muy importante a las condiciones fisiológicas de los tejidos y los patrones climáticos que ocurren durante el ciclo de cultivos perennes. Debido a esta variabilidad el impedimento para tomar medidas de control exitosas se dificulta. (Waller, 1992).
Los estudios realizados en tomate de árbol por Rondón (1998), determinaron que las hojas, los pedúnculos, las ramas jóvenes, los racimos, botones, flores, sépalos de la flor y los frutos en cualquier estado, son tejidos potencialmente susceptibles al hongo.
29
2.7. Métodos de Diagnóstico
Las herramientas moleculares han ganado gran aceptación en los últimos años, siendo empleados para diferenciar entre poblaciones de Colletotrichum en diferentes hospederos y también para diferencias entre especies y subespecies que no se permite con las técnicas tradicionales. Las técnicas moleculares más utilizadas son: análisis de las regiones codificadoras del DNA ribosomal (ITS), realizando amplificaciones vía PCR (Polymerase Chain Reaction) con cebadores o primers específicos. Análisis de polimorfismo en DNA nuclear con
marcadores moleculares RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNAs) y AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) al interior de la especie, para determinar la posible existencia y los niveles aparentes de variabilidad genética en la población, además del análisis de enriquecimiento de A+T-rich DNA asociado con (mt) DNA (Freeman et al., 1998).
Los métodos tradicionales son empleados aunque en algunos casos no permiten diferenciar entre especies y subespecies de Colletotrichum. Para las especies C. acutatum y C. gloeosporioides, algunas características como la velocidad de crecimiento y color predominante de la colonia en medios selectivos, la susceptibilidad o la tolerancia que presenta el patógeno en el medio suplementado con el fungicida benomyl y la prueba cualitativa de la proteasa (Martín & García-Figueres, 1999), por la producción de enzimas extracelulares que hidrolizan la caseina de la leche generando halos transparentes de 3 a 4 mm sobre el medio de cultivo, permitiendo diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides (Freeman et al., 1998; Peres, et al; 2002 y Abang et al., 2003).
30
2.9. Control
El control químico es el más común debido a la importancia económica del cultivo. Se disponen de muchos químicos, entre los más utilizados se encuentran compuestos como: dithiocarbamato, benzamidazoles y triazoles; y otros fungicidas como chlorothalonil, imazalil y prochloraz. Los fungicidas sistémicos son útiles y ampliamente utilizados, pero es mejor alternarlos con aplicaciones de productos de acción protectante (Páez, 2006).
Es necesario planificar las aspersiones con los fungicidas que por lo general inician antes de la floración y continua hasta que el fruto este en procesos de maduración. Las aplicaciones se hacen con intervalos de 7, 14, 21 o 30 días dependiendo de la frecuencia de la lluvia. Los productos comerciales mas empleados son benlate 07 (1g/L), dithane M45 y oxicloruro de cobre (2-3g/L), mezclados con un adherente (sulfatante HA o superstiker), para asegurar la cobertura apropiada de la superficie cerosa del follaje y fruto. (Sena, 2006).
En los controles culturales se emplean podas que ayudan con el rápido secado de la copa del árbol. La reducción de daños mecánicos o fisiológicos por el ataque de otras plagas, disminuyen las infecciones secundarias por el hongo. (Páez, 2006).
31
3.
FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
El área dedicada al cultivo del mango, es mayor año tras año a nivel mundial y nacional es así como en el año 2005, según cifras del Ministerio de Agricultura, existen aproximadamente 13.900 has de mango cultivado en 14 departamentos, las cuales producían alrededor de 170.000 toneladas anuales de diferentes variedades. Los departamentos en los que se concentra la mayor producción de mango son Tolima y Cundinamarca, seguidos de Antioquia, Bolívar y Magdalena. En el periodo de 1992 al 2003 en conjunto, estos 4 departamentos, han cultivado entre el 70 y el 80% del área cultivada a nivel nacional; mientras que la producción en el mismo periodo fue entre el 62 y el 83%. (Ministerio de Agricultura 2005).
El cultivo de mango presenta múltiples problemas fitosanitarios, la antracnosis es una de las enfermedades más importantes y la mas frecuente, sobre todo en regiones con temperaturas y humedades relativas elevadas. (Fitzell y Peak, 1984).
En Colombia la antracnosis se encuentra diseminada en todas las zonas productoras de mango, afectando la mayoría de variedades de mango cultivadas. En la actualidad las variedades criollas, azúcar e hilacha, son las que ofrecen grandes ventajas en comparación con variedades mejoradas y que si son bien utilizadas por los cultivadores, pueden liderar el mercado, la comercialización y el precio del mango a nivel nacional; ya que poseen resistencia a plagas y enfermedades, no exigen un manejo agronómico estricto y presentan características óptimas para la obtención de pulpa (Cartagena & Vega, 2001).
El estudio de infecciones quiescentes causadas por Colletotrichum sp. es de gran importancia, ya que conocer su dinámica e incidencia de acuerdo con
32
los diferentes estados de desarrollo del fruto, permite desarrollar las estrategias de control. A pesar de que estas infecciones se inician en el campo y solo se desarrollan cuando el fruto madura, ocasionan grandes pérdidas en el momento de su comercialización.
33
4.
OBJETIVOS
4.1.
OBJETIVO GENERAL
Determinar la relación entre el estado de desarrollo de frutos de mango variedad hilacha y la incidencia de infecciones quiescentes de Colletotrichum gloeosporioides.
4.1
OBJETIVOS ESPECIFICOS
4.2.1. Determinar la incidencia de infecciones quiescentes de Colletotrichum gloeosporioides en cada uno de los estados fenológicos del fruto.
4.2.2. Confirmar mediante pruebas biológicas la patogenicidad del agente causal de las infecciones quiescentes encontradas en los frutos recolectados.
4.2.3. Determinar las variaciones del pH de los frutos enfermos durante los diferentes estados de maduración.
34
5. MATERIALES Y METODOS
5.1. Localización de la investigación
El estudio se adelantó entre los meses de noviembre 2007 y febrero 2008, analizando la presencia y cantidad de infecciones quiescentes en frutos de mango variedad hilacha en los estados fenológicos, muestreados cada 25 días en los lotes del Centro de Investigación Nataima de la Corporación Colombiana de Investigación, CORPOICA que se encuentra ubicado en el departamento del Tolima, municipio de Espinal, donde la temperatura promedio anual está en 28 ºC, con una precipitación de 1300 mm al año, una humedad relativa del 70%, 430 m.s.n.m de altitud y presenta una ubicación de 4° 12´ de latitud norte y 74° 56´ longitud oeste. (IDEAM, 2006).
La investigación se desarrolló en las instalaciones de Fitopatología del Programa Manejo Integrado de Plagas de CORPOICA, Tibaitatá, ubicado en el municipio de Mosquera (Cundinamarca), km 14 de Bogotá, D. C. (N 4° 42', W 74° 12'; 2543 msnm). Los ensayos realizados permitieron detectar y cuantificar las infecciones quiescentes y mediante pruebas biológicas se determinó el agente causal de la antracnosis. Después de haber establecido el comportamiento de las infecciones quiescentes en los fruto de mango, se desarrollaron pruebas para determinar el pH en frutos y así establecer una posible relación entre las infecciones quiescentes y los valores de pH.
35
5.2. Muestreos de frutos
Los frutos se seleccionaron en un lote de árboles de mango variedad hilacha, de 15 años de edad, al los que generalmente se les realiza podas de formación y un control periódico de malezas.
El número de frutos que fueron muestreados corresponden al tamaño mínimo de muestra que permite un análisis estadístico adecuado con un error experimental de 0.05. Se realizaron 4 muestreos entre los meses de Noviembre 2007 y Febrero 2008, con intervalos de 25 días para facilitar la selección de los frutos en el campo, y de acuerdo con la metodología sugerida por Medilicott et al (1986), con algunas modificaciones, en cada muestreo se colectaron al azar 112 frutos (aparentemente sanos) en diferentes estados de desarrollo, (Tabla 1.); para el muestreo se tomaron frutos de los estados E1, E2, E3 y E4. (Figura 5.).
