Profesor Patrocinante Dra. María Paz Marzolo Depto. de Biología Celular y Molecular Facultad de Ciencias Biológicas Pontificia Universidad Católica de Chile

Profesor Co-Patrocinante Dr. Carlos B. González Instituto de Fisiología Facultad de Medicina

SEÑALIZACIÓN Y TRÁFICO DEL RECEPTOR GPBAR1 EN CÉLULAS EPITELIALES POLARIZADAS DE VESÍCULA BILIAR.

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico

STEFANIE ELISABETH TEUBER VOLKE VALDIVIA – CHILE 2013

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, me gustaría agradecer a mi profesora patrocinante Dra. María Paz Marzolo por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio y por el constante apoyo entregado durante la realización de la tesis. De igual manera, a mi profesor co-patrocinante Dr. Carlos B. González por permitirme trabajar en su laboratorio y por la confianza entregada. Agradecer también al Dr. José Sarmiento por las sugerencias brindadas. Un agradecimiento especial para Pamela Carmona que me ayudó muchísimo al principio de mi tesis y a Felipe Cabezas por la ayuda brindada en Santiago. Así como también a Carolina, Marianne, Alexis, Pamela Veloso, Daniela, César, Juan, Pamela Farfán, María Luisa, Jorge, Joaquín, Catalina y Lisette por su paciencia y amabilidad. Por último, quisiera agradecer a mi familia, en especial a mi madre Elisabeth, y a mi pareja, Andrés Rivera, por su apoyo incondicional.

Esta tesis fue realizada en el Instituto de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Austral de Chile y en el departamento de Biología Celular y Molecular de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile, financiado por el proyecto Fondecyt 1070373.

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ÍNDICE DE CONTENIDOS 1. RESUMEN ................................................................................................................................. 1 1.1 ABSTRACT........................................................................................................................... 2 2. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 3 3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 13 3.1 MATERIALES .................................................................................................................... 13 3.1.1 Material biológico ......................................................................................................... 13 3.1.2 Reactivos químicos ....................................................................................................... 13 3.1.3 Equipos .......................................................................................................................... 15 3.1.4 Programas ...................................................................................................................... 16 3.1.5 Anticuerpos ................................................................................................................... 17 3.2 MÉTODOS .......................................................................................................................... 18 3.2.1 Generación del plásmido pcDNA3.1/hygro(+)-Gpbar1EGFP mediante subclonación. 18 3.2.1.1 Transformación de células competentes DH5α. ..................................................... 18 3.2.1.2 Extracción y purificación del DNA plasmidial a escala pequeña o miniprep. ....... 18 3.2.1.3 Electroforesis en gel de agarosa. ............................................................................ 20 3.2.1.4 Sistema de purificación de DNA plasmidial a escala mediana o midiprep. ........... 20 3.2.1.5 Purificación de los productos de la miniprep en gel de agarosa. ............................ 21 3.2.1.6 Cuantificación de DNA. ......................................................................................... 21 3.2.1.7 Ligación .................................................................................................................. 22

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3.2.2 Expresión y detección de las células establemente transfectadas con la construcción que codifica para la proteína de fusión hGpbar1GFP. ........................................................... 23 3.2.2.1 Cultivo de la línea celular MDCK-I. ...................................................................... 23 3.2.2.2 Cultivo de la línea celular DGBEC. ....................................................................... 23 3.2.2.3 Propagación y congelamiento celular. .................................................................... 24 3.2.2.4 Transfección de los constructos en las células epiteliales polarizadas y selección de los clones estables............................................................................................................... 24 3.2.2.5 Fluorescencia. ......................................................................................................... 26 3.2.2.6 Extracción y solubilización de proteínas totales..................................................... 27 3.2.2.7 Cuantificación de las proteínas totales. .................................................................. 27 3.2.2.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes e inmunodetección mediante Western blotting. .................................................................... 28 3.2.2.9 Ensayo de biotinilación y precipitación con SA-Sepharose beads. ........................ 29 3.2.2.10 Ensayo de AMPc. ................................................................................................. 30 3.2.2.11 Ensayo de centrifugación en gradiente de sacarosa.............................................. 31 3.2.3 Activación de ERK1/2. ................................................................................................. 32 3.2.3.1 Tratamientos con ligandos e inhibidores. ............................................................... 32 3.2.3.2 Detección del grado de fosforilación de ERK1/2. .................................................. 33

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4. RESULTADOS ........................................................................................................................ 35 4.1 Generación de las líneas celulares establemente transfectadas con la construcción que codifica para la proteína de fusión hGpbar1-GFP. .................................................................... 35 4.2 Localización del receptor hGpbar1 en las células polarizadas MDCK-I y DGBEC. .......... 39 4.3 Activación del receptor Gpbar1 por el ligando ALC e INT777. ......................................... 44 4.4 Ubicación del receptor en microdominios de la membrana plasmática. ............................. 47 4.5 Internalización del receptor Gpbar1. ................................................................................... 49 4.6 Activación de ERK1/2 inducido por ALC. .......................................................................... 56 4.6.1 Participación de diferentes proteínas en la fosforilación de ERK1/2............................ 60 5. DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 70 5.1 Localización subcelular del receptor Gpbar1. ..................................................................... 71 5.2 Activación del receptor Gpbar1. .......................................................................................... 73 5.3 Asociación de Gpbar1 a balsas lipídicas.............................................................................. 75 5.4 Internalización de Gpbar1. ................................................................................................... 76 5.5 Activación de las vía de las MAPKs inducida por agonistas de Gpbar. .............................. 77 6. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 82 7. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 83

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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Esquema de la vía clásica de señalización de los GPCRs………………………...……4

Figura 2: Vía de señalización de ERK 1/2………………………………………….……….……6

Figura 3: Subclonamiento de la proteína de fusión hGpbar1-EGFP…………………..………...36

Figura 4: Líneas celulares DGBEC y MDCK-I que expresan el receptor hGpbar1 establemente…………………………………………………………………………………..….38

Figura 5: Biotinilación de células transfectadas establemente con hGpbar1-GFP………….…..40

Figura

6:

Localización

de la proteína

de fusión

hGpbar1-GFP

por microscopía

confocal……………………………………………………………………..……………..….….41

Figura 7: Aumento de los niveles de AMPc inducido por el ligando ALC e INT777……….....45

Figura 8: Ubicación del receptor Gpbar1 en fracciones más densas de la gradiente de sacarosa………………………………………………………………………..………………….48

Figura 9: Fluorescencia de las células DGBEC-Gpbar1 y MDCKI-Gpbar1 en condiciones de confluencia……………………………………………………………………….……...……..…50

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Figura 10: Fluorescencia de las células DGBEC-Gpbar1 y MDCKI-Gpbar1 en estado no confluente……………………………………………………………………….….…………….52

Figura 11: Fluorescencia de las células DGBEC-Gpbar1GFP y MDCKI-Gpbar1GFP cultivadas en un sistema bicameral………………………………………………………………......………55

Figura 12: Efecto de ALC en la fosforilación de ERK en las células DGBEC……….…...…...57

Figura 13: Estudio cinético de la fosforilación de ERK estimulado con ALC50 µM en las células DGBEC……………………………………………………………………………...……...……59

Figura 14: Participación del receptor de factor de crecimiento epidérmico en la activación de ERK1/2………………………………………………………………………..…………....…….61

Figura 15: Participación de las metaloproteasas en la activación de ERK1/2……..…….…...…63

Figura 16: Participación de Src en la activación de ERK1/2……………………….………..….64

Figura 17: Participación de PKA en la activación de ERK1/2……………………….……...….66

Figura 18: Comparación entre el estímulo con ALC 50 µM e INT777 30 µM en las células establemente transfectadas con hGpbar1GFP…………………………………………….….….68

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Figura 19: Representación esquemática del posible mecanismo a través del cual ALC induce la fosforilación de ERK 1/2 en la cara basolateral de células polarizadas…………………….……81

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I: Resumen de los componentes utilizados para la transfección………………....….……25

Tabla II: Resumen de los inhibidores utilizados…………………………………………..…….34

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LISTA DE ABREVIATURAS AB

Ácido biliar

ADAM

Desintegrina y metaloproteasa

AC

Adenilato ciclasa

ALC

Ácido litocólico

ALCT

Ácido litocólico conjugado a taurina

AMPc

Adenosín monofosfato cíclico

AP

Apical

AP1

Complejo adaptador 1

AP2

Complejo adaptador 2

BGT

Transportador de ácido γ-aminobutírico

BL

Basolateral

CAR

Receptor constitutivo de androstano

CHO

Células de ovario de hámster chino

D2

Yodotironina deyodinasa tipo II

DGBEC

Células epiteliales de vesícula biliar de perro

EGF

Factor de crecimiento epidérmico

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EGFP

Proteína verde fluorescente potenciada

EGFR

Receptor del factor de crecimiento epidérmico

ERK (1/2)

Quinasa regulada por señal extracelular (1 y 2)

pERK/fosfo-ERK

Quinasa regulada por señal extracelular fosforilada

FXR

Receptor X fernesoide

GFP

Proteína verde fluorescente

GLP-1

Péptido similar al glucagón tipo 1

(h)GPBAR1/TGR5

Receptor de ácidos biliares acoplado a proteína G (humano)

GPCR

Receptor acoplado a proteína G

GSK

Quinasa de receptores acoplados a proteína G

H69

Células de colangiocito humano

HEK293

Células de riñón de embrión humano 293

INT777

6α-Ethyl-23(S)-methylcholic Acid

MAPK

Proteína quinasa activada por mitógenos

MDCK-I

Células de riñón canino Madin-Darby I

MMP

Metaloproteasas de la matriz extracelular

PAR2

Receptor activado por proteasa 2

x

PKA

Proteína quinasa dependiente de AMPc

PKC

Proteína quinasa C

PXR

Receptor X de pregnano

SBF

Suero bovino fetal

RGS

Proteína reguladora de la señalización de la proteína G

SDS-PAGE

Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes

Src

Proteína quinasa perteneciente a la familia Src

T3

Triyodotironina

T4

Tiroxina

TER

Resistencia eléctrica transepitelial

V2

Receptor de vasopresina 2

VDR

Receptor de vitamina D

WT

Wild type o nativa

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1. RESUMEN Recientemente, se ha encontrado un nuevo receptor acoplado a proteína G (GPCR), el cual responde a ácidos biliares llamado Gpbar o TGR5. La estimulación de este receptor activa la proteína Gαs y la producción del segundo mensajero AMPc. Gpbar se ha visto involucrado en una serie de patologías, tales como; litiasis biliar, aterosclerosis, pancreatitis aguda y es un importante regulador del metabolismo energético corporal. En esta tesis se estudió la distribución de Gpbar1 humano fusionado a GFP en células polarizadas en presencia o no de sus ligandos, ácido litocólico (ALC) o INT777, mediante técnicas de microscopía y biotinilación selectiva. En relación a la función de Gpbar, se estudió parte de la cascada de señalización de las ERKs inducida por ALC en células epiteliales de vesícula biliar de perro (DGBEC) usando inhibidores de proteínas involucradas en esta vía. La proteína de fusión, establemente transfectada en las células DGBEC y en células epiteliales de túbulo distal renal (MDCK), se distribuyó en la membrana basolateral y en presencia de ligando no fue endocitada. Además, se demostró que el receptor Gpbar1 no está asociado a cavéolas, al no presentarse en las mismas fracciones que caveolina-1 posterior a un fraccionamiento en gradiente de sacarosa. Por otra parte, se demostró que Gpbar1 es capaz de activar ERK 1 y 2 a través de la transactivación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), dado que la fosforilación de ERK inducida por ALC fue inhibida por el inhibidor de EGFR, AG1478. Las metaloproteasas (MMP) y quinasas de la familia Src (Src) también están involucradas, a lo menos parcialmente, en la activación de ERK 1/2, ya que fueron inhibidas por GM6001 y PP1, respectivamente. En conclusión, se caracterizó parte de la distribución de Gpbar1 en células polarizadas. A pesar de no ser endocitado, el receptor es capaz de activar las ERKs. Esto ocurre mediante la transactivación autocrina de EGFR, donde MMP y Src estarían involucradas.

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1.1 ABSTRACT Recently, it has been found a new G protein coupled receptor (GPCR), which responds to bile acids called Gpbar or TGR5. The receptor stimulation activates Gαs protein and the production of the second messenger cAMP. Gpbar has been involved in a number of pathologies such as biliary lithiasis, atherosclerosis, acute pancreatitis and it is an important regulator of energy metabolism. In this thesis, we studied the distribution of GFP-tagged human Gpbar1 in polarized cells in the presence or absence of the ligand lithocholic acid (ALC) or INT777 by microscopy and selective biotinylation. In terms of Gpbar function, it was studied part of the ERK signaling cascade induced by ALC in canine gallbladder epithelial cells (DGBEC). For this, immunodetections were performed by Western blotting from cells stimulated with ALC and using specific inhibitors of proteins involved in this pathway. The fusion protein, stably transfected in kidney epithelial cell of the distal tubule (MDCK) and DGBEC cells, showed basolateral distribution and was not endocytosed in the presence of ligand. Also, Gpbar1 receptor is not associated with caveolae, because it was not fractioned together with caveolin-1 in sucrose gradient ultracentrifugation. Moreover, Gpbar1 receptor was able to activate ERK 1 and 2 by transactivation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), because ALC-induced ERK phosphorylation was inhibited by the inhibitor of EGFR, AG1478. Metalloproteinases (MMP) and Src family kinases (Src) are also involved, at least partially, on the ERK 1/2 phosphorylation since they were inhibited by GM6001 and PP1, respectively. In conclusion, part of Gpbar1 distribution was characterized in polarized cells. Despite not being endocytosed, the receptor is capable of activating MAPK. This happens by autocrine transactivation of EGFR, where Src and MMP would be involved.

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2. INTRODUCCIÓN Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son proteínas con 7 dominios de transmembrana (TM), los cuales están asociados a proteínas de unión al nucleótido de guanina (proteína G) heterotriméricas (Gα, Gβ y Gγ). Estos receptores pertenecen a la familia de proteínas de TM más numerosa en vertebrados y se clasifican, según la similitud de la secuencia, en 3 subfamilias (A, B y C) (Bridges y Lindsley, 2008). En la vía clásica de señalización de los GPCRs, estos se unen a sus ligandos y sufren un cambio conformacional. Este cambio aumenta la afinidad del receptor por las proteínas G, el cual actúa como factor de intercambio de nucleótido de guanina para la proteína Gα (liberación de GDP y unión a GTP). La proteína Gα activada se disocia del receptor y de las proteínasβγG y es capaz de asociarse a efectores para modular diferentes respuestas celulares. Algunos efectores modulados por los diferentes subtipos de Gα son; adenilato ciclasa (AC) por Gαs y Gαi, RhoGEF por Gα12/13 y fosfolipasa C (PLC) por Gαq. Además, las proteínas Gβ y Gγ se unen y regulan otras prote ínas como canales iónicos y PLCβ. Por otro lado, el receptor es fosforilado por quinasas de GPCRs (GRKs), disminuyendo la afinidad por las proteínas G y aumentando la afinidad por proteínas adaptadoras conocidas como arrestinas. Una vez que el GPCR interactúa con las arrestinas se termina la vía de señalización mediada por proteínas G y comienza la vía mediada por arrestinas. Éstas son capaces de unirse a una serie de proteínas señalizadoras formando complejos de señalización, además de mediar la internalización del receptor al facilitar la unión de éste a invaginaciones revestidas con clatrina, una de las vías de endocitosis más utilizada por los GPCRs. La internalización del receptor regula la desensibilización y resensibilización de éste. Finalmente, el receptor puede ser degradado en el lisosoma o puede ser reciclado (Figura 1). En este último caso, el receptor es transportado primero al endosoma temprano, luego al endosoma de reciclamiento y, por último, a la membrana

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Figura 1. Esquema de la vía clásica de señalización de los GPCRs. Al ser activado el receptor por el ligando, éste intercambia GDP por GTP de la proteína Gα. Esto produce la disociación de las proteínas Gαβγ y la modulaci ón de efectores. El receptor es fosforilado por quinasas de GPCRs (GRKs) permitiendo la unión de β-arrestina, la cual actúa como proteína de andamiaje. A ella se une la proteína adaptadora AP2 y clatrina. Ambas son cruciales para la endocitosis mediada por invaginaciones revestidas en clatrina. Además, se unen otras proteínas que van a mediar cascadas de señalización para producir una respuesta celular. Finalmente, el GPCR es degradado o reciclado.

