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BID/IICA ATN/SF-6486-RG Informe final Mayo 2003

preparado por Geo Coppens d'Eeckenbrugge

INIA

CONTENIDO Páginas 1.

Resumen Introducción Colectas Caracterización morfológica Caracterización isoenzimática Caracterización molecular Caracterización citogenética y palinológica Evaluación físico-química Evaluación de resistencia a nematodos Evaluación de resistencia al virus de la mancha anular Evaluación de resistencia a la bacteria de cancro Diversidad del virus Diversidad de la bacteria Hibridaciones y selección Nivel de ejecución del proyecto

1 1 1 2 2 2 3 4 4 4 5 5 6 6 7

2.

Actividades desarrolladas 2.1. Colecta, recuperación, intercambio y conservación de los recursos genéticos de papayas 2.1.1. Colectas, colecciones e intercambios 2.1.2. Conservación del germoplasma 2.2. Caracterización y evaluación 2.2.1. Caracterización morfológica 2.2.1.1. En Colombia 2.2.1.2. En el Ecuador 2.2.1.3. En Costa Rica 2.2.1.4. Análisis conjunto de datos de Costa Rica y del Ecuador 2.2.1.5. En las Antillas Francesas 2.2.2. Caracterización bioquímica y molecular 2.2.2.1. Caracterización isoenzimática 2.2.2.2. Caracterización por marcadores microsatélites 2.2.2.3. Caracterización del ADN cloroplástico por marcadores CAPS 2.2.2.4. Extracción de ADN en Venezuela 2.2.3. Caracterización citogenética y palinológica 2.2.4. Evaluación 2.2.4.1. Evaluación físico-química 2.2.4.2. Evaluación de resistencias 2.2.4.2.1. Nematodos 2.2.4.2.2. Virus de la mancha anular 2.2.4.2.3. Bacteria del cancro 2.3. Estudio de la variabilidad de los dos principales patógenos 2.3.1. Virus de la mancha anular 2.3.1.1. Venezuela (IVIC) 2.3.1.2. Colombia y Ecuador (CIAT e INIAP) 2.3.1.3. En los tres países 2.3.1.4. Conclusiones 2.3.2. Variabilidad de la bacteria (INIA)

8 8 8 11 12 12 12 12 18 18 20 20 20 23 27 29 29 33 33 33 33 35 38 39 39 40 41 42 42 44

2.4.

Hibridaciones y selección 2.4.1. Hibridaciones interespecíficas 2.4.1.1. En Venezuela 2.4.1.2. En Colombia 2.4.2. Caracterización, selección y autofecundación de segregantes en Costa Rica

44 44 44 47 47

3. Actividades de coordinación 3.1. Taller sobre taxonomía de Caricaceae y manejo de bancos de germoplasma 3.2. Reunión final del proyecto

49 49 49

4.

Nivel de ejecución del proyecto 4.1. Colecciones nacionales 4.2. Caracterización molecular 4.3. Colección nuclear regional 4.4. Genotipos elite 4.5. Inventario de las cepas del virus de la mancha anular y de la bacteria del cancro 4.6. Capacitación en taxonomía y manejo de germoplasma

50 50 50 51 51 51 51

5.

Publicaciones y tesis 5.1. Memorias del Taller Internacional sobre Caricaceae 5.2. Publicaciones 5.3. Presentaciones en congresos 5.4. Tesis de grado 5.5. Tesis de posgrado

52 52 53 53 54 55

6.

Limitaciones para el desarrollo del proyecto

ANEXOS 1.

Conclusiones y recomendaciones de la reunión final del proyecto

2.

Informes de Venezuela 2.1 Aprovechamiento de los recursos genéticos de papaya para su mejoramiento y promoción 2.2 Colecta, establecimiento y caracterización de las especies de papayas en Venezuela. MARN/CNRF 2.3 Extracciones de ADNs de especies de caricas autóctonas de Venezuela para estudios moleculares. INIA/CENIAP 2.4 Susceptibilidad de las Vasconcelleas y Carica papaya a los virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P) y mosaico distorsionante de la hoja de la lechosa (PLMV). INIA/CENIAP 2.5 Evaluación de materiales de Caricáceas a nematodos. INIA/CENIAP 2.6 Estudio de la variabilidad de la bacteria Erwinia sp y selección de materiales resistentes a la bacteriosis en Lechosa ( Carica papaya L.). INIA-/CENIAP 2.7 Caracterización molecular de aislamientos del virus PRSV (papaya Ringspot) en Venezuela; informe final de actividades. IVIC/MCT 2.8 Obtención de híbridos interespecíficos entre lechosa (Carica papaya L.) y otras especies de Vasconcelleas (Caricas). INIA/CENIAP

3.

Informes Colombia 3.1 Colección y caracterización in situ de especies de la familia Caricaceae de tierra caliente y caliente moderada en Colombia. Ver anexo 9, informe de progreso 2002 3.2 Informe final de Proyecto. CORPOICA

56

3.3 3.4

Caracterización y estudio de la diversidad genética en los géneros Vasconcellea y Carica (Caricaceae) en Colombia, Costa Rica y Ecuador por medio de marcadores isoenzimáticos. U. de Caldas, CIRAD-FHLOR/IPGRI Informe Universidad Nacional, Sede Medellín

4. Informes Ecuador 4.1 Colección, caracterización y conservación de caricáceas andinas en Ecuador. UTA 4.2 Diversidad morfológica de las principales especies de papayas de montaña en el Ecuador. UTA, CIRAD-FLHOR / IPGRI 4.3 Estudio de cepas ecuatorianas del virus de la mancha anular. INIAP 5. Informes de Costa Rica 5.1 Caracterización in situ y colecta de muestras de papayas silvestres y cultivadas de Costa Rica para estudios de diversidad. UCR, CIRAD-FLHOR / IPGRI 5.2 Informe final de actividades realizadas en Costa Rica. UCR 6. Informes de CIAT 6.1 Establecimiento de métodos de conservación para semillas de Carica papaya. Informe Unidad de Recursos Genéticos, CIAT. Ver anexo 4 del informe de progreso de 2002 6.2 Caracterización molecular del virus de la mancha Anular de la papaya (PRSV) en Colombia y Ecuador. Laboratorio de Virología, CIAT-IPGRI, Colombia 7. Informes CIRAD-FLHOR 7.1 Inventaire et collecte de Carica papaya aux Antilles Françaises. CIRAD-Guadeloupe 7.2 Développement de marqueurs microsatellites et analyse de la diversité dans les genres Carica et Vasconcellea (Caricaceae). CIRAD-FHLOR/IPGRI 7.3 Desarrollo de marcadores CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (PCR/RFLP) en Vasconcellea y Carica. CIRAD-FLHOR / IPGRI 8. Informes del Proyecto CIRAD-FLHOR/IPGRI para Frutales Neotropicales 8.1 Diversidad morfológica de papayas (Carica papaya L.) y papayuelas (Vasconcellea spp.). Análisis sintético de los datos obtenidos sobre materiales de Costa Rica y del Ecuador . CIRAD-FLHOR / IPGRI 8.2 Estudios citogenéticos y palinológicos en Caricaceae para su utilización en programas de mejoramiento, CIRAD-FLHOR / IPGRI 9.

Ficha de Colecta y Evaluación de Especies de la Familia Caricaceae

2

Aprovechamiento de los recursos genéticos de las papayas para su mejoramiento y promoción Informe final, recopilado por Geo Coppens d’Eeckenbrugge (CIRAD-FLHOR/IPGRI) con la colaboración de Francisco Morales (CIAT-virología)

1. Resumen Introducción La papaya común (Carica papaya L.) es la cuarta fruta tropical por su importancia económica. Otras papayas (Vasconcellea spp.) se cultivan en los Andes. Todas son nativas de América Central y del Sur. Además de la fruta, las papayas producen la papainasa, una enzima proteolítica con usos medicinales e industriales. Tienen gran importancia social, por su ciclo corto, su producción continua, su adaptación a parcelas pequeñas, y su demanda constante de mano de obra. El virus de la mancha anular (PRSV), la bacteriosis, y la antracnosis en América Central, constituyen graves obstáculos a la extensión de los cultivos. No existen cultivares resistentes en la región. Hay pocos trabajos de mejoramiento genético y la producción comercial depende de semillas importadas. El presente proyecto reunió instituciones del Ecuador, de Colombia, Venezuela, Costa Rica y de las Antillas Francesas. Tomó como objetivo sistematizar, reforzar e integrar los esfuerzos regionales para enfrentar los limitantes mayores del cultivo de las papayas a fin de viabilizar la producción agrícola de los pequeños y medianos agricultores, y promover su potencial industrial (papainasa). Así se propuso colectar, conservar y analizar la diversidad genética y hortícola de las papayas y estudiar la variabilidad de los principales patógenos y plagas en los países participantes buscando desarrollar resistencias por métodos tradicionales y biotecnológicos; evaluar el potencial agronómico de los materiales colectados e identificar fuentes de resistencia o tolerancia; Seleccionar materiales elite que puedan ser utilizados en el mejoramiento, o que puedan ser distribuidos directamente a los productores después de su saneamiento y multiplicación (particularmente en el caso del babaco); desarrollar marcadores moleculares de las resistencias para acelerar la introducción de los genes correspondientes en cultivares comerciales estables; introducir genes de resistencia en la papaya común por cruces interespecíficos. Colectas El proyecto ha permitido la colecta de 106 accesiones de los géneros Carica, Vasconcellea y Jacaratia en Colombia, 149 accesiones del género Vasconcellea en la zona andina del Ecuador, 42 accesiones de Carica y Vasconcellea en Venezuela y 80 accesiones de C. papaya en las Antillas Francesas. Estas accesiones se han establecido en colecciones de semillas y/o de campo. Datos morfológicos han sido tomados in situ, durante las colectas, y en colección de campo, siguiendo listas de descriptores desarrolladas durante el proyecto. En Costa Rica, se caracterizaron 37 genotipos silvestres y nueve cultivados de C. papaya. Se han definido estudiado el efecto de las condiciones de almacenamiento para la conservación de las semillas. En C. papaya, éstas soportan desecación entre 11 y 5% al igual que temperaturas de conservación

3 entre 22 y –196°C. Para la germinación, se puede reducir la latencia de la semilla de V. cundinamarcensis y V. goudotiana con giberelina y/o nitrato de potasio. Caracterización morfológica En Vasconcellea, los datos de caracterización morfológica permiten separar claramente las accesiones por especie, tanto en Colombia (V. cundinamarcensis y V. goudotiana) como en el Ecuador (esencialmente V. x heilbornii, con dos notomorfos correspondiendo al babaco y al jigacho, y sus dos presuntos genitores, V. cundinamarcensis y V. stipulata ). Se definieron dos tipos de jigacho, o baby-babaco, uno típico y otro morfológicamente más cercano a V. cundinamarcensis. El análisis de clasificación separa el babaco y cada grupo de jigacho en dos subgrupos, mostrando una heterogeneidad que es importante tomar en cuenta para el mejoramiento genético y la promoción de estas frutas tradicionales en pleno desarrollo comercial. En C. papaya, los datos de Costa Rica muestran que, a pesar de la evidente introgresión entre ellos, los tipos silvestres y cultivados se distinguen esencialmente por caracteres de forma y tamaño de la hoja, tamaño y permanencia de sépalos, disposición de pétalos, además del color de la pulpa y del tamaño del fruto. Aparece también una leve diferenciación geográfica. La comparación con los datos obtenidos en especies de Vasconcellea muestra que éstas no son más cercanas a las papayas silvestres que a las papayas cultivadas. Caracterización isoenzimática Se han desarrollado protocolos para el estudio de la diversidad isoenzimática en una muestra de 147 accesiones de diez taxones de los dos géneros, provenientes de Colombia y Ecuador. De 14 sistemas ensayados, ocho se han mostrado polimórficos. A nivel intergenérico, Carica y Vasconcellea presentan patrones isoenzimáticos muy diferentes. Dentro de C. papaya, se observa una fuerte diferenciación geográfica. Las accesiones cultivadas de Colombia muestran una diversidad tan alta como las silvestres de Costa Rica. Dentro de Vasconcellea, la variación es importante y muestra una estructuración geográfica muy fuerte por encima de la estructuración por especie. V. x heilbornii se agrupa con sus presuntos genitores, V. cundinamarcensis (accesiones ecuatorianas) y V. stipulata . Los jigachos se separan en dos grupos, cada uno acercándose de uno de sus especies parentales, confirmando las observaciones morfológicas e indicando que el fenómeno de introgresión se da en ambas direcciones. Las accesiones colombianas de V. cundinamarcensis se agrupan al lado de las otras especies de Colombia, V. goudotiana, V. crassipetala y V. sphaerocarpa. Caracterización molecular Se desarrollaron marcadores microsatélites para estudiar la diversidad genética de C. papaya, sus relaciones con las especies más cercanas, y disponer de un marcador altamente polimórfico para futuros trabajos de cartografía genética. En el desarrollo de la técnica, se diseñaron los iniciadores a partir de 76 secuencias y se evaluaron en tres genotipos de C. papaya y en ocho especies del género Vasconcellea. Un total de 70 iniciadores funcionaron en papaya, mientras solamente cuatro permitieron amplificación en las ocho especies de Vasconcellea estudiadas, confirmando nuevamente la divergencia genómica entre los género Carica y Vasconcellea. Para C. papaya, se seleccionaron 15 iniciadores para el estudio de una muestra de 69 accesiones, proveniente de 13 orígenes diferentes (Costa Rica, Colombia, Venezuela, varias islas de las Antillas, India y Hawai). El promedio de similaridad (Dice) entre países es de 0,53, con un rango de 0,34 a 0,75. El valor más elevado es de 0,72 para Saint Vincent y Antigua. En cambio, las

4 accesiones de Hawai y Guadalupe presentan una similaridad genética de 0,34. Concerniendo las accesiones de un mismo país, las de Sainte Croix muestran una similaridad elevada, de 0,75. El cultivar Solo de Hawai muestra más afinidad con los individuos de Barbados (0,59). El dendograma que ilustra las relaciones genéticas entre los individuos muestra cinco ramas principales, con una estructuración relativamente poco marcada. Se puede observar una estructura de origen geográfico en la agrupación de la accesiones por países, pero al menos un individuo queda fuera de su grupo para cada país. En la muestra de Costa Rica, la más diferenciada, no se observa diferenciación entre Costa Pacífica y Atlántica, ni entre accesiones silvestres y cultivadas. Para Guadalupe, cinco accesiones están bien agrupadas mientras G2, G66 y G77 están dispersas en grupos distintos. Las accesiones de Venezuela y de Guadalupe son las más cercanas. La hawaiana ‘Solo’ se acerca mucho a BBD6, de Barbados, lo que confirma el origen de este cultivar. Como para las isoenzimas, la variación genética detectada entre los diferentes grupos de materiales no corresponde con la fuerte variación morfológica observada en campo, en caracteres tanto vegetativos como pomológicos. Sin embargo, los valores de similaridad genética son más bajos que los obtenidos con isoenzimas y con RAPD y AFLP, lo que se puede relacionar más probablemente con una me jor aptitud de esta técnica para revelar polimorfismo. Los altos niveles de diferenciación alélica indican que los microsatélites constituirán una herramienta poderosa para el estudio genético de C. papaya, particularmente para la identificación varietal y la cartografía genética. Se puede vislumbrar el desarrollo de técnicas de selección asistida por estos marcadores. Por otra parte, se desarrolló la técnica de CAPS o PCR-RFLP sobre ADN cloroplástico para dilucidar las relaciones entre especies de Carica y de Vasconcellea. El ADN utilizado proviene de muestras de la Universidad Técnica de Ambato, de la Universidad de Gante (Bélgica) y de la Universidad Central de Costa Rica. Se ajustaron los protocolos en una primera muestra de siete individuos de V. cundin amarcensis, V. stipulata, V. weberbaueri, V. cauliflora, V. monoica, V. x heilbornii y C. papaya. Un total de nueve pares de iniciadores amplificaron sobre esta muestra. Doce enzimas se probaron para la digestión de los productos de la PCR. Después de la electroforesis, se evaluó el polimorfismo de cada marcador, obteniéndose 51 marcadores polimórficos, nueve de los cuales presentaron baja definición. Cuarenta y dos muestran polimorfismo intergenérico e interespecífico y nueve presentan polimorfismo únicamente. El estudio seguirá después del proyecto, para aplicar la técnica con el total de marcadores polimórficos sobre una muestra de 68 individuos de nueve especies de Vasconcellea y Carica. Caracterización citogenética y palinológica Para los estudios citogenéticos y palinológicos, 21 materiales fueron recolectados en las colecciones de la UTA y de CORPOICA: seis accesiones de V. stipulata, seis de V. cundinamarcensis, una de V. sphaerocarpa, V. cauliflora y V. crassipetala , dos para V. goudotiana y C. papaya, y una accesión ecuatoriana para V. monoica y V. x heilbornii nm. pentagona. Todas estas especies son diploides con 2n = 18 cromosomas y un núcleo interfásico del tipo arreticulado. La meiosis fue más particularmente estudiada en dos accesiones de V. cundinamarcensis, de Colombia y Ecuador, V. sphaerocarpa y V. cauliflora. Numerosos comportamientos diferenciados e irregularidades fueron observados, como presencia de micronucleolos en profases y telofase, condensación tardía en profase, presencia de univalentes, trivalentes y tetravalentes, asociaciones cromosómicas secundarias, irregularidades de huso y segregación precoz o retardada de cromosomas. Una accesión de V. cundinamarcensis del Ecuador se caracterizó por la frecuente ausencia de huso, con sus consecuentes irregularidades.

5 Germoplasma con estas características no son favorables para desarrollar programas de mejoramiento. Características como presencia de micronucleolos, asociaciones cromosómicas secundarias y la presencias de numerosas regiones de organización del nucleolo en las accesiones de V. sphaerocarpa y V. cauliflora indican un probable origen híbrido de estas especies. Las accesiones colombiana y ecuatoriana de V. cundinamarcensis se diferencian por los patrones de husos y tétradas, en aspectos palinológicos y por la presencia de micronucleolos y de asociaciones secundarias en la primera. La viabilidad polínica es altamente variable entre las accesiones estudiadas, tanto entre como dentro de las especies, con un rango extendiéndose entre 15 y 97%, justificando este tipo de pruebas en los programas de mejoramiento. Polen tricolporado, mediano y de un mismo patrón fue observado en todas las accesiones estudiadas. El estudio permitió una descripción general del polen en el género Vasconcellea, según las especies evaluadas, y podrá contribuir al estudio de la diversidad de las especies de Vasconcellea. Evaluación físico-química Se evaluaron accesiones de V. cundinamarcensis, V. goudotiana y C. papaya cv. Cotové para peso de fruto, mesocarpio, semillas y arilo, dimensiones de fruto, volumen y peso de látex por fruto, acidez (pH), contenido de sólidos solubles, azúcares totales y reductores, almidón, fenoles diméricos, oligoméricos y poliméricos, pectinas de alta y baja metilación, protopectina y acido ascórbico. Evaluación de resistencia a nematodos Dieciséis materiales de C. papaya, V. goudotiana, V. cauliflora, V. cundinamarcensis, V. microcarpa var. microcarpa y V. microcarpa var. pilifera fueron evaluados por su comportamiento frente a los nematodos Meloidogyne incognita Raza 1 y Rotylenchulus reniformis. La acción de los nematodos disminuyó de manera significativa los pesos aéreo y radical fresco para C. papaya en todos los materiales comerciales. Al contrario los materiales de Vasconcellea no presentaron diferencias significativas para ninguna de las variables evaluadas a excepción de V. goudotiana Tipo B, V. cundinamarcensis, V. cauliflora y V. microcarpa var. microcarpa, los cuales mostraron diferencias en alguna de las variables agronómicas. Así, mientras todos los materiales de C. papaya se muestran susceptibles y no tolerantes, algunos de los materiales del género Vasconcellea pueden ser considerados como resistentes - tolerantes a la acción del nematodo. Los estudios histopatológicos confirman que algunos materiales de Vasconcellea presentan características que les permiten reaccionar como resistentes a una población mixta de M. incognita Raza 1 y R. reniformis, al contrario de todos los materiales comerciales de C. papaya, los cuales presentaron severas alteraciones histológicas. Evaluación de resistencia al virus de la mancha anular Ocho accesiones de C. papaya, V. cauliflora; V. goudotiana, V. microcarpa, V. monoica, V. cundinamarcensis y V. cauliflora fueron inoculadas con cinco aislamientos del PRSV y un aislamiento del virus de la distorsión y mosaico de la hoja de la papaya (PLDMV). La infección viral fue confirmada a través de la recuperación del virus en cinco plantas de papaya, la técnica serológica de ELISA y la técnica más sensible de hibridación del ARN con una sonda especifica. De la misma manera se aisló el ARN de hojas de papayas y papayas de montaña, mostrando o no síntomas. Los síntomas expresados dependieron de la especie, cepa y título del virus y de la edad de la planta. Las cepas de México, Venezuela y Tailandia fueron las más virulentas, la cepa de Hawai la menos virulenta y la de Taiwán mostró virulencia media. Las especies C. papaya,

6 V. microcarpa, V. monoica y V. goudotiana dieron síntomas sistémicos para todos los aislados, las dos últimas mostrando además lesiones locales con algunas de las cepas. En V. cauliflora y V. cundinamarcensis se observaron lesiones locales y muerte regresiva. Sin embargo, algunas plantas desarrollaron mosaico sistémico, en V. caulif lora, o necrosis sistémica, en V. cundinamarcensis. Algunas plantas de V. cundinamarcensis y V. cauliflora se recuperaron de la infección, después de 21 a 35 días de la inoculación, comprobándose la eliminación del virus. Con el PLDMV, C. papaya, V. monoica, V. microcarpa y V. goudotiana mostraron síntomas sistémicos. En el caso de V. goudotiana se observaron además síntomas de necrosis apical. Por lo tanto se consideraron susceptibles al PLDMV. V. cauliflora sólo se infectó en un porcentaje bajo (0,1 %), mientras V. cundinamarcensis parece ser resistente o inmune al virus. El virus fue recuperado de las plantas que mostraron síntomas sistémicos, incluyendo V. cauliflora, pero no de las muestras de plantas de V. cundinamarcensis y V. cauliflora libres de síntomas. La técnica de RT-PCR usada permitió resultados confiables y rápidos en cuanto a la presencia del PLDMV en las diferentes accesiones y corroboró los resultados de las pruebas biológicas. Se desconocen los mecanismos de resistencia presentes en Vasconcellea hacia los virus PRSV-P y PLMV, sin embargo se sospecha que el silenciamiento de genes podría estar involucrado en estas respuestas y pareciera que estos mecanismos fueran diferentes para cada especie. Evaluación de resistencia a la bacteria del cancro Once accesiones de C. papaya, Vasconcellea goudotiana y V. cauliflora fueron inoculadas con el aislamiento 1497 de Erwinia sp designado como Musky Canker. Todos los materiales comerciales evaluados se mostraron susceptibles en menor o mayor grado. Los cultivares Cartagena Amarilla y Costa Rica tuvieron un comportamiento tolerante, lo cual justificaría un estudio más detallado en condiciones de campo. El genotipo asilvestrado ‘Pajarera’ resultó susceptible, pero se observó que los genotipos silvestres de V. goudotiana y V. cauliflora son inmunes a la enfermedad. Diversidad del virus La recolección de muestras de plantas de papaya afectadas por ‘mancha anular’ se realizó en tres regiones diferentes de Venezuela: la región Zuliana, la Región Central y la Región Oriental, para un total de 15 localidades visitadas y 24 aislamientos recolectados. El análisis polimórfico de cadena simple (SSCP) sugiere la existencia de tres grupos con diferentes patrones de polimorfismo. Siete aislamientos representativos de estos grupos fueron caracterizados molecularmente. Según los resultados, los aislamientos venezolanos del PRSV presentan notables niveles de divergencia evolutiva entre sí y respecto a los aislamientos de otras partes del mundo. Esta situación contrasta con la alta homología entre los aislamientos colectados en la zona andina de Colombia y del Ecuador. El análisis conjunto de muestras de los tres países y de otras partes del mundo permite apreciar que los aislamientos del PRSV de Colombia y el de Ecuador se asemejan considerablemente a los aislamientos mexicanos, así como a los de Florida y de Hawai. Por el contrario, se observa una gran variabilidad genética en los aislamientos venezolanos, particularmente en los aislamientos Ch-1 y StL-2 de la Región Central. En conclusión, se ha logrado la caracterización molecular de un número representativo de muestras de papaya infectadas por PRSV en Colombia, Ecuador y Venezuela. Los resultados obtenidos, particularmente en Colombia y en el Ecuador, sugieren que la adopción de técnicas de control podría seguir una estrategia similar para el caso de estos dos países y algunas regiones de Venezuela. En el caso de este último país, habría que estudiar más a fondo la variabilidad