Los frutos colectados fueron empacados en papel dentro de bolsas plásticas una vez removidos del árbol y se colocaron en una nevera de icopor, para su transporte al Laboratorio de Fitopatología del Centro de Investigación de Tibaitatá.
36
Tabla 1. Etapas fenológicas de los frutos de Mango, de acuerdo con la edad, dimensiones, peso y otras características. Modificación de Medilicott, Mohinder, y Reynolds, 1986.
ETAPAS
DIAS
LARGO (cm.)
ANCHO (cm.)
PESO (g)
I
0-10
1.9
1.5
1-3
II
10-21
3.1
2.3
3-10
III
21-35
4.1
3.1
10-20
IV
35-49
5.6
4.1
30-40
V
49-60
6.4
4.8
88
VI
60-72
8.9
6
92
VII
7290
9.5
6.5
100
VIII
90120
10
6.5
100
E1
E2
CARACTERISTICAS
Altas tasas de respiración y crecimiento, máximo coontenido de agua y rápido aumento de nitrógeno y ácidos, baja relación carbohidratos/nitrógeno.
E1 Fruto pequeño verde
Desarrollo de aromas y sabores, tasas medias de respiración, aumento de la presión osmótica, disminución del contenido de humedad y caída rápida de glucosa y aumento de sacarosa.
E2 Fruto verde oscuro
Disminución del contenido de ácidos, mínima respiración y disminuye contenido de nitrógeno.
E3 Fruto verde claro
Aumento de tasa de respiración, bajo contenido de humedad y disminución del crecimiento del fruto
E4 Amarillamiento (Maduro)
E3
E4
Figura 5. Estados Fenológicos de Mango. E1, E2, E3 y E4. (Foto L. Parra).
37
ESTADO FENOLOGICO
5.3 Detección de infecciones quiescentes
Los frutos recolectados fueron lavados en tres oportunidades con agua corriente, luego se desinfestaron por un minuto con hipoclorito de sodio al 2.6% y se lavaron dos veces con agua destilada; por último se trataron con alcohol al 70% y se lavaron nuevamente con agua destilada. Una vez secos se llevaron a incubar en cámaras húmedas a temperatura ambiente. (Cedeño, et al., 1993; Dhingra, et al., 1995).
Para el montaje de las cámaras se utilizaron contenedores plásticos transparentes de 30 cm de ancho, 45 cm de largo y 17 cm de alto, con rejillas plásticas previamente lavadas con detergente y agua, desinfestadas con hipoclorito de sodio al 2.6% y asperjadas con alcohol antiséptico. (Anexo 3). La presencia de las infecciones quiescentes se evaluó diariamente, observando el tiempo de aparición de los primeros síntomas de la enfermedad (Reyes, A,. 2007).
El diseño experimental que se utilizó en el ensayo fue un diseño de bloques completos al azar BCA, con cuatro repeticiones y cuatro tratamientos correspondientes a los estados fenológico. La unidad experimental estuvo representada por una cámara húmeda con 7 frutos. Por cada tratamiento se colectaron 28 frutos, para un total de 112 frutos.
5.4. Aislamientos de Colletotrichum sp.
A partir de los frutos que presentaron las lesiones características de la enfermedad, con la ayuda de un bisturí estéril se tomaron fragmentos del tejido enfermo de aproximadamente 5X5 mm, tratando de involucrar tejido infectado (20%) y sano (80%); que posteriormente se sembraron en cajas de
38
Petri con (PDA) papa-dextrosa-agar (Anexo 2); se realizaron 2 repeticiones por fruto, colocando cuatro fragmentos de tejido en la placa de agar. (Cedeño, et al., 1993; Dhingra, et al., 1995).
Las cajas sembradas se incubaron a temperatura ambiente (± 20°C), durante 6 días, luego cada uno de los aislamientos obtenidos se le asignó un número consecutivo y con el fin de purificar el hongo, se resembraron por separado en
placas
de
PDA;
simultáneamente
se
realizaron
observaciones
microscópicas coloreadas con azul de lactofenol para verificar las características del hongo (Contreras, 2006). La taxonomía del hongo se realizó con base a la clave para la identificación de hongos imperfectos de Barnett (2003) y las características registradas por Bailey (1992).
5.4.1 Purificación de Aislamientos
Luego de confirmar que los aislamientos obtenidos pertenecían al hongo en estudio, se realizaron cultivos monospóricos de acuerdo a una modificación de la metodología propuesta por Wang-Ching y Wen-Huising (1997), para obtener colonias puras (Anexo 4). Para este fin se llenaron con 1 ml de agua destilada estéril 160 tubos de vidrio de 6x1.5 cm previamente lavados y esterilizados. Con un asa estéril se tomó una pequeña porción de cada uno de los aislamientos y se incorporó en los tubos, en donde con ayuda del vortex se homogenizó la solución. Para calcular la concentración de 1 esporas/ml, se tomaron 10 µl de la solución y se sirvió en una cámara de Nuebauer, en donde se contó el número de esporas localizadas en los 64 cuadros y posteriormente se estableció el volumen inicial para obtener una concentración final de 1 espora/µl (Manual de procedimientos CORPOICA, 2001).
39
Se tomaron cajas con agar agua (Anexo 1) y en la base con un marcador de vidrio se dividieron en 18 círculos aproximadamente de 7mm de diámetro cada uno, para que una vez obtenidas las soluciones para cada aislamiento, sembrar 1.7 µl de la solución en cada uno de los pozos. Las placas con agar agua fueron incubadas por 24 horas a 27°C en penumbra. Transcurridas las 24 horas se observó bajo el microscopio (40X) la superficie de la placa de agar agua buscando una única espora germinada, la cual se sembró en PDA y se incubó a 27°C en penumbra, hasta obtener la colonia pura (Manual de procedimientos CORPOICA, 2001).
5.5. Pruebas biológicas
Las pruebas biológicas se realizaron con el objeto de establecer la etiología del agente causante de las infecciones quiescentes observadas en los frutos de Mango y su patogenicidad sobre frutos sanos.
5.5.1. Medio selectivo para Colletotrichum sp.
El medio selectivo para Colletotrichum sp., se compone de Hidróxido de Cobre (CuOH2) como ingrediente activo (42mg /L Cu) y 300 mg/L de estreptomicina (Anexo 7). El CuOH2 es un fungistático que actúa desnaturalizando las proteínas, a través de la reactivación de los grupos sulfhídricos (Ware y Whitaker, 2000). Este medio permite una aproximación para clasificar los aislamientos obtenidos y visualizar algunas características que pueden diferenciar estas dos especies de Colletotrichum sp., dentro de las mas evidentes se tiene la coloración predominante de la colonia y la tasa de crecimiento (Abang, et al., 2003; Alvis, 2007).
40
Algunos investigadores plantean que
la velocidad de crecimiento de la
colonia que se evalúa en este medio, puede ser rápida (fast) o lenta (slow) y los colores predominantes de las cepas pueden ser naranja (orange), verde (olive), gris (gray) y
salmón (salmón). A partir de estos criterios de
evaluación se pueden obtener las clasificaciones: FGG (Fast growing gray), SGG (Slow growing gray), FGS (Fast growing salmon), SGO (Slow growing orange) y FGO (Fast growing olive) (Abang, et al; 2003).
Estas características se utilizan para diferenciar al patógeno, entre las especies C. acutatum y C. gloeosporioides. Los criterios que permiten clasificar a las cepas como C. gloeosporioides son: SGG, FGG, FGS y FGO y la clasificación SGO orienta hacia la especie C. acutatum (Tabla 2). Tabla 2. Clasificación de las especies según los medios de evaluación biológica. (Abang et al., 2003).
