RESUMEN Ésta propuesta se enmarca en la detección de sustancias con propiedades antibióticas o cicatrizantes en sangre de reptiles autóctonos para solucionar problemas de cicatrización. La regeneración es la capacidad biológica de un organismo vivo para reconstruir por sí mismo sus partes dañadas o perdidas y esta vinculada con los procesos de cicatrización. Muchos reptiles poseen esta propiedad y además son capaces de recuperarse rápidamente de lesiones y de ser resistentes a las infecciones, lo que los hace muy interesantes. En particular nos hemos focalizado en la verificación de la existencia de dichas sustancias. Para ello testeamos sueros de diferentes clases de reptiles autóctonos (Hydromedusa tectifera, Trachemys dorbygni, Tupinambis merinae, Caiman Latirostris, Bothrops alternatus, Bothrops pubescens), en ratones heridos a los cuales les controlamos el tiempo de cicatrización y la posible aparición de infecciones Resultados preliminares confirman la presencia de dichas sustancias ya que se observa un acortamiento en los tiempos normales de cicatrización en mamífero tratados por ejemplo con suero de Caiman latirostris. Es por eso que queremos primeramente diferenciar si estos beneficios se deben a una mejora en los sistemas de cicatrización o a un efecto netamente anti infeccioso. Luego detectar cual es el origen de dichas sustancias. Posteriormente equipos de investigación con mayor infraestructura y experiencia podrían continuar con esta investigación para identificar la o las sustancias responsables, caracterizarlas y usando biología molecular producirlas en el laboratorio. Y a partir de las mismas poder desarrollar estrategias que permitan resolver los problemas de cicatrización en humanos. Según datos reportados de un estudio realizado en 1997 acerca de la prevalencia de diabetes tipo I en la población infantil (menores de 15 años) colocan a Uruguay en primer lugar en latino América con una prevalencia estimada de 4.9 en 10000, mientras que en Perú no pasa el 0.4%. La mayor incidencia de diabetes tipo 1 en menores de 15 años también corresponde a Uruguay reportándose un valor de 8.3 en 10000. La diabetes en adultos según datos reportados en 1966 muestra que un 6.9 de la población Uruguaya tiene prevalencia a la diabetes. Es importante destacar que uno de los problemas que acarrea dicha enfermedad es la gran dificultad en la cicatrización de las heridas. Es por eso que creemos que nuestro proyecto puede contribuir considerablemente a mejorar la calidad de vida no solo de estas personas (hoy en día el 8% de la población Uruguaya) sino también para sanar heridas y regenerar tejidos dañados en heridas superficiales como en quemaduras de piel de gran extensión, que hasta ahora sólo se tratan con transplantes. 1

OBJETIVOS Objetivo General: Generar herramientas a partir de estudios realizados en reptiles que permitan resolver los problemas de cicatrización específicamente en la población diabética Uruguaya. Objetivos específicos: 1. Reconocimiento de los reptiles a estudiar y sus características. 2. Verificar si existe alguna sustancia en el suero de reptiles (Hydromedusa tectífera. Trachemys dorbygni, Caiman latirostris, Bothrops alternatus, Bothrops pubescens y Tupinambis merinae) capaz de acelerar el proceso de cicatrización y/o prevenir infecciones en mamíferos. 3. Comprobar si el proceso ocurrido en la herida de los ratones fue un proceso de cicatrización o anti-infeccioso 4. Comprobar si la o las sustancias son de origen proteico u hormonal. 5. Mediante ensayos microbiológicos determinar si beneficia la cicatrización en diabéticos y si es capaz de eliminar bacterias que interfieran con dichos procesos como el, Estafilococos, Streptococo y Pseudomonas. 6. Comunicar los resultados obtenidos a la población y publicarlos. INTRODUCCIÓN Según bibliografía los lagartos y yacarés muestran cierta resistencia a las infecciones y facilidad para recuperarse de sus heridas. Uno de nuestros objetivos es verificar si estas propiedades la comparten todos los reptiles. Para ello, trabajamos con sangre de tortugas, donada por el veterinario Claudio Borteiro, de Yacaré Overo donada por Cerros Azules y sangre de ofidios (Crucera y Yara) y de lagarto overo facilitada por Marcelo Colina. Finalmente testamos diariamente y a nivel tópico los diferentes sueros en ratones machos. Una vez obtenidos los resultados los comparamos y analizamos. Los reptiles Los reptiles son animales vertebrados que viven en la tierra hace 300 millones de años. Algunos de ellos tienen la capacidad de perder la cola. Este es un mecanismo ancestral de defensa solo alguno de ellos conservan así como unos pocos anfibios, en especies más complejas como en mamíferos la capacidad de regenerar un miembro entero no es posible. La perdida de la cola sirve para provocar la distracción del depredador y, así, facilitar la huída de muchas de las especies de lagartos y algunos ofidios. 2