7 patogénica aparente, usando métodos convencionales, con el fin de determinar si las diferencias detectadas a escala molecular se traducen en mayores daños en campo. De todos modos, existen diferencias significativas en la proteína de la cápside de algunos aislamientos venezolanos del PRSV, lo cual limita el uso potencial de técnicas de control, como la protección cruzada o las plantas transgénicas, modificadas precisamente con ese gen de la cubierta protéica del virus. Diversidad de la bacteria Se extrajo el ADN de 12 cepas de Erwinia del Caribe : St Vincent (Pembroke y South Rives), Martinica (Rivière Pilote y Dumanoir), Guadalupe (Moule y Capesterre), Sainte Croix (Lagrange) y Saint Lucia (Rabot y Richefonds). En Venezuela, se aisló el patógeno de plantas con síntomas de cancro, por siembra directa y por dilución en medio nutritivo. Las colonias bacterianas fueron purificadas y su patogenicidad comprobada mediante infección mecánica de C. papaya cv. Solo. Cinco colonias patogénicas se caracterizaron morfológicamente y por pruebas bioquímicas y fisiológicas. La caracterización molecular se realizó por amplificación de PCR específico. Las cepas 68 (Guadalupe aisl. 10.429), 76 (Guadalupe aisl. 10.431), 82 (Sainte Croix – Lagrange aisl. 11568) y aisl. 1353 de Venezuela generaron un producto de amplificación de 9.000 pb con el iniciador específico de E. carotovora. Además, se puede señalar la amplificación de un producto de aproximadamente 11.000 pb en los aislamientos 1179 y 1496 de Venezuela, lo cual puede relacionarse también con la especie E. carotovora pero un patovar o una raza diferente. Las cepas restantes no amplificaron con este iniciador por lo que se infiere que podrían pertenecer a una nueva especie de Erwinia o que estarían relacionadas con E. chrysanthemi. Hibridaciones y selección Se han reciclado in vitro periódicamente (cada 1 a 2 meses) híbridos intergenéricos (C. papaya x V. cauliflora) procedentes de cruces sembrados en 1995 y 1999. Se realizaron polinizaciones controladas entre V. monoica, V. cauliflora y V. cundinamarcensis hasta completar todos los cruces posibles. Se produjeron dos frutos por cada cruce V. cundinamarcensis x V. monoica, V. cundinamarcensis x V. cauliflora y V. monoica x V. cauliflora. Sin embargo sólo se lograron cosechar los dos frutos del último cruce, que contenían semillas. Las plantas híbridas in vitro y en el umbráculo mostraron fenotipos manifestando su origen paterno, con hojas más verdes y más brillantes, con márgenes más puntiagudas que las de papaya. En el umbráculo y en el campo, los híbridos presentaron un crecimiento lento, en comparación con plantas de papaya in vitro. En el campo, los híbridos florecieron a los 3-4 meses después de la siembra presentando flores normales tipo macho (con o sin ovario primitivo) y flores hermafroditas en las dos localidades. Según estos estudios, la hibridación entre C. papaya y V. cauliflora seguida del cultivo de óvulos y de embriones inmaduros parece un método factible para la transferencia de genes de resistencia. El uso de especies genéticamente más relacionadas (como V. quercifolia y V. cundinamarcensis) en los cruces con la papaya y la evaluación de un gran número de plantas híbridas en el campo garantizarán híbridos fértiles útiles en los programas de mejoramiento genético. En Costa Rica, se realizó la caracterización, selección y autofecundación de segregantes de cuatro híbridos producidos en el marco del proyecto cooperativo de papaya UCR-INTA. Los materiales genéticos parentales utilizados en dichos híbridos corresponden a germoplasma proveniente de Costa Rica, Hawai y Cuba básicamente. Los resultados obtenidos demuestran que los segregantes seleccionados del híbrido MH tienen capacidad de producir frutos de alto contenido de sólidos solubles, aún en las condiciones de alta precipitación de la zona. Presentan también en algunos

8 casos frutos de tamaño aceptable para exportación a escala regional. Por su parte, los segregantes del híbrido LM poseen un tamaño más adecuado para mercados nacionales y agroindustria. Los materiales provenientes de los híbridos 6X30 y 70X30 poseen menor potencial comercial y por ende se han seleccionado sólo tres plantas en cada caso. Nivel de ejecución del proyecto De manera global, las metas del proyecto se han realizado. Las metas de conservación (tamaño de las colecciones nacionales de campo y de semillas) han sido netamente superadas en el Ecuador, Colombia y las Antillas Francesas. El cumplimiento es parcial en Venezuela. En Costa Rica, no se dispone de una colección por imposibilidad de financiar su instalación por el proyecto y la caracterización se realizó in situ. No se ha podido constituir una colección nuclear regional por dificultades burocráticas en el intercambio de germoplasma. Se han desarrollado metodologías para la caracterización morfológica, bioquímica y molecular, con marcadores microsatélites y CAPS. Su aplicación ha permitido una mejor comprensión de la diversidad de las Caricaceae de importancia económica, abriendo el camino para una explotación racional de sus recursos genéticos. En estos últimos, han sido detectadas fuentes de resistencia a las principales enfermedades del papayo, como el PRSV y la bacteria, al mismo tiempo que se han conseguido progresos significativos en el conocimiento de estos patógenos y de su diversidad, cumpliendo plenamente las metas correspondientes. Es esencial profundizar estos conocimientos, estratégicos para el desarrollo del cultivo en la región. También se deben continuar los arduos trabajos de hibridación intergenérica para transferir en C. papaya las resistencias identif icadas en especies de Vasconcellea. En definitiva, la plena explotación de los importantes conocimientos adquiridos en el proyecto dependerá del apoyo de los países a su casi olvidado sector de fitomejoramiento.

9 2. Actividades desarrolladas 2.1. Colecta, recuperación, intercambio y conservación de los recursos genéticos de papayas 2.1.1. Colectas, colecciones e intercambios En Colombia, los equipos de la Universidad Nacional (sede Medellín) y CORPOICA reportaron en 2001 la colecta de 106 materiales de las especies de tierra baja, Carica papaya, Vasconcellea cauliflora, V. sphaerocarpa y Jacaratia dolichaula, y de altura, V. goudotiana, V. cundinamarcensis, esencialmente en la parte noroccidental del país (Costa Caribe, valles interandinos de Antioquia y norte de la Costa Pacífica). Han preparado y utilizado un formato de levantamiento de datos de pasaporte y descripción preliminar de los materiales colectados, el cual ha sido revisado con los coordinadores y difundido para su utilización en las otras ins tituciones del proyecto (anexo 2 del informe de progreso 2001). La colección cuenta con 98 accesiones, representando dos géneros, ocho especies identificadas y una sin identificar. Las semillas colectadas están conservadas en neveras del banco de germoplasma de Corpoica, en Rionegro (Antioquia). La colección de campo está en el mismo sitio, para las especies que soportan un clima frío, mientras que las accesiones de tierra caliente se sembraron en el Centro Agropecuario Cotové de la Universidad Nacional (sede Medellín) y en el Centro de Investigación La Libertad de Corpoica, en los Llanos Orientales. A partir de la colección se ha obtenido semilla para almacenamiento del germoplasma a 10°C y 10%HR. La Universidad de Caldas juntó una colección de 70 accesiones de especies del género Vasconcellea, esencialmente en la zona central del país. Las semillas están conservadas en cuarto frío a 5°C y 30%HR. En el Ecuador, la Universidad Técnica de Ambato cumplió con las expediciones de colectas planificadas a lo largo de la Cordillera, en las provincias de Bolívar, Chimborazo, Tungurahua, Cañar, Azuay, Cotopaxi, Pichincha, Imbabura y Carchi (figura 1). Se colectaron 149 accesiones de siete taxones del género Vasconcellea. Como en Colombia, se caracterizó este material in situ, adaptando la lista de descriptores para las especies presentes en el país. Este material está conservado, cultivado, en invernadero y, en forma de semillas, en cámara fría a 4°C.

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AREAS MUESTREADAS

CarchiCarchi Imbabura Imbabura Pichincha Pichincha Cotopaxi Cotopaxi Bolívar Tungurahua BolívarTungurahua Chimborazo Chimborazo Cañar Cañar Azuay Azuay

Rango Altitudinal 1500 – 3200 msnm

Loja

Loja

Ecuador

Figura 1. Provincias de la región interandina en las que se realizó el muestreo.

En Venezuela, se visitaron seis importantes herbarios y se mapearon las distribuciones de C. papaya, V. microcarpa, V. cauliflora y V. cundinamarcensis, para preparar las colectas que se hicieron en el 2002. En las regiones central, occidental y oriental del país, se colectaron y caracterizaron in situ 10 muestras de cultivares de C. papaya y 19 muestras de V. cauliflora, V. cundinamarcensis, V. cauliflora y de dos subespecies de V. microcarpa. Estos materiales fueron propagados con los que se recibieron de CORPOICA y la UN de Colombia: cv. Cotové, cv. Sofia, V. goudotiana y V. cundinamarcensis. También se inventariaron los materiales presentes en la estación experimental Bajo Seco de la UCV, la cual cuenta con cuatro accesiones de tres especies, dos híbridos interespecíficos y dos materiales sin identificar. El INIA y la UCV acordaron establecer las papayas de altura en la Estación Experimental Bajo Seco para la reconstrucción del banco de germoplasma de Caricaceae. Esta colección cuenta actualmente con 14 accesiones de la colección anterior y 18 nuevas accesiones representadas por siete a diez individuos. Además, un banco de germoplasma se estableció en el Instituto de Genética para las papayas de zona cálida. Está conformada por 10 entradas con cinco individuos. Se intercambiaron once materiales con el INIA, para la evaluación de resistencias a patógenos.

11

En Costa Rica, no se pudo establecer una colección de campo por la imposibilidad de financiar rubros de mano de obra no especializada por el proyecto, aún para trabajos excepcionales como la instalación del germoplasma. Sin embargo, para evadir esta dificultad, se organizó un viaje para caracterizar in situ materiales silvestres y cultivados y tomar muestras para análisis enzimático y moleculares. Este trabajo se justificaba porque la papaya común tiene su origen en América Central, por lo que la caracterización del material de Costa Rica presenta un interés particular dentro del proyecto. La toma de datos y muestras ha permitido la caracterización de 37 plantas silvestres y 9 cultivadas, cuyo origen geográfica está representado en la figura 2.

Figura 2. Distribución geográfica del material estudiado en Costa Rica.

En las Antillas Francesas, se realizó un inventario de especies y variedades de frutales en el cual se colectaron 50 accesiones en las islas de Guadalupe y 30 en Martinica. Se tomaron datos correspondiendo a 150 descriptores botánicos, pomológicos agronómicos y etnobotánicos. El germoplasma está actualmente conservado en forma de semillas, mientras se desarrollan otras técnicas para su conservación in vitro.

12 2.1.2. Conservación del germoplasma Los primeros estudios de la unidad de recursos genéticos del CIAT habían mostrado el efecto nefasto de muy bajos contenidos de humedad sobre semillas de papaya. La segunda fase del estudio se centró en probar protocolos de conservación para un año, experimentando en dos variedades, con tres contenidos de humedad (11, 9, y 5%) y cuatro temperaturas de conservación (22, 7, -20 y -196°C), y con lectura a los 0, 6 y 12 meses. La germinación no se vio afectada por las diferencias de humedad. Sin embargo, las semillas con contenido de humedad de 11% mostraron mayor fragilidad a la conservación a bajas temperaturas. El análisis permite concluir que las semillas de C. papaya resisten desecación entre 11 y 5% al igual que conservación a temperaturas entre 22 y -196°C, sin que haya una ventaja significativa para alguno de los tratamientos, lo que concuerda con su clasificación en el tipo intermedio. La germinación de la variedad 1, más baja en la prueba inicial, mejoró en las dos lecturas siguientes. Posiblemente las bajas temperaturas de conservación actuaron como mecanismo de estratificación, rompiendo latencia. Paralelamente, se establecieron las curvas de secado e imbibición de las semillas de papaya común. Se pudo observar como las semillas absorben agua muy rápidamente en las primeras 24 horas, llegando a contenidos de humedad de 77%. Esto sugiere que la latencia de estas semillas está asociada a factores endógenos y no a factores externos como sus cubiertas. Esta latencia debe ser removida para las pruebas de viabilidad y más generalmente para la renovación de los materiales conservados en bancos de semillas. Este aspecto ha sido estudiado en el laboratorio de fisiología de semillas del Corpoica en la estación La Selva. Las semillas extraídas han sido sometidas a fermentación acelerada con Saccharomyces cerevisiae para facilitar la eliminación del arilo y secadas con silicagel para alcanzar el contenido de humedad de 10%, sin afectar la viabilidad. Después de determinar el grado de latencia comparando la tasa de germinación con la tasa de coloración con tetrazolio, se aplicaron tratamientos de remoción de ésta, con ácido giberélico y nitrato de potasio. La semilla de V. cundinamarcensis mostró mayor latencia que la de V. goudotiana. Los mejores resultados se obtuvieron con semillas extraídas mediante fermentación con levadura, sin remoción de la testa y con aplicación de ácido giberélico (200 ppm) y nitrato de potasio (1,5%). En un ensayo posterior, se lograron buenos resultados con concentraciones muy superiores de estos dos productos.

13 2.2. Caracterización y evaluación 2.2.1. Caracterización morfológica 2.2.1.1. En Colombia En la colección del C.I. La Selva de Corpoica, se caracterizaron 44 accesiones de las principales especies de clima frío, V. goudotiana (26) y V. cundinamarcensis (18), usando una primera versión del listado de descriptores adaptado a las especies del mismo género. La información se registró, en forma individual, en cinco plantas por accesión. Las figuras 3 a 6 muestran los dendogramas obtenidos para los caracteres cualitativos y cuantitativos, por sexo. Los atributos cualitativos presentan poder discriminante entre las dos especies, en los árboles de los dos sexos. Existe amplia variación en los caracteres cuantitativos, tanto en hembras como en machos. En los últimos, permiten una mejor discriminación taxonómica que en las hembras, quizás porque en este caso se incluyen variables de frutos, sujetas a selección convergente en las dos especies. Además del resultado producido, esta primera experiencia de caracterización permitió revisar la lista de descriptores y proponer modificaciones para completar, simplificar y sistematizar la colecta de la información. Por una inundación en la colección de especies de clima caliente de la Universidad Nacional en su estación Cotové, se perdieron la mayoría de los materiales. Por esta razón se dispone de muy pocos datos morfológicos sobre éstos. 2.2.1.2. En el Ecuador La segunda versión de la lista de descriptores se probó y completó en tres viajes al Ecuador de investigadores del grupo CIRAD/IPGRI y de la U. Caldas, quienes colaboraron con investigadores de la U.T. Ambato para caracterizar 48 accesiones de otras especies, como V. cundinamarcensis (cinco), V. stipulata (cuatro, tres de ellas caracterizadas in situ), de jigacho, incluyendo V. x heilbornii var. chrysopetala (21) y una forma vecina de ésta, que se diferencia por el tamaño de las estípulas y el color verdoso de las flores, que se llamó V. af. x heilbornii nm. chrysopetala (seis), y de babaco, V. x heilbornii nm. pentagona (14). Recordemos que la taxonomía actual del género considera que los dos primeros taxones son los parentales de los babacos y jigachos. También se estudiaron V. monoica, V. parviflora y V. palandensis.

14 2259 2275 2272 2274 2273 2375 2278 2276 2376 2279 2270 2374 ILS307 2269

V. goudotiana V. cundinamarcensis

2271 2266 2300 2260 2263 2268 2277 2265 Paproja ILS238 ILS313 ILS328 ILS331 ILS324 ILS340 ILS274 ILS441 ILS 245 ILS264 ILS268 ILS326 ILS325 ILS341 ILS357 ILS285 ILS327 ILS443

0.3

0.4

0.6 Coeficiente de similitud

0.8

Figura 3. Dendrograma elaborado a partir de los caracteres morfológicos cualitativos (hembras, colección de Corpoica).

1.0

15 2260 2279 2265 2276 2300 2374 2375 2264 ILS 307 ILS 321 2270 2277 2376 Paproja 2266 2274 2275 2272 2273 2269 2268 CDRLLG 2278 ILS 309 ILS 310 ILS 331 ILS 312 ILS 326 ILS 443 2263 C1042280 ILS 245 ILS 264 ILS 268 ILS 341 ILS 325 ILS 327 ILS 328 ILS 288 ILS 315 ILS 324 ILS 314 ILS 340

V. goudotiana V. cundinamarcensis

0.47

0.60

0.73 Coeficiente de similitud

0.87

Figura 4. Dendrograma elaborado a partir de los caracteres morfológicos cualitativos (machos, colección de Corpoica).

1.00

16

2259 2266 2273 PAPROJA 2265 2376 2260 2275 2268 2270 2272 2277 ILS313 2300 2374 ILS357 ILS341 ILS 443 2271 2375 ILS340 ILS245 ILS328 ILS285 2263 2279 C1042280 2269 2276 2274 ILS331 ILS307 2278 ILS441 ILS268 ILS325 ILS324 ILS326 ILS238 ILS264 ILS327 ILS274

0.00

V. goudotiana V. cundinamarcensis

0.22

0.45 Distancia

0.67

0.89

Figura 5. Dendrograma elaborado a partir de los caracteres morfológicos cuantitativos (hembras, colección de Corpoica).

17 2260 2264 2265 2375 2276 2376 2278 2273 paproja

V. goudotiana V. cundinamarcensis

2300 2263 ILS315 ILS245 ILS264 ILS340 ILS326 ILS324 ILS101 ILS321 ILS331 ILS325 ILS341 ILS327 ILS268 ILS288 ILS312 ILS328 ILS443 2266 2279 2270 2274 C1042280 2268 2272 2275 ILS314 2269 2276 ILS309 ILS310 ILS307 2374

0.00

0.28

0.57 Distancia

0.85

1.14

Figura 6. Dendrograma elaborado a partir de los caracteres morfológicos cuantitativos (machos, colección de Corpoica).

18 La figura 7 muestra el dendograma obtenido con los caracteres cualitativos y ciertos caracteres cuantitativos categorizados, con una clara agrupación de los pocos representantes de las especies parentales, V. cundinamarcensis y V. stipulata. Separa claramente cada una de las dos formas de jigacho en dos grupos principales, revelando una heterogeneidad insospechada de estos cultigenes. Los dos grupos de V. x heilbornii nm. chrysopetala se sitúan entre el babaco y V. stipulata, mientras que V. af. x heilbornii nm. chrysopetala expresa una mayor afinidad con V. cundinamarcensis. La separación de los babacos 47, 50, 85, 51B y 77, que alcanzan a formar un subgrupo, sorprende en una planta cultivada propagada por la vía vegetativa. Esta heterogeneidad morfológica del babaco es la primera confirmación de resultados obtenidos con marcadores AFLP en la Universidad de Gante.

Figura 7. Dendograma obtenido a partir de datos cualitativos y cuantitativos categorizados en las accesiones de papayas de montaña del Ecuador (Vasconcellea spp.).

Los resultados obtenidos son compatibles con la hipótesis según la cual el babaco y el jigacho son frutos de la introgresión mutua entre V. stipulata y V. cundinamarcensis. La heterogeneidad observada sugiere que el rol de la reproducción sexual podría ser más importante que lo suponíamos en la evolución de estos cultigenes. Prácticamente, la existencia de subgrupos claros dentro del babaco y del jigacho es un elemento nuevo y muy importante para tomar en cuenta en el mejoramiento y la promoción de estos dos cultivos en pleno desarrollo comercial en el Ecuador.

19 2.2.1.3. En Costa Rica Un análisis análogo se hizo con los datos de la caracterización in situ de plantas silvestres y cultivadas de papaya común de Costa Rica. Los descriptores cuantitativos y cualitativos distinguen claramente los tipos silvestres y mejorados. Los segundos se diferencian principalmente por caracteres como color del tallo (gris marrón), menor tamaño de hoja, mayor número de lóbulos, mayor separación entre lobos, ausencia de brácteas en el pedúnculo, mayor tamaño y permanencia de los sépalos, disposición radial de los pétalos, color del estilo (crema), además del tamaño menor y de la pulpa amarilla de los frutos, cuyos caracteres no pudieron ser incluidos sistemáticamente en la base de datos. Cuando los individuos están separados por sexo, aparece una leve estructuración geográfica entre los tipos silvestres, como se puede apreciar en el dendrograma obtenido con las hembras (figura 8). Hawaiana Hawaiana

Figura 8. Dendograma de caracteres cualitativos y cuantitativos categorizados (C. papaya, hembras, Costa Rica).

La literatura ofrece poca información sobre las papayas silvestres. Ciertos autores ignoran o refutan su existencia. Este estudio morfológico ha mostrado que las formas silvestres de C. papaya existen todavía en relativa abundancia y que, en el aspecto morfológico, se diferencian claramente de los tipos cultivados, a pesar de la evidente introgresión observada en el campo. En el caso de la papaya, veremos en la sección siguiente que los marcadores bioquímicos y moleculares aparecen limitados para estructurar toda la diversidad agro-morfológica que interesa al fitomejorador. Por lo tanto, vale la pena seguir estudiando estos materiales silvestres para detectar otros caracteres que podrían ofrecernos, particularmente en relación con resistencias a enfermedades.

20 2.2.1.4. Análisis conjunto de datos de Costa Rica y del Ecuador La disponibilidad de datos morfológicos coherentes sobre accesiones de papayas comunes y de montaña nos dio una oportunidad de estudiar la diversidad morfológica en los dos géneros de Caricaceae de mayor interés económico, contestando la pregunta central para el mejoramiento de la papaya, la cual concierne la distancia entre los géneros Carica y Vasconcellea y los posibles intercambios genéticos, espontáneos o artificiales. La muestra disponible presenta además el interés particular de comparar las especies de Vasconcellea, generalmente en un estado poco avanzado de domesticación, con tipos de papaya común en un estado comparable. El dendograma basado en los caracteres cualitativos (figura 9) nos da una imagen más completa, con una fuerte separación entre Carica y Vasconcellea. Confirma que las papayas silvestres no son más cercanas de las papayas de montaña. Al contrario, las papayas cultivadas se insertan en una posición intermedia. V. cundinamarcensis y V. stipulata forman grupos específicos. Los dos tipos de jigacho vuelven a formar dos grupos cada uno, V. af. x heilbornii nm. chrysopetala tomando una posición intermedia entre las dos especies parentales y V. x heilbornii nm. chrysopetala una posición intermedia con los babacos. Entre estos últimos, se vuelve a observar un grupo “disidente”, conformado por las accesiones 47, 50, 51B, 77, y 85.

Figura 9. Análisis de clasificación de los descriptores cualitativos combinando los datos del Ecuador sobre papayas de montaña y de Costa Rica sobre papaya común (neighbor joining).

El principal aporte de este estudio conjunto de los dos géneros es que la domesticación más intensiva de la papaya común no tiene relación con la distancia entre los dos géneros. Al contrario, las papayas silvestres se separan de las papayas cultivadas, con distancias comparables a las distancias observadas entre especies de Vasconcellea. Pero debemos conservar en mente que, aparte el carácter uni- o pentalocular del ovario, los caracteres de la hoja están entre los que más contribuyen a la diferenciación entre los dos géneros y entre los dos tipos de papaya, lo que relativiza el alcance de esta primera conclusión.

21 2.2.1.5. En las Antillas Francesas Los datos de caracterización colectados in situ y las fotografías de las accesiones han sido agrupados en una base de datos en formato Access, permitiendo buscar las accesiones por su nombre de especie, nombre común o por una muestra botánica, e imprimir una ficha de colecta sintetizando todas sus características. Un CD-Rom con esta información está anexado al presente informe.