Medio Selectivo
Medio Benomyl
Clasificación
FGG
Susceptible
C. gloeosporioides
FGO
Susceptible
C. gloeosporioides
SGO
Tolerante
C. acutatum
SGG
Susceptible
C. gloeosporioides
FGS
Susceptible
C. gloeosporioides
5.5.2. Pruebas de Patogenicidad
Este ensayo tuvo como objetivo conocer la capacidad patogénica que tienen los diferentes aislamientos, para generar síntomas de la enfermedad sobre frutos sanos. Se emplearon dos frutos por aislamiento y dos se dejaron como
41
controles; en todos los casos se realizó el proceso de desinfestación de frutos descrito anteriormente.
Posteriormente, sobre la parte media y superior de cada uno de los frutos se les coloco un disco de agar con el aislamiento (Figura 6.), ya que mediante las observaciones preliminares es la zona donde con mayor presencia se presentan las infecciones quiescentes. Sobre los frutos usados como controles se colocaron discos de agar estéril, luego de la inoculación se colocaron en cámaras húmedas estas se mantuvieron a una temperatura de ± 18 C° por un periodo de 10 días y diariamente se revisaron para observar el momento en que se evidenciaran los primeros síntomas de la enfermedad. A partir de las primeras lesiones se realizaron los aislamientos del microorganismo para comprobar los postulados de Koch. (Cedeño et al.. 1993).
A
B
Figura 6. Frutos de Mango sanos. A. Fruto sin bloques de agar y B, Fruto con bloques de agar con micelio del microorganismo. (Foto, L. Parra).
42
5.5.3. Prueba de susceptibilidad al Benomyl
De acuerdo a las metodología que usaron (Péres, et al., 2005) para identificar y conocer la susceptibilidad o la tolerancia que presentan las especies de Colletotrichum sp. a este producto. Se utilizó la concentración del fungicida Benomyl (PDA + Benomyl 2µg/ml), ya que las mínimas concentraciones del fungicida
fueron efectivas. Con base en la
susceptibilidad que presenta C. gloeosporiodes y
la tolerancia de
C.
acutatum. (Anexo 6) se diferenciaron las especies del patógeno. Para cada aislamiento se realizaron dos repeticiones, una vez inoculadas las cajas se incubaron por 72 horas en penumbra a una temperatura de 27°C.
En este medio se evaluó el diámetro de crecimiento de cada colonia tomando como parámetro de comparación el diámetro de crecimiento que presentó el hongo en el medio PDA. Esto se hace con el fin de determinar el porcentaje de inhibición del microorganismo, al crecer en contacto con este fungicida, respecto al control en PDA (Alvis, 2007).
5.5.4 Prueba de la Proteasa
Esta prueba ha sido utilizada para diferenciar las especies de de C. acutatum y C. gloeosporioides. El medio hidrólisis de la caseína (MHC) (Anexo 5), permite establecer dos tipos de reacción una positiva (+) y otra negativa (-). El principio de esta prueba se basa en la producción extracelular de la enzima proteasa (prueba +), característica de la especie C. acutatum, que hidroliza la caseína de la leche, en aminoácidos y péptidos. Esta reacción ocasiona que en el agar, normalmente opaco por la leche se observen halos transparentes alrededor del crecimiento de la colonia del microorganismo (Paterson y Bridge, 1994).
43
Una vez preparado el medio de la hidrólisis de la caseína (MHC) (Anexo 5) y servido en las cajas de Petri estériles, se tomaron bloques de PDA con el crecimiento micelial de cada aislamiento y se colocaron sobre la superficie del medio MHC. Se realizaron 4 repeticiones por cada aislamiento (Martín & García-Figueres, 1999); las lecturas se realizaron 24 horas después de iniciada la prueba. Para asegurar que el medio funcionaba se tomo como control positivo una cepa de C. acutatum (c-852) y un control negativo con una cepa de C. gloeosporioides (c-1042) caracterizadas molecularmente, que se encuentran en la Colección Nacional de Colletotrichum del Laboratorio de Fitopatología de CORPOICA
5.6. Determinación del pH en frutos sanos y enfermos de Mango.
De acuerdo con Prusky, Keen (1993), la transición de una etapa biotrófica a una necrotrófica en este grupo de microorganismos, parece estar relacionada con factores que son modulados intracelularmente y son afectados por los contenidos de nutrientes y el pH presente en el sustrato; por esta razón es necesario conocer las variaciones de los niveles de pH en los diferentes estados fenológicos de los frutos, para de esta manera comprender la dinámica de las infecciones quiescentes en la medida que se va desarrollando el fruto.
En este trabajo, se estudiaron las variaciones del pH, con el fin de comprobar que este es un factor estrechamente relacionado con el establecimiento de una relación parasítica patógeno-hospedero. (Prusky, 2001).
44
Para esta prueba se colectaron para cada estado fenológico, 4 frutos de mango sanos y 4 enfermos, se lavaron tres veces con agua destilada (pH 7), durante 10 minutos, luego se colocaron sobre papel periódico y se dejaron secar a temperatura ambiente por un periodo de 30 minutos, para garantizar un completo secado.
Luego con ayuda de un bisturí, se removieron 0.5 mm. del exocarpio de los frutos, en los enfermos por antracnosis se separó el exocarpio y mesocarpio enfermo del sano; para evitar alteraciones de las lecturas, se dejo una distancia de 3 cm. entre el tejido sano del afectado. El exocarpio se maceró en un mortero y una vez se obtuvo una pasta pura se realizó la lectura directa del pH con ayuda de un potenciómetro de (Beckam).
Para determinar el pH del mesocarpio tanto de área enferma como sana, se realizó un orificio de 2 cm de diámetro, en el cual se maceró el tejido circunvecino con ayuda de un cuchillo estéril y una vez macerado el tejido se introdujo el electrodo para la lectura del pH. En este caso los frutos evaluados presentaron lesiones aceitosas de color negro, con bordes definidos y centro deprimido.
Para establecer los valores de pH en frutos sanos de cada estado fenológico, se realizaron cuatro lecturas del exocarpio y cuatro lecturas del mesocarpio; en los frutos enfermos se hicieron cuatro lecturas tanto del exocarpio sano y enfermo, como del mesocarpio sano y enfermo. Para en análisis estadístico se empleo un diseño completamente al azar, evaluando un factorial de 4x3x2.
45
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Aislamientos de Colletotrichum sp.
En este estudio se obtuvieron varios aislamientos del hongo y se agruparon según su color y crecimiento, obteniendo un total de 20 aislamientos (Anexo 10), que fueron clasificados dentro del género Colletotrichum de acuerdo a las observaciones microscópicas realizadas, donde se identificaron las estructuras del hongo (Figura 7). Los aislamientos se obtuvieron de diferentes partes del fruto, confirmando lo encontrado en otros cultivos como aguacate, guanábana, tomate de árbol, en donde el hongo fue aislado de diferentes tejidos de la planta (Agostin, et al., 1992). Todos los aislamientos tuvieron un buen crecimiento en PDA (Figura 8), lo cual concuerda con lo propuesto por Agostin (1992), quien manifiesta que las especies de Colletotrichum sp. no requieren de medios selectivos para su crecimiento.
B
A
Figura 7. Características microscópicas de C. gloeosporioides. A: Micelio y conidias del hongo formadas en PDA, B: Conidias típicas del microorganismo. (Foto L. Parra).
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El crecimiento de las colonias se presentó en forma radial y de aspecto algodonoso, el color predominante fue el gris y el oliva lo que indica según Contreras (2006) que pertenecen al género Colletotrichum sp. y a la especie C. gloeosporioides (Figura 8); sin embargo se han demostrado incoherencias entre las descripciones morfológicas y los estudios moleculares para la identificación de especies de Colletotrichum sp. (Afanador, et al., 2003).