¿Qué pasa si el lagarto pierde la cola? Asombrosamente al perder su cola el lagarto la podrá regenerar tantas veces como sitios de clivaje tenga disponibles. La regeneración es importante para su actividad. Ya que está implicada en procesos de locomoción, almacenamiento de energía en forma de lípidos, mantenimiento del equilibrio o en el comportamiento durante la reproducción. La regeneración Es la capacidad biológica de un organismo vivo para reconstruir por sí mismo sus partes dañadas o perdidas. En los mamíferos también existe la capacidad de regeneración pero esta se limita a las cuernas, las falanges de los dedos y los agujeros en las orejas. Cuando existen grandes daños a nivel epitelial como por ejemplo quemaduras o cortes extensos la recuperación del tejido solo se logra con un transplante de tejido. Nuestro objetivo es mejorar la capacidad de reconstrucción del tejido mediante la aplicación de suero, proveniente de reptiles, sobre la superficie de una herida de mamíferos. Hasta el momento nuestros resultados apuntan que esto es posible. Un equipo de investigación de la Universidad de California ha informado que existe un mecanismo genético que dispara el desarrollo de las extremidades y de algunos de los órganos en los vertebrados. Permitiéndoles a algunos anfibios y reptiles regenerar sus miembros amputados. Se conoce que

axolotes, lagartos, pollos y humanos utilizan

exactamente el mismo mecanismo genético para generar sus extremidades. La única diferencia es que en individuos mas complejos (mamíferos) este mecanismo comandado por proteínas1 se ve silenciado, mientras que en los axolotes continúan activas toda la vida, permitiendo la regeneración prácticamente ilimitada2. Es por eso que creemos que tal vez en el suero de lagarto overo (regenera su cola) pueda existir una sustancia que sea capaz de reactivar estos mecanismos a nivel de la piel en mamíferos. Cicatrización rápida en algunos reptiles La cicatrización es un proceso natural que posee el cuerpo para regenerar los tejidos de la dermis y epidermis que han sufrido una herida. Algunos de los reptiles también se caracterizan por su rápida cicatrización y resistencia a infecciones. Comúnmente los yacarés, lagartos o cocodrilos se ven heridos dúrate luchas territoriales o al momento de cazar su presa, además están constantemente en contacto con en el barro y el agua, lo que favorece las posibilidades de infección. Nuestros resultados nos permiten suponer que debe existir una o varias sustancias en la sangre de estos reptiles que les den resistencia a las infecciones y que a su vez favorezcan la 1 2

Estas familias de proteínas llamadas FGF y WNT se conservan al menos en las especies mencionadas. Depende del estado de salud del individuo.

3

cicatrización ya que se recuperan rápidamente de las heridas. Esto nos lleva a querer desarrollar estrategias que permitan aislar e identificar estas sustancias y a partir de las mismas desarrollar cremas, lociones o parches de uso tópico que sirvan para sanar heridas y regenerar tejidos dañados. MATERIALES Y METODOS Objetivo 1 (datos no mostrados) La metodología empleada fue la observación de los animales y búsqueda bibliográfica. Objetivos 2 y 3 Materiales Todos los materiales fueron utilizados en condiciones de asepsia, así mismo los animales fueron manipulados por personal capacitado, veterinario JM Verdes y miembro de la CHEA (Comisión honoraria de experimentación animal). Todos los animales fueron tratados con previa anestesia para evitar su sufrimiento. •

Alcohol y algodon

•

•

Balanza eléctrica

•

Pinzas y tijeras

latirostris,

•

Diazepan y ketamina

Bothrops

•

Jeringas y agujas

merinae Hidromedusa tectifera

•

Guantes y bisturí

•

Centrifuga

•

Ratones cepas C573BL/6J

•

Tubos de ensayo

donados por IPdeMont y Fac.

•

Ependorf

Medicina.

•

Pipetas Pasteur.

•

Aguja e hilo quirúrgico

•

Cámara fotográfica

Sangre de Hydromedusa tectífera. Trachemys dorbygni, Caiman Bothrops pubescens

alternatus, y

Tupinambis

Metodología Obtención de suero a partir de sangre de reptiles. Posteriormente a la captura e inmovilización del lagarto, se extrajo la sangre de una vena del seno occipital. A las tortugas se les extrajo sangre de una arteria que tienen a nivel de la nuca debajo del caparazón. A los ofidios se les extrajo sangre de una arteria que tienen en la zona coxial. Las muestras de sangre se centrifugaron a 14000 rpm durante 30 minutos. Se les extrajo el sobrenadante con una pipeta Pasteur y se descartó la fracción que contenía los glóbulos rojos. 4