2.2.2. Caracterización bioquímica y molecular 2.2.2.1. Caracterización isoenzimática En colaboración con el grupo CIRAD/IPGRI, la Unidad de Recursos Genéticos del CIAT el C.I. La Selva de Corpoica y la U.T. Ambato, investigadores de la U. Caldas han adaptado protocolos desarrollados por el CIAT y el CIRAD en otras especies. La muestra estudiada incluye 271 plantas de 147 accesiones de diez taxones de los géneros Carica y Vasconcellea, provenientes de Colombia (colecciones de CORPOICA y la U. Caldas) y Ecuador (colección de la U.T. Ambato). De 14 sistemas ensayados, ocho se han mostrado polimórficos (GOT, ACP, DIA, á - EST, PGM, PGI, 6-PGDH y SKDH). A nivel intergenérico, Carica y Vasconcellea presentan patrones isoenzimáticos muy diferentes (figura 10). Dentro de Vasconcellea, existe una importante variación. V. cauliflora muestra bandas diferentes en comparación con las demás especies.

Figura 10. Gel de electroforesis de la isoenzima α Esterasa para diferentes especies. Se puede observar el polimorfismo marcado entre los géneros Carica (C.p) y Vasconcellea (V. spp.).

22

Figura 11. Arbol de clasificación (Neighbor Joining, distancia de Jaccard) obtenido con los datos del análisis enzimático. Identificación de las accesiones: ver tabla 1 o códigos a continuación. cun=V. cundinamarcensis, sti=V. stipulata, Vxh pent= V. x heilbornii var. pentagona, T2= V. af x heilbornii var. chrysopetala, T1= V. x heilbornii var. chrysopetala, gou=V. goudotiana, pap=C. pap cau=V. cauliflora, crass=V. crassipetala, sph=V. sphaerocarpa. Cun=Cundinamarca, Cal=Caldas, Boy=Boyacá, Qui=Quindio, Tol=Tolima, Ant=Antioquia, Ris=Risaralda, Val=Valle, Mag=Magdalena, cuz=Cuzco(Perú) Letras= A-G: Municipio; Números= 1-5 Localidad.

El dendograma obtenido con el análisis de agrupamiento por mayor proximidad separa claramente cinco ramas principales (figura 11). La primera está conformada por las accesiones ecuatorianas. Está subdividida en dos ramas, una que reúne las accesiones de V. stipulata y de V. x heilbornii nm. chrysopetala y nm. pentagona, y otra que agrupa las accesiones de V. cundinamarcensis y de V. af x heilbornii var. chrysopetala, mostrando que la similitud de un tipo de jigacho con cada una de las especies parentales, evidenciada en el estudio morfológico, tiene una clara base genética. La segunda rama agrupa las accesiones colombianas de V. cundinamarcensis. Es la rama con mayor representación de individuos, no se observa agrupación de origen geográfico. Es muy notable el monomorfismo en las accesiones de la colección de la Universidad de Caldas, a pesar de la supuesta diversidad en los orígenes geográficos. La tercera rama agrupa las accesiones de V. goudotiana, V. sphaerocarpa y V. crassipetala, manteniendo una subestructura por especie. Dentro de V. goudotiana, aparece un patrón geográfico, con las agrupaciones de las accesiones del Valle de Cauca y de las accesiones de Caldas, Quindío y Risaralda. La cuarta rama separa las accesiones de V. cauliflora, es la rama con menor representación de individuos y no se observa agrupación de origen geográfico.

23 Las accesiones de C. papaya se agrupan en la quinta rama, la más distante, en la cual aparece una fuerte diferenciación entre los tres países de origen. Los materiales costarricenses, en su mayoría de origen silvestre o subespontáneo, muestran variación entre sus accesio nes pero ésta no sigue un patrón geográfico o de estado silvestre o cultivado. Las accesiones colombianas, de origen cultivado, aparecen muy distantes de las de Costa Rica. Sorprendentemente, muestran una variación comparable y hasta superior. Este estudio ha evidenciado una alta diversidad isoenzimática y una fuerte estructuración. Los ocho sistemas enzimáticos presentan en su mayoría bandas o combinaciones de éstas exclusivas de una especie o un grupo. En cuanto a las relaciones entre especies, confirma la afinidad entre las dos principales especies de papaya de montaña del Ecuador, V. cundinamarcensis y V. stipulata., y el parentesco de V. x heilbornii con las dos. Diferencia claramente las especies colombianas, V. cundinamarcensis, V. goudotiana, V. sphaerocarpa y V. crassipetala y aún más la especie V. cauliflora. A nivel intergenérico, confirma la fuerte diferenciación entre Carica y Vasconcellea. La distancia entre los dos géneros supera la distancia entre ciertas especies de Vasconcellea, confirmando los resultados obtenidos con marcadores que cubren mejor el genoma, como los RAPD (Jobin et al., 1997), AFLP (Droogenbroeck et al.,2002; Kim et al., 2002) y RFLP sobre ADNcp (Aradhya et al., 1999), pero también con marcadores isoenzimáticos (Jobin et al., 1997). A nivel intraespecífico la situación varía con las especies. En tres de las siete especies, C. papaya, V. goudotiana y V. cundinamarcensis, aparece una diferenciación según el origen geográfico. En C. papaya la estructuración geográfica se manifiesta claramente por la diferenciación entre y dentro de los países. En V. goudotiana, se observa una leve estructuración geográfica con ciertas agrupaciones entre accesiones por grupos de departamentos colombianos. El carácter poco marcado de la diferenciación entre accesiones de diferentes regiones de Colombia puede explicarse en parte por el carácter estrictamente alógamo de la planta (dioica), el cual favorece una fuerte diversidad intrapoblacional y limita la diversidad entre poblaciones. El caso de V. cundinamarcensis es más complejo. La estructuración geográfica se manifiesta claramente por la diferenciación entre accesiones ecuatorianas y colombianas, pero no aparece entre las accesiones de Colombia. La separación de las accesiones ecuatorianas de V. cundinamarcensis y su agrupamiento con las demás especies del Ecuador puede explicarse por un importante flujo de genes entre V. cundinamarcensis y V. stipulata, en relación con su gran afinidad y su compatibilidad. Según Badillo, V. x heilbornii resultaría precisamente de una hibridación entre V. cundinamarcensis y V. stipulata. Esta hipótesis fue corroborada por los estudios morfológicos de Scheldeman (2002) y moleculares de Van Droogenbroeck et al., (2002). La afinidad de V. cundinamarcensis con V. af. x heilbornii nm. chrysopetala confirma los resultados obtenidos por Van Droogenbroeck et al. (2002), quienes afirman que el fenómeno de introgresión se da en ambas direccio nes, provocando una división de los híbridos en dos grupos que pueden presentar una notable similitud con cualquiera de sus parentales. La ausencia de una diferenciación entre las accesiones de V. cundinamarcensis de diferentes regiones de Colombia, comparada con la estructuración geográfica observada en la especie silvestre

24 V. goudotiana, igualmente dioica, indica la existencia de otros factores limitantes de la diversidad entre poblaciones. La selección humana y los intercambios de semilla de material domesticado de la especie podrían ser dos de ellos. La uniformidad observada en la colección de la Universidad de Caldas contrasta con la riqueza de las dos otras colecciones de Vasconcellea, en la Universidad de Ambato y en CORPOICA. Al tomar las muestras, encontramos errores de identificación taxonómica en ciertas accesiones, con presencia de plantas de diferentes especies bajo un mismo código. La caracterización isoenzimática confirma graves errores en la instalación de esta colección, por lo que es aconsejable re- instalarla a partir de las semillas, asegurándose de la identificación inicial de los materiales. 2.2.2.2. Caracterización por marcadores microsatélites Con fines de desarrollar marcadores microsatélites y estudiar las relaciones entre C. papaya y las especies más cercanas, fue construida una genoteca enriquecida de secuencias di- nucleotidas. Se obtuvieron 507 clones, de los cuales 147 fueron positivos (presencia de microsatélite). Los clones fueron secuenciados y seleccionados según la ubicación del microsatélite dentro de la secuencia. A partir de 76 secuencias se diseñaron los iniciadores utilizando el programa Primer 3. Estos iniciadores se evaluaron en tres genotipos de C. papaya y en ocho especies del genero Vasconcellea (V. sphaerocarpa, V. cundinamarcensis, V. crassipetala, V. goudotiana, V. cauliflora, V. stipulata, V. monoica, V. x heilbornii) sobre un gel de agarosa. Un total de 70 iniciadores funcionaron en papaya, mientras solamente cuatro permitieron amplificación en las ocho especies de Vasconcellea estudiadas, confirmando la divergencia genómica entre los género Carica y Vasconcellea. Fueron seleccionados 35 iniciadores teniendo en cuenta su resolución e intensidad de las bandas amplificadas (Tabla 2). Estos fueron utilizados en un pequeño estudio de diversidad con 29 genotipos de papaya provenientes del Arco Antillano y 11 de siete especies de Vasconcellea de los Andes de Colombia y Ecuador (papaya de montaña). Los resultados mostraron 26 iniciadores polimórficos en papaya y cuatro en papaya de montaña con un total de 104 alelos para el conjunto. Dos de los cuatro iniciadores polimórficos en Vasconcellea son monomórficos en Carica.

25 Tabla 2. Número de alelos de microsatélites en los dos géneros estudiados. Amorce

Cp2F10 (TC)14 Cp1A08 (CT)18..(GA)3 Cp1H03 (TC)24 Cp1C08 (AG)7 (GA)10 Cp2F11 (TC)14 Cp1B03 (CT)20..(AC)5 Cp2F08 (CT)9 Cp1H02 (CT)18 Cp1H05 (TC)10 Cp1B08 (TA)4..(AG)18 Cp1G12 (GA)5..(GA)13..A..(AG)4 Cp1E02 (AG)8 Cp2D07 (TC)15 Cp1D08 (TC)9 Cp1H12 (TC)11 (CT)13 Cp1H11 (CT)9...(TC)11 Cp2A05 (CT)9 Cp2D04 (GA)5.AC.(GA)9 Cp1E03 (CT)9…(CT)9 Cp2C11 (CT)8..CC..(CT)9 Cp1F02 (AG)16 Cp1G05 (GA)12 Cp1B12 (TC)8 Cp2E05 (TC)12 Cp1C04 (GA)9..CA..(AG)6 Cp2E02 (AG)9

Carica Nombre d'allèles 9 7 7 6 6 6 5 5 5 5 5

Tailles des allèles 185 - 240 312 - 340 258 - 280 268 - 280 222 - 235 275 - 303 130 - 148 315 - 342 163 - 190 338 - 349 215 - 232

Vasconcellea Nombre d'allèles 6 2 -

Tailles des allèles 145 – 163 335 – 340 -

4 4 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 1 1

315 - 325 320 - 333 150 - 160 205 - 228 267 - 273 281 - 286 130 - 136 290 - 296 224 - 227 281 - 284 282 - 286 280 - 283 348 - 351 283 299

5 5

264 – 286 277 – 296

La figura 12 muestra un ejemplo del iniciador Cp 1H05 donde se diferencian claramente los géneros Carica y Vasconcellea y la tabla 3 presenta la lista de los iniciadores utilizados para el estudio de diversidad. El estudio global se llevó a cabo sobre una muestra de 69 accesiones, presentada en la tabla 3. La variación genética entre 57 individuos de 12 accesiones fue estimada por el índice de similaridad de Dice (tabla 4). El promedio de similaridad entre países es de 0,53, con un rango de 0,34 a 0,75. El valor más elevado es de 0,72 para Saint Vincent y Antigua. En cambio, las accesiones de Hawai y Guadalupe presentan una similaridad genética de 0,34. Concerniendo las accesiones de un mismo país, las de Sainte Croix muestran una similaridad elevada, de 0,75. El cultivar Solo de Hawai muestra más afinidad con los individuos de Barbados (0,59).

26

Carica

Vasconcellea

Figura 12. Ejemplo del iniciador Cp 1H05 diferenciando los géneros Carica y Vasconcellea.

Tabla 3. Origen de las accesiones de Carica y Vasconcellea utilizadas en el estudio con marcadores microsatélites. Especie C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya V. cundinamarcensis V. sphaerocarpa V. goudotiana V. cauliflora V. stipulata V. x heilbornii V. monoica

Número de accesiones 26 8 7 5 4 3 1 1 1 1 1 3 2 2 1 1 1 1

Origen Costa Rica Guadalupe Venezuela Granada Barbados Sainte Croix Martinica Antigua Saint Vincent India Hawai Colombia Colombia Colombia Colombia Ecuador Ecuador Ecuador

27 Tabla 4. Similaridad genética entre papayos de diferentes países (índice de Dice). CR n=26 Costa Rica Guadalupe Venezuela Granada Barbados Sainte Croix Martinica Antigua Saint Vincent India Hawai

0,67 0,47 0,47 0,47 0,50 0,54 0,56 0,50 0,46 0,54 0,46

Guad Vene n=8 n=7

0,52 0,47 0,42 0,45 0,52 0,40 0,43 0,41 0,49 0,34

0,61 0,46 0,51 0,57 0,46 0,51 0,48 0,58 0,39

Gnd n=5

Bbd n=4

SC n=3

Mtq n=1

Atg n=1

SV n=1

India n=1

Haw N=1

0,68 0,52 0,61 0,53 0,55 0,60 0,50 0,41

0,67 0,61 0,53 0,58 0,59 0,55 0,59

0,75 0,63 0,57 0,60 0,59 0,56

1 0,43 0,49 0,50 0,47

1 0,72 0,46 0,48

1 0,41 0,48

1 0,50

1

El dendograma (figura 13) que ilustra las relaciones genéticas entre los individuos muestra cinco ramas principales, con una estructuración relativamente poco marcada. Se puede observar una estructura de origen geográfico en la agrupación de la accesiones por países, pero al menos un individuo queda fuera de su grupo para cada país. En la muestra de Costa Rica, la más diferenciada, no se observa diferenciación entre Costa Pacífica y Atlántica, ni entre accesiones silvestres y cultivadas. Para Guadalupe, cinco accesiones están bien agrupadas mientras G2, G66 y G77 están dispersas en grupos distintos. Las accesiones de Venezuela y de Guadalupe son las más cercanas. La hawaiana ‘Solo’ se acerca mucho a BBD6, de Barbados, lo que confirma el origen de este cultivar. En conclusión, de los 76 pares de iniciadores definidos, 70 han funcionado en Carica, lo que representa una proporción muy alta en comparación con estudios en otras especies. Pero sólo cuatro se pudieron utilizar en Vasconcellea, confirmando la diferenciación de los dos géneros. La clasificación obtenida no siempre concuerda con los resultados anteriores con isoenzimas; los microsatélites han permitido una mejor agrupación geográfica aunque todavía poco marcada. Por otra parte, la variación genética detectada entre los diferentes grupos de materiales no corresponde con la fuerte variación morfológica observada en campo, en caracteres tanto vegetativos como pomológicos. Sin embargo, los valores de similaridad genética son más bajos que los obtenidos con isoenzimas y con RAPD y AFLP, lo que se puede relacionar más probablemente con una mejor aptitud de esta técnica para revelar polimorfismo. Los altos niveles de diferenciación alélica indican que los microsatélites constituirán una herramienta poderosa para el estudio genético de C. papaya, particularmente para la identificación varietal y la cartografía genética. Se puede vislumbrar el desarrollo de técnicas de selección asistida por estos marcadores. Este estudio fue realizado por un investigador colombiano, J.A. Ocampo, del grupo investigativo CIRAD-FLHOR/IPGRI, en el laboratorio BIOTROP de CIRAD.

28

Figura 13. Clasificación de las papayas (datos sobre microsatélites, neighbor joining, distancia de Dice).

2.2.2.3. Caracterización del ADN cloroplástico por marcadores CAPS El ADN cloroplástico es una molecula grande, redonda, muy estable en tamaño y estructura. El ADNcp se encuentra en muchas más copias por célula que las sucesiones del ADN nuclear y su evolución es más lenta. La organización de sus genes es más estable y la taza de sustitució n de sus nucleótidos es cuatro veces menos alta que en el nuclear. Por desarrollarse clonalmente el ADNcp es una fuente de marcadores originales muy útil en filogenia a nivel interespecífico o superior. El análisis de los sitios de restricción es cada vez más usado para el estudio de la filogenia. En el presente trabajo, se utiliza la técnica de CAPS o PCR-RFLP, que consiste en amplificar el ADNcp por PCR, con iniciadores universales, y digerir el fragmento amplificado con unas o varias enzimas de restricción. Posteriormente se revela el polimorfismo de la restricción por medio de electroforesis clásica en gel de agarosa o acrilamida no denaturada.

29

El ADN utilizado para el desarrollo de la técnica proviene de muestras de la Universidad Técnica de Ambato (Ecuador; género Vasconcellea), de la Universidad de Gante (Bélgica; Vasconcellea y Carica) y de la Universidad Central de Costa Rica (C. papaya silvestre y cultivada). No se pudo disponer de muestras de ADN procedentes de Colombia ni de Venezuela a causa de dificultades de acceso. Se realizó una electroforesis para determinar la cantidad y la calidad del ADN. Con base en estos resultados se seleccionó una muestra de siete individuos de V. cundinamarcensis, V. stipulata, V. weberbaueri, V. cauliflora, V. monoica, V. x heilbornii y C. papaya, para ajustar los protocolos a las especies estudiadas. En esta etapa se tuvo en cuenta la temperatura de hibridación porque todos los iniciadores no amplifican sobre las siete especies a la misma temperatura. Un total de nueve pares de iniciadores amplificaron sobre la muestra (trnH-1/trnK-2, trnK-2/trnK-3, rpoC2-7/rpoC1-8, trnC-9/trnD-10, trnD11/trnT1-12, psbC-15/trnS-16, trnS-21/trnT-22, rbcL-29/trnM-28) a 52, 55 y 60°C. La selección de las endonucleasas se realizó bajo el criterio del número de bases, ya que este tipo de marcador requiere enzimas hasta con 3 pb. Un total de 12 enzimas se utilizaron para la digestión de los productos de la PCR, (Tas I /AATT, Aci I CCGC/, Nla III CATG/, Hinf I G/ANTC, Msp IC/CGG, Rsa IGT/AC, Alu IAG/CT, Mbo I/GATC, Mse I T/TAA, Eco R V GAT/ATC, Bsu R IGG/CC). La digestión se realizó durante toda la noche. Posteriormente se realizó la electroforesis sobre gel de agarosa y el revelado en bromuro de etidio. Una vez los geles revelados se evaluó el polimorfismo de cada marcador, obteniéndose 51 marcadores polimórficos, nueve de los cuales presentaron baja definición. Cuarenta y dos muestran polimorfismo intergenérico e interespecífico y nueve presentan polimorfismo unicamente intergenérico (tabla 5). Tabla 5. Desarrollo de marcadores CAPS para Caricaceae. Polimorfismo intergenérico (cruces verdes) e interespecífico (cruces anaranjadas) en una muestra de los géneros Carica y Vasconcellea.

Enzymes/ 1-2 3-4 7-8 9-10 11-12 15-16 21-22 28-29 30-31 Fragments trnH/trnK trnK/trnK rpoC2/rpoC1 trnC/trnD trnD/trnT psbC/trns trns/trnt trnM:rbcL rbcL:rbcl TasI /AATT X = = X X = X = = AciI CCGC/ X = X = X = = = X Nla III CATG/ X pasnet = X X X X = X Hinf I G/ANTC X X X X X X = = = MspI C/CGG nonrestreint = pasnet pasnet nonrestreint X X pasnet = RsaI GT/AC = X X X X = = X = AluI AG/CT X pasnet X X X = X X X MboI /GATC X X X X X = X = X MseI T/TAA = X pasnet X = X X = EcoRV GAT/ATC nonrestreint X X X nonrestreint nonrestreint X nonrestreint nonrestreint BsuRI GG/CC X = =

30

Para desarrollar el protocolo en el total de la muestra, se han preseleccionado tres pares de iniciadores con el conjunto de enzimas que mostraron polimorfismo en la digestión. La muestra total incluye nueve especies y 68 individuos, distribuidos de la siguiente manera : V. cundinamarcensis (16), V. candicans (1), V. x heilbornii (19), V. monoica (3), V. stipulata (8), V. palandensis (2), V. parviflora (3), V. weberbaueri (2), C. papaya (14). El estudio seguirá después del fin del proyecto, para aplicar la técnica con el total de marcadores polimórficos obtenidos sobre el conjunto de la muestra. De esta manera se tendrá una mayor cobertura de los genomas de Vasconcellea y Carica y se comprenderá mejor su filogenia. En la medida de lo posible se incrementará el número de especies y de orígenes para lograr una muestra más representativa de los dos géneros. Este estudio fue realizado por una investigadora colombiana, M.T. Restrepo, del grupo investigativo CIRAD-FLHOR/IPGRI, en el laboratorio BIOTROP de CIRAD. 2.2.2.4. Extracción de ADN en Venezuela Se extrajo el ADN de 13 accesiones de los géneros Carica y Vasconcellea autóctonas de Venezuela, para juntarlos a los estudios de caracterización molecular. Sin embargo, no se consiguió la autorización de salida de este germoplasma antes del fin del proyecto.

2.2.3. Caracterización citogenética y palinológica Los 21 materiales utilizados en los estudios citogenéticos y palinológicos realizados por el grupo investigativo CIRAD-FLHOR/IPGRI en el laboratorio de virología del CIAT, fueron recolectados en las colecciones de la UTA y de CORPOICA. Consisten en seis accesiones de V. stipulata (todas del Ecuador), seis de V. cundinamarcensis (una de Colombia), una accesión colombiana para V. sphaerocarpa, V. cauliflora y V. crassipetala y dos para V. goudotiana y C. papaya, y una accesión ecuatoriana para V. monoica y V. x heilbornii nm. pentagona. Todas estas especies son diploides con 2n = 18 cromosomas y un núcleo interfásico del tipo arreticulado. La meiosis fue más particularmente estudiada en dos accesiones de V. cundinamarcensis, de Colombia y Ecuador, V. sphaerocarpa y V. cauliflora. Numerosos comportamientos diferenciados e irregularidades fueron observados, como presencia de micronucléolos en profases y telofase, condensación tardía en profase, presencia de univalentes, trivalentes y tetravalentes, asociaciones cromosómicas secundarias, irregularidades de huso y segregación precoz o retardada de cromosomas.

31

Figura 14. Ausencia de huso en V. cundinamarcensis (VcundEc24). a) meiocitos en metafase I con diferentes asociaciones cromosómicas dispersas en el citoplasma; b) telofase I exhibiendo núcleos con diferentes cantidades de cromatina; c) telofase II con más de cuatro núcleos; d) segunda citocinesis, en planos irregulares, lo que dará origen a microcitos; e) tétrada de microsporos con dos microcitos; f) productos finales, la mayoria esteril (no teñidos), el central mas pequeño, resultante de microcito.

Una accesión de V. cundinamarcensis del Ecuador se caracterizó por la frecuente ausencia de huso, con sus consecuentes irregularidades (figura 14). Germoplasma con estas características no son favorables para desarrollar programas de mejoramiento. Características como presencia de micronucléolos, asociaciones cromosómicas secundarias y la presencias de numerosas regiones de organización del nucléolo en las accesiones de V. sphaerocarpa y V. cauliflora indican un probable origen híbrido de estas especies. Las accesiones colombiana y ecuatoriana de V. cundinamarcensis se diferencian por los patrones de husos y tétradas, en aspectos palinológicos y por la presencia de micronucléolos y de asociaciones secundarias en la primera. La viabilidad polínica es altamente variable entre las accesiones estudiadas, tanto entre como dentro de las especies, con un rango extendiéndose entre 15 y 97%, justificando este tipo de pruebas en los programas de mejoramiento. Polen tricolporado, mediano y de un mismo patrón fue observado en todas las accesiones estudiadas. El estudio permitió una descripción general del polen en el género Vasconcellea, según las especies evaluadas. En las figuras 15 y 16 son exhibidas vistas polar y ecuatorial de las diferentes especies, tomadas en microscopía electrónica de barrido. Los datos colectados podrán contribuir al estudio de la diversidad de las especies de Vasconcellea.