A
C
B
D
Figura 8. Aislamientos de Colletotrichum sp. En PDA. A y B Colonias obtenidas directamente a partir de frutos enfermos, C y D colonias obtenidas de cultivos monospóricos. (Foto L. Parra).
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6.2 Detección de Infecciones Latentes en frutos asintomáticos de Mango
Transcurrido el periodo de incubación para cada estado fenológico, se observó sobre la superficie de los frutos, la presencia de lesiones de color negro y hundidas, características de antracnosis tal como lo afirma (AllendeMolar y Cols, 2003) (Tabla 3.).
Tabla 3. Días Transcurridos hasta que aparecieron las lesiones en los Diferentes Estados Fenológicos de Frutos de Mango.
Estado Fenológico
Tamaño de Muestra
Periodo de Incubación (Días)
E1
28
10
E2
28
10
E3
28
15
E4
28
15
Se observaron infecciones quiescentes en todos los estados fenológicos del fruto de mango; en los estado fenológico E1 y E2, el porcentaje de incidencia fue superior al 75%, es decir que de un total de 112 frutos incubados en todo el estudio, 84 frutos mostraron lesiones de infecciones quiescentes, mientras que para los estados fenológicos E3 y E4 la incidencia de las infecciones estuvo por encima del 60%. (Figura 9). Estos resultados ratifican la presencia de infecciones quiescentes de C. gloeosporioides en frutos aparentemente sanos, lo cual coincide con los resultados obtenidos por Arauz, (2000).
48
Porcentaje Incidencia
100 81,13
79,05
80
64,75
60,68
60 40 20 0 E1
E2
E3
E4
Estados Fenológicos
Figura 9. Porcentaje de infección quiescente de Colletotrichum gloeosporioides. en los diferentes estados fenológicos de frutos de mango.
Las diferencias en la incidencia de infecciones quiescentes de C. gloeosporioides
entre
los
cuatro
estados
fenológicos
no
fueron
estadísticamente significativas (P>0.05); sin embargo biológicamente se evidenció mayor presencia de estas infecciones en los estados iniciales de desarrollo del fruto. Se realizaron pruebas de validación, normalidad y comparación de promedios para corroborar que no se presentaron errores y las varianzas fueran homogéneas. (Anexo 8 y 9).
El estado de quiescencia en varias frutas se debe a que las conidias de Colletotrichum sp., germinan, forman el apresorio y penetran la cutícula; posteriormente la hifa infectiva que permanece subcuticularmente en estado de letargo metabólico, no continúa el proceso de infección hasta que las condiciones ambientales y nutricionales sean las adecuadas, un ejemplo de esto es la maduración del fruto (Soriano, et al,. 2001).
49
Se podría sugerir que la fenología del fruto tiene un efecto en la incidencia de las infecciones quiescentes, siendo los frutos maduros menos susceptibles a adquirir estas infecciones. Cuatro mecanismos han sido postulados para explicar la presencia de Colletotrichum sp. como infección quiescente en frutos inmaduros: a) Requerimientos nutricionales del patógeno, b) Compuestos antifungales preformados presentes en frutos verdes que disminuyen a medida que el fruto madura por un aumento en la actividad de la enzima lipoxigenasa, cuya actividad es regulada por la presencia de flavan-3-ol, epicatequin (compuesto fenológico). Estos compuestos son el 1acetoxi-2-hidroxi-4-oxo-henicosa-12, 15-dieno y el 1-acetoxi-2,4-dihidroxi-nheptadeca-16-eno., c) Presencia de fitoalexinas y compuestos preformados y d) Factores de patogenicidad que pueden ser activados solamente en frutos maduros. (Prusky, et al,. 1996).
Para que el hongo pueda penetrar la cutícula del fruto requiere de un complejo enzimático que le permita macerar la cutícula y penetrar en exocarpio. Según Wattad y Prusky (1994), la secreción de enzimas pectolíticas responsables de la maceración de la pared celular durante el ataque de C. gloeosporioides, es un factor limitante durante la patogénesis y las condiciones que afectan la secreción de estas enzimas, pueden evitar la activación del Colletotrichum sp. en la colonización de frutos inmaduros.
Otro factor que determina la relación parasítica hospedero-patogeno es el pH del hospedero, que puede ser concluyente en la dinámica de las infecciones quiescentes en los diferentes estados fenológicos de los frutos de mango. Yakoby et al,. (2000), sugieren que la secreción de pectinasas están influenciadas por el pH, indicando que la susceptibilidad de los frutos está regulada por decrecimientos de compuestos antifungales e incrementos en el pH del pericarpio que modula la secreción de pectinasas y otras enzimas. La
50
variación en los niveles de pH explica el comportamiento de las infecciones quiescentes en frutos de mango. (Reyes, 2007).
Las pectinasas de C. gloeosporioides son secretadas con valores de pH mayores a 5.8, aunque también puede ser producida con valores de 5.1 (Prusky,
et al,. 2001), lo que indica que cuando los niveles de pH del
hospedero son adecuados se puede iniciar el proceso de infección. A medida que maduran los frutos de mango se van reduciendo los niveles de pH, lo que sugiere que los inicios del proceso de infección ocurren en los primeros estados de desarrollo del fruto.
La temperatura promedio semanal durante los muestreos fluctuó entre 27°C y 28°C, las cuales fueron favorables para el establecimiento de las infecciones quiescentes, según Arauz, (2000), temperaturas entre 20°C y 30°C, han sido reportadas como óptimas para la infección de C. gloeosporioides. El hongo requiere una humedad relativa superior a 95% para que las conidias germinen y se presente la formación del apresorio (Arauz, 2000). En este estudio la humedad relativa durante los muestreos, estuvo entre 67% y 79%.
C
6.3 Medio Selectivo para Colletotrichum sp.
D C
En esta prueba se obtuvieron colonias con crecimiento rápido y coloración gris y verde oliva (Anexo 13). Este medio permite clasificar los diferentes aislamientos, entre estas dos especies de Colletotrichum sp., por medio de la observación de la coloración que predomina en la colonia y la tasa de D
crecimiento (Abang, et al., 2003; Alvis, 2007). El CuOH2 es un fungistático que actúa desnaturalizando las proteínas, a través de la reactivación de los grupos sulfhídricos (Ware y Whitaker, 2000).
51
Las diferentes clasificaciones se utilizan para diferenciar al patógeno entre las especies C. acutatum y C. gloeosporioides. Los criterios que permiten clasificar a las cepas como C. gloeosporioides son: SGG, FGG, FGS y FGO y la clasificación SGO orienta hacia la especie C. acutatum (Figura 10).
A
B
C
Figura 10. Desarrollo de las colonias de Colletotrichum en los diferentes medios de cultivo: A, Crecimiento sobre PDA, B, Medio selectivo para Colletotrichum sp.(CuOH2) y C, Medio Benomyl (2µl/ml) (Foto L. Parra).
6.4 Prueba de Benomyl
En esta prueba que permite diferenciar especies de C. acutatum y C. gloeosporioides (Freeman, et al,.1998; Bernstein, et al,. 1995), se encontró que todos los aislamientos fueron susceptibles al Benomyl (Anexo 11), por lo tanto se considera que pertenecen a la especie C. gloeosporioides (Figura 10). Estos resultados son similares a encontrados por Cerón et al (2006) en trabajos de investigación realizados con aislamientos de las dos especies de Colletotrichum que afectan los cultivos de lulo (Solanum quitoense L.).
52
El mecanismo de acción de los benzimidasoles consiste en inhibir el proceso mitótico fungoso, bloqueando al mismo tiempo la síntesis de ácido desoxirribonucleico (De la Isla, 1994). Los fungicidas sistémicos como el benomyl son convertidos en las plantas al compuesto metil benzimidazol carbamato, el cual interfiere en la división nuclear de los hongos que son sensibles a sus componentes (Agrios, 2002).