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plasmática (Pierce et al., 2002). Una de las vías de señalización, mediada por arrestinas, más descritas es la activación de la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) (Ritter y Hall, 2009). Ésta corresponde a una cascada de 3 quinasas. Primero, la quinasa de la quinasa de la quinasa activada por mitógenos (MAPKKK) fosforila a la quinasa de la quinasa activada por mitógenos (MAPKK). Al activarse MAPKK, va a fosforilar a la quinasa activada por mitógenos (MAPK). Las familias más estudiadas son; las quinasas reguladas por señal extracelular (ERK 1 y 2), p38 y las quinasas N-terminal c-Jun (JNK 1-3). Estas enzimas son capaces de responder a una gran variedad de estímulos para producir una respuesta celular específica. Esta respuesta depende la cinética de activación e inactivación, de la localización subcelular de las enzimas, los complejos en los que actúan y la disponibilidad de los sustratos. En la Figura 2 se muestra la cascada de señalización de la familia ERK 1/2. El estímulo, proveniente del medio extracelular, se manifiesta en la unión de un ligando a su receptor. Este receptor puede pertenecer a los GPCRs u otras familias de receptores. La activación del receptor lleva a la fosforilación de las isoformas de Raf (MAPKKK). Éstas son las que más frecuentemente y selectivamente activan ERK1/2. Al ser activada Raf, ésta va a fosforilar a MEK 1 y 2 (MAPKK). Por último, las proteínas activadas MEK 1/2 van a fosforilar a ERK 1/2 (MAPK). La activación de ERK 1/2 se ha visto involucrada en una serie de respuestas celulares, tales como; movilidad, proliferación, diferenciación y supervivencia celular (Raman et al., 2007). Los GPCRs representan casi la mitad del mercado actual de agentes terapéuticos, convirtiéndolos en el foco de investigaciones biomédicas y programas para el descubrimiento de nuevas drogas (Bridges y Lindsley, 2008). Mediante la búsqueda en la base de datos de GenBankTM con DNAs complementarios (cDNAs) de bazo humano, se encontró una secuencia codificante de DNA genómico (AC021016) para un nuevo GPCR (Maruyama et al., 2002).

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Estímulo

Factores de crecimiento

Receptor

EGFR

MAPKKK

Raf 1, ARaf, B-Raf y C-Raf

MAPKK

MEK 1 y 2

MAPK

ERK 1 y 2

Respuesta celular

Movilidad, proliferación, diferenciación y supervivencia celular

Figura 2. Vía de señalización de ERK 1/2. El estímulo, mediado por un receptor (por ejemplo, EGFR), va a activar la cascada de las quinasas. Primero, la quinasa de la quinasa de la quinasa activada por mitógenos o MAPKKK va a fosforilar la quinasa de la quinasa activada por mitógenos o MAPKK (MEK 1 y 2). Ésta a su vez fosforilaría a la quinasa activada por mitógenos o MAPK (ERK 1 y 2). La activación de las ERKs va producir una respuesta celular; movilidad, proliferación, diferenciación y supervivencia celular.

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Este receptor metabotrópico fue llamado receptor tipo membrana para ácidos biliares o M-BAR (también conocido como TGR5, Gpbar o BG37). TGR5 pertenece a la subfamilia A (o clase de receptores tipo Rodopsina) de los GPCRs y se codifica de un único exón en la posición 35 del brazo largo del cromosoma 2 en humanos. La secuencia de TGR5 es conservada entre mamíferos, teniendo el receptor Gpbar1 humano (hGpbar1) un 90% de igualdad aminoacídica con su homólogo de conejo y un 82% con su homólogo de ratón. Sin embargo, análisis filogenéticos muestran que el receptor humano es convergente con el de conejo y mono, mientras que es divergente con el de rata y ratón (Tiwari y Maiti, 2009). Gpbar1 es expresado en la membrana plasmática de las células y se internaliza en respuesta a ligandos. Estos corresponderían a varios ácidos biliares (ABs), siendo el ácido litocólico, de ahora en adelante ALC, el ligando endógeno más potente y en particular el ALC conjugado a taurina (ALCT). La potencia en orden descendente de los ligandos endógenos es; ácido litocólico, ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico y ácido cólico, los cuales de forma dependiente de la concentración inducen el aumento de adenosín monofosfato cíclico (AMPc) a través de la proteína Gα s (Kawamata et al., 2003). También se ha demostrado la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) por ABs, promoviendo la proliferación celular e inhibiendo apoptosis mediante la activación de la vía de las MAPKs (Yasuda et al., 2007), lo cual sería un mecanismo de transactivación a través de la activación de Gpbar y que podría relacionarse con cáncer (Lee y Pirdas, 1995). Una de las funciones conocidas del receptor TGR5 es la participación en la homeostasis energética mediante la vía AB-TGR5-cAMP-D2-T3. La enzima yodotironina deyodinasa tipo II (D2) es la responsable de la deyodinación de la tiroxina (T4) resultando triyodotironina (T3), la cual está implicada en el control de la termogénesis en mamíferos. Los ABs incrementan la expresión y activación de D2 y gastos

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energéticos por medio de la vía TGR5 mediada por AMPc (Watanabe et al., 2006). Al inducir la termogénesis se podría regular el gasto energético de pacientes obesos. Relacionado con la obesidad, es interesante mencionar que Gpbar1 regula también la homeostasis de glucosa mediante la liberación del péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), el cual estimula la secreción de insulina dependiente de glucosa y la inhibición de la secreción de glucagón en el páncreas. La liberación de GLP-1 mediante estimulación de TRG5 ayudaría a pacientes con diabetes tipo 2 (Katsuma et al., 2005). Así, TGR5 se convierte en un blanco prometedor para desarrollar fármacos nobles contra enfermedades metabólicas. En humanos la expresión del receptor es ubicua, pero se encuentra mayormente en placenta y bazo, y en menor grado en tejido adiposo y músculo esquelético (Kawamata et al., 2003). Su presencia también ha sido identificada en el epitelio de la vesícula biliar humana (Keitel et al., 2009), mientras que en ratones se encuentra mayoritariamente en vesícula biliar (Vassileva et al., 2006). A través de criosecciones obtenidas de vesícula biliar humana se realizaron inmunofluorescencias para determinar la localización del receptor Gpbar1, el cual resultó estar distribuido principalmente en la cara apical y una pequeña porción en la cara basolateral de las células epiteliales de vesícula biliar (Keitel et al., 2009). En esta tesis se pretende corroborar la localización apical del receptor en células polarizadas cultivadas in vitro, ya que se desconoce su distribución polarizada en este modelo. El rol del receptor TGR5 no se sabe con exactitud, pero se ha visto involucrado en la litiasis. En el laboratorio se ha demostrado que la expresión de Gpbar1 es mayor en la vesícula biliar de pacientes litiásicos que en vesículas normales a nivel de mensajeros (datos del Proyecto Fondecyt 1070373 vigente al inicio de esta tesis). Además, estudios recientes han mostrado que la delección del gen de TGR5 en ratones los protege de la formación de cálculos biliares

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(Vassileva et al., 2006) y de pancreatitis aguda biliar (Perides et al., 2010). Es relevante que la litiasis biliar es un factor de alto riesgo del cáncer de la vesícula biliar, un cáncer de alta prevalencia en Chile y de alta mortalidad (de Aretxabala et al., 1992; Lazcano-Ponce et al., 2001). Se desconoce hasta el momento la función específica de esta proteína en el epitelio de la vesícula biliar, y una primera aproximación a este problema es estudiar su tráfico polarizado y las características de la vía de señalización en este epitelio. Su sobreactivación podría, dado su papel en la activación de EGFR, relacionarse con cáncer vesicular, ya que se ha demostrado que EGFR está sobreexpresado en las células tumorales malignas (Lee y Pirdas, 1995). El epitelio de la vesícula biliar se caracteriza por estar constituido por células polarizadas. Las células polarizadas tienen dos dominios de membrana; el dominio basolateral, el cual está en contacto con la lámina basal o con células vecinas y el dominio apical, el cual está dirigido hacia el lumen. Estos dominios están separados por uniones estrechas que mantienen la asimetría de los componentes lipídicos y proteicos de la membrana. Además la distribución polarizada es mantenida rigurosamente por una serie de mecanismos como el tráfico de proteínas que está mediado por señales específicas, logrando así una entrega de la proteína al dominio correcto. Hay receptores que su ubicación en un dominio u otro de la membrana plasmática es fundamental para poder ejercer su función (Muth y Caplan, 2003). Por ejemplo, el receptor de vasopresina 2 (V2) se ubica en la cara basolateral de las células del túbulo contorneado distal y en las del túbulo colector de la nefrona humana (Sarmiento et al., 2005). Su ligando, la hormona antidiurética, es transportada por la sangre y se une al receptor V2 acoplado a proteína G, activándose una cascada de señalización que llevará al aumento de aquaporinas en la membrana apical de estas células resultando en un aumento de la reabsorción de agua (Robben et al., 2004). Por otra parte, dependiendo en que dominio se encuentre el receptor, las vías de señalización también pueden

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diferir. El receptor activado por proteasa 2 (PAR2) se ubica en la cara apical y basolateral de las células epiteliales del intestino. Al ser activado en la cara basolateral del epitelio, PAR2 activa las ERK 1/2 tardíamente mediante la vía G α q/Ca+2 y β-arrestina. Por el contrario, la activación del receptor en la cara apical lleva a la activación de las ERK 1/2 y su translocación al núcleo de manera rápida y bifásica mediante la vía αq/Ca G

+2

/PKC. Esta última vía va a resultar en

expresión de genes y proliferación, mientras que la vía dependiente deβ -arrestina está asociada a reorganización de actina y quimiotaxis (Lau et al., 2011). Llama la atención que Gpbar1 esté en la cara apical del epitelio vesicular, en contacto con altas concentraciones de sus ligandos, lo cual podría resultar en un estado de desensibilización. También se ha visto que varios de los receptores acoplados a proteína G pueden estar asociados a balsas lipídicas o cavéolas (de Weerd y Leeb-Lundberg, 1997; Manes et al., 1999; Fujita et al., 2001). Las balsas lipídicas corresponden a dominios de membrana enriquecidos en colesterol y glicoesfingolípidos, que resultan en regiones de alto orden y menor fluidez comparado con el resto de la membrana más desordenada (enriquecida con fosfolípidos) (Insel et al., 2005). Además, estos dominios se caracterizan por ser insolubles en detergentes no iónicos a bajas temperaturas, en las cuales forman complejos ricos en glicoesfingolípidos que flotan a baja densidad durante una centrifugación en gradiente (Brown y Rose, 1992). Las cavéolas, al igual que las balsas lipídicas, son dominios ricos en colesterol y glicoesfingolípidos, pero además contienen caveolina. Debido a esto, las cavéolas son consideradas como una subfamilia no plana de balsas lipídicas. Algunas de las funciones celulares en las que están involucradas las balsas lipídicas y cavéolas son homeostasis del colesterol, destinación de proteínas y lípidos intracelulares, establecimiento de la polaridad celular, trancitosis, endocitosis y en la transducción de señales (Chini y Parenti, 2004). La asociación de los GPCRs con balsas lipídicas

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o cavéolas puede ser modulada por la presencia de ligando y podría tener un papel en el tráfico endocítico, vías de señalización y/o vías de degradación de estos receptores (Insel et al., 2005). Este aspecto se desconoce en relación con Gpbar1. En este estudio se pretende estudiar el tráfico polarizado del receptor Gpbar1 y las vías de señalización implicadas, en especial la vía de las ERKs, en células derivadas de epitelio de vesícula biliar de perro denominadas DGBEC y también en células polarizadas obtenidas de riñón llamadas MDCK-I.

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HIPÓTESIS

Hipótesis 1: El receptor Gpbar1 se localiza apicalmente en células polarizadas cultivadas in vitro y se asocia a dominios de membrana ricos en colesterol y glicoesfingolípidos al unirse a su ligando.

Hipótesis 2: La unión a ligando gatilla la internalización de Gpbar1 y, posteriormente, activa la vía de las ERKs en células polarizadas.

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la distribución polarizada, asociación a dominios de membrana, la internalización de Gpbar1 y las vías de señalización activadas por la unión de ligandos en células epiteliales de vesícula biliar con fenotipo polarizado.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

•

Precisar la localización y el tráfico del receptor en células DGBEC transfectadas con Gpbar1-GFP en respuesta a su ligando.

•

Ver la presencia del receptor en microdominios ricos en colesterol de la membrana plasmática de las células transfectadas establemente.

•

Determinar la activación de la vía de las ERKs por ABs en células DGBEC.

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3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MATERIALES 3.1.1 Material biológico Las células DGBEC fueron obtenidas del Dr. Sum P. Lee (Erranz et al., 2004) y las células MDCK-I fueron adquiridas de ATCC.

3.1.2 Reactivos químicos Los reactivos utilizados en esta tesis fueron adquiridos en las siguientes empresas:

BD Bioscience Clontech: pcDNA 3.1/hygro(+). Biontex: Metafectene® Pro. Bio-Rad Laboratories, Inc.: Ensayo de medición de proteínas (Bio-Rad Dc Protein assay), tween-20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), membrana de nitrocelulosa (0.2 µm). CalbioChem®: Forskolina, inhibidor de la actividad tirosina quinasa del receptor EGFR, tirfostina AG1478 (4-[3-cloroanilinio]-6,7-dimetoxiquinazolina); inhibidor de la actividad tirosina quinasa de la familia de las proteínas Src, PP1 (4-amino-5-(4-metilfenil)-7-(t-butil) pirazolo

[3,4-d]

pirimidina);

inhibidor

de

metaloproteasas,

hidroxamidocarbonilmetil-4-metilpentanoil]-L-triptofano diclorhidrato pepstatina A.

o

H-89

metilamida);

GM6001 Inhibidor

(N-[(2R)-2de

PKA,

(N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide),

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Diagnostic Biosystems: Flouromount. Fisher Scientific: Ácido tricloroacético, fosfato de potasio monobásico (KH2PO4). GibcoTM: Colorante Tripan blue, geneticina (G418), L-glutamina, medio mínimo esencial (MEM), medio Eagle modificado por Dulbecco con baja concentración de glucosa (DMEM LG), solución de aminoácidos no esenciales MEM 100x, solución de vitaminas MEM 100x, antibiótico antimicótico 100x (Penicilina G sódica 10.000 U, Sulfato de Estreptomicina 10.000 µg y Anfotericina B 25 µg/mL). Intercept Pharmaceuticals: INT777 (6α-Ethyl-23(S)-methylcholic Acid). Invitrogen: Agarosa, bromuro de etidio, células competentes DH5,cianol de xileno, enzimas de restricción; NotI (10U/uL), NheI (10U/uL), KpnI (10U/uL) y BgLII (10U/uL), glicerol, glicina, higromicina B, marcador tamaño molecular 1 Kb DNA Ladder y 100 pb DNA Ladder, tampón endonucleasa (reactivo 3 y 4), triptona. InvivoGen: PlasmocinTM. Merck: 1-butanol, ácido acético glacial, ácido clorhídrico (HCl), aceite de inmersión, cloruro de magnesio (MgCl2), cloruro de calcio (CaCl2), cloruro de potasio (KCl), etanol absoluto (EtOH), extracto de levadura, glucosa, hidróxido de sodio (NaOH), isopropanol, lubrol, metanol absoluto (MeOH), rojo de metilo y extracto de levadura. Promega Corporation: T4 DNA ligasa y su tampón, acrilamida, bis-acrilamida, dodecilsulfato de sodio (SDS), 2,4 ditiotreitol (DTT), cloruro de sodio (NaCl), tris-base y el Kit Wizard Plus para purificación de DNA plasmidial a mediana escala. Pierce: Biotina, placas autoradiográficas, SA-sepharose beads.

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Qiagen Inc.: Sistema de purificación de DNA Qiaex II. Sigma

Aldrich:

Ácido

etilendiamonotetraacético

4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico

(HEPES),

ácido

(EDTA), ácido etilendiaminotetraacético (EGTA), ácido litocólico

(ALC), acetato de potasio, agar, albúmina de suero Bovino (BSA), ampicilina, azida de sodio, azul de bromofenol, bicarbonato de sodio (NaHCO3), cloruro de amonio (NH4Cl), cloruro de sodio (NaCl), dimetilsulfóxido (DMSO), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), fluoruro de sodio (NaF), fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4·H2O), fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4), inhibidor de tripsina, kanamicina, leupeptina (C20H38N6O4 · 1/2H2SO4), Nonidet P40 (IGEPAL CA-630), paraformaldehído, persulfato de amonio, N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED), ortovanadato de sodio, tripsina de páncreas porcino. Thermo Scientific: SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, marcador de peso molecular preteñido para proteínas (20-120KDa). Watt’s: Leche descremada en polvo Calo. Winkler Ldta.: Tampones para calibración (pH 4.0, 7.0 y 10).

El suero bovino fetal fue adquirido en Frigorífico Osorno (Osorno, X región, Chile) y se esterilizó por filtración e inactivó (56°C por 30 min.) en el laboratorio.