32

Figura 15. Vistas ecuatorial (a,c, e, g) y polar (b, d, f, h) del polen de Caricaceae, en microscopía electrónica de barrido. a-b) V. cundinamarcensis de Ecuador VcundEc24; c-d) V. cundinamarcensis de Colombia (VcundCol); e-f) V. stipulata; g-h) V. goudotiana.

33

Figura 16. Vistas ecuatorial (a,c, e, g) y polar (b, d, f, h) del polen de Caricaceae, en microscopía electrónica de barrido. a-b) V. cauliflora; c-d) V. sphaerocarpa; e-f) V. crassipetala; g-h) C. papaya.

34 2.2.4. Evaluación 2.2.4.1. Evaluación físico-química Se evaluaron accesiones de V. cundinamarcensis, V. goudotiana y C. papaya cv. Cotové para peso de fruto, mesocarpio, semillas y arilo, dimensiones de fruto, volumen y peso de látex por fruto, acidez (pH), contenido de sólidos solubles, azúcares totales y reductores, almidón, fenoles diméricos, oligoméricos y poliméricos, pectinas de alta y baja metilación, protopectina y ácido ascórbico. Los resultados se pueden consultar en el informe de Corpoica en anexo. 2.2.4.2. Evaluación de resistencias 2.2.4.2.1. Nematodos Cinco materiales fueron evaluados en el INIA por su comportamiento frente a los nematodos Meloidogyne incognita Raza 1 y Rotylenchulus reniformis : ‘Pajarera’ (papaya asilvestrada), ‘Red Lady’, ‘Maradol’ de C. papaya y A y B de V. goudotiana. Otro grupo de materiales fue evaluado sólo con respecto a M. incognita Raza 1: C. papaya ‘Sofía’, ‘Paraguanera’, ‘Cartagena Amarilla’, ‘Varadero’, ‘Criolla roja’, ‘Costa Rica’, ‘San Felipe’, ‘La Habana’, ‘Maradol’ – Falcón, V. cauliflora, V. cundinamarcencis (Las Lomas, Trujillo, La Azulita, Chorotal, La Porquera), V. microcarpa var. microcarpa, V. microcarpa var. pilifera. Se usaron de cada material cinco plantas no inoculadas como testigo y cinco inoculadas con 2000 huevos+juveniles / planta de una población mixta de M. incognita y R. reniformis. Para el caso de sólo M. incognita, se usó un nivel de 2.500 huevos+juveniles / planta. Después de 12 semanas se evaluaron las variables agronómicas peso aéreo fresco y seco y peso radical fresco y seco; también se determinó el Factor de Reproducción (FR=Pf/Pi) y el Indice de Agallamiento. Todas las plantas inoculadas presentaron formación de agallas. Hubo diferencias significativas entre los materiales evaluados para el peso aéreo y radical fresco, entre las plantas inoculadas y las no inoculadas, a excepción de C. papaya ‘Red Lady’ y ‘Maradol’- Aragua que no presentaron diferencias para el peso radical y aéreo respectivamente. Se realizó histolopatología de los materiales. Todos los materiales de C. papaya inoculados mostraron células gigantes, núcleos y nucléolos y masas de huevos típicas de Meloidogyne. Además, aquellas inoculadas simultáneamente con R. reniformis, mostraron las células del parénquima vascular formando un sincitio, con células hipertrofiadas, citoplasma granular, núcleos agrandados y nucléolos prominentes. La acción de los nematodos disminuyó de manera significativa los pesos aéreo y radical fresco para C. papaya en todos los materiales comerciales. Al contrario los materiales de Vasconcellea no presentaron diferencias significativas para ninguna de las variables evaluadas a excepción de V. goudotiana Tipo B, V. cundinamarcencis, V. cauliflora y V. microcarpa var. microcarpa, los cuales mostraron diferencias en alguna de las variables agronómica evaluadas. Así, mientras todos los materiales de C. papaya se muestran susceptibles y no tolerantes, algunos de los materiales pertenecient es al género

35 Vasconcellea pueden ser considerados como resistentes - tolerantes a la acción del nematodo (tablas 6 y 7).

Tabla 6. Reacción de los materiales ensayados a M. incognita y R. reniformis. Material

Reacción (Cook,1974)

Carica papaya ‘Pajarera ’

Susceptible – No tolerante

Carica papapa ‘Red Lady’

Susceptible – No tolerante

Carica papaya ‘Maradol’ - Aragua

Susceptible – No tolerante

Vasconcellea goudotiana Tipo A

Susceptible – Tolerante

Vasconcellea goudotiana Tipo B

Susceptible – No tolerante

Tabla 7: Reacción de los materiales ensayados a M. incognita.

Material

Reacción (Cook,1974)

C. papaya ‘Sofía’

Susceptible – No tolerante

C. papaya ‘Paraguanera’

Susceptible - No tolerante

C. papaya ‘Cartagena amarilla’

Susceptible - No tolerante

C. papaya ‘Varadero’

Susceptible - No tolerante

C. papaya ‘Criolla roja’

Susceptible - No tolerante

C. papaya ‘Costa Rica’

Susceptible - No tolerante

C. papaya ‘San Felipe’

Susceptible - No tolerante

C. papaya ‘La Habana’

Susceptible - No tolerante

C. papaya ‘Maradol’ - Falcón

Susceptible - No tolerante

V. cauliflora

Susceptible – No tolerante

V. cundinamarcencis Las Lomas

Resistente - No tolerante

V. cundinamarcencis Trujillo

Resistente - No tolerante

V. cundinamarcencis La Azulita

Resistente - Tolerante

V. cundinamarcencis Chorotal

Susceptible - Tolerante

V. cundinamarcencis La Porquera

Resistente – No tolerante

V. microcarpa microcarpa

Resistente – No tolerante

V. microcarpa pilifera

Resistente - Tolerante

36

Los estudios histopatológicos (figura.17) también indican que algunos materiales de Vasconcellea presentan ciertas características que les permiten reaccionar como resistentes a una población mixta de M. incognita Raza 1 y R. reniformis, al contrario de todos los materiales comerciales de C. papaya, los cuales presentaron severas alteraciones histológicas.

Ne N Ne

CM

A

B Si

CM

P

MH

C

N

D

Figura 17. Corte transversal de raíces de V. cundinamarcencis (A, B y C) inoculadas con M. incognita Raza 1 y de V. cauliflora (D) inoculada además con R. reniformis: célula multinucleada (CM), nematodo (Ne), necrosis (N), masa de huevos (Mh), periciclo alterado (P), sincitio (Si).

2.2.4.2.2. Virus de la mancha anular (Papaya Ring Spot Virus: PRSV) Existe controversia en la literatura sobre la susceptiblilidad de las diferentes especies de Caricaceae al PRSV-P. Algunas especies han resultado susceptibles para algunos autores y resistentes para otros. Estas especies podrían ser fuentes de genes de resistencia al virus a través de cruzamientos genéticos conve ncionales o mediante el aislamiento, clonaje e introducción de genes de resistencia por técnicas moleculares. Este estudio pretende esclarecer la susceptibilidad o resistencia de seis especies usando cinco aislados geográficos del virus de varias partes del mundo, y técnicas de diagnóstico más sensibles que las usadas en el pasado.

37 Este trabajo se realizó en colaboración entre el INIA y el laboratorio de virología de la Universidad de Cornell (Nueva York), sobre germoplasma de la colección del USDA (código HCA) y material venezolano, incluyendo C. papaya cv. Sunrise, V. cauliflora (HCAR 274 N93-42; HCAR 173 372), V. goudotiana HCAR 281 UHACC # 1030, V. microcarpa HCAR 288 N93-56), V. monoica, V. cundinamarcensis y V. cauliflora (sin números). Estos materiales se inocularon con cinco aislamientos PRSV, procedentes de Venezuela (El Vigia), México (Tapachula), Hawai (HA), Taiwán y Tailandia, con la finalidad de estudiar la susceptibilidad o resistencia de estas especies. Se inocularon de 10 a 20 plantas/especie/aislamiento. Cada inoculación fue repetida al menos dos veces. También se inoculó un aislamiento del virus de la distorsión y mosaico de la hoja de la papaya (Papaya Leaf Distortion Mosaic potyvirus - PLDMV) a plantas de cinco de estas especies, V. monoica, V. cundinamarcensis, V. microcarpa HCAR 288 No 93-56, V. goudotiana HCAR 278 y UH ACC No. 1026, V. cauliflora HCAR 173 372. Se usaron como plantas testigos C. papaya cv. Solo, Cucumis metuliferus y Chenopodium quinoa. Se evaluaron los síntomas de las plantas inoculadas cada semana, por espacio de 45 días. El PLDMV es predominante en Japón, pertenece al mismo grupo que el PRSV-P, induce síntomas similares, tiene el mismo rango de plantas hospederas y se transmite también por áfidos. El conocimiento del virus y pruebas de diagnóstico que descarten su presencia en la región es importante para el desarrollo de estrategias de control de enfermedades virales para este frutal. En este estudio se investiga por primera vez la reacción de otras especies de Caricaceae hacia este virus, ya que estas podrían actuar como reservorio en algunas áreas y pueden ser usadas como fuentes de resistencia en programas de mejoramiento genético. La infección viral fue confirmada a través de la recuperación del virus en cinco plantas de papaya, la técnica serológica de ELISA y la técnica más sensible de hibridación del ARN con una sonda especifica. De la misma manera se aisló el ARN de hojas de papayas y papayas de montaña, mostrando o no síntomas. En la tabla 8 se resumen los síntomas que presentan las plantas hospederas de los dos virus, después de su inoculación. En general, los síntomas expresados dependieron de la especie, cepa y título del virus y de la edad de la planta. Las cepas de México, Venezuela y Tailandia fueron las más virulentas, la cepa de Hawai la menos virulenta y la de Taiwan mostró virulencia media. Las especies C. papaya, V. microcarpa, V. monoica y V. goudotiana dieron síntomas sistémicos para todos los aislados, las dos últimas mostrando además lesiones locales con algunas de las cepas. En V. cauliflora y V. cundinamarcensis se observaron lesiones locales y muerte regresiva. Sin embargo, en V. cauliflora, algunas plantas desarrollaron mosaico sistémico, y, en V. cundinamarcensis necrosis sistémica, donde se detectó la presencia del virus, mediante pruebas biológicas (síntomas en plantas), serológicas y moleculares. Algunas plantas de V. cundinamarcensis y V. cauliflora se recuperaron de la infección, después de 21 a 35 días de la inoculación. Pasado este tiempo, las hojas nuevas no mostraban síntomas y no se detectó la presencia del virus en estas plantas. Así, en este trabajo, se señala por primera vez síntomas de lesiones locales, muerte regresiva y recuperación de plantas de papaya y papaya de

38 montaña, después de la inoculación con el PRSV-P, comprobando la eliminación del virus en las plantas recuperadas. Con el virus de PLDMV, C. papaya, V. monoica, V. microcarpa y V. goudotiana mostraron síntomas sistémicos. En el caso de V. goudotiana se observaron además síntomas de necrosis apical. Por lo tanto se consideraron susceptibles al PLDMV. V. cauliflora sólo se infectó en un porcentaje bajo (0,1 %), mientras V. cundinamarcensis parece ser resistente o inmune al virus. El virus fue recuperado de las plantas que mostraron síntomas sistémicos, incluyendo V. cauliflora, pero no de las muestras de plantas de V. cundinamarcensis y V. cauliflora libres de síntomas. Los testigos Chenopodium quinoa y Cucumis metuliferus no desarrollaron ningún síntoma. La técnica de RT-PCR usada permitió resultados confiables y rápidos en cuanto a la presencia del PLDMV en las diferentes accesiones y corroboró los resultados de las pruebas biológicas. Este trabajo de susceptibilidad de Caricaceae al PLDMV es el primero en su área, y permitió identificar plantas hospederas que podrían servir de reservorio del virus en su habitat natural y otras que podrían servir de fuentes de resistencia. Si se requiriere confirmar la presencia de este virus en países donde no esté citado, se recomienda reforzar el diagnóstico con las técnicas moleculares descritas. Tabla 8. Susceptibilidad de especies de Vasconcellea a los virus de la mancha anillada de la papaya (PRSV-P) y mosaico distorsionante de la hoja de la papaya (PLMV). SS=síntoma sistémico; SSs=síntoma sistémico suave; Ns= ningún síntoma; LI=lesión local; lln=lesión local necrótica’Mr=muerte regresiva: R=recuperación, sin síntomas. Planta Hospedera

C. papaya cv. Sun Rise (Hawai) V. microcarpa (HCAR 288 No. 93-56) V. goudotiana (HCAR 278 UH 1026) V. monoica (venezuela) V. cundinamercensis (Venezuela) V. cauliflora (HCAR 173 372) Cucumis metuliferus (Acc. 2459) Chenopodium quinoa N. benthamiana

PRSVVenezuela SS

PRSVTapachula (Mx) SS

PRSVThailandia

PRSVTaiwán

PRSVHawai

PLDMV

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS+LI

SS

SS

SS

SS+LI

SS

SS+LI

SS

SS

SS+Mr

Mr/LI/R

Mr/LI+Lin R

Lin+LI

LLn

LI+LIn

Ns

SS

SS

SS

SS

SS

SS

Ns Ns

Ns Ns

Ns Ns

Ns Ns

Ns Ns

Ns Ns

Mr/Ns

Se desconocen los mecanismos de resistencia presentes en las Caricaceae hacia los virus PRSV-P y PLDMV, sin embargo se sospecha que el silenciamiento de genes podría estar involucrado en estas respuestas, y pareciera que estos mecanismos fueran diferentes para cada especie. Se amerita un estudio más profundo para determinar si ciertas reacciones podrían constituir mecanismos de resistencia del tipo hipersensible.

39 2.2.4.2.3. Bacteria del cancro Las variedades comerciales de papaya de exportación, como las del grupo Solo y los cultivares taiwaneses, se han visto afectadas severamente por bacterias del género Erwinia. En las pruebas bioquímicas, las cepas de la bacteria aisladas de las diferentes zonas del Caribe han mostrado una alta variabilidad y características muy distintas en comparación con las cepas de Erwinia sp. descritas en Java, Taiwán y en las Islas Marianas. Estas diferencias han llevado a varios autores a concluir que se podría tratar de una nueva especie de Erwinia que estaría afectando el papayo. Para el estudio de la reacción de diferentes genotipos y variedades comerciales de la planta ante la bacteria, en el INIA, se utilizaron 10 plantas de los siguientes materiales : ‘Pajarera’ (papaya asilvestrada), Vasconcellea goudotiana tipo A y tipo B y V. cauliflora y cultivares Maradol, Cartagena Amarilla (San Felipe), Varadero, Costa Rica, Criolla Redonda, Paraguanera Amarilla y Solo, este último utilizado como testigo susceptible. A los 45 días de edad las plántulas fueron inoculadas con la suspensión bacteriana del aislamiento 1497 de Erwinia sp., produciendo heridas en la unión del pecíolo con el tallo con jeringa hipodérmica y heridas en las hojas. Las plantas inoculadas se colocaron en cámara húmeda por 48 horas. De cuatro a cinco días después de la inoculación, se comienzan a observar los síntomas de la enfermedad en los materiales susceptibles. Aparecen manchas acuosas en el punto de inoculación, luego los síntomas crecen y comienzan también los síntomas foliares y la diseminación de manchas grasientas en el tallo a partir del punto de inoculación. Finalmente, el alto grado de degradación de los tejidos en los puntos de inoculación provoca una marchitez de las plantas y su muerte en algunos casos. Todos los materiales comerciales evaluados se mostraron susceptibles en menor o mayor grado (tabla 9). Los cultivares Cartagena Amarilla y Costa Rica tuvieron un comportamiento tolerante, lo cual justificaría un estudio más detallado en condiciones de campo. El genotipo asilvestrado ‘Pajarera’ resultó susceptible, pero se observó que los genotipos silvestres de V. goudotiana (Tipo A y Tipo B) y V. cauliflora son inmunes a la enfermedad, lo que coincide con los resultados obtenidos por de Lapeyre et al., en el CIRAD-FLHOR. Este trabajo fue realizado con una cepa de la bacteria designada como Musky Canker. Se requieren seguir la evaluación de genotipos con varias cepas de la bacteria para evidenciar posibles fuentes de resistencia que se puedan incluir en los programas de mejoramientos. Unas primeras pruebas de evaluación de resistencia contra las cepas más virulentas de Erwinia está en curso en Guadalupe, con el objetivo de identificar accesiones con tolerancia y buenas características pomológicas para el mercado local.

40 Tabla 9. Reacción de diferentes genotipos de C. papaya y Vasconcellea spp. a la inoculación con Erwinia sp. (escala de susceptibilidad de 0 (inmune) a 4 (marchitamiento de las plantas); evaluación a seis semanas. Materiales

Grado de la enfermedad

Plantas con síntomas

C. papaya ‘Cartagena Amarilla’

2

3/10

‘Costa Rica’

1

2/10

‘Criolla redonda’

3

7/!0

‘Maradol’ ‘Pajarera’

4 3

8/10 8/10

‘Paraguanera Amarilla’

3

6/10

‘Varadero’

3

5/10

‘Solo’ (testigo susceptible) Vasconcellea spp. V. goudotiana A V. goudotiana B V. cauliflora Testigo

4

10/!0

0 0 0 0

0/10 0/!0 0/10 0/!0

Observaciones

Manchas aceitosas punto inoculación Manchas pequeñas aceitosas en el tallo Muerte del ápice y Pudrición parcial del tallo Marchitez severa Muerte del ápice y pudrición parcial del tallo Muerte del ápice y manchas aceitosas en el tallo Muerte del ápice y manchas aceitosas en el tallo Marchitez severa, pudrición del tallo y muerte de ápice Sin síntomas Sin síntomas Sin síntomas Sin síntomas

2.3. Estudio de la variabilidad de los dos principales patógenos 2.3.1. Virus de la mancha anular Sin duda alguna, la mancha anular de la papaya es el principal problema fitosanitario de este cultivo, no sólo en América tropical sino a escala mundial. Esta enfermedad viral afecta tanto la calidad del fruto como el rendimiento de las plantas afectadas, y reduce la vida productiva de éstas a unos pocos años. En la etapa final de la enfermedad, las plantas infectadas pierden prácticamente todo su follaje y su capacidad reproductiva. El agente causal, el virus de la mancha anular de la papaya (PRSV), es un patógeno transmitido por varias especies de áfidos de manera ‘no persistente’, lo cual significa que el virus puede ser adquirido de plantas enfermas y transmitido a plantas sanas en cuestión de segundos, antes de que un insecticida pueda actuar. El otro problema es que todas las variedades comerciales de papaya seleccionadas por métodos convencionales son susceptibles al virus. Para tratar de controlar esta enfermedad, investigadores en diversos países del mundo han recurrido a prácticas tales como la ‘protección cruzada’ y el desarrollo de plantas transgénicas. La ‘protección cruzada’ comprende la inoculación de una planta de papaya con una variante (cepa) del virus de baja agresividad, la cual debe proteger la planta contra la inoculación de las cepas más agresivas del virus que causan el daño severo asociado a esta enfermedad. Esta estrategia no ha sido muy utilizada por los productores porque aun

41 las cepas ‘suaves’ pueden causar daños a las frutas de algunas variedades de papaya muy susceptibles, y porque los agricultores no quieren infectar sus árboles a propósito. Además, las llamadas cepas ‘suaves’ del PRSV suelen dar solo una protección adecuada contra las cepas del virus muy estrechamente relacionadas, generalmente dentro de una misma región. Las plantas transgénicas de papaya han sido obtenidas siguiendo la estrategia de la transferencia de genes específicos, por lo general el de la cápside del virus, a las variedades comerciales, utilizando métodos biolísticos o transformando plantas mediante cepas de Agobacterium. Mientras que esta estrategia ha sido exitosa en lugares como Hawai, no ha sido así en otros países, debido a la variabilidad patogénica existente en el PRSV. El conocimiento de la variabilidad patogénica es también necesario en programas de mejoramiento genético tradicional, con el fin de seleccionar padres con el mayor espectro posible de resistencia a las diferentes variantes patogénicas del PRSV existente en un país o región. Es por estas razones que uno de los principales objetivos del proyecto fue el de generar conocimientos básicos sobre la variabilidad patogénica del PRSV en la región andina seleccionada: Venezuela, Colombia y Ecuador. 2.3.1.1. Venezuela (IVIC) La recolección de muestras de plantas de papaya afectadas por ‘mancha anular’ se realizó en tres regiones diferentes de Venezuela: la región Zuliana, la región Central y la Región Oriental, para un total de 15 localidades visitadas y 24 aislamientos recolectados. Estos fueron sometidos a un análisis polimórfico de cadena simple (SSCP), usando la enzima de restricción EcoRI. Los resultados de este análisis sugieren la existencia de tres grupos con diferentes patrones de polimorfismo. Se seleccionaron siete de aislamientos representativos de cada uno de estos grupos para su caracterización molecular parcial (500 pares de bases de la región central del gen de la cápside del virus). La tabla 10 muestra la matriz de homología obtenida para estos aislamientos del PRSV en la región central de Venezuela. Tabla 10. Matriz de homología para las secuencias obtenidas posterior al proceso de escisión de ambos extremos en la secuencia de la cápside proteica. Los porcentajes indicados en azul representan los mayores valores de homología con relación al total.

Como se puede apreciar, hay un porcentaje (62,6%) intermedio de similitud entre estos aislamientos, siendo mayor (88-92%) para los aislamientos Ch-2, LCb y PM. Sin embargo, la variabilidad observada (78,3%) sugiere la presencia de variantes del PRSV,

42 en algunos casos dentro de una misma planta. La Figura 18 muestra el dendrograma filogenético para estas secuencias, comparadas con otras seleccionadas del Banco de Genes. Los resultados obtenidos muestran una variabilidad patogénica considerable para la mayoría de los aislamientos del PRSV analizados en Venezuela, especialmente para aquellos colectados en el Zulia.

Figura 18. Dendograma filogenético para las secuencias centrales de la proteína de cápside de PRSV obtenida en Venezuela y las correspondientes a las publicadas en el GeneBank a escala mundial.

Los aislamientos venezolanos del PRSV presentan notables niveles de divergencia evolutiva entre sí y respecto a los aislamientos de PRSV de otras partes del mundo. Los autores del trabajo concluyen que sólo en la región central del país, siendo la más pequeña, se “presentan notables niveles de divergencia evolutiva entre sí y respecto a los aislados comparados a nivel mundial”. Estos resultados sugieren la necesidad de tener en cuenta toda la variabilidad patogénica y molecular detectada en Venezuela, para ampliar el estudio y diseñar estrategias de control específicas para el caso venezolano, bien sea por medio de métodos convencionales o moleculares. 2.3.1.2. Colombia y Ecuador (CIAT e INIAP) En Colombia se analizaron muestras de papaya afectada por ‘mancha anular’ procedentes de diferentes localidades del área andina. La tabla 11 muestra la relación entre la similitud de secuencia a nivel de nucleótidos, entre los aislamientos seleccio nados. Como se observa, hay una alta homología entre los aislamientos colectados en diferentes puntos de Colombia. Se observa también la secuencia de un aislamiento del PRSV procedente del norte del Ecuador, cerca de la frontera con Colombia. Este aislamiento también presentó una alta homología con relación a los aislamientos colombianos. Los otros dos aislamientos procedentes de Ecuador, específicamente de las provincias de Manabí y Guayas, mostraron secuencias casi idénticas al aislamiento original de la provincia de

43 Carchi. El total de muestras recolectadas en el Ecuador fue de 31 muestras, procedentes de las provincias de Los Ríos, Pichincha y las dos antes mencionadas. El porcentaje de muestras positivas para el PRSV en todas las localidades visitadas, fue del 77%. Tabla 11. Porcentaje de similitud de secuencias de aislados del PRSV.