En nuestro país dentro de las prácticas de manejo de la antracnosis, se utiliza con frecuencia el producto, el cual sólo es efectivo en el control de la enfermedad cuando el agente causal es C. gloeosporioides (Páez, 2006), por lo cual es necesario que en el país se inicie su manejo mediante diferentes alternativas de control.
6.5 Prueba de la Proteasa
En las lecturas realizadas en el medio MHC se observó que todos los aislamientos presentaron una reacción negativa (-), que corresponden a C. glooesporioides (Anexo 12). Esta prueba ha mostrado ser una forma rápida y útil para diferenciar entre especies de C. gloeosporioides y C. acutatum (Martín & García-Figueres, 1999). La respuesta positiva consistió en que en el medio se observó la formación de un halo transparente alrededor del sitio de contacto con el aislamiento del hongo y cuando no se observó algún cambio en el medio, la reacción se tomo como negativa (Figura 11).
53
A
B
Figura 11. Prueba de la Proteasa. A. Respuesta negativa sin halo transparente característica, de la especie gloeosporiodes. B. Respuesta con halo transparente, típica de acutatum. (Foto, L. Parra).
Los hongos patógenos de plantas utilizan diferentes enzimas capaces de destruir los componentes estructurales de los tejidos vegetales ocasionando la muerte celular. Estas enzimas degradan carbohidratos que disuelven la pared celular e hidrolizan la cutícula. Existen otras enzimas que degradan la pared celular como las pectinliasas y proteasas que son consideradas indispensables para la colonización de las plantas por parte del patógeno (Bailey, et al,. 1992). En el caso de las proteasas, cuando el patógeno secreta estas enzimas, inactiva los componentes proteínicos de respuesta de defensa de las plantas tales como las quitinas y la ß- 1,3 glucanasa. (Cerón, 2004).
54
6.6 Pruebas de Patogenicidad
De los frutos evaluados cuando se emplearon discos de agar con el crecimiento
del
microorganismo,
el
100%
mostraron
los
síntomas
característicos de antracnosis. Los primeros síntomas se identificaron como puntos superficiales necróticos de color café oscuro y negro, que posteriormente ocasionaron el hundimiento en la zona central, como se puede observar en la Figura 12 (A y B). El reaislamiento del patógeno a partir de los frutos con síntomas confirmó la presencia del mismo comprobando los postulados de Koch.
En los aislamientos caracterizados como C. gloeosporioides según las pruebas de Benomyl, proteasa y medio selectivo para Colletotrichum spp. causaron en los frutos los síntomas inicialies de antracnosis a los 4 días en su gran mayoría y algunos con 7, 5 y 9 días. (Anexo 14)
La humedad de los tejidos permite que la conidia germine, forme apresorio y se desarrolle la enfermedad, condición que al igual que en otras especies de frutos favorece el desarrollo del microorganismo. (Arauz, L. F. 2000).
A
B
Figura 12. Frutos de Mango con lesiones de antracnosis. A, Lesiones primarias y B, Lesiones avanzadas. (Foto, L. Parra).
55
6.7 Determinación de pH en frutos sanos y enfermos de Mango
Según Lakshminarayana et al (1970) los frutos de mango en sus primeros estados son ácidos y altamente astringentes, con mayor desarrollo presentan un contenido alto de polifenol y conservan la astringencia, sin embargo alrededor de las ocho semanas presenta una reducción de polifenoles y luego permanece estable. El ácido ascórbico aumenta rápidamente alcanzando su máximo a las cinco semanas, declina a las ocho semanas y permanece estable hasta cosecha, pero al colocar en condiciones de maduración frutos cosechados con seis, ocho, once y trece semanas de desarrollo, se encontró que con mayor tiempo se tornaban altamente ácidos. (Lakshminarayana et al 1970).
Coincidiendo con los resultados obtenidos en este estudio, ya que mostraron que a medida que el fruto madura, los niveles de pH tanto en el exocarpio como en el mesocarpio, disminuyen haciéndose mas ácidos (Tabla 4.). Al comparar estos resultados, con los obtenidos por Lagos et al (1989), en un estudio sobre mango de la variedad Kent, encontramos que son similares, indicando que los valores de pH disminuyen en los frutos maduros.
Tabla 4. Valores de pH de Frutos Sanos de Mango en los diferentes Estados Fenológicos, en Exocarpio y en Mesocarpio.
FRUTOS SANOS pH Exocarpio pH Mesocarpio FRUTOS E1 E2 E3 E4 E1 E2 E3 E4 1 5,20 5,00 5,10 4,20 5,12 4,95 4,32 4,12 2 5,40 5,20 4,60 3,50 4,91 4,63 4,45 3,95 3 5,80 5,00 4,50 3,70 5,11 4,78 4,23 3,74 4 6,00 5,50 5,00 3,30 4,52 4,45 4,12 3,35 5,6 5,2 4,8 3,7 4,9 4,7 4,3 3,8 Media
56
Algunos factores como el pH juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad, ya que sus variaciones de acuerdo con la fenología del fruto sirve como una barrera y un mecanismo de defensa contra patógenos. De esta manera el patógeno supera la barrera del exocarpio y las esporas germinadas melanizan el apresorio, no solo por la reducción del pH que se observa en el mesocarpio (Tabla 4), sino por la alta concentración de compuestos antifungosos presentes en los frutos inmaduros (Prusky, et al 2001). Esta condición de quiescencia permanece hasta la maduración del fruto, donde los contenidos nutricionales y su fisiología le permiten al patógeno activar sus mecanismos de patogenicidad.
El pH tanto del exocarpio como del mesocarpio de los frutos enfermos con antracnosis, muestran valores mayores comparados con los frutos sanos (Tabla 5), tal como lo describe Prusky et al (2001) en frutos de aguacate, donde los niveles de pH aumentan por la secreción local de amonio corroborando que C. gloeosporioides tiene la capacidad de aumentar los niveles de pH.
Tabla 5. Valores de pH de Frutos Enfermos de Mango en los diferentes Estados fenológicos, en Exocarpio y Mesocarpio en áreas sanas y enfermas.
FRUTOS ENFERMOS pH EXOCARPIO SANO FRUTOS
E1
E2
E3
E4
E1
E2
E3
E4
4,87
5,12
4,25
4,42
5,74
6,54
6,63
6,54
2
6,00 5,90 5,12 5,00 8,13 7,11 6,51 6,54
4,32
4,98
4,33
4,40
6,32
6,98
5,98
6,33
3
5,98 6,00 6,10 5,56 7,74 6,98 7,14 7,00
5,00
4,69
4,33
4,69
6,52
6,21
6,54
6,98
4
6,00 6,00 5,54 5,85 7,98 6,47 7,00 7,00
4,68
4,25
4,18
4,21
6,13
6,87
6,87
6,41
4,72
4,76
4,27
4,43
6,18 6,65
6,50
6,56
5,9
E3
5,8
E4
5,4
E1
7,83
E2
6,9
E3
6,8
E4
ENFERMO
6,12 5,87 6,00 5,13 7,45 7,16 6,57 6,87
6
E2
SANO
1
Media
E1
FRUTOS ENFERMOS pH MESOCARPIO
ENFERMO
6,9
57
Con los resultados obtenidos tanto para el diseño factorial como en el diseño de bloques al azar, hubo diferencia significativa mínima (Anexo 15 y 16), entre el estado fenológico y el área donde se midió el pH (p0.05); en el mesocarpio esta tendencia no se ve tan marcada. Las variaciones en los valores del pH en áreas sanas con respecto a enfermas, indican que el patógeno necesita alterar el pH para poder superar barreras fisiológicas impuestas por el hospedero (Prusky, et al. 2001).
