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ARTÍCULO ORIGINAL

Regulación del metabolismo del colesterol y ácidos grasos en el síndrome nefrótico experimental por las proteínas que se unen a los elementos regulatorios de esteroles (SREBP´s): efecto de la soya Armando Tovar,a* Natalia Manzanoa y Nimbe Torresa a

Departamento de Fisiología de la Nutrición, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición "Salvador Zubirán", México, D.F. México.

Recibido en su versión modificada: 24 de diciembre del 2004

RESUMEN El síndrome nefrótico (SN) cursa con hiperlipidemia. Se conoce que la biosíntesis del colesterol y de los ácidos grasos es regulada por los factores transcripcionales que se unen a los elementos de respuesta a esteroles (SREBP’s). El consumo de proteína de soya disminuye la concentración de estos lípidos, aunque su mecanismo de acción no es del todo conocido. El objetivo de este estudio fue conocer si el consumo de la proteína de soya reduce los niveles de colesterol y triglicéridos a través de una regulación de las SREBP’s. Se estudiaron ratas Wistar macho con SN experimental por 64 días. Se observó que las concentraciones plasmáticos de colesterol y triglicéridos plasmáticos, así como de la proteinuria eran significativamente menores en las ratas alimentadas con proteína de soya que aquellas que consumían caseína. Estos cambios se asociaron con disminución de la expresión del ARNm SREBP-1 y de las enzimas de la síntesis de ácidos grasos. Los análisis por Western Blot revelaron que en los núcleos de hepatocitos obtenidos de ratas alimentadas con proteína de soya hubo menor presencia del factor transcripcional SREBP-1. Los resultados de este estudio indican que el consumo de proteína de soya produce efectos benéficos durante el síndrome nefrótico.

Palabras clave: SREBPs, síndrome nefrótico, colesterol, triglicéridos

Introducción

L

os nutrimentos contenidos en la alimentación de un individuo no son sólo importantes por su aporte energético o de materias primas para la síntesis de otras macromoléculas o como parte estructural del propio organismo. Los nutrimentos en muchas ocasiones constituyen importantes reguladores de la expresión de gran diversidad de genes, pudiendo actuar a nivel de la transcripción o sobre el procesamiento, estabilidad y traducción del ARNm.1 En el caso del colesterol ésta no es una excepción. El colesterol es un lípido de gran importancia tanto para la morfología como para la fisiología de la célula, así como para el correcto desarrollo de los organismos, pues es uno de los

aceptado: 24 de febrero del 2005

SUMMARY Hyperlipidemia occurs during nephrotic syndrome (NS). It is known that cholesterol and fatty acid biosynthesis is controlled by the transcription factors sterol regulatory element binding proteins (SREBPs). Soy protein consumption reduces the concentration of these lipids, although its mechanism of action is not well known. The aim of the present study was to establish whether soy protein consumption reduces cholesterol and triglycerides levels by regulating of SREBPs. Male Wistar rats with experimental NS were studied for 64 days. The results showed that rats fed with soy protein had significantly lower plasma cholesterol and triglyceride concentrations as well as proteinuria than rats fed with casein diet. These decrements were associated with a decrease in the expression of SREBP-1 and fatty acid biosynthetic enzymes. In addition, Western blot analysis revealed that in nuclear extracts from hepatocytes of rats fed with soy protein, there was a lower concentration of SREBP-1 than in rats fed with casein. The results of this study indicate that consumption of a soy protein diet has beneficial effects on nephrotic syndrome.

Key words: SREBPs, nephrotic syndrome, cholesterol, triglycerides

constituyentes principales de las membranas celulares y un importante precursor de las hormonas esteroideas, de los esteroles fecales y de los ácidos biliares.2 Los organismos superiores tienen dos vías de adquisición del colesterol, ya sea mediante la dieta, o bien, si la dieta no lo contiene tienen la capacidad de sintetizarlo a partir de Acetil-CoA.3 La forma como la célula censa los niveles de colesterol es a través de una familia de proteínas denominadas SREBP´s (siglas en inglés de "sterol regulatory element binding proteins"). Estas proteínas regulan a varios genes involucrados en la biosíntesis y captura del colesterol.4 y reciben su nombre por unirse a una secuencia de 10 pb (5´- ATCACCCCAC – 3´)5 denominada SRE-1 ("Sterol Regulatory Element-1") ubicada en la región 5´ promotora de los genes del receptor de LDL y

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Correspondencia y solicitud de sobretiros: Dr. Armando Tovar-Palacio, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, Departamento Fisiología de la Nutrición, Vasco de Quiroga No. 15. Col. Sección XVI. Deleg. Tlalpan. México D.F. 14000. Tel: 56553038, Fax: 56553038. Correo electrónico: [email protected].