Nucleotidos Aislamiento viral Similitud de secuencias de nucleotidos secuenciados 570 Yotoco-Valle 100 900 SantaMarta-Magdalena 96,1 100 673 Ecuador 94,9 94,3 100 650 Ginebra-Valle 93,8 87,4 86,1 100 230 Viterbo-Caldas 96,9 95,6 96 98,2 100 499 Santafe-Antioquia 86,6 79,9 75,6 78,8 96,5

2.3.1.3. En los tres países La Figura 19 muestra las relaciones filogenéticas de los aislamientos colombianos, ecuatorianos y venezolanos, con relación a otros aislamientos del PRSV a escala mundial. Se aprecia que los aislamientos del PRSV de Colombia y el de Ecuador, se asemejan considerablemente a los aislamientos mexicanos, así como a los de Florida y de Hawai. Por el contrario, se observa una gran variabilidad genética en los aislamientos venezolanos, particularmente en los aislamientos Ch-1 y StL-2 de la Región Central. 2.3.1.4. Conclusiones Se ha logrado la caracterización molecular de un número representativo de muestras de papaya infectadas por el PRSV en Colombia, Ecuador y Venezuela. Los resultados obtenidos, particularmente en Colombia y en Ecuador, sugieren que la adopción de técnicas de control podría seguir una estrategia similar para el caso de estos dos países y algunas regiones de Venezuela. En el caso de este último país, habría que estudiar más a fondo la variabilidad patogénica aparente, usando métodos convencionales, con el fin de determinar si las diferencias detectadas a escala molecular se traducen en mayores daños en campo. De todos modos, existen diferencias significativas en la proteína de la cápside de algunos aislamientos venezolanos del PRSV, lo cual limita el uso potencial de técnicas de control, como son las plantas transgénicas, modificadas precisamente con ese gen de la cubierta proteica del virus. A corto plazo, se debería estudiar la posibilidad de evaluar el comportamiento de materiales transgénicos de papaya en Colombia y Ecuador, teniendo cuidado de realizar las pruebas lejos de regio nes donde existan especies relacionadas cercanamente a C. papaya. También se podrían adoptar medidas de control físico de áfidos vectores. Estos métodos de control están siendo usados exitosamente en Hawai y Taiwán, respectivamente. Los objetivos de este proyecto han sido cumplidos en lo que respecta a la caracterización parcial de la variabilidad patogénica del PRSV en Colombia, Ecuador y Venezuela.

44

Arbol de similitud de secuencias nucleotídicas de PRSV Colombia- Santa Marta

96%

Colombia- Valle del Cauca Yotoco Ecuador- Guayas

97%

Ecuador- Manabí

98%

Ecuador Mexico- AF319499 Hawaii- S46722

96%

USA- Florida- AF196839 Mexico- AF319495

98% 95%

Mexico- AF319504 Mexico- AF309968

86%

94% 97%

Mexico- AF319487 93%

Mexico- AF319502 Mexico- AF319490 USA- Puerto Rico- AF196838

92%

Venezuela- Ch-2 Mexico- AY017190

95%

Mexico- PRI012650

90%

Mexico- PRI012099

82%

89%

China- Taiwan- PRVNIAB Venezuela- PM

77%

Venezuela LCb Venezuela Ocu-3

75%

Colombia- Valle del cauca Ginebra Colombia- Antioquia-Santafe

95% 62%

Colombia- Caldas- Viterbo Venezuela Ch-1

44%

Venezuela StL-2

85%

India- AF323637

83%

India- AF323638 100%

90%

80%

70%

60%

50%

Figura 19. Dendograma de similitud de secuencias nucleotídicas de PRSV en Venezuela, Colombia y Ecuador.

40%

45 2.3.2. Variabilidad de la bacteria (INIA) Se extrajo en Guadalupe el ADN de 12 cepas de Erwinia del Caribe: St Vincent (Pembroke y South Rives), Martinica (Rivière Pilote y Dumanoir), Guadalupe (Moule y Capesterre), Sainte Croix (Lagrange) y Saint Lucia (Rabot y Richefonds). En Venezuela, se aisló el patógeno de plantas con síntomas de cancro, por siembra directa y por dilución en medio nutritivo. Las colonias bacterianas fueron purificadas y su patogenicidad comprobada mediante infección mecánica de C. papaya cv. Solo. Cinco colonias patogénicas se caracterizaron morfologicamente y por pruebas bioquímicas y fisiológicas. La etapa siguiente fue la caracterización molecular de la bacteria. Se realizó la amplificación de PCR específico de ocho ADN de las cepas de la bacteria Erwinia sp. del Caribe y de las cinco ADN de cepas de Venezuela. Las cepas 68 (Guadalupe aisl. 10429), 76 (Guadalupe aisl. 10431), 82 (Sainte Croix – Lagrange aisl. 11568) y aisl. 1353 de Venezuela generaron un producto de amplificación de 9.000 pb con el iniciador específico de E. carotovora. Además, se puede señalar la amplificación de un producto de aproximadamente 11.000 pb en los aislamientos 1179 y 1496 de Venezuela, lo cual puede relacionarse también con la especie E. carotovora pero un patovar o una raza diferente. Las cepas restantes no amplificaron con este iniciador por lo que se infiere que podrían pertenecer a una nueva especie de Erwinia o que estarían relacionadas con E. chrysanthemi.

2.4. Hibridaciones y selección 2.4.1. Hibridaciones interespecíficas 2.4.1.1. En Venezuela En el INIA, se han reciclado in vitro periódicamente (cada 1 a 2 meses) híbridos intergenéricos (C. papaya x V. cauliflora) procedentes de cruces sembrados en 1995 y 1999. En 2000, en la granja Mis Oscares, Tasajera, Sabaneta, Estado Aragua, a 1500 m, se sembraron en el campo plantas de V. cauliflora (8 plantas), V. cundinamarcensis (8 plantas), V. monoica (1 planta) y un híbrido intergenérico (clone n° 6: C. papaya x V. cauliflora). Para inicio de 2002, todas las plantas estaban en fase de floración y la accesión de V. monoica en fase de fructificación. Se comenzaron las polinizaciones controladas entre V. monoica, V. cauliflora y V. cundinamarcensis hasta completar todos los cruces posibles. Se esperaba compatibilidad completa entre los cruces de estas tres especies. En el año 2001, se agregaron plantas de papaya de los cultivares Sofia (de Colombia) y Maradol (de Cuba) (5 plantas/cultivar) y plantas híbridas C. papaya x V. cauliflora, clones 4 y 6. C. papaya x V. cauliflora clon 6 produjo 4 flores solitarias, a los tres meses después de la siembra. Las primeras flores cosechadas tenían aspecto normal; una de ellas era macho con cinco anteras largas y cinco cortas, y la otra flor era macho con un ovario primitivo, 10 anteras y dos estigmas. Se produjeron dos frutos por

46 cada cruce V. cundinamarcensis x V. monoica, V. cundinamarcensis x V. cauliflora y V. monoica x V. cauliflora. Sin embargo sólo se lograron cosechar los dos frutos del último cruce, que contenían semillas. Estas semillas se usarán para continuar con las actividades de los cruces interespecíficos. Por otra parte, en una siembra comercial de papaya ubicada en Valle Guanape, Estado Anzoátegui, a 500 m, se sembraron los híbridos interespecíficos clones n° 4 y 6. De esta misma siembra comercial se seleccionaron plantas madres de las poblaciones ‘Paraguanera’ (Roja y Amarilla, porte alto y porte bajo), ‘Cartagena’ (Roja y Amarilla), ‘Costa Rica’ y los cultivares ‘Maradol’ y ‘Red Lady’. La planta C. papaya x V. cauliflora más desarrollada formó ocho racimos de flores más tres flores solitarias, la primera flor a 40 cm del suelo, a los 4 meses después de la siembra. Lamentablemente, las plantas murieron después por falta de disponibilidad de agua. Las plantas híbridas in vitro y en el umbráculo mostraron fenotipos manifestando su origen paterno, con hojas más verdes y más brillantes, con márgenes más puntiagudas, que las vitroplantas de papaya (figura 20). En el umbráculo y en el campo, los híbridos presentaron un crecimiento lento, en comparación con plantas de papaya in vitro (figuras 20 y 21). En el campo, los híbridos florecieron a los 3-4 meses después de la siembra presentando flores normales tipo macho (con o sin ovario primitivo) y flores hermafroditas en las dos localidades (figura 21). Estos resultados corroboran parcialmente los obtenidos por Magdalita et al. (1997), cuyas plantas híbridas entre C. papaya y V. cauliflora solo produjeron flores hermafroditas.

Figura 20. Comparación entre plantas de híbrido intergenérico y papaya procedentes del cultivo in vitro, a nivel de umbráculo. a) papaya (izquierda) e híbrido (derecha), después de tres meses del transplante a suelo. b) Morfología característica del híbrido, antes del transplante a campo.

47

a

b

c

Figura 21. a) Comparación entre plantas de híbrido intergenérico (derecha) y papaya (izquierda), procedentes del cultivo in vitro, después de cuatro meses del transplante a campo. b) Híbrido intergenérico en fase de floración. c) Detalle de la floración del híbrido.

Según estos estudios, la hibridación entre C. papaya y V. cauliflora seguida del cultivo de óvulos y de embriones inmaduros parece un método factible para la trans ferencia de genes de resistencia. El uso de especies genéticamente más relacionadas en los cruces con la papaya y la evaluación de un gran número de plantas híbridas en el campo garantizarán híbridos fértiles útiles en los programas de mejoramiento genético.

48

2.4.1.2. En Colombia Se cruzaron plantas de C. papaya y V. cauliflora en la estación experimental Cotové de la Universidad Nacional (700 m) y se colectaron los frutos entre 90 y 120 días después de la polinización, para extracción y cultivo in vitro de los embriones. De 670 flores polinizadas, 120 desarrollaron frutos. No todas las semillas tenían embrión. El 40% de ellos presentaron tejidos embriogénicos para lograr la clonación del material. La giberelina tuvo un efecto muy positivo en el desarrollo y crecimiento de los embriones somáticos. Estos embriones serán individualizados y sembrados en un medio de enraizamiento y llevados a campo.

2.4.2. Caracterización, selección y autofecundación de segregantes en Costa Rica La Universidad de Costa Rica y el Ministerio de Agricultura y Ganadería realizan desde 1999 un proyecto de mejoramiento genético en papaya (Proyecto cooperativo UCRINTA). El objetivo de dicho proyecto es el de dotar a los agricultores nacionales con híbridos de alto potencial comercial para mercados nacionales e internacionales que posean además características fisiológicas favorables para su cultivo bajo las condiciones locales. Las labores principales se han centrado en la hibridación de materiales con características favorables complementarias con el fin de producir generaciones segregantes a partir de los cuales seleccionar y estabilizar líneas de alto valor comercial. Las líneas así generadas se seleccionan luego en base a sus aptitudes combinatorias específicas para la formación de los híbridos comerciales. Las parcelas de segregación se establecieron en la Estación Experimental “Los Diamantes” del Ministerio de Agricultura y Ganadería. Dicha estación se ubica en la región Atlántica de Costa Rica, a una altura de 240 msnm y cuenta con una temperatura promedio y una precipitación anual promedio de 24,6°C y 4380 mm respectivamente. El trabajo consistió en la caracterización, selección y autofecundación de segregantes de cuatro híbridos producidos en el marco del proyecto cooperativo de papaya UCR-INTA. Los materiales genéticos parentales utilizados en dichos híbridos corresponden a germoplasma proveniente de Costa Rica, Hawai y Cuba básicamente. En marzo del 2002, se sembraron 300 plantas segregantes del híbrido LM, así como 200 plantas para cada uno de los híbridos LH, 6X30 y 70X30. En septiembre, se procedió a ralear aquellas plantas con evidentes problemas de esterilidad femenina y carpeloidía. También se realizó una autopolinización de aquellas plantas que manifestaban un buen potencial productivo en ese período fenológico. A partir de enero del 2003, se procedió a caracterizar las plantas autopolinizadas y a seleccionarlas básicamente con criterios de productividad, así como de características organolépticas y de vida poscosecha de sus frutos. También se utilizaron como criterios de selección la apariencia externa de los frutos. Para dicha caracterización se tomaron tres frutos representativos de cada planta.

49 Se tomó un registro fotográfico digital de las plantas seleccionadas con el fin de compararlas con las generaciones posteriores de estabilización. Los resultados obtenidos hasta la fecha demuestran que los segregantes seleccionados del híbrido MH tienen capacidad de producir frutas de altos contenido de sólidos solubles, aun en las condiciones de alta precipitación de la zona. Presentan también en algunos casos frutos de tamaño aceptable para exportación a escala regional. Por su parte, los segregantes del híbrido LM poseen un tamaño más adecuado para mercados nacionales y agroindustria. Los materiales provenientes de los híbridos 6X30 y 70X30 poseen menor potencial comercial y por ende se han seleccionado sólo tres plantas en cada caso.

50 3. Actividades de coordinación El proyecto se inició bajo la coordinación del Profesor Freddy Leal de la Universidad Central de Venezuela, con el apoyo de la oficina del IPGRI para las Américas y más particularmente de Geo Coppens d’Eeckenbrugge, experto del Proyecto CIRADFLHOR/IPGRI para los Frutales Neotropicales y coordinador asociado. Cuando el Profesor Leal se retiró del proyecto para representar a su país ante la FAO en Roma, Geo Coppens d’Eeckenbrugge asumió la coordinación. En lo que concierne más específicamente la coordinación de las actividades del proyecto en Venezuela, fue la investigadora Carolina Rosales, del INIA, quién tomó el relevo del Profesor Leal. Además de las visitas de los coordinadores a los sitios del proyecto, se organizaron dos reuniones generales de los participantes, la primera al inicio del proyecto para armonizar metodologías y normas de taxonomía, la segunda al final del proyecto para compartir los resultados obtenidos y abrir perspectivas para la continuación de los trabajos y de la colaboración.

3.1. Taller sobre taxonomía de Caricaceae y manejo de bancos de germoplasma El taller tuvo lugar en las instalaciones del INIA-CENIA en Maracay, durante los días 19, 20 y 21 de octubre de 1999. Con excepción del INIAP-DENAREF, todas las instituciones participantes al congreso fueron representadas. Después de fa miliarizarse con la taxonomía de las Caricaceae y sus recientes modificaciones bajo la dirección del Profesor Victor M. Badillo, los científicos compartieron experiencias sobre el manejo de germoplasma, el mejoramiento y las principales plagas y enfermedades de las papayas, en una series de presentaciones. El taller también incluyó una planificación de las actividades entre los participantes y una introducción al manejo computarizado de los bancos de germoplasma (programa PCGRIN). El informe detallado del taller está presentado en el anexo 1 del informe de progreso 2001. Los textos de las presentaciones se han recopilado, editado y publicado. Estas memorias constituyen un estado del arte sobre el mejoramiento genético de las Caricaceae en los paises participantes.

3.2. Reunión final del proyecto La reunión final tuvo lugar en el CIAT, durante los días 28 y 29 de abril de 2003. Todas las instituciones participantes fueron representadas. La UCR y el IVIC no pudieron mandar representante pero aseguraron la presentación de sus resultados por colegas. La calidad de las presentaciones fue generalmente de un nivel muy bueno y muchos de ellas podrían desarrollarse para presentación en congresos internacionales y para publicación en revistas de alto nivel. Los participantes analizaron sus experiencias en el proyecto y estudiaron perspectivas para futuros proyectos cooperativos (ver anexo 1).

51 4. Nivel de ejecución del proyecto Para apreciar el nivel de ejecución del proyecto, hay que recordar que el presupuesto realmente otorgado por el Fondo (200.000 US$) corresponde al 40% del presupuesto de la propuesta inicial (500.000 US$) y al 50% del presupuesto que sirvió de base para el redimensionamiento del proyecto (400.000US$). Por esta razón, la meta se considera alcanzada cuando llega al 50% del nivel previsto en el proyecto modificado.

4.1. Colecciones nacionales con un promedio de 150 accesiones La meta está netamente superada en las Antillas (80 accesiones), el Ecuador (149 accesiones) y Colombia (106 accesiones). Para este último país, no incluimos la colección establecida en la Universidad de Caldas, que presenta numerosos errores de identificación taxonómica; además, la caracterización isoenzimática mostró un nivel de polimorfismo muy bajo, incompatible con lo s datos de pasaporte (cfr. sección 2.2.2.1) ; por lo tanto, en su estado actual, esta colección no puede ser utilizada para mejoramiento de papayas de monte. En Venezuela, las colectas fueron tardías, por lo que la meta se realizó sólo en 56%. En Costa Rica, no se pudo instalar una colección por limitantes relacionados con las normas del proyecto. La caracterización morfológica y evaluación agronómica y bioquímica están particularmente avanzadas en las colecciones de clima frío del Ecuador y de Colombia. Los resultados obtenidos permiten entender mucho mejor la estructura de la diversidad intra- e interespecífica en el género Vasconcellea. Para las especies de clima caliente, la situación varía entre los países. En Costa Rica, la caracterización in situ es muy completa, compensando en buena parte la falta de colección. En Colombia, Venezuela y las Antillas, los datos esenciales han sido tomados también in situ, pero los problemas encontrados en la instalación o el mantenimiento de las colecciones (inundaciones o enfermedades endémicas) no han permitido una caracterización completa de los materiales. Aunque enfocada en muestras limitadas, la evaluación de resistencias ha progresado notablemente en Venezuela.

4.2. Caracterización molecular Con 147 accesiones caracterizadas por marcadores isoenzimáticos, 69 por marcadores microsatélites y 68 por marcadores CAPS, y con el desarrollo de las técnicas correspondientes, podemos dar la meta como superada.

52 4.3. Colección nuclear regional Esta meta, que estaba condicionada a las políticas de cada país participante, no se pudo concretar por falta de intercambio de germoplasma entre las instituciones, lo que se debió principalmente a las normas vigentes en los países andinos. A pesar de que la norma general debiera facilitar el acceso y los intercambios entre países andinos, los decretos y normas nacionales de aplicación han generado muchos obstáculos burocráticos.

4.4. Genotipos elite Por primera vez, se reporta la recuperación de plantas de V. cundinamarcensis y V. cauliflora después de una inoculación con el PRSV, comprobando la eliminación del virus en las plantas recuperadas. Igualmente, se encontró inmunidad contra la bacteria del cancro en V. cundinamarcensis y V. goudotiana. En accesiones cultivadas de C. papaya, sólo se identificaron genotipos tolerantes. Se ha confirmado la factibilidad de la hibridación intergenérica, seguida de cultivo de embriones, para transferir las resistencias genéticas encontradas en el género Vasconcellea, pero el crecimiento de los híbridos es muy lento y no se ha podido comprobar su resistencia o susceptibilidad. El programa de mejoramiento de la UCR ha permitido seleccionar materiales de elite en varios híbridos intraespecíficos de C. papaya. Los datos agromorfológicos reunidos en Ambato permitirán la identificación de genotipos de babaco y baby-babaco (jigacho) superiores para su utilización directa por los productores. En conclusión, se puede considerar que la meta se ha cumplido.

4.5. Inventario de las cepas del virus de la mancha anular y de la bacteria del cancro Los resultados obtenidos en el Ecuador, Colombia y Venezuela son muy satisfactorios.

4.6. Capacitación en taxonomía y manejo de germoplasma Los participantes del proyecto se han familiarizado con la nueva taxo nomía de las Caricaceae desarrollada por el Profesor Victor M. Badillo. Esta clasificación ha sido confirmada por los mismos resultados del proyecto, tanto en lo morfológico y reproductivo como bioquímico y molecular. Los responsables de las colecciones han fortalecido su experiencia en caracterización y procesamiento de datos morfológicos así como de datos geográficos para la planeación de las colectas y la interpretación de los estudios de diversidad. En conclusión, esta meta también ha sido plenamente cumplida.

53 5. Publicaciones y tesis 5.1. Memorias del Taller Internacional sobre Caricaceae Editores científicos: F. Leal y G. Coppens d’Eeckenbrugge Publicado por FONTAGRO-IICA. Impresora Feriva, Cali, 2003.

Contenido Página Presentación Freddy Leal y Geo Coppens d'Eeckenbrugge

1

Acerca de la historia y taxonomía de las papayas y sus parientes silvestres Freddy Leal

2

Las Caricaceae en el sistema de bancos para alimentación y agricultura de Colombia Mario Lobo A. y Clara Inés Medina

11

La investigación de las Caricaceae en la región interandina del Ecuador Jorge Vega Ch. y Fidel Rodríguez A.

18

Panorama general del germoplasma de papaya en Costa Rica y su utilización en el mejoramiento genético Eric Mora

23

Los recursos genéticos de la familia Caricaceae en el mejoramiento de Carica papaya L. en Colombia Carlos Reyes Sequeda

28

Caracterización y evaluación morfológicas y caracterización química y organoléptica de germoplasma de Caricaceae. Clara lnés Medina y Mario Lobo A.

33

Mejoramiento genético de la papaya (Carica papaya L.) mediante técnicas biotecnológicas A. Vegas, J. Mata, S. Colina, G. Trujillo, R. Fuguet, L. Verdú, C. Garboza, G. Fermín y M. Dager.

37

Utilización de los marcadores moleculares en la caracterización y evaluación de la diversidad genética de Caricaceae Inés Sánchez M.

41

Enfermedades bacterianas que afectan al cultivo del lechoso (Carica papaya L.) en Venezuela Yonis Hernández y Gustavo Trujillo

47

La bacteriosis del papayo en el Caribe Oriental. Perspectivas de mejoramiento genético para la creación de cultivares resistentes Patrick Ollitrault, Lue De Lapeyre de Bellaire, John Albeiro Ocampo, S. Bruyère, Frédérick Leblanc, Patrick Fournier y Geo Coppens d'Eeckenbrugge

55

Nemátodos en papayas Ligia Carolina Rosales y Zoraida Suárez H.

62

Enfermedades virales que afectan el cultivo del lechoso (Carica papaya L.) en Venezuela. Experiencias en su control Gustavo Trujillo y Ariadne Vegas

67

54 5.2. Publicaciones Rosales, L.C. y Suárez H., Z. 2001. Reacción de cinco materiales de papaya, al ataque del nematodo Meloidogyne incognita. Nematología Mediterránea 29: 177-180. Rosales, L.C. y Suárez H., Z. 2001. Importancia de nematodos asociados al lechoso y distribución geográfica en Venezuela. Fitopatología Venezolana 14: 21-23. Rosales, L.C., Suárez H. Z y Gómez, M.A. 2002. Histological alterations in Caricaceae roots caused by a mixed population of Meloidogyne incognita Race 1 and Rotylenchulus reniformis. International Journa l of Foundamental and Applied Nematological Research. 4(2): 274. Maselli, A. y Guevara, Y. 2002. Evaluación de la reacción de materiales de lechosa a la bacteria Erwinia sp. Fitopatología Mexicana ( en revisión). Marys, E., Sanchez, M., Carballo, O., Rub io, L. 2003. "Molecular detection and characterization of papaya ringspot virus isolates in Venezuela". Plant Disease (en revisión). Rosales, L.C., Suárez H., Z. y Gómez, M.A. 2003. Evaluación de materiales comerciales y silvestres de Caricáceas a la acción de Meloidogyne incognita Raza 1. Fitopatología Venezolana (en revisión). Rosales, L.C., Suárez H., Z. y Gómez, M.A. 2003. Alteraciones histológicas de materiales comerciales y silvestres de Caricáceas afectadas por Meloidogyne incognita Raza 1. Fitopatología Venezolana (en revisión). Vegas, A, G. Trujillo, J. Mata, L. Castro, M. Martínez y G. Robles. 2003. Obtención, regeneración y evaluación de híbridos intergenéricos entre Carica papaya y Vasconcella (Carica) cauliflora. Interciencia. Interciencia. (en revisión).

5.3. Presentaciones en congresos Rodríguez, D. 2000. Caracterización in situ de las especies Carica papaya ‘ Pajarera‘ y Vasconcellea cauliflora en Caripe estado Monagas. En: Memorias del XIV Congreso de Botánica, Caracas del 18 al 21 de Julio/00. Rodríguez, D. 2000. Distribución de especies de la familia Caricaceae en Venezuela. Memorias de la VII Congreso Nacional de Frutales, San Cristóbal Táchira, 18 al 20 /10/00. Rodríguez, D. 2000. Distribución de especies de la familia Caricaceae en Venezuela. Memorias de la 46 Reunión Anual de la Sociedad de Horticultura Tropical en Miami. Florida. USA del 24 al 29/09/00.