3.1.3 Equipos Agitador magnético Cole Palmer (Mod. 4658. Stirrer/Hot plate), agitador ProBlot™ Rocker 25 con plataforma simple (Labnet International Inc.), balanza analítica Sartorius (LA230S), balanza electrónica Shimadzu (321-33557), baño termorregulado Memmert, baño

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termorregulado modelo PY4 (Science/Electronics Inc.), cámara Neubauer (BOECO Blood Counting Chambers), bomba de vacío Meduak, cámara de flujo laminar Nuaire 8 (clase II tipo A), centrífuga clínica International Equipment (Mod. CL) (Biofuge A), centrífuga Eppendorf refrigerada 5415 R, centrifuga Kubota (8KR-20000T), cámara fotográfica digital Kodak, cámaras de electroforesis y transferencia de proteínas Bio Rad (Mini-PROTEAN 3), cámara para electroforesis de DNA Lifetechnologies (Horizon 58), espectrofotómetro Shimadzu (UV-15002), estufa de cultivo con CO2 Forma Scienific (Water Jackedted Incubator), freezer a -86 °C ULT (ultra low temperature) (DW-86L288), fuente de poder Bio-Rad Power Pac-200, iluminador UV Vilber-Lourmat, lámpara UV Camag (Type TL900/U), lector de placas ELISA Multiskan Thermo Labsystem, micropipetas Gilson (Pipetman P2, P20, P200 y P1000), microscopio óptico invertido Nikon-TMS, microscopio de epifluorescencia Leica DM 2000, cámara digital Leica DFC 300 FX, microscopio confocal “Olympus FLUOVIEW 1000”, mini centrífuga Heathrow Scientific Sprout®, pHmetro WTW (pH521), pipetiador automático Fast Pette TM, refractómetro Leica, sonicador (Cole Parmer Ultrasonic Homogenizer Power Supply 4710 Series), ultracetrífuga Sorvall WX Floor y su rotor AH 650, vortex (Vortex MIXER VX-200, Labnet International Inc.), voltímetro y electrodos EVOM epitelial Voltohmmeter (Word Precision Instruments, Inc., FL, USA), autoclave ORSA y estufa de secado de material plástico ORSA.

3.1.4 Programas Se utilizó el programa ImageJ para la cuantificación de las bandas de los geles de poliacrilamida y para el procesamniento de las imágenes de fluorescencia. Las imágenes de fluorescencia fueron obtenidas con el programa Leica IM50. La cuantificación de las bandas en geles de agarosa fue realizada mediante el programa UN-SCAN-IT gel versión 4.1

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(SilkScientific, Inc., Orem, UT, USA). Se utilizó el programa SigmaPlot v11.0 para graficar y realizar el análisis estadístico.

3.1.5 Anticuerpos Cell Signaling: anti-p44/42 MAPK (ERK1/2), anti-fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2). Jackson InmunoResearch Lab.: anti-conejo y anti-ratón conjugados a peroxidasa de rábano (HRP). Chemicon: anti-conejo (HRP), anti-ratón (HRP). Molecular Probes: anti-GFP. BS Transduction Lab.: anti-E-caderina, anti-p44/42 MAPK (ERK1/2). Santa Cruz: anti-caveolina-1, anti-fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2). Pierce: Hoechst 33342.

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3.2 MÉTODOS 3.2.1 Generación del plásmido pcDNA3.1/hygro(+)-Gpbar1EGFP mediante subclonación. 3.2.1.1 Transformación de células competentes DH5α. Una vez descongeladas las células, a un volumen de 50 µL se agregó 1 µL (30 ng de DNA aproximadamente) del DNA de interés. Se mezcló suavemente e incubó por 30 minutos. Luego se sometió la mezcla a un shock térmico (45°C) por 90 segundos y se incubó por 3 minutos en hielo. Se agregó 950 µl de medio LB (triptona10 g/L, extracto de levadura 5 g/L y NaCl 10 g/L) a lo anterior y se agitó por 90 minutos a 37°C. Luego se centrifugó por 5 minutos a 6.000 r.p.m. y se eliminó el sobrenadante. Se resuspendió el pellet en 100 µL de medio LB, se mezcló y sembró en placas Petri que contenían agar LB (15 g/L de medio LB) con kanamicina a 20 µg/mL o ampicilina 50 µg/mL (para pEGFP-N1-Gpbar1 y pcDNA3.1/hygro(+), respectivamente). Se incubó a 37°C por 16 horas.

3.2.1.2 Extracción y purificación del DNA plasmidial a escala pequeña o miniprep. Se eligieron 3 colonias únicas de cada placa (una placa que contenía colonias transformadas con el plásmido pEGFP-N1-Gpbar1 y otra con el vector pcDNA3.1/hygro(+)) y se inocularon cada una en 3 mL de medio LB con kanamicina a 20 µg/mL o ampicilina 50 µg/mL, respectivamente. Se dejó agitando por toda la noche (15 horas aproximadamente) a 37°C. Luego se tomaron 1,5 mL de cada inóculo y se centrifugaron por 5 minutos a 5.000 r.p.m. por separado, eliminando el sobrenadante al finalizar la centrifugación. Cada pellet se lavó con 500 µL de STE (Tris-HCl 10 nM, NaCl 0,1 M y EDTA 1 mM) pH 8,0, se agitó fuertemente y se centrifugó a 12.000 r.p.m. a 4°C por 2 minutos. Luego se eliminó el sobrenadante y cada pellet se resuspendió

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en 100 µL de solución de lisis alcalina I (Tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM y glucosa 50 mM) pH 8,0, agitando fuertemente. Se agregó 200 µL de lisis alcalina II (NaOH 0,2 N y SDS 1%) preparada en el momento, se mezcló por inversión y se incubó por 2 minutos cada inóculo. Se agregaron 150 µL de la solución alcalina III (KAc 5 M y ácido acético glacial al 11,55%) a cada tubo Eppendorf, se mezcló por inversión y se incubó por 5 minutos. Al terminar la centrifugación (por 5 minutos a 12.000 r.p.m. y a 4°C) se transfirió el sobrenadante, se agregaron 2 volúmenes de etanol al 100% frío y se mezcló fuertemente. Se sometió a cada tubo a una nueva centrifugación por 30 minutos a 4°C a 12.000 r.p.m. Los sobrenadantes fueron eliminados y se lavaron los precipitados con 1 mL de etanol al 70%. Luego se mezclaron y fueron centrifugados por 2 minutos a 12.000 r.p.m. a 4°C, para posteriormente eliminar el sobrenadante y secar los precipitados por inversión entre 10 a 15 minutos a temperatura ambiente con los tubos destapados. Finalmente, se resuspendieron en 50 µL de agua ultrapura conteniendo RNAsa (20 µg/mL) libre de DNAsa. Para la corroboración de la presencia del DNA de interés se realizaron digestiones con enzimas de restricción. Una alícuota (3 µL) del DNA de los inóculos de la placa transformada con pEGFP-N1-Gpbar1 se digirieron primero con la enzima de restricción KpnI (5 U) durante 2 horas a 37°C y luego los 15 µL de la reacción anterior fueron digeridos con la enzima BgLII (10U) durante 2 horas a 37°C. Mientras que una alícuota (3 µL) del DNA correspondiente al vector pcDNA3.1/hygro(+) se linearizaron con la enzima de restricción NheI (5 U) durante 2 horas a 37°C. De cada digestión se obtuvo una alícuota de 5 µL y éstas se resolvieron en un gel de agarosa al 1%.

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3.2.1.3 Electroforesis en gel de agarosa. Los geles de agarosa al 0,8% y 1% se realizaron con el tampón TAE 1X (Tris-Ac 40 mM y EDTA 1 mM) y con una concentración de 0,5 mg/mL de bromuro de etidio. Además se utilizó un tampón de carga (glicerol 30%, azul de bromofenol 0,25% y cianol de xileno 0,25%) en relación 1:6 con respecto al volumen de la muestra. El estándar utilizado fue 1 Kb Plus DNA Ladder. El tiempo de corrida fue de 30 minutos a 100 V. Finalmente, el gel fue visualizado en un transiluminador.

3.2.1.4 Sistema de purificación de DNA plasmidial a escala mediana o midiprep. Para este procedimiento se utilizó el kit comercial Wizard® Plus Midipreps DNA purification system. Después de elegir una colonia que tuviese el DNA de interés corroborado por la miniprep, se tomó 1 mL del inóculo, se agregó a 100 mL de medio LB con kanamicina (20 µg/mL) o ampicilina (50 µg/mL) y se incubó a 37°C con agitación durante toda la noche. Pasado el tiempo se centrifugó a 8.000 r.p.m. por 10 minutos a 4°C y se eliminó el sobrenadante. Se resuspendió el pellet en 3 mL de solución de resuspención celular y se trasvasijó a otro tubo centrífuga. Se agregó 3 mL de la solución de lisis celular y se mezcló por inversión 4 veces. Luego se repitió lo anterior, pero con 3 mL de la solución de neutralización. Se centrifugó a 11.000 r.p.m. a 4°C por 15 minutos y el sobrenadante se traspasó a un tubo nuevo, al cual se le agregó 10 mL de resina para purificación de DNA y se mezcló por inversión. Se conectó la columna a una cámara de vacío y se aplicó vacío hasta que el líquido pase a través de ella. Luego se lavó la columna con 15 mL de la solución de lavado dos veces y se dejó secar por 30 segundos. Se removió la columna transfiriéndola a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y se centrifugó

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por 10.000 r.p.m. por 2 minutos para eliminar residuos del lavado. Se volvió a transferir la columna a un nuevo tubo Eppendorf, se agregó 300 µL de agua ultra pura (50 – 60°C) y se incubó por 1 minuto. Finalmente, se centrifugó a 10.000 r.p.m. por 30 segundos para eluir el DNA y se cuantificó (métodos 3.2.1.6).

3.2.1.5 Purificación de los productos de la miniprep en gel de agarosa. Los productos de la midiprep (3 µg de DNA) fueron digeridos con enzimas de restricción. Primero se digirió con la enzima NheI (5 U) y luego con la enzima NotI (10 U), ambos por 2 horas y a 37°C. Los productos de la digestión se resolvieron en un gel de agarosa al 0,8% y luego se procedió a cortar las bandas del gel que eran de interés con un bisturí. Para ello se colocó el gel en el transiluminador y se realizó el corte lo más rápido posible para no generar mutaciones en el material genético por la luz ultravioleta. Los 2 cortes de gel (uno que contenía a la secuencia Gpbar1-GFP y el otro al vector pcDNA3.1/hygro(+)) se colocaron en un tubo Eppendorf y se procedió según las instrucciones del fabricante del Kit de extracción de DNA desde geles de agarosa QIAEX II (QIAGEN). Una vez obtenido el material purificado se procedió a tomar una alícuota de cada una para su cuantificación (métodos 3.2.1.6).

3.2.1.6 Cuantificación de DNA. La cuantificación de DNA se realizó mediante la medición de la absorbancia a 260 nm de las muestras diluidas en un espectrofotómetro Shimadzu UV 150-02, calculando la concentración según la relación que una unidad de absorbancia (DO) a 260 nm equivale a 50 ng/mL de DNA doble hebra (Sambroock y Russell, 2002). En el caso de los productos para la ligación, estos

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fueron digeridos con las enzimas de restricción NheI y NotI (métodos3.2.1.5) y se corrieron en un gel de agarosa al 0,8% con los estándares de masa molecular λDNA/HindIII fragments y ϕX174 RF DNA/HaeIII fragments para fragmentos sobre 1 kb y de entre 100 y 1400 pb, respectivamente. Luego de resulto el gel, se tomó una fotografía digital acoplada al transiluminador y las bandas fueron cuantificadas en el programa UN-SCAN-IT gel versión 4.1.

3.2.1.7 Ligación La ligación con T4 DNA ligasa se realizó según la razón molar 3:1 del inserto en relación con el vector y el cálculo de la cantidad se determinó según las indicaciones del fabricante (Promega). Para la reacción de ligación se utilizó la T4 DNA ligasa (1 UE/µL), el vector pcDNA3.1/hygro(+) (3,5 pM correspondientes a 40 ng), el inserto Gpbar1-GFP (10,5 pM) y el tampón 10X (2,5 µL) en un volumen total de la reacción de 25 µL. Se dejó incubar toda la noche a 4°C. El producto de la ligación fue transformado en bacterias competentes (métodos 3.2.1.1) y se realizó la miniprep (métodos 3.2.1.2) y midiprep (métodos 3.2.1.4). Posteriormente una alícuota (3 µL) se digirió con las enzimas de restricción NheI (5 U) y luego con NotI (10 U) 2 horas a 37°C (con cada enzima) y luego se corrió un gel de agarosa al 1%, para corroborar el subclonamiento.

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3.2.2 Expresión y detección de las células establemente transfectadas con la construcción que codifica para la proteína de fusión hGpbar1GFP. 3.2.2.1 Cultivo de la línea celular MDCK-I. Las células epiteliales de riñón canino Madin-Darby de tipo I (MDCK-I) fueron cultivadas en medio Eagle modificado por Dulbecco con baja concentración de glucosa (DMEM LG) suplementado con 10% de suero bovino fetal (SBF), plasmocin 0,01% y se utilizó una solución de antibiótico/antimicótico al 2X en un ambiente húmedo con CO2 al 5% y a 37°C. En el caso de las células establemente transfectadas con el receptor, éstas se cultivaron de igual manera que las células wild type (WT) aunque al medio se le incorporó el antibiótico de selección geneticina 800 µg/mL.

3.2.2.2 Cultivo de la línea celular DGBEC. Las células epiteliales de vesícula biliar de perro (DGBEC) se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% de SBF, HEPES 20 mM, solución de vitaminas MEM 1X, aminoácidos no esenciales MEM 1X, L-glutamina 2 mM, plasmocin 0,01% y se utilizó una solución de antibiótico/antimicótico al 2X en un ambiente húmedo con CO2 al 5% y a 37°C. En el caso de las células establemente transfectadas con el receptor, éstas se cultivaron de igual manera que las células WT aunque al medio se le incorporó el antibiótico de selección higromicina B 200 µg/mL.

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3.2.2.3 Propagación y congelamiento celular. Las células fueron propagadas cada 3 o 4 días utilizando tripsina (tripsina 0,25%, EDTA 1 mM en PBS pH 8,0) a 37°C. Para congelar las células de ambas líneas celulares se cultivaron hasta un 80% de confluencia y se centrifugaron por 5 minutos a 1.000 r.p.m. Se resuspendieron en un medio previamente filtrado que contenía SBF al 60%, 10% del medio respectivo (MEM para las células DGBEC y DMEM LG para las células MDCK-I) y 10% de DMSO.

3.2.2.4 Transfección de los constructos en las células epiteliales polarizadas y selección de los clones estables. Las células DGBEC y MDCK-I fueron sembradas en placas de 10 cm. Cuando éstas alcanzaron la confluencia se les cambió el medio (9,4 mL) y se les adicionó la mezcla de 20 µL de metafectene pro, 10 µg del DNA plasmidial y medio sin SBF hasta completar los 600 µL (incubada previamente por 20 minutos a temperatura ambiente) y se agitó suavemente. Las células fueron dejadas durante 48 horas en una estufa a 37°C y 5% de CO2. Se les cambió el medio y 24 horas más tarde se les agregó el antibiótico de selección (ver Tabla I). Al cuarto o quinto día la mayoría de las células estaban muertas, por lo que se procedió a eliminar el medio y las células restantes (resistentes al antibiótico) fueron lavadas con PBS 1X dos veces. Luego se colocaron sobre las colonias de células (previamente marcadas por fuera de la placa) los discos de clonamiento con vaselina. Se resuspendieron las células con 100 µL de tripsina (0,25%, EDTA 1 mM en PBS pH 8,0) a 37°C. Luego se agregaron 200 µL del medio respectivo sin antibiótico. Una vez disgregadas las células se trasvasijaron a una placa de 60 mm y se completó a un volumen de 3 mL. Al día siguiente, se agregó el antibiótico de mantenimiento respectivo

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Tabla I. Resumen de los componentes utilizados para la transfección. Células

DNA plasmidial

Antibiótico de selección

DGBEC

pcDNA3.1/hygro(+)-hGpbar1GFP

Higromicina B 250 µg/mL

MDCK-I

pEGFP-N1-hGpbar1

Geneticina 1000 µg/mL

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(geneticina 800 µg/mL o higromicina B 250 µg/mL).