El sobrenadante conteniendo el suero la almacenó en un freezer en Ependorf rotulados. Manipulación de animales Primeramente se pesaron los ratones en una balanza electrónica con el fin de calcular la dosis de anestesia a suministrar. Según datos tabulados se preparó una solución de anestésico conteniendo 5 mg de diazepan por cada 100 mg de ketamina. La solución se administró a los ratones vía intraperitoneal utilizando jeringa y agujas estériles. Posteriormente se esperó a que la frecuencia cardíaca de los animales disminuyera para realizarles un corte de 1cm subcutáneo a nivel dorso cervical (nuca) utilizando un bisturí previamente esterilizado con alcohol. Luego se cosió la herida con hilo quirúrgico. A los ratones controles se administró superficialmente cada 24hs suero comercial. A los ratones 2 y 3 se les realizó el mismo procedimiento a diferencia que se les aplicó cada 24 hs suero de Trachemys dorbignyi y a los ratones 1 y 4 se les aplicó suero Hidromedusa tectifera. Se realizó lo mismo para los ratones 6 y 7 con suero de Caimán latirostris, 8 y 9 para Bothrops alternatus y finalmente 10 y 11 para Bothrops pubescens. Se controlaron los signos vitales de los animales durante todo el procedimiento. Toma de datos Durante los días siguientes se tomaron fotografías y completaron las planillas correspondientes a cada ratón. Se realizaron las siguientes observaciones cada 24hs horas a cada ratón: A. Apariencia del animal: perdida de peso o pelo, temblores, etc. B. Apariencia de la herida: color, olor, tamaño y forma C. Conducta: agresividad, hiperactividad, stress, alimentación, etc

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Objetivos 2 y 3 Para cumplir con el objetivo 2, primeramente se extrajo sangre de la zona posterior de Trachemys dorbygni e Hydromedusa tectífera. Esta sangre fue centrifugada a 14.000 rpm por minuto durante 20 minutos. Logrando separar así sus componentes. Se observan 3 fases: glóbulos rojos, glóbulos blancos y suero. De estas 3 fases se extrajo la menos densa, el suero ver imagen 3. Elegimos el suero porque en él se encuentran los elementos de menor densidad, como por ejemplo, hormonas, proteínas o moléculas que pensamos podrían contribuir con el proceso de cicatrización y desinfección de la herida.

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Para poder comprobar nuestro objetivo, elegimos ratones machos como modelo de experimentación. Los

ratones

utilizados

en

estos

Imagen 3. Se observan las tres fases luego de centrifugar. Suero en la parte superior, Glóbulos blancos y en la parte inferior glóbulos rojos.

experimentos

pertenecen a la cepa C573BL/6J son

sanos,

hermanos, de la misma edad y sexo. Es necesario que todos los ratones tengan las mismas características para que los resultados sean comparables.

Antes de comenzar con el testeo de los sueros, se estudió la evolución de la cicatrización de una herida normal, en un animal sano, para ello se le realizó el procedimiento ya mencionado a un ratón control. Con esto se pudo registrar el tiempo de cicatrización normal y que datos se deberían de tomar en cuenta en los experimentos siguientes.

Tamaño (cm)

1 0,9

Suero hydromedusa tectifera

0,8

Suero Trachemys dorbignyi

0,7

Control

0,6

Caiman latirostris

0,5

Bothrops alternatus

0,4 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11

Bothrops pubescens

Tiempo (dias)

Grafico 1. Registro de cambios en el tamaño de la herida de los ratones tratados con sueros de reptiles y suero comercial. ∆ Ratones control tratados con suero comercial ◊ Ratones tratados con suero de Hidromedusa tectifera □ Ratones control tratados con suero de Trachemis dorbygni,x Ratones control tratados con suero de Caiman latirostris, * Ratones control tratados con suero de Bothropsalternatus, o Ratones control tratados con suero de Bothrops pubescens.

Se testeó el suero fisiológico en 2 ratones, a estos se les llamó control. La herida de estos ratones tardó en cicatrizar completamente 8 días ver gráfico 1. Se consideró como finalización del proceso de cicatrización a la caída de la “cascarita”. La evolución de la misma fue acompañada por un cambio gradual en el color, de rojo intenso a rosa pálido.