55

Maselli A. y Guevara Y. 2001. Reacción de genotipos de Caricaceae ante la bacteriosis de cancro producida por Erwinia sp”. XVII congreso de Fitopatología, Maracay 14-16 de Noviembre del 2000. Maselli A. y Guevara Y. 2001. Control in vitro de bacterias fitopatógenas.” (Control químico de la bacteriosis de cancro en lechosa). I Simposio Internacional sobre vigilancia fitosanitaria y su relación con la protección al entorno. Palacio de Convenciones La Habana – Cuba. 28 de octubre al 1 de noviembre del 2002. Sánchez, M., y Marys, E. 2001. Caracterización molecular de aislamientos de papaya ringspot virus (PRSV) en Venezuela. XVII Congreso Venezolano de Fitopatología Dr. José Agustín González, Maracay, 14 al 16 de noviembre del 2001. Cadavid, A.C.; Villegas, E.; Medina, C.I.; Lobo, M.; Reyes, C. 2002.Caracterización morfológica de Caricáceas de altura. En: Memorias IV Seminario Nacional de Frutales de Clima frío moderado. Medellín, Colombia. 20 a 22 de Noviembre de 2002.CDTF, UPB, Corpoica. 55-60.

5.4. Tesis de grado Cadavid, A.C., Villegas, E. 2001. Evaluación y caracterización morfológicas de Caricáceas de altura. Tesis para optar al título de Ingenieras Agrónomas, Universidad Nacional, Medellín, Colombia. Cardozo, J. 2002. Evaluación de materiales resistentes a la marchitez bacteriana en Lechosa (Carica papaya L.). Tesis para optar al titulo de Ingeniero Agrónomo. Universidad Central de Venezuela. Jiménez, D. 2002. Caracterización y estudio de la diversidad genética en los géneros Vasconcellea y Carica (Caricaceae) en Colombia y Ecuador por medio de marcadores isoenzimáticos. Tesis para optar al titulo de Ingeniero Agróno mo. Universidad de Caldas. Benitez, S.P. 2003. Estudios de germinación de la semilla de papayuela Vasconcellea cundinamarcensis (pubescens) y Vasconcellea goudotiana. Tesis para optar al título de Ingeniero Agrónomo. Universidad Nacional Medellín.

56 5.5. Tesis de posgrado Ocampo, J.A. 2002. Développement de marqueurs microsatellites pour l’analyse du génome dans les genres Carica et Vasconcellea (Caricaceae). Rapport pour l’obtention du Certificat d’Etudes Supérieures en Agronomie. Université Montpellier II. Cadavid A.C. 2003. Caracterización isoenzimática de Caricáceas de altura. Tesis para optar al título de M.Sc., Universidad Nacional, Medellín, Colombia. En ejecución. Ocampo, J.A. 2003. Développement de marqueurs microsatellites et étude de la diversité des ressources génétiques de la papaye (Carica papaya L.). Mémoire présenté pour l’obtention du Diplôme d’Etudes Approfondies, spécialité Ressources Génétiques et Interactions Biologiques. Université Montpellier II. Restrepo, M.T. 2003. Développement de marqueurs CAPS pour l’étude de la diversité de l’ADN chloroplastique dans les genres Carica et Vasconcellea. Rapport pour l’obtention du Certificat d’Etudes Supérieures en Agronomie. Université Montpellier II.

57 6. Limitantes para el desarrollo del proyecto El proyecto preveía la participación de dos consorcios, INIA/IVIC y CNCRF/UCV en Venezuela, de la Universidad Nacional, de la Universidad de Caldas y de CORPOICA en Colombia, de la Universidad Técnica de Ambato y del INIAP-DENAREF en el Ecuador, de la Universidad de Costa Rica (UCR), del CIRAD-FLHOR desde Guadalupe, del CIAT (unidades de recursos genéticos y de virología) y del IPGRI-Américas. Para soportar las transferencias de fondos, el IPGRI ha suscrito cartas de entendimiento con los participantes desde el inicio del proyecto. En tres casos, se han presentado problemas graves en este proceso. Así la carta de entendimiento permitiendo la participación del INIAP-DENAREF sólo ha sido firmada en marzo del 2001 por razones de reorganización de esta institución y por la imposibilidad de contratar personal científico en el proyecto. Finalmente, por las dificultades de manejar los fondos según las normas del donante, el INIAP-DENAREF ha desistido de su participación. Al final del proyecto, el INIAP volvió a participar, pero de manera puntual y en el estudio de la diversidad del virus de la mancha anular. La firma de las cartas de entendimiento con el consorcio CNCRF-UCV se ha demorado, retrasando a su vez la transferencia de los fondos y la ejecución del proyecto en Venezuela. En parte, se debió a que la institución no se pudo comprometer a cumplir con sus obligaciones con los otros participantes venezolanos, esencialmente por la entrada en vigencia de los nuevos reglamentos de acceso a los recursos genéticos. Es un triste ejemplo de la importancia de este freno burocrático, el cual bloquea colaboraciones hasta entre instituciones de un mismo país. No se ha podido firmar una carta de participación con la UCR porque esta institución no aceptó eliminar completamente los overheads que aplica a los proyectos realizados con fondos externos. Tomando en cuenta el interés particular de la colaboración del equipo de la UCR (disponibilidad de germoplasma silvestre, experiencia adquirida en mejoramiento de la papaya) y la alta motivación de este equipo, los coordinadores han propuesto varias soluciones para asociar a los investigadores costarricenses financiando sus costos en el proyecto directamente desde el IPGRI-Américas. Esto ha permitido realizar actividades muy limitadas en el marco del proyecto, esencialmente una caracterización morfológica in situ, con toma de muestras para caracterización bioquímica y molecular, y una primera fase de selección y autofecundación en descendencias híbridas. No se ha podido instala r una colección de germoplasma como previsto, por la imposibilidad de financiar mano de obra no calificada con fondos del proyecto. De manera más general, las normas de manejo del proyecto han creado desconcierto entre los participantes, lo que ha retrasado su arranque en todos los países. Podemos recordar lo que escribíamos en el informe de progreso de mayo de 2001: “Los principales problemas encontrados en la ejecución del proyecto derivan de las normas impuestas por el Fondo. La no elegibilidad de gastos de mano de obra temporal ha sido un freno importante para el establecimiento de las colecciones de campo. Prácticamente todos los participantes pidieron cambiar el rubro de consultores para poder contratar personal temporal,

58 esencialmente obreros y jóvenes científicos (quienes además hubieran podido beneficiarse en experiencia en el proyecto, al lado de los investigadores confirmados). Otra limitación importante ha sido la no elegibilidad de los costos anexos a las compras de equipos (IVA y costos de importación). Aunque estas reglas puedan parecer justificadas en el marco de un proyecto donde el aporte de los países es muy superior al del ente financiador, esta norma no es realista para las instituciones involucradas si admitimos que uno de los objetivos es el fortalecimiento institucional y un parámetro de apreciación sobre el proyecto la eficiencia y el progreso científico y técnico. Estos problemas han llegado a crear desmotivación entre los investigadores participantes. Delante del riesgo de ver ciertos gastos no reconocidos, ciertos de ellos han preferido reducir inversiones y, por consecuencia, actividades. En varias oportunidades, la coordinación del proyecto ha transmitido al Fondo la frustración de los participantes, subrayando que estas reglas son posteriores a la aprobación del medio-presupuesto obtenido y que, por lo tanto, no pudieron ser tomadas en cuenta en la fase de concepción del proyecto. La baja ejecución presupuestal es sólo un reflejo de esta situación.” El lector encontrará expresiones más específicas de estos problemas generales en los informes de las instituciones anexados al presente documento y en el anexo 1.

ANEXO 1 Conclusiones y recomendaciones de la reunión final del proyecto

Conclusiones y Recomendaciones de la reunión final del proyecto

Impacto del proyecto Los participantes de la reunión final del proyecto “Aprovechamiento de los recursos genéticos de las papayas para su mejoramiento y promoción” consideran que este proyecto contribuyó notablemente en el avance de la investigación sobre la papaya y las papayas de altura de importancia económica. Entre los logros conseguidos, subrayan: con impacto inmediato: − el establecimiento o incremento de las colecciones nacionales de Caricaceae (X accesiones); − la recuperación de cultivares criollos con potencial comercial; − nuevos conocimientos sobre fisiología de semillas y desarrollo de tecnologías de conservación y de remoción de latencia para producción de material vegetal;

con impacto a futuro: − la conformación de una red de investigadores en Caricaceae; − la colecta, caracterización morfológica, química, bioquímica y molecular, e identificación de germoplasma elite utilizable en programas de mejoramiento genético − el desarrollo de metodologías de caracterización del germoplasma; − la identificación y caracterización de patógenos de estos cultivos; − nuevos conocimientos sobre su diversidad para elaboración de estrategias de control ; − la identificación de fuentes de resistencia genética a estos patógenos; − avances en el conocimiento de la citogenética y palinología de este grupo de especies, con aplicación directa al mejoramiento intra e interespecífico; − el desarrollo de técnicas de manipulación de este germoplasma, incluyendo hibridaciones intergenéricas; − el fortalecimiento institucional y promoción de nuevos trabajos y propuestas derivados del proyecto. Como indicador de estos logros podemos contar 27 artículos científicos publicados y comunicaciones, en preparación (3) o a publicar a corto plazo (13).

Perspectivas Para dar continuidad y materializar estos logros, los participantes se proponen formular una nueva propuesta de proyecto sobre Caricaceae. Esta buscaría en particular: − iniciar una selección en el germoplasma elite identificado para producción de cultivares locales uniformes para producir semilla certificada para los cultivos comerciales; − completar las colecciones por nuevas colectas; − completar la caracterización y evaluación del germoplasma en colección en sus aspectos agromorfológicos, químicos y moleculares; − completar los estudios de la diversidad de patógenos (virus, bacteria, nematodos) y de la interacción hospedero-patógeno; − intensificar los esfuerzos de hibridación intergenérica para transferir genes de interés, en particular de resistencia; − iniciar un proceso de producción de cultivares modificados enfocados en cepas de importancia regional

Recomendaciones para manejo de futuros proyectos Se considera que los proyectos deben promover no sólo un progreso en el conocimiento pero también un avance institucional. Por ejemplo deben permitir la inclusión de un plan de capacitación. Muchas de las normas de administración de FONTAGRO, en particular las condiciones de elegibilidad de los gastos, buscan asegurar una fuerte implicación de las instituciones nacionales, lo que parece muy justo a los participantes, el FONTAGRO aportando una financiación específica para reforzar e integrar las actividades estratégicas de los países. Sin embargo, una aplicación rigurosa de este principio, sin tomar en cuenta la realidad cotidiana de la investigación, puede entorpecer la buena ejecución de las investigaciones. •

Todos los participantes reportaron graves dificultades y falta de ejecución técnica por la imposibilidad de financiar mano de obra no especializada para trabajos excepcionales como instalación de las nuevas colecciones de campo indispensables para la caracterización y evaluación del germoplasma. Esta norma redujo drásticamente la ejecución del plan de trabajo en Costa Rica.

•

Las normas de contratación de profesionales no son claras y no permiten optimizar la selección de candidatos. En ciertas condiciones, bajo la supervisión del personal de las instituciones, un personal con una experiencia limitada pero muy específica puede contribuir tan eficazmente como un profesional de alto nivel, pero a menor costo.

•

Igualmente, la posibilidad de financiar trabajos de estudiantes puede aumentar la eficiencia en la utilización de los fondos, además de capacitar personal nacional para la continuación de los trabajos.

•

La inelegibilidad de los impuestos menores (por ejemplo impuestos aeroportuarios) y de los costos de correo ha sido problemática y a veces estos gastos han sido costeados por los investigadores mismos.

•

No se entiende porque el mismo servicio no es elegible cuando se realiza internamente y lo es cuando se contrata a mayor precio en el exterior.

•

También se ha reportado el caso de la inelegibilidad de costos de mantenimiento de equipos usados en la ejecución del proyecto, o de rechazo de gastos de consumibles bajo un criterio de utilidad emitido por un administrador.

Otro problema en la ejecución fue la falta de intercambio de germoplasma debido a las normas de acceso vigentes en cada país. Los participantes sugieren : •

La reducción de las normas y flexibilidad en su aplicación;

•

la nominación de coordinadores nacionales en cada país participante en el proyecto;

•

una mayor implicación y responsabilización de esta coordinación nacional y de la coordinación general en estos aspectos, la cual reduciría la cadena de decisiones burocráticas, acelerando los procesos administrativos e investigativos y mejorando la eficiencia en la ejecución;

•

reuniones anuales en los niveles nacionales e internacional;

•

la definición previa de las normas de acceso e intercambio de recursos genéticos en los proyectos.

ANEXO 2 Informes de Venezuela

2.1 Aprovechamiento de los recursos genéticos de papaya para su mejoramiento y promoción

APROVECHAMIENTO DE LOS RECURSOS GENÉTICOS DE PAPAYA PARA SU MEJORAMIENTO Y PROMOCIÓN Reporte Técnico Final 2001 - 2003 Preparado por Carolina Rosales INIA – CENIAP RESUMEN Colecta y recuperación: Colectas menores: Se colectaron los siguientes materiales: Carica papaya ‘Pajarera’, ‘Solo’, ‘Cartagena roja’, ‘Paraguanera’, ‘Costa rica’ y ‘Maradol’, Vasconcellea cauliflora y V. cundinamarcensis. Colecta mayores: colecta hacia la región central y occidental del país: Estados Lara, Falcón, Maracay, Trujillo, Mérida y Táchira. Se colectaron los siguientes materiales: Carica papaya ‘Paraguanera’, ‘Maradol’, C. ‘Zapote’, Vasconcellea microcarpa subespecies microcarpa y pilifera, V. cundinamarcensis (V. pubescens) y V. cauliflora Se realizó una caracterización in situ de todos los materiales colectados. Caracterización y evaluación: Bacterias: Se evaluaron 6 materiales de Caricaceae a Erwinia sp. Todas los materiales comerciales de C. papaya son susceptibles en menor y mayor grado a esta enfermedad sin embargo las var. Cartagena amarilla y Costa Rica tuvieron un comportamiento tolerante. Vasconcellea goudotiana (tipo A y Tipo B) y V. cauliflora presentaron resistencia. Nematodos: Se evaluaron doce materiales comerciales de Carica papaya y diez pertenecientes a Vasconcellea. Los resultados preliminares indican que todos los materiales evaluados de C. papaya fueron susceptibles al ataque de los nematodos Meloidogyne incógnita Raza 1 y Rotylenchulus reniformis. Los materiales V. cauliflora, V. microcarpa microcarpa, V, microcarpa pilifera y V. cundinamarcencis presentan cierta resistencia – tolerancia a los mismos. Los estudios histopatológicos de los materiales afectados muestran que estas especies de nematodos pueden establecer su sitio de alimentación en la misma raíz e inducir alteraciones fisiológicas en la planta. Virus: Se efectuó un trabajo de las respuestas de especies Vasconcellea (V. cauliflora, V. pubescens, y V. monoica ) a cinco aislamientos conocidos del virus de la mancha anillada de la lechosa. En general, las pruebas biológicas y moleculares fueron mas sensibles que la prueba serológica, demostrándose la presencia del virus en todas las especies de Vasconcellea. En este trabajo se señala por primera vez síntomas de lesiones locales, muerte regresiva y recuperación de plantas de caricáceas, después de la inoculación con el PRSV-P. Se comprobó mediante pruebas moleculares que al recuperarse las plantas de V. pubecens y V. cauliflora, el virus no estaba presente. Este trabajo de susceptibilidad de caricas al PLDMV es el primero en su área, y permitió identificar plantas hospederas que podrían servir de reservorio del virus en su hábitat natural y otras que podrían servir de fuentes de resistencia. V. cauliflora muestra cierta resistencia y V. pubecens parece inmune al virus. Estudio de la variabilidad de patógenos: Bacterias: Se realizó la amplificación de PCR específico de 8 ADN de las cepas de la bacteria Erwinia sp. procedentes de la zona del Caribe y de 5 ADN de las cepas de Venezuela. Los resultados determinaron que la cepa 68 (Guadalupe aisl. 10.429), 76 (Guadalupe aisl. 10.431) , 82 (St. Croix –Langrage aisl 11568) y aisl. 1353 de

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Venezuela, amplificaron al primer Erwinia carotovora. Las cepas restantes no amplificaron con el primer E. carotovora por lo que se infiere que podríamos estar en presencia de una nueva especie de Erwinia ó estarían relacionadas con E. chrysanthemi. Virus: Se evaluó la resistencia de variedades locales de papaya a la infección por el virus PRSV. Análisis de secuenciación de los productos de PCR arrojaron un índice de variabilidad para la región que codifica para la cápside del virus (CP) de 78.26%. La técnica de SSCP permitió reconocer la presencia de infecciones mixtas en una misma planta en la región Zuliana. Los cálculos de alineamiento de 9 secuencias correspondientes al de gen la cápside indicaron una similaridad del 62.59%. Los dendogramas filogenéticos obtenidos señalaron la presencia de nuevas variantes del virus presentes en el país. Obtención de híbridos ínter específicos entre lechosa (Carica papaya L.) y otras especies de Vaconcelleas . La hibridación intergenérica entre C. papaya y Vasconcellea (C) cauliflora seguida del cultivo de óvulos y de embriones inmaduros parece ser un método factible para la transferencia de genes entre la especie silvestre y la cultivada. El uso de vasconcelleas geneticamente más relacionadas (como V. (C) quercifolia y cundinamarcensis) en los cruces con la lechosa, y la evaluación de un gran número de plantas híbrido en el campo garantizará híbridos fértiles útiles en los programas de mejoramiento genético. Extracciones de ADNs de especies de caricas autóctonas de Venezuela para estudios moleculares. Se realizó la extracción del ADN se utilizaron 13 especies de caricas autóctonas de Venezuela. Las extracciones dieron ADNs de buena calidad, de una concentración de 100 ng/ul.

ANEXO RESUMEN POR CADA UNA DE LAS ACTIVIDADES: I. COLECTAS Y CARACTERIZACIÓN DE MATERIALES. CONSTITUCIÓN DE LOS BANCOS DE GERMOPLASMA. Dilia Rodríguez, Rafael Ortiz, Hernando Quecán Centro nacional de Conservación de los Recursos Fitogenéticos – Oficina Nacional de Biodiversidad – Ministerio del Ambiente. Después de realizada la revisión de herbarios tenemos que en Venezuela se han reportado las siguientes especies: Carica papaya ‘Pajarera’ (forma asilvestrada de la Carica papaya), Vasconcellea cauliflora, V. cundinamarcensis (V. pubescens) y V. microcarpa subespecies microcarpa y pilifera (esta última endémica de la zona andina). Con los datos recopilados se elaboró una base de datos en el programa Excel, y de allí se extrajo la información necesaria para la obtención del mapa de Distribución de Caricáceas en Venezuela, así como las áreas potenciales de colecta, utilizando el programa FLORAMAP. Colectas menores: colecta hacia la región central y oriental del país, en colaboración con las Investigadoras Ariadne Vega del INIA/ Maracay, América Lares de la Universidad de Oriente y el Dr. Freddy Leal UCV / Maracay. Se colectaron los siguientes materiales: Carica papaya ‘Pajarera’, Carica papaya ‘Solo’, Carica papaya ‘Cartagena roja’, Carica papaya ‘Paraguanera’, Carica papaya ‘Costa rica’, Carica papaya ‘Maradol’, Vasconcellea cauliflora y Vasconcellea cundinamarcensis. Por otra parte el Dr. Carlos Reyes (Universidad de Medellín), Clara Inés Medina y Mario Lobo (CORPOICA), donaron los siguientes materiales Carica papaya ‘Cotove’, Carica papaya ‘Sofia’, Vasconcellea goudotiana y Vasconcellea cundinamarcensis.

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Colecta mayores: colecta hacia la región central y occidental del país: Lara, Falcón, Maracay, Trujillo, Mérida y Táchira. En donde se colectaron los siguientes materiales: Carica papaya ‘Paraguanera’ Carica papaya ‘Maradol’, Carica papaya ‘Zapote’, Vasconcellea microcarpa subespecie microcarpa y pilifera, Vasconcellea cundinamarcensis (V. pubescens) y Vasconcellea cauliflora . Caracterización in situ de los materiales colectados: a través de los descriptores elaborados por el IPGRI se realizó una caracterización in situ de todos los materiales colectados. El Centro llevó a cabo la multiplicación de los siguientes materiales colectados y donados a la institución Colección nueva. En Agosto del año 2001, se inició en el establecimiento de las papayas de altura, en la Estación Experimental Bajo Seco /UCV, para la reconstrucción del banco de germoplasma de la familia caricáceas. Dentro de las actividades se encuentran: Esta colección contempla 18 entradas de papayas de altura entre 7 a 10 individuos por entrada, correspondiente a las colectas de las región central y occidental del país. También se incorporó 14 materiales de la colección anterior. Constitución de un Banco de Germoplasma de papayas de zona cálida. en el Instituto de Genética /CIBA /UCV, En enero del presente año se establecieron en el Instituto de Genética, las papayas de zona cálida. Dentro de los materiales se encuentran: Carica papaya ‘Solo’, Carica papaya ‘Cartagena roja’, Carica papaya ‘Paraguanera’, Carica papaya ‘Red Lady’, Carica papaya ‘Maradol’ y Vasconcellea cauliflora (Cuadro 11). Esta conformado por 10 entradas con 5 individuos; la misma permanecerá allí hasta que se realice su caracterización morfológica y su propagación. II. ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD DE LA BACTERIA ERWINIA SP Y SELECCIÓN DE MATERIALES RESISTENTES A LA BACTERIOSIS EN LECHOSA (CARICA PAPAYA L.). Anna Maselli1 , Asia Zambrano y Yolanda Guevara 1. INIA- Lab. Bacteriología1 – Biotecnología. El principal objetivo de este trabajo es la caracterización molecular de la bacteria Erwinia sp. Para ello, se realizó la extracción de ADN utilizando la metodología descrita por Chen y Kuo (1993), modificado por Maselli y Zambrano (2002). Una vez extraído y cuantificado el ADN se procedió a su amplificación según metodología descrita por Hélias et al. (1998). Se realizó la amplificación de PCR específico de 8 ADN de las cepas de la bacteria Erwinia sp. procedentes de la zona del Caribe y de 5 ADN de las cepas de Venezuela. Los resultados determinaron que los aislamientos St. Croix,-Lagrange (82 y 84) aisl.1156 y aisl. 1353 de Venezuela, generaron un producto de amplificación de 9.000 pb, el cual se asocia a la especie Erwinia carotovora. El resto de los ADN no amplificaron con el primer. Esto permite a identificar los aislamientos St. Croix,-Lagrange (82 y 84) aisl.11568 y 1353 de Venezuela como pertenecientes a la especie Erwinia carotovora. Asì mismo, se puede señalar la amplificación de un producto de aproximadamente 11.000 pb en los aislamientos 1179 y 1496 de Venezuela, lo cual puede relacionarse también con la especie E. carotovora pero un patovar o una raza diferente. El segundo objetivo de esta investigación fue la evaluación de la reacción de algunos genotipos y variedades comerciales ante la bacteria Erwinia sp. Se utilizaron 10 plantas de los siguientes materiales:.Genotipos: Maradol, Pajarera, Vasconcellea goudotiana tipo A y tipo B y V. Cauliflora y las Variedades comerciales fueron; Cartagena amarilla ( San Felipe), Varadero, Costa Rica , Criolla redonda, Paraguanera