3.2.2.5 Fluorescencia. Según el ensayo realizado la cantidad de células DGBEC-Gpbar1GFP y MDCKI-Gpbar1GFP sembradas (en placa de 24 pocillos sobre un cubreobjetos) varió. Al tercer o cuarto día a las células se les cambió el medio a uno sin suero. 16 horas más tarde se procedió a hacer o no los estímulos pertinentes. Luego se lavaron las células con PBS Ca/Mg (PBS 1X, Ca+2 0,1 mM y Mg+2 1 mM) tres veces. Se fijaron durante 30 minutos con paraformaldehído al 4%. Se lavaron las células 3 veces más en PBS Ca/Mg. Se incubaron con el anticuerpo Hoechst 33342 1X por una hora a 4°C en oscuridad. Se lavó 2 veces con PBS 1X y luego una vez con agua destilada. Se montaron los cubreobjetos con 5 µL de fluoromount sobre el portaobjetos. Finalmente, se dejaron secar por 15 minutos a 37°C en oscuridad. Las células fijadas fueron observadas por microscopía de epifluorescencia a 60x de magnificación en un microscopio de marca Leica (modelo DM2000) y las fotos fueron obtenidas por la cámara digital (acoplada al microscopio) de marca Leica DFC 300 FX. En el caso de las células cultivadas en filtros, los procedimientos fueron los mismos excepto en el montaje. Una vez cortada la membrana semipermeable (en la cual se encuentran las células) del filtro, se montó con una gota de fluoromount por arriba y por debajo de la membrana entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Luego se dejó secar por 30 minutos a 60°C en oscuridad. Las células fijadas fueron observadas por microscopía confocal a 60x de magnificación en un microscopio de marca Olympus Fluoview 1000.

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3.2.2.6 Extracción y solubilización de proteínas totales. Cada placa sembrada, que fue sometida a distintos tratamientos, fue lavada 3 veces con PBS 1X frío (4°C) y, posteriormente, se incubaron por 10 minutos con 100 μL de buffer de lisis RIPA 1X (Tris·HCl 50 mM, NaCl 150 mM, SDS 0,1%, Nonidet P-40 1%, EGTA 1 mM y EDTA 100mM) pH 7,4 que contenía los siguientes inhibidores de proteasas y fosfatasas, PMSF 200 nM, inhibidor de tripsina 5 µg/mL, pepstatina A µg/mL y leupeptina 1 µg/mL, Na2VO3 1mM y NaF 1mM. Luego las células fueron raspadas con espátula en hielo y traspasadas a un tubo Eppendorf de 1,5 mL. La mezcla obtenida fue sonicada con 18 pulsos de 40 de amplitud y los tubos fueron mantenidos en hielo. A continuación las células fueron centrifugadas a 13.000 r.p.m. durante 20 minutos a 4°C y, finalmente, se traspasó el sobrenadante a otro tubo Eppendorf, descartando el pellet.

3.2.2.7 Cuantificación de las proteínas totales. Una vez obtenidas las proteínas totales, su concentración fue determinada mediante el método de Lowry modificado a través del kit comercial BIO RAD. En breve se adicionó a cada uno de los tubos Eppendorf 20 µL de muestra diluida o del estándar (2, 1, 0,5, 0,25 y 0,125 mg/mL de BSA en buffer Ripa 1X), 100 µL de la mezcla del reactivo A y el reactivo S (por cada 1 mL de reactivo A se agregan 20 µL del reactivo S) y 800 µL del reactivo B. Posteriormente la mezcla se dejó incubando durante 15 minutos a temperatura ambiente y se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a 750 nm.

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3.2.2.8

Electroforesis

en

gel

de

poliacrilamida

en

condiciones

denaturantes

e

inmunodetección mediante Western blotting. Las proteínas se analizaron por SDS-PAGE usando geles separadores (Tris-HCl 0,375 M pH 8,8, SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,05% y TEMED 0,1%) de diferentes porcentajes de poliacrilamida (del 7,5% y 12%) y geles apiladores al 4% (Tris-HCl 0,125 M pH 6,8, SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,05% y TEMED 0,2%), ambos a partir de un stock de acrilamida/bisacrilamida 29:1 (30% p/v). Antes de cargar los geles con las muestras respectivas (proteínas totales o marcador de proteínas en buffer de carga 2X (Tris-HCl 125 mM pH 6,8, glicerol 20%, SDS 4%, azul de bromofenol 0,04 mg/mL, DTT 1 M) en razón 1:1), éstas son calentadas durante 5 minutos a 95°C. La corrida electroforética se realizó en un sistema miniprotean Electrophoresis System (Bio-Rad) a un voltaje constante de 150 volts durante 2 horas en un tampón compuesto por (glicina 0,2 M, Tris 25 mM, SDS 0,1%). La transferencia se realizó a una membrana de nitrocelulosa (Pure Nitrocellulose Membrane (0.2 µm) Bio-Rad) durante 90 minutos para geles de 1,5 mm de grosor a amperaje constante de 350 mA a 8°C en un tampón compuesto por glicina 0,1 M, Tris 12,5 mM, metanol absoluto 20% y SDS 0,5%. Una vez finalizada la transferencia, las membranas fueron lavadas con una solución para eliminar SDS (isopropanol 25% y ácido acético 10%) durante 15 minutos, para posteriormente ser lavadas 3 veces durante 10 minutos con TTBS 1X (Tris·HCl 20 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0,1 %) pH 7,4. Finamente, se bloquearon las membranas con leche descremada al 5% en TTBS 1X durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación suave, para proceder a su incubación con el anticuerpo primario deseado. Las membranas fueron incubadas con los anticuerpos primarios durante toda la noche a 4°C en leche descremada al 5% en TTBS 1X. Al día siguiente se lavaron 3 veces con TTBS 1X a temperatura ambiente y luego éstas fueron incubadas con el anticuerpo

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secundario correspondiente en leche descremada al 5% en TTBS 1X durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, la inmunodetección fue visualizada mediante el kit de quimioluminiscencia (ECL) de Thermo Scientific, siguiendo las instrucciones del fabricante.

3.2.2.9 Ensayo de biotinilación y precipitación con SA-Sepharose beads. En este ensayo se utilizaron filtros Transwell (COSTAR 3142) en placas de formato de 6 pocillos. Además, se debió medir el voltaje de los 4 pocillos mediante el voltímetro EVOM (World Precision Instruments, FL, USA) todos los días durante los 6 días del experimento. El día cero correspondió a la medición realizada en los pocillos antes de sembrar las células (contenían el medio de cultivo correspondiente a la línea celular). Se sembraron 100.000 células en los filtros de cada pocillo tanto de las células DGBEC-Gpbar1GFP (2 pocillos) como de las células MDCK-Gpbar1GFP (2 pocillos) en un total de 4 filtros Transwell. El medio de cultivo fue reemplazado cada 2 días con mucho cuidado. Al sexto día, después de la última medición de voltaje, las células se lavaron con PBS Ca/Mg (PBS 1X, Ca+2 0,1 mM y Mg+2 1 mM) frío a 4°C por 5 minutos con agitación suave. Luego se eliminó la solución de lavado según correspondía y se agregó la biotina (0,5 mg/mL en PBS Ca/Mg) 0,5 mL en la zona superior (si es marcación apical) o 1,5 mL en la zona inferior (si la marcación en basolateral). Se dejó incubando por 30 minutos a 4°C con agitación suave. Este paso se repitió 2 veces. Luego se eliminó la biotina y se agregó NH4Cl (50 mM en PBS Ca/Mg) frío, una vez rápido y luego 2 veces más, dejándolo incubar por 10 minutos a 4°C con agitación suave. Se volvió a lavar con PBS Ca/Mg por 5 minutos a 4°C con agitación suave 3 veces. Una vez terminados los lavados se cortaron los filtros (membranas semipermeables) con una aguja y se agarraron con una pinza, dejando la membrana lo más estirada posible dentro de un Eppendorf de 1,5 mL. A cada tubo se le agregó 1 mL del

30

tampón de lisis SA frío (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA pH 8,0 5 mM, BSA 0,2%, tritón 1%, PMSF 3X, pepstatina 3X, leupeptina 3X y antipaina 3X) y se dejó incubar por una hora a 4°C con agitación fuerte intermitente. Terminada la incubación se procedió a transferir el sobrenadante a otro tubo Eppendorf y eliminar el filtro. Se centrifugaron los sobrenadantes por 3 minutos a 4°C a 10.000 r.p.m. y estos se agregaron a otros tubos que contenían 60 µL de Streptavidin-Sepharose beads al 50% (resuspendidas en tampón de lisis SA) y 40 µL de SDS al 10%. Se dejó incubar toda la noche a 4°C. Al día siguiente, se centrifugó por 2 minutos a 10.000 r.p.m. y se eliminó el sobrenadante. Se lavó con 1 mL de la solución HAmix (SDS 0,1%, tritón 1% y BSA 0,5% en PBS Ca/Mg) y secuencialmente con las soluciones TPII (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA pH 8,0 5 mM, BSA 0,2% y SDS 0,1%) pH 8,0, TPIII (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, EDTA pH 8,0 5 mM y BSA 0,2%) y TPIV (Tris 50 mM pH 8,0). Después de los lavados, se secaron las beads con una aguja de tuberculina y se agregaron 30 µL del tampón de carga para proteínas 2X a cada tubo. Estos se incubaron a 95°C por 5 minutos, se centrifugó a 10.000 r.p.m. por 3 minutos y el sobrenadante fue cargado en un gel de poliacrilamida al 7,5% (gel separador) en condiciones denaturantes (métodos 3.2.2.9). La membrana fue incubada con los anticuerpos primarios anti-GFP (Molecular Probes) 1:10.000 y anti-E-caderina (BD Transduction Lab.) 1:10.000 a 4°C durante toda la noche. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron anti-conejo 1:5.000 y anti-ratón 1:5.000 (Chemicon), respectivamente, durante 90 minutos a temperatura ambiente.

3.2.2.10 Ensayo de AMPc. En una placa de 24 pocillos se sembraron 13.000 células DGBEC-Gpbar1GFP por pocillo (12 pocillos) y 17.500 células DGBEC por pocillo (4 pocillos). En otra placa se sembraron

31

40.000 células MDCKI-Gpbar1GFP por pocillo (12 pocillos) y 75.000 células MDCK-I por pocillo (4 pocillos). Se cultivaron las células durante 3 días y 16 horas previo al estímulo se les cambió a un medio de cultivo sin SBF (respectivo de cada línea celular). Las células fueron estimuladas por duplicado con ALC 50 µM, INT777 10 y 30 µM, forskolina 2,5 µM, con el vehículo DMSO y metanol/agua razón 1:1 durante 1 hora según corresponda. Para medir los niveles de AMPc se utilizó el kit comercial Cyclic AMP XP® Assay Kit (Cell Signaling), siguiendo las instrucciones del fabricante.

3.2.2.11 Ensayo de centrifugación en gradiente de sacarosa. Las células DGBEC-Gpbar1GFP y MDCKI-Gpbar1GFP fueron sembradas en placas de 10 cm (3 y 3, en total 6 placas de 10 cm). Al obtener un 80% de confluencia, las células fueron estimuladas con el vehículo (DMSO o metanol/agua razón 1:1) o con los ligandos (ALC 50 µM o INT777 30 µM) según corresponda por 15 minutos. Luego se lavó con PBS Ca/Mg dos veces, se agregó 1 mL de TNE (Tris-HCl 25 mM pH 7,5, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM) y se rasparon las células. Éstas fueron centrifugadas a 4°C a 1.000 r.p.m. durante 5 minutos. El pellet se resuspendió en 500 µL de buffer de lisis (Lubrol 0,5% en buffer TNE) y se sometió a agitación intermitente a 4°C. El lisado se pasó por una jeringa G27 5 veces y se centrifugó a 10.000 g por 3 minutos. Los 500 µL del sobrenadante se mezclaron con 500 µL de sacarosa al 80% en el tubo centrífuga (5 mL) y se homogenizaron. Sobre los 1.000 µL se colocaron lentamente 2 mL de sacarosa al 35% y encima, 2 mL de sacarosa al 5%. Los tubos se centrifugaron por 18 horas a 46.000 r.p.m. en la ultracentrífuga Sorvall (rotor AH 650). Las fracciones recolectadas (500 µL cada una) fueron homogenizadas y se utilizaron 10 µL de cada fracción para medir la densidad por refractometría. Los 490 µL restantes de la fracción fueron precipitados mediante el ácido

32

tricloroacético (TCA). Cada fracción se llevó a un volumen de 900 µL con el buffer TNE. Luego se agregaron 100 µL de TCA y se mezcló por inversión dos veces. Se incubaron en hielo por 20 minutos y fueron centrifugadas a 14.000 r.p.m. a 4°C por 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el pellet fue resuspendido con 25 µL de NaOH 0,1 M. Se centrifugaron los tubos a 14.000 r.p.m. por 10 minutos y se eliminó el sobrenadante. El pellet se resuspendió en buffer de carga 2X y se calentaron las muestras 5 minutos a 95°C. Las proteínas de cada fracción se cargaron a un gel de poliacrilamida (10 fracciones por gel) al 12% (gel separador) en condiciones denaturantes (métodos 3.2.2.9). En la inmunodetección se utilizaron los anticuerpos primarios anti-GFP (Molecular Probes) 1:10.000 y anti-caveolina1 (Santa Cruz) 1:2.000 y se incubaron durante toda la noche a 4°C. El anticuerpo secundario, anti-conejo 1:5.000 (Chemicon), fue incubado 90 minutos a temperatura ambiente.

3.2.3 Activación de ERK1/2. 3.2.3.1 Tratamientos con ligandos e inhibidores. Para ver el grado de fosforilación de ERK1/2 inducido por el ácido litocólico o INT777, se trabajó con células DGBEC WT, DGBEC-Gpbar1GFP o MDCKI-Gpbar1GFP al 80% de confluencia en placas de 60 mm. Una vez alcanzada esta confluencia, se cambió a un medio libre de SBF 16 horas (aproximadamente) antes del estímulo con ALC a diferentes concentraciones o diferentes tiempos según corresponda. El vehículo de ALC (metanol/agua 1:1) y el de INT777 (DMSO) se incubaron por el tiempo mayor de estímulo. Por otra parte, para ver la participación de ciertas proteínas en la activación de ERK1/2, las células DGBEC WT al 80 % de confluencia se les cambió a un medio libre de SBF 16 horas

33

(aproximadamente) antes de la incubación con el inhibidor específico respectivo (ver Tabla II) por 30 min a 37°C. Luego se procedió a estimular las células, preincubadas con el inhibidor o no, con ALC 50 µM por 5, 15 y 60 minutos. Además del estímulo del vehículo (durante 60 minutos), se estimulaban las células con el inhibidor solo (30 minutos) para ver si éste producía un cambio en la fosforilación de ERK1/2.

3.2.3.2 Detección del grado de fosforilación de ERK1/2. Una vez realizados los estímulos con los ligandos y/o inhibidores, se procedió a la extracción y solubilización de proteínas totales (métodos 3.2.2.6), a la cuantificación de las proteínas totales (métodos 3.2.2.7), a correr 40 ng de proteína por muestra en cada pocillo en electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% (gel separador) en condiciones denaturantes e inmunodetección mediante Western blotting (métodos 3.2.2.8). Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-pERK1/2 1:2.000 y anti-ERK1/2 1:4.000 (Cell Signaling) y los secundarios anti-ratón 1:25.000 y anti-conejo 1:25.000 (Jackson IRL), respectivamente, a excepción de un ensayo. En este ensayo se utilizaron los anticuerpos anti-pERK1/2 1:1.000 (Santa Cruz), antiERK1/2 1:3.000 (BD Transduction Lab.), anti-ratón y anti-conejo 1:5.000 (Chemicon), especificado en la leyenda correspondiente.