6

No se observó la segregación de pus o inflamación u olor en la zona de la herida, lo que nos permite decir que no se produjo ningún tipo de infección. Se testeó el suero de Hydromedusa tectífera en 2 ratones y se observó que la evolución de la herida era notoriamente más rápida, 6 días, que en los ratones control (8 días) ver grafico 1. Los cambios de color fueron graduales al igual que en el control. Aparte se pudo comprobar que no se produjo infección, ya que no se observó segregación de pus, inflamación u olor en la zona de la herida. Además se testeó el suero de Trachemys dorbygni en 2 ratones y se observó que la evolución de la herida era notoriamente más lenta, 9 y 10 días, que en los ratones control (8 días) ver grafico 1, además uno de los ratones tratado con este suero murió en el día 13. Los cambios de color no fueron graduales al igual que en el control, el color rojo se mantuvo por mas tiempo. No se observó segregación de pus pero si inflamación y aumento de temperatura en la zona de la herida, lo que nos permite decir que se produjo algún tipo de infección. A diferencia de los ratones control y de los tratados con suero de Hydromedusa tectífera, se observó cambio en el comportamiento de los animales, se mostraron por periodos muy inquietos y durante otros extremadamente tranquilos, con periodos de sueño muy prolongados. A partir de estos resultados, podríamos decir que en el suero de Hydromedusa tectífera podrían existir sustancias que aceleren los procesos de cicatrización y prevengan infecciones. Creemos que estos resultados se deban a que la tortuga Hydromedusa tectífera pasa la mayor parte de su vida en el agua, además de poder vivir en aguas contaminadas. Probablemente estas condiciones le hayan permitido desarrollar un sistema inmune que le permita cicatrizar rápidamente en condiciones de humedad y de resistir frente a infecciones al estar en contacto directo con los contaminantes. Para Trachemys dorbygni no podemos decir lo mismo. Probablemente el efecto negativo de su suero se corresponda a que estos animales son de hábitos mayoritariamente terrestres, además se desconoce su resistencia a vivir en ambientes contaminados. Por otra parte, los

resultados

obtenidos

en

Hydromedusa

tectífera,

fueron

verdaderamente

sorprendentes (aunque se debió de usar mayor numero de animales para que fueran 100% confiables). Ya que en nuestra hipótesis inicial sólo esperáramos encontrar alguna propiedad cicatrizante o antibiótica en los sueros de reptiles de conducta territorial, agresiva o que fueran capaces de regenerar. Sin embargo Hydromedusa tectífera no presenta ninguna de estas características pero si parecería beneficiar la cicatrización en mamíferos.

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Para Caiman latirostris los resultados obtenidos fueron asombrosos ya que tan solo en tres días se completó el proceso de cicatrización en los ratones tratados. Aquí el efecto es muy significativo y se corresponde con nuestras hipótesis. De esta forma se sitúa al Caiman latirostris como la especie que beneficia mas la cicatrización. Para realizar los siguientes objetivo utilizaremos el suero de Caiman latirostris. Creemos que estos resultados se deban a que Caiman latirostris presenta conductas agresivas y territoriales y se recupera rápidamente de heridas, además pasa gran parte de su vida en el agua o ambientes húmedos. Probablemente estas condiciones le hayan permitido desarrollar un sistema inmune muy potente. También para Bothrops pubescens y Bothrops alternatus se obtuvieron resultados favorables, sobretodo para el primer caso. En ratones tratados con suero de Bothrops pubescens el proceso de cicatrización finalizó al quinto día mientras que para B. alternatus el sexto día, lo que nos permite afirmar que en ambos sueros podrían existir sustancias que aceleren los procesos de cicatrización y prevengan infecciones. Lo que hace a este trabajo mas interesante aun, es que no existen hasta el momento estudios de estas características realizados en reptiles autóctonos. Lo que nuestro trabajo seria el inicio de una posible línea de investigación. CONCLUSIÓNES  El suero proveniente de Trachemys dorbignyi no mejoró la cicatrización ni tuvo efectos antibióticos.  Los ratones tratados con suero de Hydromedusa tectífera, Bothrops pubescens y Bothrops alternatus cicatrizaron notoriamente mas rápido que los controles. A partir de esto podemos concluir que probablemente exista una sustancia en estos sueros que posea propiedades cicatrizantes o antibióticas.  Los

ratones

tratados

con

suero

de

Caiman

latirostris

cicatrizaron

significativamente mas rápido que los controles y los ratones tratados con los demas sueros . A partir de esto podemos concluir que probablemente exista una sustancia en estos sueros que posea propiedades cicatrizantes o antibióticas muy potentes.

PERSPECTIVAS

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•

Repetir el mismo procedimiento esta vez utilizando la fracción de glóbulos blancos de los diferentes reptiles.

•

De existir alguna sustancia que favorezca la cicatrización o proteja de las infecciones se podría calentar el suero de manera de desnaturalizar las proteínas y así comprobar si la sustancia es de origen proteico o no.

•

Realizar el mismo procedimiento esta vez con el suero y los glóbulos blancos de un lagarto que haya perdido su cola y se encuentre regenerándola y compararla con suero de lagartos que no la hayan perdido.

•

Otros equipos de investigación con mayor infraestructura y experiencia podrían continuar con esta investigación para identificar la o las sustancias responsables, caracterizarlas y producirlas en el laboratorio. Y a partir de las mismas desarrollar cremas, lociones o parches de uso tópico que sirvan para sanar heridas y regenerar tejidos dañados.

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