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amarilla, y la var Solo utilizado como testigo susceptible. Todas los materiales comerciales que fueron evaluados son susceptibles en menor y mayor grado a esta enfermedad, la var. Cartagena amarilla y var Costa Rica tuvieron un comportamiento tolerante, sin embargo, se requiere de un seguimiento mas detallado y en el campo del comportamiento de estas variedades. El genotipo Pajarera que es un material local también resulto susceptible, pero se observó que los genotipos V. goudotiana (tipo A y Tipo B) y V. cauliflora, son resistentes. III. EVALUACIÓN DE MATERIALES DE CARICÁCEAS A NEMATODOS. Carolina Rosales y Zoraida Suárez y Maria Alejandra Gòmez H. INIA – CENIAP, Laboratorio de Nematologìa. Con la finalidad de estudiar la acción de los nematodos Meloidogyne incognita Raza 1 y Rotylenchulus reniformis en Caricáceas, se evaluaron cinco materiales: Los materiales evaluados fueron: Carica papaya: ‘Pajarera’, ‘Red Lady’, ‘Maradol-Aragua’, Vasconcellea goudotiana tipo A y V. goudotiana tipo B. Otro grupo de materiales fue evaluado sólo con respecto a M. incógnita Raza 1: C. papaya‘Sofía’, ‘Paraguanera’, ‘Cartagena amarilla’, ‘Varadero’, ‘Criolla roja’, ‘Costa Rica’, ‘San Felipe’, ‘La Habana’, Maradol – Falcón, V. cauliflora, V. cundinamarcencis (Las Lomas, Trujillo, La Azulita, Chorotal, La Porquera), V. microcarpa microcarpa, V. microcarpa pilifera. Se usaron de cada material cinco plantas no inoculadas como testigo y cinco inoculadas con 2000 huevos+juveniles / planta de M. incognita raza 1 y Rotylenchulus reniformis. Para el caso de solo M. incógnita Raza 1, se usó un nivel de 2.500 huevos+juveniles/ planta. Después de doce semanas se evaluaron las variables agronómicas peso aéreo fresco y seco y peso radical fresco y seco; también se determinó el Factor de Reproducción (FR=Pf/Pi) y el Indice de Agallamiento. Todas las plantas inoculadas presentaron formación de agallas. Hubo diferencias significativas (Tukey, 5%) entre los materiales evaluados para el peso aéreo y radical fresco, entre las plantas inoculadas y las no inoculadas, a excepción de C. papaya ‘Red Lady’y ‘Maradol’- Aragua que no presentaron diferencias para el peso radical y aéreo respectivamente. Se realizó histolopatología de los materiales. Segmentos de raíces de cada especie fueron fijados en Craff III y deshidratados en una serie de alcohol butílico, embebidos en parafina y cortados en secciones de 15µ. Se tiñeron con la técnica cuadrúple de Triarch, modificada por Suárez et al. Todas los materiales de C. papayaa inoculadas, mostraron células gigantes, núcleos y nucleolos y masas de huevos típicas de Meloidogyne. Además de ello, aquellas inoculadas simultáneamente con R. reniformis, mostraron las células del parénquima vascular formando un sincitio, con células hipertrofiadas, citoplasma granular, núcleos agrandados y nucleolos prominentes. Algunos de los materiales pertenecientes al género Vasconcellea pueden ser consideradas como resistentes - tolerantes a la acción del nematodo en virtud de la no reducción de las variables agronómicas evaluadas. IV. CARACTERIZACION MOLECULAR DE AISLAMIENTOS DEL VIRUS PRSV (PAPAYA RINGSPOT) EN VENEZUELA. Edgloris Elena Marys Saravia, Maria Luisa Izaguirre, Octavio Carballo, Miguel A. Sánchez Mercado. Laboratorio de Biotecnología y Virología Vegetal, Centro de Microbiología y Biología Celular, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. El potivirus Papaya ringspot (PSRV) es el patógeno de mayor incidencia y prevalencia en el cultivo de papayas a nivel mundial. Estudios epidemiológicos en Venezuela, han mostrado que el virus es el mayor limitante de la producción nacional, la cual se ha visto severamente reducida en las ultimas décadas. El

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objetivo de este trabajo de investigación fue establecer un sistema de diagnostico altamente sensible como la PCR para detectar el virus en el campo, y poner a punto la técnica denominada SSCP, que permitió diferenciar entre aislamientos del virus en el pais a nivel molecular. Análisis de secuenciación de los productos de PCR arrojaron un índice de variabilidad para la región que codifica para la cápside del virus (CP) de 78.26%. La técnica de SSCP permitió reconocer la presencia de infecciones mixtas en una misma planta en la región Zuliana. Los cálculos de alineamiento de 9 secuencias correspondientes al de gen la cápside indicaron una similaridad del 62.59%. Los dendogramas filogenéticos obtenidos señalaron la presencia de nuevas variantes del virus presentes en el país. V. OBTENCIÓN DE HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS ENTRE LECHOSA (CARICA PAPAYA L.) Y OTRAS ESPECIES DE VACONCELLEAS (CARICAS). Ariadne Vegas García, Jonàs Mata y Gustavo Saldaña. INIA – UCV FAGRO. 1. Actividades del cultivo in vitro de los híbridos interespecíficos. Los híbridos intergenéricos se obtuvieron en investigaciones realizadas en años anteriores a esta actividad (Vegas, A, 1997) y se mantuvieron en cultivos in vitro. Para la realización de esta actividad, se germinaron los híbridos intergenéricos en medios de cultivo de germinación o multiplicación.. Posteriormente se llevaron a condiciones de umbráculo y campo para su aclimatación y evaluación, respectivamente. Las plantas aclimatadas se sembraron a 500 y 1500 m.s.n.m. en los estados Anzoategui y Aragua, respectivamente. Resultados de la investigación: Las plantas híbridas in vitro y en el umbráculo mostraron fenotipos que fueron consistentes con su origen paterno, tuvieron hojas más verdes y más brillantes, con márgenes más punteagudas, que las plantas in vitro de lechosa (Figura 1). En el umbráculo y en el campo, los híbridos presentaron un crecimiento lento, en comparación con plantas de lechosa in vitro (Figuras 1 y 2). En el campo, los híbridos florecieron a los 3-4 meses después de la siembra presentando flores normales tipo macho (con o sin ovario primitivo) y flores hermafroditas en las dos localidades (Figura 2). Estos resultados son corroborados parcialmente por los obtenidos por Magdalita et al. (1997), cuyas plantas híbridas entre C. papaya y V(C) cauliflora solo produjeron flores hermafroditas. En el ensayo ubicado en la Granja Mis Oscares, Tasajera, Sector Los Naranjos, Edo. Aragua a 1.500 msnm, una planta híbrido C. papaya x C. cauliflora, clon 6, floreció y produjo 4 flores solitarias, a los 3 meses después de la siembra. Las primeras flores cosechadas (11/00) tenían aspecto normal, una de ellas era macho con 5 anteras largas y 5 cortas, y la otra flor era macho con un ovario primitivo, 10 anteras y dos estigmas. Las otras dos flores cosechadas (12/00) fueron analizadas por el Prof. Jonas Mata. En el ensayo de campo en Valle Guanape, Edo. Anzoategui a 500 msnm. Se visitó la siembra en fecha 12-13/02/2001. Las 6 plantas híbridos C. papaya x C. cauliflora, clones 4 y 6, murieron por falta de disponibilidad de agua. En Valle Guanape no se logró cosechar flores de las plantas híbridos antes que murieran por sequía. Sin embargo en la visita anterior (11/00) se observó la floración de la planta más desarrollada (clon 6), se formaron 8 racimos de flores más 3 flores solitarias, la primera flor se presentó a 40 cm. del suelo, a los 4 meses después de la siembra. Se produjeron 2 frutos por cada cruce entre: C. pubecens x C. monoica; C. pubecens x C. cauliflora y ; C. monoica x C. cauliflora, sin embargo

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sólo se logró cosechar los dos frutos del último cruce, que contenían semillas. Estas semillas se usarán para continuar con las actividades de los cruces interespecíficos. Conclusiones y recomendaciones Estos estudios demuestran que la hibridación intergenérica entre C. papaya y Vasconcellea (C) cauliflora seguida del cultivo de óvulos y de embriones inmaduros parece ser un método factible para la transferencia de genes entre la especie silvestre y la cultivada. El uso de vasconcelleas geneticamente más relacionadas (como V. (C) quercifolia y cundinamarcensis) en los cruces con la lechosa, y la evaluación de un gran número de plantas híbrido en el campo garantizará híbridos fértiles útiles en los programas de mejoramiento genético. VI. SUSCEPTIBILIDAD DE LAS VASCONCELLEAS Y CARICA PAPAYA A LOS VIRUS DE LA MANCHA ANILLADA DE LA LECHOSA (PRSV-P) Y MOSAICO DISTORSIONANTE DE LA HOJA DE LA LECHOSA (PLMV). Ariadne Vegas INIA , Dennis Gonsalves (USDA. EEUU), Gustavo Fermín (Universidad de los Andes. Venezuela). Se inocularon plantas de caricas con un aislamiento del virus de la distorsión y mosaico de la hoja de la lechosa (Papaya Leaf Distortion Mosaic potyvirus - PLDMV). Se utilizaron cinco especies de caricas: V. monoica, V. pubecens, V. microcarpa accesion HCAR 288 No 93-56, V. goudotiana accesiones HCAR 278 UH ACC No. 1026, V. cauliflora accesion HCAR 173 372, las dos primeras procedentes de Venezuela y las otras de Hawai. La lechosa variedad Sunrise, Chenopodium quinoa y Cucumis metuliferus (Acc. 2459), se usaron como testigos. La infección viral fue confirmada a través de recuperación del virus en lechosa cinco plantas de lechosa; la técnica de RT-PCR siguiendo el protocolo estandarizado en el laboratorio de Kosiyachinda (2002) y la técnica de hibridación del ARN con una sonda específica (en ingles, ARN blotting), según Sambrook et al (2001). Este trabajo de susceptibilidad de caricas al PLDMV es el primero en su área, y permitió identificar plantas hospederas que podrían servir de reservorio del virus en su hábitat natural y otras que podrían servir de fuentes de resistencia. V. cauliflora muestra cierta resistencia y V. pubecens parece inmune al virus. En el caso que se quiera confirmar la presencia de este virus en países donde no este citado, se recomienda reforzar el diagnóstico con las técnicas moleculares descritas. Se desconoce los mecanismos de resistencia presentes en las caricas hacia los virus PRSV-P y PLMV, sin embargo se sospecha que el silenciamiento de genes podría estar involucrado en estas respuestas, y pareciera que estos mecanismos fueran diferentes para cada especies. OTRAS ACTIVIDADES REALIZADAS EN EL MARCO DEL PROYECTO PUBLICACIONES: 1. Rosales, L.C. y Suárez H., Z. 2001. Reacción de cinco materiales de papaya, al ataque del nematodo Meloidogyne incógnita. Nematología Mediterránea 29: 177180.

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2. Rosales, L.C. y Suárez H., Z. 2001. Importancia de nematodos asociados al lechoso y distribución geográfica en Venezuela. Fitopatología Venezolana 14: 2123. 3. Rosales, L.C., Suárez H. Z y Gómez, M.A. 2002. Histological alterations in Caricaceae rotos caused by a mixed population of Meloidogyne incógnita Race 1 and Rotylenchulus reniformis. International Journal of Foundamental and applied Nematological Research. 4(2): 274. 4. Maselli, A. y Guevara. 2002. Evaluación de la reacción de materiales de lechosa a la bacteria Erwinia sp Fitopatología Mexicana ( en Revisión) 5. Rosales, L.C., Suárez H., Z. y Gómez, M.A. 2003. Evaluación de materiales comerciales y silvestres de Caricáceas a la acción de Meloidogyne incógnita Raza 1. Fitopatología Venezolana (en Revisión). 6. Rosales, L.C., Suárez H., Z. y Gómez, M.A. 2003. Alteraciones histológicas de materiales comerciales y silvestres de Caricáceas afectadas por Meloidogyne incógnita Raza 1. Fitopatología Venezolana (en Revisión) 7. Marys, E., Sanchez, M., Carballo, O., Rubio, L. 2003. "Molecular detection and characterization of papaya ringspot virus isolates in Venezuela". Y la revista a la que fue enviado es Plant Disease (en revisión) 8. Vegas, A, G. Trujillo, J. Mata, L. Castro, M. Martinez y G. Robles. 2003. Obtención, regeneración y evaluación de híbridos intergenéricos entre Carica papaya y Vasconcella (Carica) cauliflora. Interciencia. Interciencia. (En revisión)

TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS: 1. Rodríguez, D. 2000. Caracterización in situ de las especies Carica papaya ‘ Pajarera‘ y Vasconcellea cauliflora en Caripe estado Monagas. En: Memorias de la XIV Congreso de Botánica, Caracas del 18 al 21 de Julio/00 2. Rodríguez, D. 2000. Distribución de especies de la familia Caricaceae en Venezuela. Memorias de la VII Congreso Nacional de Frutales, San Cristóbal Táchira, 18 al 20 /10/00 3. Rodríguez, D. 2000. Distribución de especies de la familia Caricaceae en Venezuela. Memorias de la 46 Reunión Anual de la Sociedad de Horticultura Tropical en Miami. Florida. USA del 24 al 29/09/00. 4. Maselli A. y Guevara Y. 2001. Reacción de genotipos de caricaceae ante la

bacteriosis de cancro producida por Erwinia sp”. XVII congreso de Fitopatología, Maracay 14-16 de Noviembre del 200

Reporte Técnico Final 2001-2003

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5. Sanchez, M., y Marys, E. 2001. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE AISLAMIENTOS DE PAPAYA RINGSPOT VIRUS (PRSV) EN VENEZUELA. XVII Congreso Venezolano de Fitopatología Dr. José Agustín González, Maracay, 14 al 16 de noviembre del 2001. 6. Maselli A. y Guevara Y. 2001. Control in vitro de bacterias fitopatogenas.” (Control químico de la bacteriosis de cancro en lechosa). I Simposio Internacional sobre vigilancia Fitosanitaria y su relación con la protección al entorno. Palacio de Convenciones La Habana – Cuba. 28 de octubre al 1 de noviembre del 2002.

TESIS DE GRADO: 1. Evaluación de materiales Resistentes a la marchitez bacteriana en Lechosa (Carica papaya L.) “ realizada por Br. Juan Cardozo para optar al titulo de Ingeniero Agrónomo. Universidad Central de Venezuela. Febrero del 2002.

OTRAS: •

Rodríguez, Dilia. Entrenamiento en Manejo de los Recursos Fitogenéticos de la Familia Caricaceae. El programa fue el siguiente: Revisión de los descriptores propuestos para la colección, caracterización y evaluación (Universidad Nacional Dpto. Agronomía); revisión de descriptores en las especies de altura (Centro de Investigación La Selva CORPOICA- Río Negro); visita a la colección de especies de tierra cálida (Centro de Investigación COTOVE de la Universidad Nacional Santa Fe de Antioquia); visita al banco de semillas de CORPOICA; visita al huerto de la colección de santa Fe para polinizaciones ínter especificas y manejo de información. Esto fue a cargo de los investigadores: M.Sc. Carlos Reyes (Universidad Nacional), PhD. Mario Lobo y Tec. Agr. María Clara Medina (CORPOICA)

•

Rodríguez, Dilia. Asesora de pasantías a estudiantes de la Universidad del Zulia (LUZ) y Universidad Central de Venezuela (UCV), sobre MANEJO DE BANCO DE GERMOPLASMA DE CARICÁCEAS en la Estación Experimental Bajo Seco /UCV.

•

Rodríguez, Dilia. Entrenamiento en el programa FLORAMAP en las instalaciones del IPGRI/ Cali/ Colombia, bajo la asesoría del PhD. Geo Coopens

•

Maselli, Anna. Entrenamiento en CIRAD, Guadalupe.

FALTA EDGLORIS

Reporte Técnico Final 2001-2003

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EQUIPO TÉCNICO RESPONSABLE: Carolina Rosales – [email protected]

INIA

–

CENIAP

(Nematología)

(Coordinadora)

Anna Maselli (Bacteriología), Ariadne Vegas (Biotecnología)– INIA – CENIAP. [email protected] Edgloris Marys S., María Luisa Izaguirre, Octavio Carballo y Miguel Sánchez (Virología) – IVIC [email protected] Dilia Rodríguez – CNCRF – MARN. [email protected] Jonás Mata – UCV- FAGRO – [email protected]

Reporte Técnico Final 2001-2003

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2.2 Colecta, establecimiento y caracterización de las especies de papayas en Venezuela. MARN/CNRF

CENTRO NACIONAL DE CONSERVACIÓN DE LOS RECURSOS FITOGENÉTICOS OFICINA NACIONAL DE DIVERSIDAD BIOLÓGICA MINISTERIO DEL AMBIENTE Y LOS RECURSOS NATURALES

MARN

“APROVECHAMIENTO DE LOS RECURSOS GENÉTICOS DE LAS PAPAYAS PARA SU MEJORAMIENTO Y PROMOCIÓN “

COLECTA, ESTABLECIMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LAS ESPECIES DE PAPAYAS EN VENEZUELA

RESPONSABLE: Ing. MSc. Dilia Rodríguez COLABORADORES: Lic. Rafael Ortiz Ing. Hernando Quecan Téc. Luz M. Trocel

La papaya, lechosa o fruta bomba (Carica papaya L.), juntos con sus parientes silvestres pertenecen a la familia Caricaceae. De acuerdo con la taxonomía propuesta por Badillo (1967; 1971; 1993; 2000) esta familia está formada por 6 géneros: Cylicomorpha, Jacaratia, Jarilla, Horovitzia, Carica y Vasconcellea, este último contiene alrededor de 21 especies incluyendo la reciente escrita Vasconcellea palandensis (Badillo, 2000). El género Cylicomorpha está ubicado en las regiones tropicales del África ecuatorial; pero los demás géneros están presentes únicamente en América. La especie Carica papaya es la mas conocida y se encuentra asilvestrada desde América Central hasta el noreste de América del Sur. La mayor parte de la producción comercial de papaya en el mundo proviene de plantas cultivadas.

Entre los años 1969 – 1972, se estableció en la Estación Experimental Bajo Seco/ UCV, Maracay – Venezuela, la colección de la familia Caricaceae, que llegó a constituirse en la mas grande del mundo, esta sirvió como fuente de distribución y material genético para los diferentes cruzamientos. Hoy día la conservación de estos recursos fitogenéticos son esenciales para establecer programas de mejoramientos genético (plantas resistentes a virus, bacterias, nematodos, entre otros), así como, para el desarrollo de cultivares especiales para producción de papaina (Jiménez, 1970; León, 1987) y utilizar su diversidad con el fin de enfrentar los retos más urgentes de una agricultura sostenible. El Centro Nacional de Conservación de los Recursos Fitogenéticos /Oficina Nacional de Diversidad Biológica /Ministerio del Ambiente y los Recursos Naturales, ha venido trabajando en la recopilación de información de la papayas, a través de los principales herbarios del país, con el fin de divulgar la existencia y distribución de las especies de Caricaceae en Venezuela. Dicho Centro dentro del marco del proyecto regional “APROVECHAMIENTO DE LOS RECURSOS GENETICOS DE LAS PAPAYAS PARA SU MEJORAMIENTO Y PROMOCIÓN”; coordinado a nivel nacional por la Ing. Carolina Rosales, del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA – MCT), financiado por el Fondo Regional de Tecnología Agropecuaria (FONTAGRO); se comprometió en las siguientes actividades:

1. Colectas de materiales en la Región Central y Occidental del país 2. Multiplicación de los materiales colectados

3. Constitución de un Banco de Germoplasma de papayas de altura en la Estación Experimental Bajo Seco /UCV 4. Constitución de un Banco de Germoplasma de papayas de zona cálida en el Instituto de Genética /CIBA /UCV 5.

Caracterización morfológica de la colección

6. Documentación idónea (en forma electrónica) 7. Intercambio de materiales con otras instituciones del proyecto (teniéndose como referencia la normativa legal sobre acceso, Decisión 391 del Acuerdo de Cartagena).

I. Colectas de materiales en la Región Central y Occidental del país

El Centro Nacional de Conservación de los Recursos Fitogenéticos ha trabajado en la recopilación de información a través de los principales herbarios del país, y la consecución de materiales genéticos, con el fin de divulgar la existencia y distribución de especies de Caricaceae en Venezuela. Dentro de los Herbarios revisados se encuentran: Facultad de Agronomía “Dr. Víctor M. Badillo” (MY) UCV/ Maracay; Herbario Nacional de Caracas (VEN); Herbario Nacional de la Universidad de los Llanos Ezequiel Zamora. Guanare (PORT); Herbario del Departamento de Botánica. Fundación La Salle; Herbario “ Simón Bolívar”, El Herbario de la Facultad de Farmacia “ Víctor Ovalle” de Caracas y el de la Universidad de Oriente (UOJ). El Herbario “Dr. Víctor M. Badillo” (MY) UCV/ Maracay es el que contiene la mayor colección de la familia Caricaceae (aprox. 1.300 muestras). En Venezuela se han reportado las siguientes especies: Carica papaya ‘Pajarera’ (forma asilvestrada

de

la

Carica

papaya),

Vasconcellea

cauliflora,

Vasconcellea

cundinamarcensis (V. pubescens) y Vasconcellea microcarpa subespecie microcarpa y pilifera (esta última endémica de la zona andina). Con los datos recopilados se elaboró una base de datos en el programa Excel, y de allí se extrajo la información necesaria para la obtención del mapa de Distribución de Caricáceas en Venezuela, así como las áreas potenciales de colecta, utilizando el programa FLORAMAP (Fig. 1 y 2).

Colectas menores: colecta hacia la región central y oriental del país, en colaboración con las Investigadoras Ariadne Vega del INIA/ Maracay, América Lares de la Universidad de Oriente y el Dr. Freddy Leal UCV / Maracay. Se colectaron los siguientes materiales: Carica papaya ‘Pajarera’, Carica papaya ‘Solo’, Carica papaya ‘Cartagena roja’, Carica papaya ‘Paraguanera’, Carica papaya ‘Costa rica’, Carica papaya ‘Maradol’, Vasconcellea cauliflora y Vasconcellea cundinamarcensis. Por otra parte el Dr. Carlos Reyes (Universidad de Medellín), Clara Inés Medina y Mario Lobo (CORPOICA), donaron los siguientes materiales Carica papaya ‘Cotove’, Carica papaya ‘Sofia’, Vasconcellea goudotiana y Vasconcellea cundinamarcensis.

Colecta mayores: colecta hacia la región central y occidental del país: Lara, Falcón, Maracay, Trujillo, Mérida y Táchira. En donde se colectaron los siguientes materiales: Carica papaya ‘Paraguanera’ Carica papaya ‘Maradol’, Carica papaya

‘Zapote’, Vasconcellea microcarpa subespecie microcarpa y pilifera, Vasconcellea cundinamarcensis (V. pubescens) y Vasconcellea cauliflora (Cuadro 1)

Toma de muestras: se tomaron muestras de suelo compuestas alrededor de la planta (suelo + raíz), en diferentes localidades, con el fin de realizar un análisis de nemátodos (Cuadro 2) y muestras de tejido vegetal para el análisis fitopatológico (Cuadro 3).

CUADRO 2. Muestras de suelo tomadas en diferentes localidades

MUESTRA

LOCALIDAD

I

Parque Nacional Yacambú. Sanare. Lara

II

La Cuchilla. Municipio Campo Elías. Mérida

III

Finca Las lomas. Sector Los Pinos. El Valle. Mérida.

IV

Sector Quebrada Seca, vía La Lagunita. Trujillo.

V

El Limón de Monay

VI

Sector Las Tapias, vía a Bailadores. Mérida

VII

14 Km. a partir del Pueblo del Amparo. Páramo Mariño. Mérida

VIII

Vía Los Estanques los Colorados. Mérida

IX

Sector Jatira. Tocuyo de la Costa. Falcón

XI

Sector Labacoa. Tocuyo de la Costa. Falcón

XII

Sector Tacarigua. Tocuyo de la Costa. Falcón

CUADRO 3. Muestras de tejido vegetal para su respectivo análisis fitopatológico.

ESPECIE

LOCALIDAD

Vasconcellea

Finca Las lomas. Sector Los Pinos. El Valle.

cundinamarcensis

Mérida.

Vasconcellea

microcarpa Entre la India y la laguna. Camino del Morro-

microcarpa

Aricagua. Mérida

Carica papaya Paraguanera

El Tocuyo de la Costa. Falcón.

Por otra parte se tomaron muestras de parte vegetal (hoja, flor, fruto y semilla) se colocaron a secar a 80°C por dos días, con el fin de elaborar muestras botánicas. Se prepararon un total de 30 especimenes botánicos del cual la mitad fue depositada en el herbario de Referencia del Centro y la otra mitad en el Herbario “ Víctor M. Badillo”.