34

Tabla II. Resumen de los inhibidores utilizados. Inhibidor

Blanco de inhibición

Concentración (µM)

Referencia

AG1478

EGFR

1

(Fuentes et al., 2008)

GM6001

MMP

10

(Fuentes et al., 2008)

PP1

Src

10

(Fuentes et al., 2008)

H-89

PKA

10

(Lochner y Moolman, 2006)

35

4. RESULTADOS

4.1 Generación de las líneas celulares establemente transfectadas con la construcción que codifica para la proteína de fusión hGpbar1-GFP. Dada la ausencia de anticuerpos comerciales de calidad y con el objetivo de estudiar la localización polarizada del receptor Gpbar1 y su tráfico inducido por ligando, se generaron dos líneas celulares establemente transfectadas con el receptor humano Gpbar1 (hGpbar1) unido a la proteína verde fluorescente potenciada (EGFP). Para ello se utilizaron dos líneas celulares de perro; las células epiteliales de riñón canino Madin-Darby I (MDCK-I) y las células epiteliales de la vesícula biliar de perro (DGBEC). Las células MDCK-I corresponden a un modelo de células polarizadas muy caracterizado y utilizado, a diferencia de las células DGBEC, las cuales no están bien caracterizadas. Para la generación de las células MDCKI-Gpbar1GFP se utilizó el vector pEGFP-N1 (Figura 3A), el cual posee la secuencia de EGFP y se le insertó la secuencia codificante del receptor Gpbar1 humano (1.007 pb) realizado anteriormente en el laboratorio. Este constructo se transfectó en células MDCK-I y se seleccionó con el antibiótico geneticina, obteniéndose una línea celular estable (métodos 3.2.1.4). A diferencia de las células MDCK-I, las células DGBEC wild type resultaron ser resistentes a geneticina, pero sensibles a higromicina B. Debido a esto, se tuvo que realizar un nuevo constructo mediante subclonación. El vector utilizado fue pcDNA3.1/hygro(+) (Figura 3B), el cual posee como marcador de selección el gen de resistencia a higromicina. Se procedió a digerir el vector pEGFP-Gpbar1 con las enzimas de restricción NheI y NotI, obteniéndose 2 fragmentos; uno que correspondería a la secuencia de Gpbar1 unido a la secuencia de EGFP y el otro que correspondería al resto del vector pEGFP-N1. La secuencia Gpbar1-EGFP se insertó en el vector pcDNA3.1/hygro(+) digerido con las mismas

36

A

B

C

Std. 1 Kb

12.000 pb

2.000 pb

hGpbar1-EGFP 1.778 pb

Figura 3. Subclonamiento de la proteína de fusión hGpbar1-EGFP. La secuencia codificante del receptor hGpbar1 se insertó en el plásmido pEGFP-N1 (panel A). Luego éste y el vector pcDNA3.1/hygro(+) (panel B) fueron digeridos con las enzimas de NheI y NotI. Se prosiguió a purificar el receptor unido a GFP y el plásmido pcDNA3.1/hygro(+) y, posteriormente, se ligaron. En el panel C se muestra la digestión con las enzimas de restricción NheI y NotI del constructo pcDNA3.1/hygro(+)-Gpbar1GFP.

37

enzimas de restricción. Fue el constructo pcDNA3.1-Gpbar1-EGFP, el que se utilizó para transfectar las células DGBEC (métodos 3.2.1). En la Figura 3C se observa la digestión del constructo, el cual liberó el inserto del tamaño esperado. Una vez seleccionados los clones de las líneas celulares con sus respectivos antibióticos, se verificó que la proteína de fusión se estaba expresando en las células eucariotas mediante Western blotting y por microscopía de epifluorescencia (Figura 4). En los Western blots (Figura 4C y D), para ambas líneas celulares, se observó la banda de la proteína de fusión con un peso aparente de 82 kDa aproximadamente y otras bandas, que al parecer serían diferentes grados de glicosilación del receptor unido a GFP. Mientras que en la microscopía de epifluorescencia (Figura 4A y B) se observó a la proteína de fusión en la membrana plasmática de las células. Además, se encontró en las células una acumulación de la proteína en la zona perinuclear (indicada con una flecha) lo que podría indicar una acumulación en un endosoma de reciclamiento o, alternativamente, en el aparato de Golgi. Sorprendentemente, la membrana plasmática de las células DGBEC-Gpbar1GFP (Figura 4B) presentaron estructuras tipo lamelipodios. Estas estructuras desaparecen a medida que las células se cultivan por más tiempo, llegando a tener una forma tipo hexagonal.

38

MDCKI-Gpbar1GFP

DGBEC-Gpbar1GFP

A

C kDa

B

1

2

3

D kDa

4

175

80

82

58

64

46

1

2

3

4

175

80 58

82 64

51 46

Figura 4. Líneas celulares DGBEC y MDCK-I que expresan el receptor hGpbar1 establemente. Para confirmar la expresión del receptor unido a GFP en las células MDCKIGpbar1GFP (A) y en las células DGBEC-Gpbar1GFP (B) se realizó una fluorescencia. Para ello se dejaron crecer las células (por separado) sobre un cubre objeto, se fijaron en paraformaldehído al 4%, se montaron en un portaobjetos y se visualizaron por microscopía de epifluorescencia. Además, se realizó un Western blotting para las células MDCKI-Gpbar1GFP (C) y las células DGBEC-Gpbar1GFP (D) para confirmar la presencia de la proteína de fusión. Se utilizó el anticuerpo policlonal anti-GFP 1:10.000 y el anticuerpo secundario anti-conejo 1:50.000 (Jackson IRL). El carril 1 contiene el extracto de las proteínas totales de las células wild type, mientras que el carril 2, carril 3 y carril 4 contienen 5 µg, 10 µg y 25 µg, respectivamente, del extracto de las proteínas totales de las líneas estables. La barra indica 20 µm.

39

4.2 Localización del receptor hGpbar1 en las células polarizadas MDCK-I y DGBEC. Una vez obtenidas las líneas celulares estables, se evaluó la localización del receptor a nivel de la membrana plasmática de las células polarizadas mediante biotinilación selectiva apical o basolateral (Figura 5) y por microscopía confocal (Figura 6). En el caso de la biotinilación, las células se cultivaron en un sistema de cultivo bicameral, el cual contiene una membrana semipermeable sobre la cual se siembran las células. Si éstas son del tipo epitelial y llegan a 100% de confluencia van a formar una monocapa, la cual va a separar el medio superior del inferior simulando, en parte, las condiciones fisiológicas en las que el medio externo (apical, AP) está separado del medio interno (en contacto con el polo basal, BL). Para establecer con certeza el grado de confluencia se midió la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de las células. Se utilizó el voltímetro EVOM (World Precision Instruments, FL, USA) para medir el voltaje del día cero (solución + filtro), día 3, 4, 5 y 6 (solución + filtro + células). Con las lecturas se procedió a calcular la resistencia (Ω*cm2). TER (Ω*cm2) = [(solución + filtro + células) - (solución + filtro)] * área del filtro (π*r2) En la Figura 5A se muestra un gráfico con las resistencias calculadas a medida que avanzaban los días. Durante los primeros días, la resistencia de las células MDCK-Gpbar1 aumentó levemente. Al cuarto y quinto día la pendiente de la resistencia aumentó significativamente, llegando a un estado estacionario en el día 5. Esto significa que las células en el quinto día alcanzaron un 100% de confluencia. Mientras que el comportamiento de las células DGBEC-Gpbar1 fue similar a las células MDCK-Gpbar1 durante los 3 primeros días. En el cuarto y quinto día la pendiente de éstas últimas aumentó considerablemente y en el sexto día la pendiente disminuyó levemente, lo que sugiere que estas células estaban pronto a alcanzar el

40

1400

A

B

DGBEC-Gpbar1GFP MDCKI-Gpbar1GFP

1200

kDa

1000 2

TER (ohm*cm )

DGBEC MDCKI AP BL AP BL

800 600

80

400

58

Anti-GFP

200 0

120 0

1

2

3

4

5

6

Anti E-cadherina

7

Días

Figura 5. Biotinilación de células transfectadas establemente con hGpbar1-GFP. A las células de ambas líneas celulares estables, se les midió el voltaje y se calculó la resistencia eléctrica transepitelial o TER (Ω*cm 2) durante 6 días (A). El día cero corresponde a la medición realizada previo a la siembra de las células (medio de cultivo + filtro). Después de la última medición, se prosiguió con el procedimiento de la biotinilación. La inmunodetección (B) mediante Western blotting del extracto de proteínas obtenidas del lado apical (AP) o basolateral (BL) de las células fue realizada con los anticuerpos primarios anti-GFP 1:10.000 y anti-Ecaderina 1:10.000. Los anticuerpos secundarios respectivos fueron anti-conejo 1:5.000 y antiratón 1:5.000 (Chemicon).

41

DGBEC-Gpbar1GFP

C

A

XY

MDCKI-Gpbar1GFP

XY

XY

XZ

XZ

B

D

XY

XY

XZ

XY

XY

XY

XZ

Intensidad de la fluorescencia

Figura 6. Localización de la proteína de fusión hGpbar1-GFP por microscopía confocal. Las células se cultivaron sobre un cubreobjetos hasta llegar a confluencia. Luego se fijaron y se montaron en un portaobjetos. Éstas fueron examinadas por microscopía confocal y las imágenes fueron analizadas en el programa ImageJ. Los paneles A y B corresponden a las células DGBECGpbar1GFP y los paneles C y D corresponden a las células MDCKI-Gpbar1GFP a diferentes aumentos. La barra indica 10 µm.

42

estado estacionario. El aumento de la resistencia de las células DBGEC-Gpbar1 en comparación con las células MDCK-Gpbar1 fue mucho mayor, lo cual no necesariamente tiene relación con el grado de confluencia alcanzado, ya que este parámetro (TER) es propio de cada tipo celular epitelial. Luego de hacer las últimas mediciones (día 6) se prosiguió a realizar el ensayo de biotinilación como se describe en métodos 3.3.2.9. En la Figura 5B se ve la inmunodetección mediante Western blotting, en la cual las bandas superiores corresponden al receptor Gpbar1-GFP y las inferiores a la proteína E-caderina. Esta proteína se caracteriza en ubicarse solamente en la cara lateral de las células polarizadas y es el mayor componente de las uniones de adhesión entre células epiteliales (Lock y Stow, 2005). El receptor hGpbar1 se encontró en los carriles correspondientes a la fracción basolateral (BL) tanto en las células DGBEC y MDCK-I. Cabe destacar que, a pesar de que las células DGBEC-Gpbar1GFP no alcanzaron el estado estacionario, éstas si estaban polarizadas, ya que E-caderina no estaba presente en la fracción de la cara apical. Para la microscopía confocal, las células fueron cultivadas hasta 4 días después de llegar a la confluencia. Luego éstas fueron fijadas y montadas en un portaobjetos (métodos 3.2.2.5). Las imágenes fueron analizadas en el programa ImageJ. Primero, se utilizó la herramienta Volume Viewer para obtener las 3 dimensiones de las células (plano X, Y y Z). Además, se utilizó la herramienta Fire Lut, la cual permite con colores destacar la distribución de la proteína en cuestión. El azul (baja intensidad de luz promedio) indica menor presencia de la proteína, mientras que el color blanco (alta intensidad de luz promedio) indica una alta concentración de la proteína en esa zona. El panel A y B de la Figura 6 muestra las células DGBEC-Gpbar1GFP y el panel C y D corresponde a las células MDCK-Gpbar1GFP con diferentes aumentos. En las células MDCK-I el receptor tuvo una distribución mayoritariamente en la cara basolateral (color

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rojo-amarillo) de la célula. La expresión del receptor en las células DGBEC fue mucho mayor en comparación con las células MDCK-I y al igual que en las células MDCK-I, el receptor se distribuyó principalmente en la cara basolateral. A pesar de ello, en ciertas células que presentaron una mayor expresión del receptor, éste estaba presente en la cara apical (color rosado-morado). Por otra parte, en ambos tipos celulares se apreció una acumulación del receptor en vesículas intracelulares, ubicándose la mayoría de éstas en la periferia del núcleo. Esto sugiere que, probablemente, se trate de un compartimento endosomal de reciclaje. En ambos tipos celulares (DGBEC y MDCK-I) se encontró que la proteína Gpbar1-GFP está en el polo basolateral (Figuras 5 y 6). No obstante, algunas células presentaron la proteína de fusión en su cara apical. Esto podría ser explicado por saturación del sistema de segregación BL al tener estas células una mayor expresión del receptor.

44

4.3 Activación del receptor Gpbar1 por el ligando ALC e INT777. Uno de los objetivos de la tesis fue confirmar si el receptor se internaliza en respuesta al ligando. Debido a esto, se determinó, en una primera instancia, la activación del receptor Gpbar1 inducida por el ligando endógeno ALC y por el ligando sintético específico del receptor Gpbar1 INT777. Gpbar1 corresponde a la clase A de los GPCRs, por lo que, se postuló que su comportamiento de señalización e internalización sería similar a la mayoría de los integrantes de esta clase (vía canónica). Entonces la activación del receptor Gpbar1 por el ligando ALC o INT777 va a llevar a la activación de Gαs y a la activación de la AC, produciendo un aumento de adenosín monofosfato cíclico (AMPc). Este aumento de AMPc fue cuantificado por el kit comercial Cyclic AMP®XP Assay Kit (Cell Signaling). Para ello se siguió según las instrucciones del fabricante con unas leves modificaciones, descrito en métodos 3.2.2.10. En la Figura 7 se muestran graficados los niveles de AMPc inducidos por los ligandos ALC e INT777 a diferentes concentraciones en las células WT o en las células transfectadas establemente con el receptor hGpbar1 de las líneas celulares DGBEC (Figura 7A) y MDCK-I (Figura 7B). Forskolina se usó como control positivo del ensayo, ya que este compuesto aumenta los niveles de AMPc al estimular adenilato ciclasa (Seamon et al., 1981). Además, se utilizó el vehículo metanol/agua razón 1:1 (V1) y el vehículo DMSO (V2) para compararlos con el ligando ALC y el ligando INT777, respectivamente. Las células WT en el panel B, correspondiente a las células MDCK-I, que fueron estimuladas con ALC mostraron una disminución leve (1,5 veces) de los niveles de AMPc en comparación con las células estimulas con el vehículo. Las células establemente transfectadas estimuladas tanto con los vehículos 1 y 2 muestran aumento de los niveles de AMPc, aunque estos son inferiores a los alcanzados en las células WT. En las células MDCKIGpbar1GFP estimuladas con ALC 50 µM mostraron niveles de AMPc del orden de 50 nM

45

MDCKI-Gpbar1GFP

DGBEC-Gpbar1GFP 55

120

A

B 80

AMPc (nM)

AMPc (nM)

50

45 20 15

30 20

10

10

5 0

WT

Gpbar1-GFP

WT

M

M IN T7

77

30

10

M 77

a

V 2

30

50

7

IN T7

7 T7 IN

V 1

10

C

7

AL

7 T7 IN

M

50

M

50

C

M

rs ko lin

AL

M

V 1

V2

C

V1

Fo

F

a

AL

AL

C

50

V 1

M

0 in ol sk or

Gpbar1-GFP

Figura 7. Aumento de los niveles de AMPc inducido por el ligando ALC e INT777. Las células establemente transfectadas con la proteína de fusión hGpbar1-GFP y las wild type (WT) fueron sembradas en dos placas de 24 pocillos. Al tercer día se les cambió el medio a uno sin suero. Después de 16 horas con el medio sin suero, las células fueron estimuladas con el vehículo V1 (metanol agua razón 1:1), vehículo V2 (DMSO), ALC 50 µM y con INT777 10 y 30 µM por 1 hora (n=2). Para medir los niveles de AMPc se utilizó el kit comercial Cyclic AMP®XP Assay Kit (Cell Signaling). El panel A corresponde a las células DGBEC y el panel B, a las células MDCKI.

46

aproximadamente, muy superior a lo alcanzado por el vehículo (V1) o por el mismo estímulo en las células WT (20 y 9 veces superior, respectivamente). Se usaron 2 concentraciones de INT777 10 µM (recomendada por el fabricante) y 30 µM, las cuales aumentaron los niveles de AMPc al triple y al séptuple respectivamente comparados con el V2. Estos niveles son superiores al vehículo, pero no alcanzaron los obtenidos por ALC 50 µM. En las células DGBEC (panel A) WT el estímulo con ALC 50 µM no produjeron una mayor cantidad de AMPc comparado con el estímulo del vehículo. En cambio, ALC 50 µM indujo un aumento de AMPc en estas células (el doble en comparación con su vehículo), pero no alcanzó a los niveles de AMPc inducidos por el mismo ligando en las células MDCK-I establemente transfectadas. Por último, en las células estimuladas con INT777 10 y 30 µM se lograron niveles superiores a los obtenidos con el estímulo de su vehículo (V2) y con el ligando ALC 50 µM. Con INT777 30 µM se alcanzaron niveles mayores de AMPc (mayor activación de receptor) que la concentración de 10 µM en ambos tipos celulares, por lo que se utilizó esta concentración en los ensayos posteriores. En conclusión ambos ligandos logran activar al receptor Gpbar1, aunque la activación varía dependiendo de la concentración, del ligando y del tipo celular.