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Regulación de las SREBPs en el síndrome nefrótico de las enzimas 3-Hidroxi-3-metilglutaril coenzima A sintasa (HMG-CoA sintasa),6 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa),7-11 farnesil difosfato sintasa6,7,10,12-14 y la escualeno sintasa.6,7,9,13,15,16 Asimismo, se ha encontrado que las SREBP´s modulan la transcripción de genes que codifican para las enzimas de la síntesis y captura de ácidos grasos, como la acetil CoA carboxilasa,7,9,15,16 la sintasa de ácidos grasos,8-10,15-19 la estearoil CoA desaturasa17,9,14,16 y la lipoproteína lipasa9,20-23 así como los genes de los receptores de HDL (High density lipoprotein),24 del receptor de activadores de la proliferación de peroxisomas (PPAR-[] 1 y 3), la proteína microsomal de transferencia de triglicéridos,7,25 la ATP-citrato liasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la 6fosfogluconato deshidrogenasa y la enzima málica. Se han identificado tres familias de SREBP´s ( SREBP-1a, SREBP-1c y SREBP-2).5,26 Las SREBP´s tienen un peso molecular de 125 kD5,26,27 y están localizadas en el retículo endoplásmico con los extremos NH2 y COOH terminales orientados hacia el citoplasma y el pequeño fragmento intermedio orientado hacia el lumen de este organelo.28,29 El dominio NH2- terminal de las SREBP´s, es un factor transcripcional con un peso molecular de 65 kD5,5,26,27 que pertenece a la familia de los factores transcripcionales "basichelix-loop-helix-leucine zipper" (bHLH-Zip). La forma en que el dominio NH2 terminal es liberado del retículo endoplásmico para posteriormente entrar al núcleo celular es a través de dos pasos proteolíticos, uno de ellos regulado por esteroles27,30,31 que son catalizados por las proteasas denominadas SP1 y SP2. Fisiológicamente, se cree que de manera general, aunque no exclusiva,9 las formas SREBP-1 están involucradas en la activación de los genes de las enzimas que regulan la síntesis de ácidos grasos mientras que la forma SREBP-2 está relacionada más bien con los genes de las enzimas de la vía de síntesis del colesterol.7,8,14 Las dietas ricas en colesterol, tan comunes en el Mundo Occidental provocan graves daños en la salud del individuo. Asimismo se ha encontrado que la administración de dietas basadas en proteína de origen animal tales como la caseína, aumentan los niveles de colesterol en sangre provocando problemas de aterosclerosis en animales de experimentación. Por otra parte, es bien conocido el hecho de que una alimentación basada en proteínas vegetales disminuye en gran medida los niveles de colesterol de los individuos.32 La soya es la proteína vegetal más utilizada para estos fines32-35 se ha reportado que el consumo de soya en animales experimentales reduce los niveles de colesterol total36 de LDL, de VLDL y de apo B,37 así como de HDL e IDL.38 No se conocen bien los mecanismos por los cuales la proteína de soya modifica los niveles de colesterol, y tampoco se sabe si regulan a las SREBPs. Existen patologías en las que se observa un aumento en las concentraciones de colesterol en sangre como es el caso del síndrome nefrótico. La sintomatología de este padecimiento se caracteriza por la coexistencia de proteinuria, hipoproteinemia, hiperlipidemia e hipercoagulabilidad.39 En lo referente al metabolismo de lípidos, el síndrome nefrótico se caracteriza por la elevación de la concentración plasmática del colesterol total, aunque también se registran valores altos de triglicéridos; asimismo, las IDL, las LDL y las VLDL aumentan y están además enriquecidas de ésteres de colesterol.40

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Anteriormente se recomendaba para el tratamiento de pacientes con síndrome nefrótico el consumo de dietas ricas en proteína para compensar la pérdida de estas macromoléculas a través de la orina; sin embargo en los últimos años se ha fomentado el uso de dietas con bajo contenido proteico, pues se ha encontrado que altas concentraciones de proteína dietaria aumentan la tasa de filtración de los riñones y se acelera entonces la pérdida de proteínas, así como su catabolismo.41 El tipo de proteína utilizada en estas dietas ha sido normalmente de origen animal, pero en la última década se ha sugerido el consumo de proteína vegetal como una alternativa para los pacientes con trastornos renales.41-43 Estudios realizados recientemente en nuestro laboratorio muestran que la alimentación de ratas con proteína de soya permite un desarrollo y un crecimiento similar al de ratas alimentadas con caseína, lo que demuestra que el consumo de proteína vegetal a concentraciones adecuadas llena los requerimientos nutricionales de estos animales, con la ventaja de que la dieta basada en proteína de soya reduce significativamente los niveles de colesterol plasmático.44 Por lo que el objetivo del presente estudio fue el de conocer si el mecanismo molecular por medio del cual la soya reduce los niveles de colesterol y triglicéridos en el modelo del síndrome nefrótico experimental en ratas es a través de la regulación de la expresión de los factores transcripcionales SREBPs. pdf elaborado en medigraphic