En la figura 13 B-C. se observa que el pH aumenta a medida que el fruto se enferma y que dependiendo del estado de desarrollo del fruto, existe una interacción entre el valor del pH y el área donde se realiza la evaluación; es decir que en frutos sanos los valores de pH del exocarpio y mesocarpio son diferentes (p0.05). En áreas sanas de frutos enfermos los valores de pH se comportan igual que en frutos sanos.
58
A A
B
59
C
Figura 13. Efecto de Antracnosis sobre el pH. A, Te: tejido enfermo, ts: tejido sano. Ts-fe: tejido sano en fruto enfermo, exo: exocarpio y meso: mesocarpio. B, efecto sobre el pH en mesocarpio y exocarpio. C, efecto sobre tejido tomado en el fruto. Te: tejido enfermo, ts-fe: tejido sano en fruto enfermo y ts: tejido sano.
Con lo resultados obtenidos en este estudio se puede decir que a medida que el fruto se desarrolla los valores de pH disminuyen dificultando la penetración del patógeno durante la maduración del fruto; por lo tanto se sugiere que los síntomas observados en los estados fenológicos E3 y E4 son el resultado de infecciones quiescentes que se formaron cuando el fruto se encontraba en los estados fenológicos E1 y E2.
60
La baja presencia de infecciones quiescentes en estados de desarrollo avanzado del fruto, puede atribuirse a factores como, uso de fungicidas sistémicos que pueden afectar al hongo, y el lavado natural del inóculo por encontrarse expuesto mayor tiempo a condiciones de campo. Además como en frutos maduros los niveles de pH son bajos, el patógeno no puede iniciar la enfermedad y su actividad se ve limitada a las infecciones quiescentes o latentes que persistieron a las condiciones adversas.
61
7. CONCLUSIONES
La incidencia de infecciones quiescentes en frutos de mango variedad hilacha fue mayor en estados de desarrollo iniciales, y el periodo de incubación de las infecciones quiescentes fue en los estados E1 y E2 de 10 días y en los estados E3 y E4 fue de 15 días.
El color de las colonias obtenidas de los aislamientos en PDA fue de un aspecto característico reportados para el género Colletotrichum.
Los sistemas tradicionales de clasificación con base en las características morfológicas, deben complementarse con otras pruebas para poder determinar la especie dentro del género.
Las pruebas de la proteasa, sensibilidad al benomyl y crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp. permitieron establecer que los aislamientos obtenidos de las infecciones quiescentes en los diferentes estados fenológicos correspondieron a la especie C. gloeosporioides.
Mediante las pruebas de patogenicidad se comprobó que los 20 aislamientos fueron patogénicos en frutos de mango variedad hilacha y su presencia se determinó mediante la observación de la expresión de síntomas sobre los frutos.
A medida que el fruto se va desarrollando se disminuyen los niveles de pH, dificultando la penetración del patógeno, razón por la cual se observa una abundante
presencia
de
infecciones
quiescentes
en
desarrollados, comparados con frutos de fenología avanzada.
62
frutos
pocos
El efecto que ejerce C. gloeosporioides sobre el pH es un factor de patogenicidad que debe ser tenido en cuenta a la hora de realizar un control y manejo sobre la antracnosis.
63
8. RECOMENDACIONES
Se debe investigar la incidencia de infecciones quiescentes sobre otros tejidos o estructuras de la planta para saber si el microorganismo sobrevive de forma quiescente ocasionando infecciones tempranas en frutos. También se debe evaluar durante los doce meses del año para observar el tiempo en donde ocurren los mayores porcentajes de enfermedad.
Realizar investigaciones relacionadas con el pH, ya que puede ser un factor de patogenicidad importante para el control de la antracnosis.
Realizar investigaciones donde se conozcan las propiedades químicas y nutricionales de los frutos de mango a medida que se desarrollan, para identificar factores que puedan controlar el desarrollo de infecciones por parte de C. gloeosporioides.
64
9.
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72
ANEXOS
ANEXO 1. Preparación del AGAR AGUA
Agar-Agar
15g
Agua Destilada
1000 ml
Esterilizar a 121°C a 15 lb por 15 minutos
73
ANEXO 2. Preparación de agar PDA
*Infusión de Papa
200g
Dextrosa
10g
Agar-Agar
20g
Ajustar el pH a 5.6 *Infusión de papa: preparada a partir de 200g de papa por litro.
74
ANEXO 3. Protocolo de Cámaras Húmedas
1. Objetivo Crear condiciones favorables de humedad para el rápido desarrollo de hongos que pueden estar involucrados en la producción de síntomas de enfermedad, pero cuya presencia no es detectada en el momento de la primera observación.
2. Alcance: Este procedimiento se aplica para obtener crecimiento tanto vegetativo como reproductivo de los microorganismos para su posterior análisis
3. Materiales y Equipos: − Material vegetal − Hipoclorito 1% − Alcohol antiséptico 1% − Bisturí − Portaobjeto estéril − Cinta scotch − Toalla de papel − Cajas de petri − Recipiente plástico desinfectado − Agua estéril − Parafilm − Cuarto de crecimiento
75
4. Contenido Seleccionar y tomar los frutos a estudiar, esterilizar los frutos con hipoclorito al 1% durante 30 a 60 segundos; lavarlos tres veces con agua destilada estéril; sumergirlos en alcohol durante 30 a 60 segundos y lavarlos tres veces con agua destilada estéril para eliminar el exceso de hipoclorito y secar el material vegetal sobre toalla de papel. Se recomienda escoger tejido que no esté demasiado dañado o con lesiones muy avanzadas para evitar la presencia de saprófitos. Agregar al recipiente 600ml de agua destilada estéril y colocar una toalla de papel de modo tal que no quede en contacto directo con el agua para evitar pudriciones de tejido. Colocar el material vegetal sobre la toalla y tapar la cámara sellándola con vinipel para permeabilizar la cámara. Incubar en un cuarto de crecimiento esterila 25+/- 2 °C. Al completar el 3 y 5 día de incubación, abrir la caja y observar la presencia o ausencia y tamaño de la lesión para pruebas de patogenicidad.
76
ANEXO 4. Protocolo Monospóricos.
1. Objetivos Obtener aislamientos puros generados a partir de una sola espora de determinado hongo con el fin de garantizar la pureza y estabilidad genética de las colecciones.
2. Alcance Va dirigido a todo el personal que labora en el laboratorio de fitopatología
3. Documentos relacionados Preparación de agar agua
4. Materiales y métodos
-
Agua estéril
-
Tubos tapa rosca con 1 ml de agua estéril
-
Tubos tapa rosca secos, estériles
-
Agar agua
-
Pipetas automáticas de 0.5 a 10 µl, 40 a 200 µl y de 100 a1000 µl
-
Puntas estériles
-
Cámara de Nuebauer
-
Laminillas
-
Vórtex
-
Microscopio
-
Asas
-
Mecheros
77
5. Procedimiento A partir del cultivo inicial con el asa estéril tomar un inoculo. Suspenderlo en 1 ml de agua estéril. Agitarlo en el vórtex. A la cámara de Nuebauer colocarle una laminilla. Tomar 10 ul de la suspensión y ponerlo entre la cámara y la laminilla. Realizar el conteo de esporas en los cuadrantes a, b, c y d. Realizar el cálculo para obtener una espora en 1 mL de agua con la siguiente formula:
Nº Esporas _________________ X 160.000 = esporas / ml 64 Nº Esporas _________________ X 160 = esporas / µl 64 Para obtener una suspensión de 1 espora / ml o 1 espora / µl, se aplica la fórmula siguiente: V1 C1 = V2 C2 Donde: C1 = Concentración inicial (conocida en el conteo) V1 = Volumen final (desconocido) C2 = Concentración final deseada (según el estudio a realizar) V2 = Volumen inicial (establecido arbitrariamente al preparar el inóculo)
Con los datos que se obtengan con la primera, se calcula la cantidad de agua que se debe agregar al volumen necesario de suspensión de esporas preparada, para obtener una concentración de 1 espora por ml o por µl.