47

4.4 Ubicación del receptor en microdominios de la membrana plasmática. Con el objetivo de determinar si el receptor se asocia a microdominios de membrana ricos en colesterol y glicoesfingolípidos, se realizó el ensayo de centrifugación isopícnica. Este ensayo consiste en colocar la muestra (extracto celulares solubilizadas con un detergente no iónico) en una gradiente de sacarosa (5 - 40%), en la cual los fragmentos de membrana resistentes al detergente no iónico se van a separar por densidad. Posterior a esta centrifugación se recolectaron fracciones de la gradiente, donde la número 1 (6 - 7% de sacarosa) corresponde a la fracción menos densa (1,02 g/mL) y la fracción número 10 (36 - 37% de sacarosa) a la más densa (1,16 g/mL). Las células establemente transfectadas con la proteína de fusión (Gpbar1-GFP) se sembraron en placas de 10 cm y se dejaron crecer hasta un 80% de confluencia. Luego fueron estimuladas con el vehículo (DMSO) y los ligandos (ALC 50 µM e INT777 30 µM) según corresponda por 15 minutos (métodos 3.2.2.11). La Figura 8 muestra la inmunodetección mediante Western blotting de la proteína de fusión con el anticuerpo anti-GFP y de las fracciones que poseen alto contenido de colesterol y están asociadas a caveolina con el anticuerpo anticaveolina-1, para ambas líneas celulares. En la inmunodetección se observó que el receptor Gpbar1 está distribuido principalmente de la Fracción 7 a las 10 y no se encontró en las mismas fracciones que caveolina-1 (fracciones 4 y 5). Por otra parte, tampoco se encontró efecto de la estimulación del receptor por sus ligandos, en lo que respecta a generar un cambio en su sedimentación. De esto se puede concluir que el receptor Gpbar1 no estaría distribuido en microdominios ricos en colesterol asociados a caveolina.

48

Células DGBEC-Gpbar1GFP

Fracciones 1 2 3 4 5

6

7 8

9 10

Células MDCKI-Gpbar1GFP

1 2 3 4

5 6

7 8

9 10

kDa

90

VDMSO

INT777 30 µM

50

90 50

Anti-GFP

LCA 50 µM

20

Anti-caveolina-1

Figura 8. Ubicación del receptor Gpbar1 en fracciones más densas de la gradiente de sacarosa. Inmunodetección mediante Western blotting del extracto celular de ambas líneas celulares sometidos a un detergente no iónico y separados por una gradiente de sacarosa discontinua (5 - 40%). Se utilizaron los anticuerpos primarios anti-GFP 1:10.000 y anticaveolina-1 1:2.000. El anticuerpo secundario utilizado para ambos fue anti-conejo 1:5.000 (Chemicon). El cuadrado en rojo muestra las fracciones 4 y 5 que contienen caveolina-1.

49

4.5 Internalización del receptor Gpbar1. Uno de los objetivos de la tesis fue determinar si el receptor Gpbar1 es endocitado al unirse a su ligando. Para ello, en una primera instancia, se cultivaron células sobre un cubre objetos hasta confluencia, se estimularon, luego se fijaron en paraformaldehído al 4% y se observaron en el microscopio de epifluorescencia (métodos 3.2.2.6). En la Figura 9 se muestra a las células DGBEC y MDCK-I establemente transfectadas con la proteína de fusión y estimuladas con el vehículo del ligando (DMSO o agua/metanol 1:1 para INT777 o ALC, respectivamente), con INT777 30 µM o con ALC 50 µM. En el caso de las células DGBECGpbar1GFP al ser inducidas con ALC 50 µM durante 15 (panel C) y 30 minutos (panel E) no se observó un cambio en la distribución del receptor comparado con su vehículo (panel A), pero si se observó un aumento leve de la marca perinuclear. De la misma manera, no se observó cambios importantes en la distribución del receptor al ser estimuladas las células con INT777 30 µM a los 15 y 30 minutos (panel I y K) en comparación con el vehículo (panel G), pero la marca perinuclear en las células (panel G, I y K) fue más puntiforme. En el caso de las células MDCKI-Gpbar1GFP, tampoco hubieron cambios significativos inducidos por el ligando (ALC; panel D y F, INT777; panel J y L) comparado con su vehículo (B y H, respectivamente). Algunas células muestran una menor expresión del receptor (panel B, D y H) en comparación con las otras (panel F, J y L), por lo que dificulta la observación de la marca perinuclear. Al parecer, no hay cambios en la ubicación del receptor entre las células estimuladas con el vehículo y las células estimuladas tanto con INT777 como con ALC, es decir, el receptor permanece en la membrana plasmática en presencia del ligando. Debido a esto, se repitió el experimento, pero las células se dejaron crecer hasta un 80% de confluencia para que el ligando pueda acceder al lado basolateral de las células. En la Figura 10 se muestra que tampoco hubo un cambio significativo con respecto a la

50

DGBEC-Gpbar1GFP

MDCKI-Gpbar1GFP

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

Vmet/agua

15 minutos ALC 50 µM

30 minutos

VDMSO

15 minutos

INT777 30 µM

30 minutos

51

Figura 9. Fluorescencia de las células DGBEC-Gpbar1 y MDCKI-Gpbar1 en condiciones de confluencia. Las células DGBEC y MDCK-I establemente transfectadas fueron cultivadas hasta llegar a confluencia y estimuladas con ALC 50 µM, INT777 30 µM a diferentes tiempos o el vehículo según corresponda (metanol/agua 1:1 y DMSO, respectivamente). Los preparados fueron examinados por microscopía de epifluorescencia y analizados en el programa ImageJ. Los núcleos están marcados de color azul. La barra indica 20 µm.

52

DGBEC-Gpbar1GFP

MDCKI-Gpbar1GFP

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

Vmet/agua

15 minutos ALC 50 µM

30 minutos

VDMSO

15 minutos

INT777 30 µM

30 minutos

53

Figura 10. Fluorescencia de las células DGBEC-Gpbar1 y MDCKI-Gpbar1 en estado no confluente. Las células DGBEC y MDCK-I establemente transfectadas fueron cultivadas hasta llegar a un 80% de confluencia y estimuladas con ALC 50 µM, INT777 30 µM a diferentes tiempos o el vehículo según corresponda (metanol/agua 1:1 y DMSO, respectivamente). Los preparados fueron examinados por microscopía de epifluorescencia y analizados en el programa ImageJ. Los núcleos están marcados de color azul. La barra indica 20 µm.

54

ubicación del receptor al ser estimuladas las células de ambas líneas celulares, observándose ciertas características similares con la Figura 9. La marca perinuclear se vio aumentada levemente al ser estimuladas las células DGBEC-Gpbar1GFP con ALC 50 µM (Figura 10C y E) y se observaron con una forma más redonda y pequeña (Figura 10G, I y K). Mientras que en las células MDCKI-Gpbar1GFP no se observaron tales cambios en la marca perinuclear. Finalmente, debido a un posible impedimento del ligando de poder llegar a la cara basolateral, se intentó probar en el sistema de cultivo bicameral. Las células se dejaron crecer hasta estar confluentes, y luego se estimularon por la cara apical (AP) o basolateral (BL) con ambos ligandos según corresponda. Las células fueron fijadas y montadas para su posterior análisis. Las imágenes fueron adquiridas por microscopía confocal y analizadas en Image J. En la Figura 11 se muestran las imágenes obtenidas para ambas líneas celulares. Al estimular con el ligando en las células DGBEC y MDCKI establemente transfectadas, tanto con INT777 30 µM (Figura 11B, E, G y J) como con ALC 50 µM (Figura 11A, D, F e I), el receptor permaneció en la cara basolateral de la membrana plasmática de las células sin haber un cambio en su ubicación con respecto al vehículo (panel H y C, respectivamente). La marca perinuclear no se observó en estas imágenes. En conclusión, Gpbar1 no fue endocitado en presencia de sus ligandos en las células DGBEC y MDCK-I.

55

Vehículo

ALC 50 µM A

INT777 30 µM B

AP

C

D

DGBECGpbar1GFP

E

BL

F

G

AP

H

I

MDCKIGpbar1GFP

J

BL

Figura 11. Fluorescencia de las células DGBEC-Gpbar1GFP y MDCKI-Gpbar1GFP cultivadas en un sistema bicameral. Las células DGBEC y MDCK-I establemente transfectadas fueron cultivadas en sistema de cultivo bicameral hasta llegar a confluencia y estimulas apical(AP) o basolateralmente (BL) con ALC 50 µM o INT777 30 µM, según corresponda. Los preparados fueron examinados por microscopía confocal y analizados en el programa ImageJ. La barra indica 10 µm.

56

4.6 Activación de ERK1/2 inducido por ALC. Según el trabajo realizado por Yasuda y colaboradores (2007) se ha visto que el ácido desoxicólico activa la vía de las MAPKs a través del receptor Gpbar1. Debido a esto, se quiso determinar la participación de ciertos componentes implicados en la activación de esta vía por ALC mediante el uso de inhibidores específicos. Previo a esto, se debió hacer ciertos ensayos para establecer la concentración de ALC a utilizar en las células DGBEC WT. Se usó el ligando ALC, ya que éste produce una mayor activación del receptor Gpbar1 comparado con los otros ABs endógenos (Kawamata et al., 2003). Las condiciones de cultivo fueron según métodos 3.2.3.1. Se estimularon las células con ALC a diferentes concentraciones durante 30 minutos y después se lisaron. Las proteínas fueron separadas mediante SDS-PAGE y detectadas mediante Western blotting. Las membranas fueron incubadas con un anticuerpo específico para la fosforilación de la proteína ERK 1 y ERK 2 (pERK1/2) y para las proteínas totales ERK 1 y ERK2 (ERK1/2), ambos anticuerpos adquiridos de Cell Signaling. En la Figura 12A se puede apreciar la inmunodetección, en el cual C corresponde al control (células sin estímulo) y V al vehículo del ligando ALC (metanol/agua 1:1). En el panel B, el gráfico muestra la cuantificación de pERK1/2 normalizado con ERK1/2 total de 3 repeticiones independientes (n=3). Se utilizaron diferentes concentraciones de ALC (10, 25, 50 y 75 µM), las cuales aumentaron significativamente la fosforilación de ERK1/2 comparado con el vehículo (P < 0,01). El aumento de pERK1/2 fue gradual hasta la concentración de 50 µM, donde se mantuvo la fosforilación (no hay diferencias significativas entre la concentración 50 y 75 µM, P = 0,220). Tanto en el panel A como en el B, se muestra que ALC 50 µM fue la concentración más baja que indujo más fosforilación de ERK, por lo que se decidió trabajar con esta concentración.

57

A

C

V

10

ALC (µM) 25 50 75

pERK1/2

44 kDa 42

ERK1/2

44 kDa 42

B 1,0

*

NS

pERK/ERK

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0 V

10

25

50

75

ALC µM

Figura 12. Efecto de ALC en la fosforilación de ERK en las células DGBEC. Las células DGBEC WT se mantuvieron en ausencia de SBF durante 16 horas previo al estímulo con diferentes concentraciones de ALC por un período de 30 minutos. La inmunodetección (A) se realizó por Western blotting utilizando los anticuerpos monoclonales anti-pERK1/2 1:2.000 y anti-ERK1/2 1:4.000. Los anticuerpos secundarios fueron anti-ratón 1:25.000 y anti-conejo 1:25.000, respectivamente. C corresponde al control (células sin estimular) y V al vehículo del ligando ALC (metanol/agua razón 1:1). El panel B corresponde al análisis densitométrico de pERK1/2 normalizado con ERK1/2 (n=3).

58

Luego se quiso establecer el grado de fosforilación de ERK1/2 a tiempos cortos inducido por ALC 50 µM. Para ello las células, en las mismas condiciones anteriores, fueron estimuladas con ALC 50 µM a diferentes tiempos y se realizó una inmunodetección (Figura 13). En ésta se apreció el aumento progresivo de la fosforilación de ERK1/2 hasta los 60 minutos de estímulo con ALC 50 µM. A los 60 minutos se apreció la máxima fosforilación y luego una disminución en los 120 y 180 minutos. El aumento de la fosforilación observado a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos fue altamente significativo con respecto al vehículo (P < 0,01) y a los 5 minutos es significativo con respecto al vehículo (P< 0,05). En conclusión, ALC induce la fosforilación de ERK1/2 a tiempos cortos y ésta es dependiente de la concentración del ligando en las células DGBEC WT.

59

A

B

C

V

5

15 30

60 120 180 (min)

pERK1/2

44 kDa 42

ERK1/2

44 kDa 42

0,8

**

**

pERK/ERK

0,6

0,4

0,2

0,0 V

5

15

30

60

120

180

Tiempo (min)

Figura 13. Estudio cinético de la fosforilación de ERK estimulado con ALC 50 µM en las células DGBEC. Las células DGBEC WT se mantuvieron en ausencia de SBF durante 16 horas previo al estímulo con ALC 50 µM a diferentes tiempos. La inmunodetección (A) se realizó por Western blotting utilizando los anticuerpos monoclonales anti-pERK1/2 1:2.000 y anti-ERK1/2 1:4.000. Los anticuerpos secundarios fueron anti-ratón 1:25.000 y anti-conejo 1:25.000, respectivamente. C corresponde al control (células sin estimular) y V al vehículo del ligando ALC (metanol/agua razón 1:1). El panel B corresponde al análisis densitométrico de pERK1/2 normalizado con ERK1/2 (n=3).

60

4.6.1 Participación de diferentes proteínas en la fosforilación de ERK1/2. Como se había descrito, la fosforilación de las ERKs se produce al activar el receptor Gpbar1 inducido por desoxicolato (o ácido desoxicólico). Esta activación de las ERKs sería por la transactivación de EGFR (Yasuda, et al, 2007). Se quiso saber si la activación de ERK también se produciría por transactivación en las DGBEC WT. Para ello las células DGBEC WT fueron cultivadas hasta obtener un 80% de confluencia y estimuladas con ALC 50 µM o INT777 30 µM a tiempos cortos y/o con inhibidores específicos durante 30 minutos previo al estímulo con el ligando (métodos 3.2.3.1). Se extrajeron las proteínas totales y se detectaron mediante Western blotting. La primera proteína a determinar su participación en la transactivación fue EGFR. Para ello se utilizó el inhibidor AG1478 que inhibe en forma específica la actividad tirosina quinasa de EGFR. En la Figura 14 se muestra el blot incubado con anti-pERK1/2 y anti-ERK1/2 (panel A) y el gráfico (panel B) muestra la cuantificación de pERK1/2 normalizado con ERK1/2 (n =3). En el primer carril se ve el tratamiento con el vehículo (metanol/agua en la razón 1:1), el cual produjo un pequeño aumento en al fosforilación de ERK1/2. A pesar de ello el aumento de pERK1/2 inducido por ALC 50 µM a los 5, 15 y 60 minutos fue significativo con respecto al vehículo (P < 0,01). En el segundo carril se hizo un control del inhibidor, por lo que se estimuló solo con éste para ver si produce un aumento en pERK, lo cual no fue así. De forma paralela a la estimulación con el ligando, se incubó previamente con el inhibidor AG1478 1 µM por 30 minutos, y luego se estimuló con ALC 50 µM. La fosforilación de ERK1/2 inducida por ALC se vio drásticamente disminuida al preincubar las células con el inhibidor específico de EGFR (P < 0,01). Esto implica un rol fundamental de EGFR en la activación de las ERKs inducida por el ALC a tiempos cortos.

61

A

5 +

ALC 50 µM AG1478 1 µM

+

15 + +

+

60 + +

(min)

+

+ +

pERK1/2

44 kDa 42

ERK1/2

44 kDa 42

B

1,4

**

1,2 **

pERK/ERK

1,0 0,8

**

0,6 0,4 0,2 0,0 V

+ -

+

+ + 5

+

+ + 15

+ +

+ 60

AG1478 1 M ALC 50 M Tiempo ALC (min)

Figura 14. Participación del receptor de factor de crecimiento epidérmico en la activación de ERK1/2. Las células DGBEC WT fueron estimuladas con el vehículo (metanol/agua razón 1:1) y con ALC 50 µM a diferentes tiempos previamente incubado o no con el inhibidor AG1478 1 µM por 30 minutos. Para la inmunodetección (A) mediante Western blotting se utilizaron los anticuerpos anti-pERK 1/2 1:2.000, anti-ERK 1/2 1:4.000, anti-ratón 1:25.000 y anti-conejo 1:25.000, respectivamente. C corresponde al control (células sin estimular). El panel B corresponde al análisis densitométrico de pERK1/2 normalizado con ERK1/2 (n=3).