Materiales y métodos

Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar de entre 100 y 120 gramos de peso al inicio del experimento, que duró 64 días. La inducción del síndrome nefrótico crónico se llevó a cabo por la administración subcutánea del aminonucleósido de puromicina (ANP) en los días 0, 14, 28 y 42 en dosis de 50, 40, 40 y 25 mg/kg de peso respectivamente. Los animales fueron divididos en los siguientes grupos experimentales de 12 individuos cada uno: 1) Grupo Control + caseína: Ratas normales alimentadas con una dieta con 20 % de caseína tratadas con inyecciones subcutáneas de solución salina. 2.) Grupo Síndrome Nefrótico + caseína: Ratas con síndrome nefrótico inducido con ANP alimentadas con una dieta con 20 % de caseína. 3) Grupo Control + soya: Ratas normales alimentadas con dieta con 20 % de soya tratadas con inyecciones subcutáneas de solución salina. 4) Grupo Síndrome Nefrótico + soya: Ratas con síndrome nefrótico inducido con ANP alimentadas con una dieta con 20 % de soya. Los animales estuvieron en condiciones de bioterio bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 por 12 horas en jaulas individuales con libre acceso al agua y al alimento. La medición del peso de los animales se realizó tres veces por semana y el consumo de alimento dos veces por semana. A los 7, 21, 35 y 63 días se hicieron determinaciones de colesterol y triglicéridos en suero y de proteínas urinarias. El colesterol y los triglicéridos séricos se determinaron por métodos enzimáticos colorimétricos y las proteínas urinarias por el método de Lowry modificado. Los animales se sacrificaron en el día 64 del experimento por decapitación. Se analizó el contenido de colesterol y de triglicéridos en hígado de acuerdo al método de Folch.

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Tovar A, y cols. Se realizaron ensayos de Northern Blot para determinar la concentración de ARNm en hígado de la HMG-CoA reductasa, de la HMG-CoA sintasa, del receptor LDL, de la enzima málica y de la sintasa de ácidos grasos, así como de la SREBP-1 por el método de Chomzynski. 15 mg de ARN se separaron electroforéticamente en gel de agarosa al 1%. El ARN fue transferido a una membrana de nylon (Hybon N+). Las sondas de ADNc necesarias se prepararon por medio de la transcripción reversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y de PCR, a partir de primers obtenidos por medio del programa computacional Oligo 5.0 y basándose en las secuencias reportadas en el GenBank para los genes estudiados. Las sondas fueron marcadas radiactivamente con P32 (Fósforo 32) con ayuda del Kit RedyPrime de Amersham Pharmacia Biotech. La cantidad de cpm (cuentas por minuto) y la digitalización de las bandas se realizó mediante el uso del Instant Imager de Packard. Por otra parte se realizaron ensayos de Western Blot para las proteínas SREBP-1 y 2, en los que se utilizaron anticuerpos contra éstas provenientes de hibridomas. Hibridomas de ATCC (American Type Culture Collection) anti-SREBP-1 (CRL-2121) e hibridoma anti-SREBP-2 (CRL-2128). Se aislaron previamente los núcleos por centrifugación diferencial en gradiente de sacarosa. Se homogeneizaron 4 gramos de hígado en buffer de lisis (Sacarosa 0.3 M, ditiotrietol 5 mM, MgCl2 5 mM, Tris/HCl 10 mM, pH 5 y tritón 100X al 0.05%), se filtró y centrifugó a 2500 r.p.m. por 10 minutos a 4oC. El botón se resuspendió en buffer con sacarosa 2.3 M, MgCl2 2 mM y pdf elaborado medigraphic Tris/HCl 10 mM, pHen7.5, se depositó en un tubo Quick Seal con el mismo buffer y se centrifugó a 33,5000 r.p.m. por 45 minutos a 4oC. El botón fue resuspendido en 500 ml de buffer de almacenamiento (Glicerol 50%, MgCl2 2 mM, EDTA 0.1 mM y HEPES 50 mM, pH 7.5). Se utilizó en todos los pasos una mezcla inhibidora de proteasas (EDTA, EGTA, Benzamidina, DTT, Pepstatina A y Leupeptina). Se determinó la concentración de proteína del extracto nuclear por el método de Lowry y 20 mg se sometieron a una electroforesis discontinua en geles de poliacrilamida al 8 %, en presencia de SDS al 1% y DTT 0.2 M. Las proteínas fueron electrotransferidas a membranas de PVDF. Las membranas fueron bloqueadas durante 2 horas-toda la noche con leche descremada al 3-5 %; se usaron los anticuerpos anti-SREBP-1 y anti-SREBP-2 por 1.5 horas-toda la noche y se reveló la reacción a través de la oxidación de luminol con el Kit ECL de Amersham Pharmacia Biotech que utiliza un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano.

Resultados Ingesta de alimento y ganancia de peso Las ratas controles alimentadas con dieta de proteína de soya o caseína consumieron cantidades similares de alimento durante los 64 días del estudio (Figura 1). La inducción del síndrome nefrótico con el aminonucleósido de puromicina no cambió el patrón de ingesta de alimento observado en las ratas controles, excepto en los días 28 a 35, donde las ratas nefróticas mostraron una reducción significativa en la ingesta de alimento (p