78
Ej. V1
x
C1
=
10 esporas
V2 1mL
x C2 1mL
= 0.1 mL X 1.000 = 100 UL completar con 900 UL de agua, para obtener 1 espora en 1 mL.
Realizar círculos en al caja de agar agua. Sembrar en cada pozo 2 µl de la suspensión final Dejar a 25º C por 24 horas Al completar las 24 horas se realiza la lectura en el microscopio. Observando si hay germinación de las esporas. Retirar con el asa estéril la espora que germino y colocarla en agar PDA.
79
ANEXO 5. Medio para evaluar la reacción de la proteasa producida por Colletotrichum acutatum.
KH2PO4
1.0 g
KCL
0.5 g
CaCl2.2H2O
0.2 g
Glucosa
10.0 g
Agar-Agar
12.0 g
Agua Destilada
975 ml
*Leche Desnaturalizada 15%
25 ml
Ajustar el pH al 5.4 con ácido clorhídrico y posteriormente autoclavar a 121°C, 20 min y 15 lb de presión.
*Preparar una solución de leche al 15% (Pesar 15 g de leche desnaturalizada y diluirlo en 100 ml de agua), someter a agitación y tomar el volumen requerido para completar el litro (25 ml).
Recomendación: El volumen de agua (975 ml) debe estar bajo agitación constante y luego comenzar a agregar cada compuesto en el orden establecido.
80
ANEXO 6. Protocolo Medio Suplementado con Base Benomyl.
1. Objetivo Diferenciar especies de Colletotrichum susceptibles y tolerantes a benomyl
2. Alcance Evaluación de pruebas biológicas para la identificación de especies de Colletotrichum sp. aislados de mango.
3. Definiciones El benomyl es un fungicida sistémico que pertenece al grupo de los benzimidazoles y que interfiere con la división nuclear de los hongos que son sensibles a su efecto (Delp y Kloping, 1968, citado por Tabares en el 2002). Tiene acción protectora y erradicante, es efectivo contra numerosos hongos fitopatógenos y también posee propiedades acaricidas (Tabares, 2002). Este producto es absorbido por las plantas, luego de los cual se acumula principalmente en las venas y en las hojas. Una vez penetra en el tejido vegetal, el benomyl es convertido a butil isocianato y carbendazim, el cual se une a las unidades de tubulina del patógeno, lo que afecta la formación de microtúbulos. Esto interfiere directamente con ciertas funciones celulares, ya que afecta el aparato mitótico, inhibe la división nuclear y el transporte intracelular (Torres y Osorio, 2005).
4. Materiales y Equipos
-
Fungicida Benomyl
-
Agua destilada
-
Agar PDA
81
-
Autoclave
-
Enlermeyer
-
Cajas petri
-
Tiras de pH
5. Contenido
5.1 Prepara el agar PDA 5.2 Autoclavar a 121 °C y 15 Lb de presión (15 mint) 5.3 Dejar atemperar el agar PDA 5.4 Agragar el fungicida benomyl hasta obtener una concentración de 2ug/ml (Peres et al; 2002) 5.5 Servir en cajas petri y conservar las cajas en refrigeración 5.6 Sembrar las cepas de Colletotrichum que se desean evaluar 5.7 Incubar durante 72 horas 5.8 Medir los halos de crecimiento y observar el color predominante de la colonia. 5.9 Interpretación: en base a los resultados del crecimiento de las especies de Colletotrichum se debe determinar la susceptibilidad o la tolerancia del fungicida, estos parámetros deben ir a la mano con las otras evaluaciones biológicas para identificar la especie en estudio.
82
ANEXO 7. Protocolo Medio Suplementado con Hidróxido de Cobre y Estreptomicina
1. Objetivo Diferenciar especies de Colletotrichum susceptibles y tolerantes a CuOH2
2. Alcance Este procedimiento se aplica para obtener una clasificación preliminar de especies de Colletotrichum sp. aislados de diversos frutales.
3. Definiciones CuOH2 es el medio selectivo para Colletotrichum, se compone de Hidroxido de Cobre como ingrediente ativo, y del antibiótico Estreptomicina. El CuOH2 es un fungistático que actúa desnaturalizando las proteínas, a través de la reactivación de los grupos sulfihídricos (Ware y Whitaker, 2000). Este medio permite clasificar los diferentes aislamientos para la diferenciación entre estas dos especies de Colletotrichum por medio de la observación de la coloración que predomina en la colonia y la taza de crecimiento (Abang, et al; 2003).
4. Materiales y Equipos -
Fungicida CuOH2
-
Antibiótico estreptomicina
-
Agua destilada
-
Agar PDA
-
Autoclave enlermeyer
-
Cajas de petri
-
Tiras de pH
83
5. Contenido 5.1 preparar el agar PDA 5.2 autoclavar a 121°C y 15Lb (15min) 5.3 dejar atemperar el agar PDA 5.4 Agregar el fungicida CuPH2 hasta obtener una concentración de 42mg/L. 5.5 Agregar 300 mg/L de estreptomicina 5.6 Servir en cajas de petri y conservar las cajas en refrigeración 5.7 Sembrar las cepas de Colletotrichum que se deseen evalaur 5.8 Incubar durane 72 horas 5.9 Medir los halos de crecimiento y observar el color predominante de la colonia 5.10 Interpretación: en base a los resultados del crecimiento de las especies de Colletotrichum, se debe determinar la susceptibilidad o la tolerancia del fungicida, estos parámetros deben ir a la mano con las otras evaluaciones biológicas para identificar la especie en estudio.
84
ANEXO 8. Incidencia de Infecciones Quiescentes en los estados fenológicos de frutos de Mango.
INCIDENCIA DE LA ENFERMEDAD
99 19:42 Wednesday, April 14, 1998
The GLM Procedure Class Level Information Class
Levels
Values
rep
4
1 2 3 4
est
4
E1 E2 E3 E4
Number of observations
85
16
INCIDENCIA DE ENFERMEDAD
100 19:42 Wednesday, April 14, 1998
The GLM Procedure Dependent Variable: in
Incidencia ()
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
6
1823.365000
303.894167
1.21
0.3831
Error
9
2263.455000
251.495000
15
4086.820000
Source
Corrected Total
Source rep est
Source rep est
R-Square
Coeff Var
Root MSE
in Mean
0.446157
22.21092
15.85859
71.40000
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
3 3
573.980000 1249.385000
191.326667 416.461667
0.76 1.66
0.5439 0.2449
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr > F
3 3
573.980000 1249.385000
191.326667 416.461667
0.76 1.66
0.5439 0.2449
86
INCIDENCIA DE LA ENFERMEDAD
101 19:42 Wednesday, April 14, 1998
The GLM Procedure t Tests (LSD) for in NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate not the experimentwise error rate.
Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference
0.05 9 251.495 2.26216 25.367
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping
Mean
N
est
A A A A A A A
81.13
4
E1
79.05
4
E2
64.75
4
E3
60.68
4
E4
87
ANEXO 9. Pruebas de Validación, Normalidad y comparación de promedios en la incidencia de infecciones quiescentes en los estados fenológicos de frutos de mango.
INCIDENCIA DE ENFERMEDAD
102 19:42 Wednesday, April 14, 1998
The UNIVARIATE Procedure Variable: r Moments N Mean Std Deviation Skewness Uncorrected SS Coeff Variation
16 0 12.284014 0.05635386 2263.455 .
Sum Weights Sum Observations Variance Kurtosis Corrected SS Std Error Mean
16 0 150.897 -0.484169 2263.455 3.0710035
Basic Statistical Measures Location Mean Median Mode
Variability
0.000000 0.212500 .