62

Puesto que hay diferentes vías de transactivación del EGFR, se evaluó la participación de las metaloproteasas de la matriz extracelular (MMP) en este mecanismo. Éstas están implicadas en el procesamiento del proligando de EGFR; pro-HB-EGF (forma inactiva) a EGF-(HB) (forma activa) (Prenzel et al., 2000, Lee 2002). La inhibición de este proceso mediante un inhibidor específico de MMP resultaría en el bloqueo de la transactivación de EGFR. El inhibidor utilizado fue GM6001 a una concentración de 10 µM. La Figura 15 muestra en el panel A la inmunodetección de pERK1/2 y ERK1/2 y en el panel B, el análisis densitométrico de tres repeticiones (n=3). A pesar de que el vehículo (V) estimuló en alguna medida la fosforilación de ERK1/2, el estímulo con ALC 50 µM es significativo con respecto al vehículo (P < 0,01). Las células preincubadas con GM6001 10 µM y luego estimuladas con ALC 50 µM mostraron una gran disminución de pERK1/2 en comparación con las células estimuladas solo con ALC 50 µM (P < 0,01). A medida que pasó el tiempo (entre los 15 y 60 minutos) el grado de inhibición inducido por GM6001 disminuyó significativamente (P < 0,05). Se puede concluir que las MMP están implicadas, por lo menos parcialmente, en la transactivación autocrina de EGFR inducido por ALC a tiempos cortos. En la señalización mediada por Gpbar1, río arriba de las MMP, podrían estar involucradas las proteínas de la familia Src. Se ha observado en otros estudios que estas proteínas modularían la actividad de las MMP (Pai et al., 2002). Debido a esto se quiso saber el rol de Src en la transactivación de EGFR inducida por ALC. En este caso se utilizó el inhibidor específico PP1 a una concentración de 10 µM. En la Figura 16 se muestra una inmunodetección de pERK1/2 y del total ERK1/2 (panel A) de las células DGBEC WT estimuladas con ALC 50 µM y con o sin el inhibidor PP1. Además, en el panel B se muestra un gráfico del análisis densitométrico donde se representa el promedio + la desviación estándar de tres experimentos independientes (n=3). Al

63

5

A

ALC 50 µM

+

GM6001 10 µM

B

+

+

15 + +

+

+

(min) + +

pERK1/2

44 kDa 42

ERK1/2

44 kDa 42

0,7

**

0,6

**

0,5

pERK/ERK

60 +

**

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 V

+ -

+

+ + 5

+

+ + 15

+

+ + 60

GM6001 10 M ALC 50 M Tiempo ALC (min)

Figura 15. Participación de las metaloproteasas en la activación de ERK1/2. Las células DGBEC WT fueron estimuladas con el vehículo (metanol/agua razón 1:1) y con ALC 50 µM a diferentes tiempos previamente incubado o no con el inhibidor GM6001 10 µM por 30 minutos. El panel A muestra la inmunodetección mediante Western blotting. Los anticuerpos utilizados fueron anti-pERK 1/2 1:2.000, anti-ERK 1/2 1:4.000, anti-ratón 1:25.000 y anti-conejo 1:25.000, respectivamente. C corresponde al control (células sin estimular). El panel B corresponde al análisis densitométrico de pERK1/2 normalizado con ERK1/2 (n=3).

64

A

5

ALC 50 µM PP1 10 µM

+ +

15 + + +

+ +

60 (min) + + +

pERK1/2

44 kDa 42

ERK1/2

44 kDa 42

B

1,2 * 1,0 **

pERK/ERK

0,8 ** 0,6

0,4

0,2

0,0 V

+ -

+

+ + 5

+

+ + 15

+

+ + 60

PP1 10 M ALC 50 M Tiempo ALC (min)

Figura 16. Participación de Src en la activación de ERK1/2. Las células DGBEC WT fueron estimuladas con el vehículo (metanol/agua razón 1:1) y con ALC 50 µM a diferentes tiempos previamente incubado o no con el inhibidor PP1 10 µM por 30 minutos. El panel A muestra la inmunodetección mediante Western blotting. Los anticuerpos utilizados fueron anti-pERK 1/2 1:2.000, anti-ERK 1/2 1:4.000, anti-ratón 1:25.000 y anti-conejo 1:25.000, respectivamente. C corresponde al control (células sin estimular). El panel B corresponde al análisis densitométrico de pERK1/2 normalizado con ERK1/2 (n=3).

65

igual que en el ensayo anterior, al incubar previamente con el inhibidor y luego estimular con ALC durante 5 y 15 minutos, la fosforilación de ERK1/2 se vio drásticamente disminuida en comparación con el estímulo de ALC respectivo (P < 0,01). A los 60 minutos de estímulo con ALC y previa incubación con el inhibidor PP1, los niveles de pERK1/2 se vieron disminuidos significativamente con respecto al estímulo de los 60 minutos de ALC (P < 0,05). A pesar de ello, los niveles fueron superiores a los anteriores (5 y 15 minutos), lo que podría indicar una pérdida del efecto del inhibidor o la activación de otra vía. Cabe destacar que los niveles de pERK1/2 inducidos por ALC 50 µM a los 5, 15 y 60 minutos fueron altamente significativos con respecto al vehículo (P < 0,01). De esta manera, se puede inferir que las proteínas de la familia Src están implicadas parcialmente en la fosforilación de pERK1/2 inducida por ALC a tiempos cortos. La vía clásica de señalización de los GPCRs parte con la unión del ligando al receptor. Esto permite la interacción y activación de las proteínas G heterotriméricas. En el caso de Gpbar1 las proteínas G que se asocian al receptor son; Gα s, Gβ y Gγ. La proteína Gα s activada (α•GTP) se va a unir a la proteína AC e induce la producción de AMPc. El aumento de sus niveles va a activar a la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) (Michel y Scott, 2002). Con el objeto de determinar el papel de la proteínaαG s/PKA en la fosforilación de las ERKs se utilizó un inhibidor específico de PKA llamado H-89. Para ello se utilizó el mismo ensayo anterior solo que se preincubaron las células con el inhibidor H-89 a una concentración de 10 µM por 30 minutos. El análisis densitométrico (panel B) de la Figura 17 consta de solo 2 repeticiones (n = 2), por lo que no se pudo hacer el análisis estadístico. Los niveles de pERK1/2 inducidos por ALC a los 5, 15 y 60 minutos fueron mayores que los producidos por el vehículo y el inhibidor H-89. A pesar de ello no se logró obtener la cinética observada en la Figura 13 (aumento progresivo de pERK1/2). Sorprendentemente, el estímulo solo con el inhibidor de PKA produjo un aumento

66

A

5 +

ALC 50µM H-89 10µM

15 + +

+

+

+ +

+

60 (min) + +

pERK1/2

44 kDa 42

ERK1/2

44 kDa 42

1,0

B

pERK/ERK

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0 V

+ -

+

+ + 5

+

+ + 15

+

+ + 60

H-89 10 M ALC 50 M Tiempo ALC (min)

Figura 17. Participación de PKA en la activación de ERK1/2. Las células DGBEC WT fueron estimuladas con el vehículo V (metanol/agua razón 1:1) y con ALC 50 µM a diferentes tiempos previamente incubado o no con el inhibidor H-89 10 µM por 30 minutos. El panel A muestra la inmunodetección mediante Western blotting. Los anticuerpos utilizados fueron anti-pERK 1/2 1:2.000, anti-ERK 1/2 1:4.000, anti-ratón 1:25.000 y anti-conejo 1:25.000, respectivamente. C corresponde al control (células sin estimular). El panel B corresponde al análisis densitométrico de pERK1/2 normalizado con ERK1/2 (n=2).

67

en los niveles de pERK1/2. Además, el estímulo con ALC 50 µM previamente incubado con el inhibidor H-89 tanto a los 5, 15 y 60 minutos produjo un aumento de pERK1/2 superior al estímulo respectivo con ALC 50 µM. Esto lleva a pensar que la activación de PKA estaría ejerciendo un rol negativo en la fosforilación de ERK1/2, ya que al inhibir PKA los niveles de pERK1/2 aumentan. Todos los ensayos anteriores fueron realizados con el ligando endógeno ALC. Existiendo un ligando sintético específico de Gpbar, se evaluó si el ligando INT777 produce el mismo efecto que el ALC. Para ver un mayor efecto de ambos ligandos se utilizaron las células establemente transfectadas. Cada línea celular fue estimulada con el vehículo de ALC, ALC 50 µM durante 5 y 15 minutos, con el vehículo de INT777 e INT777 30 µM a diferentes tiempos. Las proteínas totales fueron extraídas y se realizó la inmunodetección mediante Western blotting. En la Figura 18, las células MDCKI-Gpbar1GFP (panel A y C) estimuladas con el vehículo metanol/agua mostraron un gran aumento de pERK1/2. Sin embargo, el estímulo con ALC a los 5 y después a los 15 minutos fue mayor y progresivo. El vehículo DMSO indujo una fosforilación de las ERKs menor que el vehículo con metanol/agua, pero el estímulo con INT777 generó un aumento de pERK1/2 a los 5 minutos y luego una disminución gradual (a excepción en los 120 minutos). Por otro lado, en las células DGBEC-Gpbar1GFP (panel B y D) el vehículo metanol/agua no produjo un aumento importante en la fosforilación de las ERKs y la activación de ERK1/2 obtenida por el estímulo con ALC fue similar a los dos primeros tiempos de la cinética con las células WT. Contrario a lo que sucede en las células MDCKI-Gpbar1GFP, el vehículo DMSO produjo una mayor activación de ERK1/2 en comparación con el vehículo metanol/agua. Además, el estímulo con INT777 (al igual que en las células MDCKI-Gpbar1GFP) produjo una disminución gradual de pERK1/2 a medida que pasaban los minutos. El efecto producido por INT777 al parecer fue

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MDCK-Gpbar1GFP

A V1

DGBEC-Gpbar1GFP

B

ALC 50 µM

ALC 50 µM INT777 30 µM 5 15 V2 5 15 30 60 120 (min)

V1

5

15 V2

INT777 30 µM 5

15 30 60 120 (min) 44 kDa

pERK1/2

42

ERK1/2

C

42 kDa

2,0

D

1,5

pERK/ERK

pERK/ERK

1,5

2,0

1,0

0,5

1,0

0,5

0,0

0,0 V1

5

15

ALC 50 M

V2

5

15

30

60

120 (min)

INT777 30 M

V1

5

15

ALC 50 M

V2

5

15

30

60

120 (min)

INT777 30 M

Figura 18. Comparación entre el estímulo con ALC 50 µM e INT777 30 µM en las células establemente transfectadas con hGpbar1GFP. Las células DGBEC-Gpbar1GFP (A y C) y MDCKI-Gpbar1GFP (B y D) fueron estimuladas con el vehículo V1 (metanol/agua razón 1:1) o V2 (DMSO), con ALC 50 µM por 5 y 15 minutos y con INT777 30 µM a diferentes tiempos. La inmunodetección (A y B) se realizó mediante Western blotting. Los anticuerpos utilizados fueron anti-pERK 1/2 1:1000 (Santa Cruz), anti-ERK 1/2 1:3000 (BD Transduction Lab), anti-ratón 1:5.000 y anti-conejo 1:5.000 (Chemicon), respectivamente. Los paneles C y D son la representación gráfica de la inmunodetección (n=1).

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totalmente diferente al producido por ALC, llevando a la disminución progresiva de pERK1/2 en el tiempo. De acuerdo a lo mostrado en la figura 7, INT777 induce altos niveles de AMPc, lo que podría ocasionar un efecto similar al que produce PKA (Figura 17).

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5. DISCUSIÓN

Se ha demostrado que los ABs, además de su rol en la digestión de lípidos, actúan como moléculas señalizadoras. Uno de los primeros receptores nucleares identificado que responde a los ABs es FXR. Este receptor activa enzimas y proteínas en la síntesis de ABs, metabolismo de lipoproteínas y homeostasis de glucosa. Otros receptores que se activan por ABs son PXR, CAR y VDR (Schmidt y Mangelsdorf, 2008). Hace algún tiempo investigadores han demostrado que los ABs producen activación de proteínas quinasas como PKC y MAPKs (Beuers et al., 1996; Kurz et al., 2001) y aumento de AMPc en segundos o minutos (Potter et al., 1991). Por la rapidez de la respuesta se pensó que estos efectos podrían ser producidos por mecanismos independientes de transcripciones. Eventualmente se encontró un receptor acoplado a proteína G, Gpbar1, el cual responde a ABs y produce aumentos de AMPc de manera dosis-dependiente (Maruyama et al., 2002). Últimamente el estudio de Gpbar1 ha cobrado gran importancia, ya que se ha visto involucrado en una serie de patologías y desórdenes metabólicos, incluyendo obesidad y diabetes (Pols et al., 2011). Además su delección genética (Gpbar1− /−) protege a ratones de la litiasis y pancreatitis aguda biliar (Vassileva et al., 2006; Perides et al., 2010). Por otra parte, se ha visto que Gpbar1 activa la vía de las MAPKs inducido por ABs a través de EGFR (Yasuda et al., 2007). Dado que Gpbar1 se encuentra en el epitelio de la vesícula biliar, en contacto con altas concentraciones de ligandos, es interesante evaluar el tráfico y características de señalización de esta proteína en epitelios. Basados en estos antecedentes se decidió estudiar el tráfico polarizado de Gpbar1 en células epiteliales polarizadas y las características de la vía de señalización inducido por ALC.

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En la presente tesis, se utilizaron diferentes aproximaciones experimentales como Western blotting, microscopía, biotinilación dominio específica, separación isopícnica en gradiente de sacarosa para determinar la ubicación de Gpbar1 en balsas lipídicas, su posible internalización inducida por ligandos y activación de vías de señalización asociadas a MAPKs en cultivos in vitro de las líneas DGBEC y MDCK-I wild type o establemente transfectadas con el receptor.

5.1 Localización subcelular del receptor Gpbar1. La expresión estable del receptor unido a GFP en ambas líneas celulares se pudo corroborar por las imágenes obtenidas por microscopía (Figura 4A y B) y mediante Western blotting (Figura 4C y D). Gpbar1 se distribuyó principalmente en la membrana plasmática de las células DGBEC- y MDCK-Gpbar1GFP (color verde) y además, se apreció una acumulación del receptor en el interior de las células (indicado con la flecha roja). Esta acumulación, al parecer, tiene una localización perinuclear, lo que lleva a pensar que podría tratarse del aparato de Golgi y/o de endosomas de reciclaje. Para tener mayor certeza se debería realizar una colocalización de la proteína de fusión con diferentes marcadores y luego visualizarlo con microscopía de epifluorescencia. En la inmunodetección se reconocen de 2 a 3 bandas. Lo más probable es que éstas correspondan a diferentes grados de maduración del receptor, siendo la banda superior (82 kDa) la forma madura y las otras 2 bandas (64 y 51 kDa) corresponderían a versiones inmaduras de Gpbar1-GFP. Esto se debe a que la mayoría de las GPCRs son glicosilados en su dominio extracelular, debido a que las estructuras glicanas (oligosacáridos) son importantes para la función o expresión normal de los receptores. En el caso del receptor de rodopsina (Kaushal et al., 1994) y el receptor β2-adrenérgico (Rands et al., 1990) la glicosilación permite el correcto plegamiento y/o tráfico del receptor hacia la membrana plasmática. Para otros GPCRs como el

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receptor de tirotropina (Russo et al., 1991) y el receptor del péptido liberados de gastrina (Kusui et al., 1994) son importantes para la unión de alta afinidad del ligando y/o la unión de la proteína G al receptor. El receptor Gpbar1 tiene en su secuencia 3 posibles sitios de glicosilación en el extremo amino terminal y loops extracelulares (datos no mostrados), en los cuales podrían ser añadidos estructuras de azúcares durante su plegamiento y síntesis en el retículo endoplasmático. En ambas líneas celulares establemente transfectadas con la proteína de fusión, Gpbar1GFP, se pudo apreciar la expresión del receptor en la cara basolateral de las células tanto por biotinilación como por microscopía confocal (Figuras 5 y 6, respectivamente). Estos resultados concuerdan con los de Hov y colaboradores (2010), en el cual el constructo Gpbar1 WT-YFP se expresa en la cara basolateral de las células MDCK-II. A pesar de ello, estos resultados difieren a lo observado fisiológicamente en tejido humano de vesícula biliar, donde el receptor se ubica principalmente en la cara apical del epitelio (Keitel et al., 2009) y en el cilio primario de células epiteliales del conducto biliar (Masyuk et al., 2013). Diferentes estudios han demostrado que parte de la maquinaria responsable de la destinación polarizada de las proteínas en epitelio puede ser diferente entre un tipo celular y otro. Un ejemplo es el receptor de transferrina, el cual se expresa apicalmente en las células porcinas del túbulo proximal de riñón (LLC-PK1), mientras que en las células MDCK-II se expresa en la cara basolateral. Esta diferencia fue atribuida a la falta de la subunidad µ1B de la proteína adaptadora AP1 (Folsch et al., 1999). Por otra parte, en la microscopía confocal (Figura 6) se observó que las células presentaron acumulación del receptor en vesículas intracelulares, de las cuales la mayoría se ubica en la zona perinuclear. Lo más probable es que se traten de endosomas de reciclaje y no del aparato de Golgi, aunque se requieren más estudios para corroborarlo.