Std Deviation Variance Range Interquartile Range
12.28401 150.89700 44.90000 16.58750
Tests for Location: Mu0=0 Test
-Statistic-
-----p Value------
Student's t Sign Signed Rank
t M S
Pr > |t| Pr >= |M| Pr >= |S|
0 0 -1
1.0000 1.0000 0.9799
Tests for Normality Test
--Statistic---
-----p Value------
Shapiro-Wilk Kolmogorov-Smirnov Cramer-von Mises Anderson-Darling
W D W-Sq A-Sq
Pr Pr Pr Pr
0.985528 0.121483 0.02133 0.139598
Quantiles (Definition 5) Quantile
Estimate
100% Max 99% 95% 90%
21.9500 21.9500 21.9500 17.8000
88
< > > >
W D W-Sq A-Sq
0.9926 >0.1500 >0.2500 >0.2500
INCIDENCIA DE LA ENFERMEDAD 103 19:42 Wednesday, April 14, 1998 The UNIVARIATE Procedure Variable: r Quantiles (Definition 5) Quantile
Estimate
75% Q3 50% Median 25% Q1 10% 5% 1% 0% Min
8.1500 0.2125 -8.4375 -15.3000 -22.9500 -22.9500 -22.9500
Extreme Observations -----Lowest-----
-----Highest----
Value
Obs
Value
Obs
-22.950 -15.300 -10.575 -8.725 -8.150
14 3 5 8 10
6.075 10.225 13.300 17.800 21.950
9 12 2 6 15
Stem 2 1 1 0 0 -0 -0 -1 -1 -2
Leaf 2 8 03 66 23 1 9885 1 5 3 ----+----+----+----+ Multiply Stem.Leaf by 10**+1
89
# 1 1 2 2 2 1 4 1 1 1
Boxplot | | | +-----+ *--+--* | | +-----+ | | |
INCIDENCIA DE LA ENFERMEDAD 104 19:42 Wednesday, April 14, 1998 The UNIVARIATE Procedure Variable: r Normal Probability Plot 22.5+ | | 7.5+ | | -7.5+ | | -22.5+
+*++ *+++ *+*++ *+*++ +**++ ++** *+*+* ++*+ +++* ++*+ +----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+ -2 -1 0 +1 +2
90
ANEXO 10. Características Morfológicas de los Aislamientos.
ESTADO AISLAMIENTO COLOR CRECIMIENTO 1 Gris Radial 2 Gris oscuro Radial 3 Gris Oliva Radial E1 4 Blanco Radial 5 Salmón Radial 6 Oliva Radial 1 Blanco Radial 2 Oliva Radial 3 Gris Oscuro Radial E2 4 Blanco Salmón Radial 5 Gris Radial 6 Salmón Radial 7 Gris Oliva Radial 1 Gris Radial 2 Oliva Radial E3 3 Gris Oscuro Radial 4 Blanco Radial 1 Oliva Radial 2 Gris Radial E4 3 Gris Oscuro Radial 4 Salmón Radial 5 Blanco Radial
91
ANEXO 11. Prueba de Benomyl en 2 repeticiones.
ESTADO AISLAMIENTO CONTROL 1 + 1 + 2 + 3 E1 + 4 + 5 + 6 + 1 + 2 + 3 + E2 4 + 5 + 6 + 7 + 1 + 2 E3 + 3 + 4 + 1 + 2 + E4 3 + 4 + 5 -
-: Sensibilidad e inhibición del crecimiento micelial. +: Tolerancia y crecimiento micelial.
92
2 -
ANEXO 12. Prueba de la proteasa en 2 repeticiones.
ESTADO
E1
E2
E3
E4
C. acutatum (852) + + + +
AISLAMIENTO 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 1 2 3 4 5
1 -
2 -
C. gloeosporioides (1022) -
La respuesta positiva es una característica que presenta C. acutatum. La respuesta negativa es una característica que presenta C. gloeosporioides.
93
ANEXO 13. Prueba de Medio Selectivo para Colletotrichum spp.
ESTADOS
AISLAMIENTO REPETICIÓN
1
2
E1
3
4
5
6
1
2
3 E2 4
5
6
7
DIAMETRO (cm)
CLASIFICACIÓN
PDA
COBRE
COBRE
Crecimiento
1
2.7
3.0
Salmón
FGS
2
2.7
2.8
Salmón
FGS
1
2.6
2.8
Salmón
FGS
2
2.5
2.6
Salmón
FGS
1
3.0
3.5
Gris
FGG
2
3.4
3.3
Gris
FGG
1
3.4
3.1
Gris
FGG
2
3.2
3.0
Gris
FGG
1
3.2
2.8
Oliva
FGO
2
3.2
2.6
Oliva
FGO
1
3.4
2.4
Gris
SGG
2
3.4
2.3
Gris
SGG
1
3.3
3.6
Salmón
FGS
2
3.1
2.7
Salmón
FGS
1
2.7
3.2
Gris
FGG
2
3.4
3.4
Gris
FGG
1
3.3
3.6
Oliva
FGO
2
3.3
3.0
Oliva
FGO
1
3.0
2.6
Gris
FGG
2
2.9
2.8
Gris
FGG
1
3.4
3.2
Salmón
FGS
2
3.6
3.3
Salmón
FGS
1
2.9
3.4
Gris
FGG
2
2.7
3.3
Gris
FGG
1
2.9
3.1
Oliva
FGO
2
3.2
2.9
Oliva
FGO
94
Especie C. gloeosporioides C. gloesoporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides
1
E3
2
3
4
1
2 E4 3
4
5
1
3.2
2.6
Salmón
FGS
2
3.3
2.8
Salmón
FGS
1
3.2
2.9
Salmón
FGS
2
3.0
3.1
Salmón
FGS
1
3.1
2.6
Salmón
FGS
2
3.0
2.8
Salmón
FGS
1
3.2
2.6
Gris
SGG
2
3.4
2.5
Gris
SGG
1
3.2
2.7
Gris
FGG
2
3.1
3.2
Gris
FGG
1
3.2
3.5
Salmón
FGS
2
3.4
3.5
Salmón
FGS
1
3.5
2.6
Gris
SGG
2
3.4
2.5
Gris
SGG
1
3.0
2.6
Salmón
FGS
2
3.2
3.1
Salmón
FGS
1
3.5
3.4
Oliva
FGO
2
3.5
3.4
Oliva
FGO
95
C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides C. gloeosporioides
ANEXO 14. Presencia de síntomas iniciales de Antracnosis en los tratamientos de Patogenicidad.
ESTADO AISLAMIENTO MANGO 1 4 Días 2 4 Días 3 4 Días E1 4 4 Días 5 7 Días 6 4 Días 1 9 Días 2 4 Días 3 4 Días E2 4 4 Días 5 4 Días 6 4 Días 7 4 Días 1 4 Días 2 4 Días E3 3 4 Días 4 4 Días 1 4 Días 2 4 Días E4 3 4 Días 4 4 Días 5 5 Días
96
ANEXO 15. Efecto de la Enfermedad sobre el pH en áreas sanas y enfermas de frutos enfermos y en frutos sanos.
EFECTO DE LA ENFERMEDAD SOBRE EL pH 19:42 Wednesday, April 14, 1998 The GLM Procedure Class Level Information Class
Levels
Values
est
4
e1 e2 e3 e4
enf
3
te ts ts_fe
tej
2
exo meso
Number of observations
97
96
83
EFECTO DE LA ENFERMEDAD SOBRE EL pH 84 19:42 Wednesday, April 14, 1998 The GLM Procedure Dependent Variable: pH
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
23
93.45663333
4.06333188
48.04
F
3 2 6 1 3 2 6
4.55715833 64.71193958 9.62831042 8.49660000 0.44172500 4.80166875 0.81923125
1.51905278 32.35596979 1.60471840 8.49660000 0.14724167 2.40083437 0.13653854
17.96 382.52 18.97 100.45 1.74 28.38 1.61