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5.2 Activación del receptor Gpbar1. Los ligando ALC e INT777 activan al receptor, ya que producen altos niveles de AMPc (Figura 7) en las células establemente transfectadas con respecto a sus vehículos. El aumento de AMPc inducido por INT777 10 y 30 µM, resultó ser dependiente de la concentración en ambas líneas celulares. Ya se había visto anteriormente, en otro trabajo, que los niveles de AMPc inducidos por INT777 3 µM fueron 3 veces mayor que los niveles de AMPc inducido por el vehículo en cultivo primario de macrófagos (Pols et al., 2011). En cuanto a ALC 50 µM en las células MDCKI-Gpbar1GFP, éste indujo más del doble de los niveles de AMPc obtenidos por INT777 30 µM. Mientras que en las células DGBEC-Gpbar1GFP los niveles de AMPc inducidos por ALC 50 µM fueron muy inferiores a los alcanzados por las células MDCKI-Gpbar1GFP (diferencia de 13,5 veces). El aumento de AMPc en estas células podría ser debido a que Gpbar1 sea modulado por un ligando alostérico. Alostérico se refiere a sitios de unión diferentes al sitio de unión del agonista o del sustrato primario (ortostérico). Por lo tanto, los ligandos alostéricos no pueden activar al receptor y solo en presencia del agonista pueden modular (potenciar o inhibir) la respuesta celular. Algunos ligandos alostéricos endógenos de GPCRs son iones, ácidos grasos y aminoácidos (Jensen y Spalding, 2004). También se podría explicar, la diferencia de niveles de AMPc entre las 2 líneas celulares estables al ser estimuladas con ALC, por la presencia de proteínas reguladoras de la señalización de proteína G (RGS). Éstas modulan la actividad de las proteínas G. La función más conocida es la de acelerar la hidrólisis de GTP (actividad GAP), por lo que inhibirían la señalización mediada por las proteínas G. También pueden potenciar la activación de las proteínas G y actuar como proteínas de andamiaje. Las RGS son específicas del tejido y son fuertemente reguladas por eventos de transducción de señales (Zhong y Neubig, 2001). Ciertas RGS no poseen la actividad GAP hacia Gαs, la proteína Gα asociada a Gpbar1,

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pero tienen un efecto negativo en la producción de AMPc. Esto implica que estas RGS estarían inhibiendo la señalización de α G s, independientemente de la actividad GAP. De hecho se ha demostrado la interacción de RGS2 con Gα s y con diferentes isoformas de AC. La expresión de RGS2 en células HEK293, redujo la producción de AMPc inducido por glucosa en 50% a través del receptor de insulina (Bansal et al., 2007). Además se ha visto que RGS1 y RGS16 son capaces de interaccionar con la proteína de fusión α2AR-Go1α (receptor adrenérgico α 2 unido a la proteína Gαo1) y reducen la potencia del agonista adrenalina en gran medida en comparación con el agonista parcial UK14304. Esto sugiere una posible interacción entre las proteínas RGS con α2AR, las cuales cambiarían la conformación del receptor y llevarían a una actividad alterada del agonista (Hoffmann et al., 2001). En el caso de Gpbar1, podría ocurrir que una proteína RGS se una al receptor produciendo un cambio conformacional en éste e inhibiendo la señalización de AMPc inducida por ALC y no por INT777. Como se dijo anteriormente la distribución de las RGS es única para cada tejido, por lo que las células MDCK no expresarían la proteína RGS que se une al receptor Gpbar1 en las células DGBEC. Por otra parte, en ambas líneas celulares WT, el estímulo con el vehículo produjo un mayor aumento de AMPc en comparación con ALC 50 µM. Al parecer el vehículo metanol/agua estaría produciendo una activación del receptor Gpbar1 u otros receptores, los cuales estarían implicados en el aumento de AMPc. En forma similar, el vehículo, en algunos casos, activó levemente a las ERK1/2 de acuerdo a la inmunodetección con el anticuerpo anti p-ERK1/2.

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5.3 Asociación de Gpbar1 a balsas lipídicas. Dentro de la caracterización del receptor Gpbar1, se quiso conocer si éste estaba asociado o no a balsas lipídicas y cavéolas. Se han descrito muchos GPCRs asociados a balsas lipídicas constitutivamente y/o al ser estimulados con su ligando. Además de los GPCRs se encuentran proteínas G y efectores que regulan proteínas G, formando complejos de señalización (Insel et al., 2005). La importancia de la asociación de los componentes de señalización a balsas lipídicas y cavéolas radica en que estos, al parecer, estarían regulando la señalización y tráfico de ciertos GPCRs. En el caso del receptor tipo 1 de angiotensina II, la interacción de caveolina con el receptor ha sido implicado en la destinación del receptor a la membrana, pero esta interacción no resulta en la secuestración del receptor en cavéolas (Wyse et al., 2003). Por otra parte, dependiendo de la ubicación del receptor de oxitocina en diferentes microdominios de la membrana plasmática (algunos que contenían caveolina-1 y los otros no), la respuesta celular varió de una activación del crecimiento celular (receptor excluido de cavéolas) a una inhibición del crecimiento (receptor en cavéolas). Esto se debería a una diferencia en la transactivación de EGFR (Rimoldi et al., 2003). Los resultados obtenidos en esta tesis mostraron que Gpbar1 no está asociado a cavéolas constitutivamente ni al ser estimulado con su ligando. Esto no quiere decir que no exista la posibilidad de que Gpbar1 esté asociado a balsas lipídicas, ya que las cavéolas (microdominios enriquecidos en colesterol que contienen caveolina) son solo un tipo de balsas lipídicas. Aun así la probabilidad es baja, ya que el receptor se ubica en las fracciones de alta densidad de la gradiente de sacarosa. Esto sugiere que el receptor no estaría ubicado en microdominios de la membrana plasmática enriquecidos en colesterol y glicoesfingolípidos en las células DGBEC y MDCK-I. Sin embargo, no se excluye la posibilidad de que Gpbar1 esté ubicado en cavéolas o balsas lipídicas en el epitelio de vesícula biliar humana u otro tipo celular.

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Se ha demostrado que la localización y señalización de GPCRs depende del tipo celular, lo cual estaría determinado por la ubicación del receptor o uno de los componentes de señalización en balsas lipídicas o no. Un ejemplo sería el del receptorβ 2-adrenérgico (y las isoformas 5 y 6 de la adenilato ciclasa), el cual en miocitos o fibroblastos cardíacos se encuentra en balsas lipídicas. Mientras que en las células epiteliales de las vías respiratorias, el receptor β 2-adrenérgico (al igual que las isoformas 5 y 6 de la adenilato ciclasa) no se ubica en balsas lipídicas (Ostrom y Insel, 2004).

5.4 Internalización de Gpbar1. Un supuesto en este trabajo fue que Gpbar1 se comportaría como muchos de los GPCRs, los cuales suelen ser endocitados en presencia de ligando (Lefkowitz, 1998). Contrariamente, los resultados obtenidos mostraron que el receptor Gpbar1 no fue endocitado al ser expuesto a su ligando en células polarizadas (Figuras 8, 9 y 10). No obstante, Kawamata y colaboradores (Kawamata et al., 2003) demostraron la internalización del receptor en células de ovario de hámster chino (CHO) inducido por ácido litocólico conjugado a taurina (ALCT). Estos resultados son contradictorios, pero divergen en el tipo celular. Como ya se mencionó anteriormente, distintos tipos celulares tienen diferentes componentes de la maquinaria encargada de la destinación de las proteínas a la membrana plasmática, lo que explicaría la destinación del receptor Gpbar1 a la cara basolateral de las células polarizadas. Así mismo, si este componente u otro, que fuese indispensable para la endocitosis de Gpbar1, no estuviese presente en estos 2 tipos celulares resultaría en lo obtenido en esta tesis. Por otra parte, se han descrito ciertas proteínas que confieren estabilidad en la membrana plasmática a GPCRs (Tan et al., 2004; Ritter y Hall, 2009). La destinación de Gpbar1 a la cara basolateral pudiese provocar el secuestro de éste por

77

otra proteína, estabilizando al receptor. Un ejemplo es el del transportador γ de ácido

-

aminobutírico (BGT), el cual se une a LIN-7 por el motivo PDZ. La interacción le da estabilidad, evitando la internalización del transportador (Perego et al., 1999).

5.5 Activación de las vía de las MAPKs inducida por agonistas de Gpbar. A pesar de no ser endocitado el receptor Gpbar1 en las células DGBEC, éste si fue capaz de producir la activación de las ERKs descrito por Yasuda y colaboradores (2007). Al parecer, la falta de internalización del receptor no altera su función señalizadora, al menos no a la encargada de la activación de ERK. Una situación similar se produce al sobreexpresar la proteína de densidad postsináptica PSD-95. Esta proteína se une al receptorβ1 adrenérgico, inhibiendo la internalización de éste, pero no afecta su función (Hu et al., 2000). La activación de las ERKs resultó ser dependiente de la concentración (Figura 13). Además, la activación del receptor EGFR inducida por ALC fue completamente inhibida por AG1478 a tiempos cortos (Figura 14), indicando que Gpbar1 es capaz de producir la transactivación de EGFR. Estos resultados son similares a los descritos por Yasuda y colaboradores (2007). Por otra parte, proteínas de la familia Src y metaloproteasas (MMP) también están implicadas, por lo menos parcialmente, en la fosforilación de ERK1/2 (Figuras 15 y 16). Se ha descrito previamente que la transactivación de EGFR producida por GPCRs ocurre mediante la activación de las MMP, las cuales escinden el proligando y producen la liberación de ligandos activos de EGFR de la membrana plasmática (Prenzel et al., 1999). La fosforilación de ERK1/2 inducida por ALC en presencia del inhibidor de MMP, GM6001, es mayor a la obtenida usando el inhibidor de EGFR. La inhibición parcial de las MMP podría deberse a que GM6001 inhibe ciertas MMP (MMP 1, 2, 3, 8 y 9). Se ha demostrado que algunas proteínas desintegrinas y metaloproteasas, conocidas como ADAM

78

(ADAM 10,12 y 17), también están implicadas en el corte del proligando de EGFR (Singh y Harris, 2005). La utilización de GM6001 y otro inhibidor complementario darían a conocer el rol de las MMP en la transactivación autocrina de EGFR. Igualmente, se observó una inhibición de la fosforilación de las ERKs con el inhibidor PP1 sugiriendo la participación de Src en el mecanismo de transactivación. En cuanto al rol de las quinasas de la familia de Src es más complejo. Se ha descrito que las proteínas Src podrían estar involucradas en la transactivación de EGFR, activando las MMP (Pai et al., 2002). Por otra parte, al parecer hay una vía, en la cual Src estaría modulando la actividad de ERK directamente (McCole et al., 2002). Se ha visto también que Src puede activar directamente EGFR fosforilando la tirosina 845 (Andreev et al., 2001; Alexander et al., 2006; Fuentes et al., 2008). Por otro lado, se ha demostrado que EGFR activa Src (Wilde et al., 1999) y que ambos pueden funcionar sinérgicamente (Tice et al., 1999; McCole et al., 2002). Se deben realizar ensayos adicionales para determinar la implicancia de Src en las células DGBEC al ser inducidas con el ligando ALC. Otro aspecto en la señalización de TGR5 es la participación de la proteína Gα s y PKA en la activación de las ERKs. Según los resultados en esta tesis, no se observan grandes cambios en la fosforilación de las ERKs después de la inhibición de PKA con H-89 (Figura 17). Debido a los pocos ensayos efectuados, no se pudo realizar el análisis estadístico. De haber sido significativo el aumento de la fosforilación de las ERKs en presencia del inhibidor, esto corroboraría lo descrito por Stork y Schmitt (2002) sobre la comunicación cruzada entre PKA y la vía de las ERKs.

79

Finalmente, se utilizó el ligando INT777 (agonista semi-sintético de Gpbar1) en células establemente transfectadas para ver el grado de fosforilación de las ERKs (Figura 18). La tendencia en ambas líneas celulares fue una disminución progresiva de la fosforilación de ERK 1/2. Esto no es extraño, ya que como se mostró en la Figura 7, INT777 eleva los niveles de AMPc. Altos niveles de AMPc activarían a PKA y por consiguiente resultaría en la inhibición de ERK 1/2 por una posible comunicación cruzada entre la vía Gα s/AMPc/PKA y la vía de las ERKs (Stork y Schmitt, 2002). A pesar de que este ensayo fue realizado solo una vez y debe ser corroborado más adelante, sugiere que INT777 y ALC producen diferentes vías de señalización. Otros GPCRs también comparten esta característica. Por ejemplo, los miembros de la familia ErbB de los receptores tirosina quinasas (RTKs) se unen a varios factores de crecimiento. Estos producen diferentes respuestas celulares, debido a su habilidad de unirse diferencialmente y dimerizar receptores ErbB (Gschwind et al., 2001). Además, la discriminación por el ligando induce fosforilación diferencial de los receptores ErbB, lo cual contribuye a la diversidad de la señalización producida por los factores de crecimiento (Sweeney y Carraway, 2000). Muy recientemente, Masyuk y colaboradores (2013) han demostrado la ubicación de Gpbar en el cilio primario (cara apical) en colangiocitos (células H69). Al ser expuesto Gpbar a agonistas (INT777 y ALCT), éste se asociaría a Gα i inhibiendo la producción de AMPc, aumentando la fosforilación de ERK1/2 y disminuyendo la proliferación celular. Mientras que en células que no presentan el cilio primario, al ser estimulado Gpbar con sus agonistas, éste se asociaría αa G

s

produciendo

efectos contrarios respecto a AMPc, ERK y proliferación celular. Según las condiciones del cultivo empleadas en esta tesis previo a la estimulación con el ligando (80 % de confluencia), las células no debieron haber alcanzado a formar el cilio primario. Comparando la misma condición (ausencia de cilio primario) en ambos tipos celulares (DGBEC y H69), la estimulación con ALC

80

produjo un aumento de la fosforilación de ERK 1/2. Mientras que el ligando INT777 no logró la activación de ERK 1/2 en las células DGBEC a diferencia de la activación de las ERKs observada en colangiocitos inducida por el agonista. Esto prueba la importancia de la localización de Gpbar en diferentes microdominios de la membrana y que la señalización es dependiente de la ubicación del receptor. En resumen este trabajo ha demostrado que el receptor hGpbar1 se ubica basolateralmente en células polarizadas y no estaría asociado a cavéolas. El ligando ALC logra inducir la activación de ERK 1/2 mediante la transactivación de EGFR, independientemente de la internalización de Gpbar1. Según los resultados obtenidos se propone el siguiente esquema de señalización (Figura 19), en la cual el ALC induce la transactivación de EGFR y la activación de las ERKs a tiempos cortos en células polarizadas. Estudios futuros son necesarios para la completa caracterización de este receptor que revelarán su rol fisiológico y el descubrimiento de drogas para el posible potencial terapéutico de Gpbar.

81

Figura 19. Representación esquemática del posible mecanismo a través del cual ALC induce la fosforilación de ERK 1/2 en la cara basolateral de células polarizadas. ALC induciría la activación de las MMP (probablemente a través de β -arrestina) mediante el receptor Gpbar. Las MMP producirían el corte del proligando (HB-EGF) de EGFR, liberándose el ligando activo (EGF). Éste se uniría a EGFR e induciría la autofosforilación de receptor. El receptor activado llevaría a la modulación positiva de la vía de las MAPKs (posiblemente Ras y Raf1, luego MEK 1/2 y finalmente ERK 1/2), lo que se reflejaría en la fosforilación de ERK 1/2. La otra proteína que estaría participando, Src, podría producir la activación de 3 posibles blancos; las MMP, EGFR y directamente sobre las ERKs. Por otra parte, la activación de la proteína αG

s

induciría la activación de la adenilato ciclasa (AC), la cual aumentaría los niveles de AMPc intracelular. Este segundo mensajero llevaría a la activación de PKA y a una posible inhibición de la vía de las MAPKs. Finalmente, predominaría la activación de la vía de las ERKs. Los inhibidores utilizados están en color rojo.

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6. CONCLUSIONES

1. La transfección del plásmido que codifica para la proteína de fusión hGpbar1-GFP en las células polarizadas (MDCK-I y DGBEC), resultó en la expresión basolateral de este receptor. 2. Gpbar1 no se encontraría en dominios enriquecidos en colesterol que contengan caveolina-1 en células polarizadas. 3. El estímulo del receptor con el ligando endógeno o sintético aumenta los niveles de AMPc intracelulares y no induce su internalización. 4. A pesar de ubicarse en la cara basolateral de las células polarizadas y no internalizarse frente a estímulo, el receptor Gpbar1 es capaz de transactivar a EGFR resultando en la activación de las ERKs. 5. Las MMP y quinasas de la familia Src estarían implicadas en la vía de la transactivación de EGFR. 6. Al parecer, el ligando INT777 estaría activando una vía diferente que ALC, llevando a la inhibición de las ERKs.

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7. BIBLIOGRAFÍA

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