Caracterización in situ de los materiales colectados: a través de los descriptores elaborados por el IPGRI se realizó una caracterización in situ de todos los materiales colectados (Cuadro 4).

.

CUADRO 4. Datos de colecta y descripción de los fenotipos in situ

Número de colecta

001 20/05/00

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Táchira

Estado

Algarabeca. Michelena. vía El

Localidad

Zumbador 07°57’22”N

Coordenadas

72°04’35”O 2.400 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERISTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto Color del fruto

Hembra

140,32 g amarillo

x

Hermafrodita

Longitud

9,7 cm

Color de la pulpa

amarillo Grado brix

Diámetro

5,01 cm

claro Otras características

Planta de aprox. 3 m. Hábitat:: Bosque nublado

4,5

CUADRO 4. Continuación

Número de

002

colecta 22/08/00

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez;

Colector (es)

América Larés

Nombre científico

Vasconcellea cauliflora Tapaculo, papayo de

Nombre vulgar

monte

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Monagas

Estado

Sector La Paila. P.N. La

Localidad

Cueva del Guacharo. Caripe. 10° 19’ 05” N

Coordenadas

63° 39’ 01” O 900 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA Tipo de planta Peso del fruto Color del fruto

69,6 g amarillo naranja

Hembra

x

Longitud

6,5 cm

Color de

amarillo Grado brix

Hermafrodita Diámetro

3,4 cm

la pulpa Otras características

Planta de aprox. 6 m. Hábitat:: Bosque siempre verde

CUADRO 4. Continuación

5,0

Número de

003

colecta 23/08/00

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez;

Colector (es)

América Larés

Nombre científico

Carica papaya Pajarera Pajarera

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Monagas

Estado

El Palmar de paradero,

Localidad

carretera principal. 10° 12’ 10”N

Coordenadas

63° 24’ 39” O 750 - 800 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto

Hembra

793 g

Longitud

x

Hermafrodita

20,0 cm Diámetro

10,2 cm

Color del fruto

naranja

Color de la pulpa

Otras características

Naranja Grado brix rojizo

Planta de aprox. 9 m. Hábitat: Bosque siempre verde. Material asilvestrado

CUADRO 4. Continuación

10,0

Número de colecta

004 27-30/11/00

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Ariadne Vega

Colector (es)

Nombre científico

Carica papaya Paraguanera Paraguanera

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

País

Venezuela

Estado

Anzoategui Valle Guanape

Localidad

09°52’N

Coordenadas

65°43’O Altura sobre el nivel

800 msnm

del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

x

Hermafrodita

Peso del fruto

4.896 g

Longitud

47,5 cm

Diámetro

16,4 cm

Color del fruto

naranja

Color de la

Naranja

Grado brix

10,0

pulpa Otras características

CUADRO 4. Continuación

rojizo

Planta de aprox. 3, 5 m. Hábitat:: Campo de producción

Número de colecta

005 27-30/11/00

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Ariadne Vega

Colector (es)

Nombre científico

Carica papaya Maradol Maradol

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

País

Venezuela

Estado

Anzoategui Valle Guanape

Localidad

09°52’N

Coordenadas

65°43’O 800 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

Peso del fruto

1.275 g

Color del fruto

amarillo

Longitud Color de la

x

Hermafrodita

23,0 cm

Diámetro

10,0 cm

rojo

Grado brix

12,0

pulpa Otras características

CUADRO 4. Continuación

Planta de aprox. 2,5 m. Hábitat: Campo de producción

Número de colecta

006 27-30/11/00

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Ariadne Vega

Colector (es)

Carica papaya Red Lady

Nombre científico

Red Lady

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

País

Venezuela

Estado

Anzoategui Valle de Guanape

Localidad

09°52’N

Coordenadas

65°43’O Altura sobre el nivel del

800 msnm

mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

Peso del fruto

1.633 g

Color del fruto

amarillo naranja

Longitud

27,5 cm

Diámetro

Color de la

Naranja

Grado brix

pulpa Otras características

CUADRO 4. Continuación

x

Hermafrodita

11,5 cm 10,0

rojizo

Planta de aprox. 2,5 m. Hábitat: Campo de producción

Número de colecta

007 27-30/11/00

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Ariadne Vega

Colector (es)

Nombre científico

Carica papaya Cartagena roja Cartagena roja

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

País

Venezuela

Estado

Anzoategui Valle de Guanape

Localidad

09°52’N

Coordenadas

65°43’O Altura sobre el nivel 800 msnm

del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

Peso del fruto Color del fruto

3.550 g amarillo naranja

Longitud

35,5 cm Diámetro

12,2 cm

Color de

Naranja Grado brix

10

la pulpa Otras características

CUADRO 4. Continuación

x

Hermafrodita

rojizo

Planta de aprox. 1,8 m. Hábitat:: Campo de producción

Número de colecta

008 27-30/11/00

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Ariadne Vega

Colector (es)

Nombre científico

Carica papaya Solo Solo

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

País

Venezuela

Estado

Anzoategui Valle Guanape

Localidad

09°52’N

Coordenadas

65°43’O 800 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

x

Hermafrodita

Peso del fruto

1,100 g

Longitud

14,0 cm Diámetro

12,2 cm

Color del fruto

amarillo

Color de la

amarillo Grado brix

7,5

pulpa

naranja

Otras características

CUADRO 4. Continuación

Planta de aprox. 3,5 m. Hábitat: Campo de producción

Número de colecta

009 30/04/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Hernando Quecan

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea microcarpa pilifera papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Lara

Estado

El Blanquito y casa Tabla. P. N.

Localidad

Yacambú 07°42’08”N

Coordenadas

69°36’21”O 1.572 - 1.872 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto

3,10 g

Color del fruto

naranja

Hembra

x

Longitud

1,88 cm

Diámetro

1,60 cm

Color de la

Amarillo

Grado brix

6,06

pulpa Otras características

CUADRO 4. Continuación

Hermafrodita

claro

Planta de aprox. 2 m. Hábitat:: Borde de camino

Número de colecta

010 01/05/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Hernando Quecan

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Mérida

Estado

Finca San Benito. Vía La Azulita.

Localidad

Sector Chorotal 08°40’44”N

Coordenadas

71°24’59”O 1.789 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto Color del fruto

130,04 g amarillo

Hembra

x

Longitud

8,77 cm

Diámetro

5,56 cm

Color de la

amarillo

Grado brix

4,5

pulpa Otras características

CUADRO 4. Continuación

Hermafrodita

claro

Planta de aprox. 3 m. Hábitat:: Bosque nublado

Número de colecta

011 02/05/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Hernando Quecan

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Mérida

Estado

La Cuchilla. Municipio Campo Elías

Localidad

08°37’40”N

Coordenadas

71°21’47”O 2.410 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERISTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto Color del fruto

Hembra

138,26 g amarillo

Otras características

CUADRO 4. Continuación

X

Hermafrodita

Longitud

8,77 cm Diámetro

5,83 cm

Color de la

amarillo Grado brix

4,0

pulpa

naranja

Planta de aprox. 6,6 m. Hábitat: Huerto familiar

Número de colecta

012 02/05/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Hernando

Colector (es)

Quecan

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Mérida

Estado

Municipio Andrés Bello. La

Localidad

Azulita. ULA 08°39’19”N

Coordenadas

71°24’32”O 2.269 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICA DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto

Hembra

6,4 g

Longitud

x

7,5 cm

Hermafrodita

Diámetro

4,32 cm

Color del fruto

amarillo

Color de la pulpa

Amarillo

Grado brix

claro Otras características

Planta de aprox. 4 m. Hábitat:: Bosque siempre verde

CUADRO 4. Continuación

5,5

Número de colecta

013 04/05/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Hernando Quecan

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Mérida

Estado

Finca Las Lomas. Sector Los Pinos.

Localidad

El Valle 08°39’25”N

Coordenadas

71°07’58”O 2.139 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

X

Hermafrodita

Peso del fruto

146,87 g

Longitud

9,2 cm Diámetro

6,5 cm

Color del fruto

amarillo

Color de la

amarillo Grado brix

3,6

pulpa Otras características

CUADRO 4. continuación

claro

Planta de aprox. 3,4 m. Hábitat: campo cultivado

Número de colecta

016 05/05/02

Fecha de colecta Dilia

Colector (es)

Nombre científico

odríguez; Hernando Quecan

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Trujillo

Estado

Sector Quebrada Seca, vía La

Localidad

Lagunita 09°05’49”N

Coordenadas

70°44’00”O 2.160 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto

Hembra

117,33 g

Longitud

X

Hermafrodita

8,99

Diámetro

5,59 cm

cm Color del fruto

amarillo

Color de la pulpa

Otras características

CUADRO 4. Continuación

amarillo Grado brix

5,24

claro

Planta de aprox. 3,8 m. Hábitat: Borde de camino

Número de colecta

017 11-12/05/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez

Colector (es)

Carica papaya Maradol

Nombre científico

Maradol

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Falcón

Estado

Tocuyo de la Costa

Localidad Coordenadas Altura sobre el nivel del

510 msnm

mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

x

21,5 cm

Peso del fruto

1,900 g

Longitud

Color del fruto

amarillo naranja

Color de la

Hermafrodita

Diámetro

16,4 cm

naranja rojizo Grado brix

pulpa Otras características

CUADRO 4. Continuación

Planta de aprox. 1,6 m. Hábitat: campo cultivado

13

Número de colecta

019 02/06/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Hernando Quecan

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Mérida

Estado

Las Tapias, vía Bailadores

Localidad

08°12’00”N

Coordenadas

71°50’22”O 2.000 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto Color del fruto

Hembra

81,93 g amarillo

CUADRO 4. Continuación

Hermafrodita

Longitud

8,25 cm Diámetro

4,77 cm

Color de la

amarillo Grado brix

5,25

pulpa Otras características

x

claro

Planta de aprox. 4,0 m. Hábitat: campo

Número de

020

colecta 03/06/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Hernando Quecan

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Táchira

Estado

Parque Nacional La Porquera

Localidad

08°09’33”N

Coordenadas

71°55’16”O 2.436 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA Tipo de planta

Peso del fruto Color del fruto

90,45 g amarillo

Hembra

X

Longitud

8,39 cm

Diámetro

4,57 cm

Color de la

amarillo

Grado brix

4,0

pulpa Otras características

Hermafrodita

claro

Planta de aprox. 2,8 m. Hábitat:: Bosque nublado

CUADRO 4. Continuación

Número de

021

colecta Fecha de colecta

03/06/02

Dilia

Colector (es)

Nombre científico

odríguez; Hernando Quecan

Vasconcellea microcarpa pilifera papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Mérida

Estado

Vía Los Estanques Las Coloradas

Localidad

08°26’04”N

Coordenadas

71°31’06”O 1.457 – 2.000

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERISTICAS DE LA PLANTA Tipo de planta

X

Hembra

Hermafrodita

Peso del fruto

3,46 g

Longitud

2,05 cm Diámetro

1,7 cm

Color del fruto

naranja

Color de

Amarillo Grado brix

9,0

la pulpa Otras características

claro

Planta de aprox. 3,0 m. Hábitat: Bosque siempre verde

CUADRO 4. Continuación

Número de colecta Fecha de colecta Colector (es)

Nombre científico

023 05/09/02 Dilia Rodríguez; Dumas Conde

Vasconcellea cauliflora

Tapaculo

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Aragua

Estado

P.N.H.P. Las Guamitas

Localidad

10°20’27”N

Coordenadas

67°39’35”O Altura sobre el

800 msnm

nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

Peso del fruto

90,2 g

Color del fruto

naranja

Otras características

CUADRO 4. Continuación

x

Hermafrodita

Longitud

8,8 cm

Diámetro

6,8 cm

Color de la

amarillo

Grado brix

4,8

pulpa

naranja

Planta de aprox. 6 m. Hábitat: Bosque nublado

Número de

024

colecta 02-03/11/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Rafael Ortíz

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cauliflora

Nombre vulgar

Tapaculo

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Táchira

Estado Asentamiento

Localidad

Jabillos.

La

campesino

Los

Rochela.

Los

Pensamientos 07°26’57”N

Coordenadas

72°09’20”O 450 –600 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERISTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto Color del fruto

90,8 g amarillo naranja

Otras características

CUADRO 4. Continuación

Hembra

x

Longitud

14,5 cm

Diámetro

9,2 cm

Color de

Amarillo

Grado brix

8,5

la pulpa

naranja

Hermafrodita

Planta de aprox. 8 m. Hábitat:: Bosque siempre verde

Número de colecta

025 03/11/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Rafael Ortíz

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Táchira

Estado

Finca El Tejar. Algarabeca, a 21 Km

Localidad

de Michelena 07°59’33”N

Coordenadas

72°09’20”O 2.350 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

Peso del fruto Color del fruto

198,86 g amarillo

Longitud Color de la pulpa

Otras características

CUADRO 4. Continuación

X

Hermafrodita

9,5 cm

Diámetro

6,7 cm

Amarillo Grado brix claro

Planta de aprox. 5,5 m. Hábitat: Bosque nublado

6

Número de

026

colecta 05/11/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Rafael Ortíz

Colector (es)

Nombre

Vasconcellea cundinamarcensis

científico papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Táchira

Estado

Quebrada El Mugral. Los Mirtos.

Localidad

Algarabeca 07°57’42”N

Coordenadas

72°04’45”O 2.450 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

x

Hermafrodita

Peso del fruto

80,5 g

Longitud

7,4 cm Diámetro

3,9cm

Color del fruto

amarillo

Color de la

amarillo Grado brix

4,5

pulpa Otras características

CUADRO 4. Continuación

claro

Planta de aprox. 3 m. Hábitat:: Bosque nublado

Número de colecta

028 04/11/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Rafael Ortíz

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Táchira

Estado

Sector El Huérfano, vía a Boca de

Localidad

Monte. A 18 Km de Michelena 07°59’02”N

Coordenadas

72°10’30”O 2.250 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Peso del fruto

Hembra

84,5 g

Color del fruto amarillo

Longitud

7,05 cm Diámetro

4,37 cm

Color de

amarillo Grado brix

4,2

la pulpa Otras características

CUADRO 4. Continuación

X

Hermafrodita

claro

Planta de aprox. 3 m. Hábitat:: Bosque nublado

Número de colecta

029 05/11/02

Fecha de colecta

Dilia Rodríguez; Rafael Ortíz

Colector (es)

Nombre científico

Vasconcellea cundinamarcensis papayuela

Nombre vulgar

SITIO DE COLECTA

Venezuela

País

Táchira

Estado

Río arriba, vía El Zumbador a el

Localidad

Cobre 08°00’54”N

Coordenadas

72°03’52”O 2.000 msnm

Altura sobre el nivel del mar

CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA

Tipo de planta

Hembra

Peso del fruto

85,6 g

Color del fruto

amarillo

Longitud Color de la pulpa

Otras características

X

Hermafrodita

7,2 cm

Diámetro

5,3 cm

Amarillo Grado brix claro

Planta de aprox. 3,5 m. Hábitat: Bosque nublado

II. MULTIPLICACIÓN DE MATERIALES

5,0

El Centro llevó a cabo la multiplicación de los siguientes materiales colectados y donados a la institución (Cuadro 5).

CUADRO 5. Total de materiales propagados en el Centro Nacional de Conservación de los Recursos Fitogenéticos/MARN.

ESPECIE

TOTAL DE PLANTAS

Carica papaya ‘ Solo’

50

Carica papaya ‘ Pajarera’

50

Carica papaya ‘ Maradol’

50

Carica papaya ‘ Red Lady’

50

Carica papaya ‘ Sofia’

50

Carica papaya ‘ Cotové’

50

Carica papaya ‘ Paraguanera’

50

Carica papaya ‘Costa rica’

40

Carica papaya ‘Cartagena roja’

40

Vasconcella cundinamarcensis

180

Vasconcella goudotiana

150

Vasconcella cauliflora

120

Vasconcella microcarpa pilifera

50

Nota: muchos de estos materiales se perdieron por enfermedad

III. ESTABLECIMIENTO DEL BANCO DE GERMOPLASMA CARICACEAE

DE LA FAMILIA

A. Constitución de un Banco de Germoplasma de papayas de altura en la Estación Experimental Bajo Seco /UCV

Antecedentes En el período comprendido entre loa años 1963-1968, Horovitz, Badillo, Jiménez, entre otros realizaron viajes al Ecuador, Bolivia, Perú, Costa rica y Panamá, en la búsqueda de material genético de la familia Caricaceae, con el fin de conformar un banco de germoplasma que les permitiera, llevar a cabo sus programas de mejoramiento; y además, como fuente de distribución de ese material a muchas partes del mundo. Investigaciones importantes sobre la genética y la horticultura de las Caricáceas fue desarrollada por el Dr. Salomón Horovitz, Ing. Humberto Jiménez y la Dra. Dora Micheletti de Zerpa, que culminaron con los estudios taxonómicos de Badillo (1967; 1971; 1993; 2000); y el establecimiento de la colección Caricaceae, durante los años 1969 – 1972, en la Estación Experimental Bajo Seco de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela, ubicada en el Km 37, carretera El Junquito. Colonia Tovar, Sector Bajo Seco, Edo. Vargas. Dentro de las especies se encontraban: Jacaratia spinosa, J. corumbensis, J. dolichaula, J. mexicana, Vasconcellea stipulata, Heilbornii y sus variedades, V. cundinamarcensis, V. weberbaueri, V. goudotiana, V. monoica, V. glandulosa, V. quercifolia, V. candicans, V. crassipetala, V. cauliflora, V. pulcra, V. sprucei, V. sphaerocarpa, V. microcarpa subsp microcarpa y pilifera, y Jarilla heterophylla. Esta colección de papayas llegó a constituirse en la más grande del mundo. El establecimiento de esta colección no solamente sirvió como material genético para los diferentes cruzamientos, sino como fuente de distribución para muchas partes del mundo.

De acuerdo a las revisiones hechas se encontró el siguiente listado de materiales (Cuadro 6), se observa que todavía no estaba establecido la separación de los dos géneros, el género Vasconcellea St. Hil. (1837) hasta ahora incluido como sección del género Carica L, se propone su rehabilitación (Badillo, 2000). En este caso Carica L., pertenece con Carica papaya L. como única especie, mientras que el género Vasconcellea St. Hil., cuenta con alrededor de 21 especies y 5 subespecies en América del Sur.

CUADRO 6. Lista de materiales de la familia Caricaceae durante los años 1969 – 1972

N°

ENTRADA 749252

ESPECIE/HIBRIDO Carica stipulata

75210236

[(Carica goudotiana x Carica shaerocarpa) x Carica goudotiana]

75210277

[(Carica goudotiana x Carica shaerocarpa) x Carica goudotiana]

JG1766-1

Carica stipulata

JG1288-1

Carica chrysopetala

6531

Carica quercifolia

72217226

Sin identificación

9-380-6

Carica quercifolia

782180

Carica shaerocarpa

74978-1

Carica quercifolia

782180-5

Carica shaerocarpa

742174

Sin identificación

7821741

Carica manihot

7206537

Sin identificación

752015

Carica goudotiana x [Carica goudotiana x (Carica goudotiana x Carica pubescens)]

671936

Carica horovitziana x Carica stipulata

7171436

Carica pubescens x (Carica pulcra x Carica pubescens)

67225 7520651

Carica pubescens x Carica cauliflora Carica goudotiana x [Carica goudotiana x (Carica goudotiana x Carica pubescens)]

74925

Carica stipulata

694316

Carica candicans

6943112

Carica candicans

66-5-1

Carica candamarcensis x Carica stipulata

65-7-1

Carica quercifolia

JG18803

Carica candicans

7495129

Carica monoica x Carica stipulata

672255

Carica pubescens x Carica cauliflora

66285

Carica pubescens

749896

Sin identificación

749423

{Carica stipulata x [Carica stipulata x (Carica stipulata x Carica pubescens)]} x IDEM

749422

IDEM 749423

749411

IDEM 74942

762150

Carica pubescens x Carica monoica

752103

[(Carica goudotiana x Carica shaerocarpa) x Carica shaerocarpa] X Carica shaerocarpa

716832

Sin identificación

749251

Carica stipulata

75201516

Carica goudotiana x [Carica goudotiana x (Carica goudotiana x Carica pubescens)]

12641

Sin identificación

752102

[(Carica goudotiana x Carica shaerocarpa) x Carica goudotiana]

762163

Carica pubescens x [Carica pubescens x ( Carica pubescens x Carica manihot)]

7172310

Carica pubescens x ( Carica pubescens x Carica manihot)

76216339

Carica pubescens x [Carica pubescens x ( Carica pubescens x Carica manihot)]

717081

Sin identificación

739101

(Carica pulcra x Carica pubescens) x Carica pubescens

762163

IDEM 762163

749902

{Carica stipulata x [Carica stipulata x (Carica stipulata x Carica pubescens)]}

17661

Carica stipulata

14662

Carica fructifragans

NOTA: Todos los cruces fueron realizados por el Dr. Horovitz del Instituto de genética. Facultad de Agronomía. UCV-Maracay

CUADRO 7. Inventario de la colección vieja de la familia Caricaceae, presentes en la Estación Experimental Bajo Seco. N° IDENTIFICACIÓN

ESPECIE

694316

Vasconcellea quercifolia (2)

752015-16

Vasconcellea goudotiana [V. goudotiana ( V. goudotiana x V. pubescens ) ]

657-1

782180

749251

Vasconcellea quercifolia

Vasconcellea sphaerocarpa

Vasconcellea stipulata (2)

7495129

Vasconcellea monoica x Vasconcellea stipulata

762163

Sin identificación (3)

749896

Sin identificación (3)

Nota: no hay seguridad en el nombre de la especie /híbrido, ya que el número de la placa no se visualizaba bien o simplemente no la tenía. El número que se encuentra entre paréntesis es la cantidad de individuos por entrada.

Colección nueva

En Agosto del año 2001, se inició en mutuo acuerdo con el INIA y UCV el ESTABLECIMIENTO DE LAS PAPAYAS DE ALTURA, en la Estación Experimental Bajo Seco /UCV, para la RECONSTRUCCIÓN DEL BANCO DE GERMOPLASMA DE LA FAMILIA CARICACEAE, para ello se contó con la colaboración del Ing. Cruz Berbin (Director de la estación) y del técnico Javier Velásquez, así como pasantes de la Universidad del Zulia y de la Universidad Central de Venezuela y estudiantes del curso propedéutico. Dentro de las actividades se encuentran:

CUADRO 8. Representación esquemática del establecimiento de los materiales en campo

ACTIVIDADES Preparación del terreno

Propagación de materiales

Medición del terreno Trazado a curvas de nivel

Holladura

2.400 m2

Instalación del sistema de riego

Transplante de material

Elaboración de pocetas y etiquetas

COLECCIÓN DE LA FAMILIA CARICACEAE

Esta colección contempla 18 entradas de papayas de altura entre 7 a 10 individuos por entrada, correspondiente a las colectas de las región central y occidental del país (Cuadro 9 ). También se incorporó 14 materiales de la colección anterior (Cuadro 7).

La colección de papayas de altura está ubicado geográficamente a 10°26’01,8¨ N; 67°12’17,0” O. Dentro de datos climatológicos promedio de la estación se encuentra en el Cuadro 10

CUADRO 10. Datos climatológicos de la Estación Experimental Bajo Seco. Datos climatológicos

Promedios

Precipitación

157 mm

Temperatura

17 °C

Humedad relativa

70%

Altura

1.760 msnm

B. Constitución de un Banco de Germoplasma de papayas de zona cálida en el Instituto de Genética /CIBA /UCV

En enero del presente año se establecieron en el Instituto de Genética, las papayas de zona cálida. Dentro de los materiales se encuentran: Carica papaya ‘Solo’, Carica papaya ‘Cartagena roja’, Carica papaya ‘Paraguanera’, Carica papaya ‘Red Lady’, Carica papaya ‘Maradol’ y Vasconcellea cauliflora (Cuadro 11). Esta conformado por 10 entradas con 5 individuos; la misma permanecerá allí hasta que se realice su caracterización morfológica y su propagación.

IV. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA La misma se llevará a cabo cuando los materiales estén adultos. Es decir un año aproximadamente para los materiales de zona cálida y dos años para las papayas de altura.

V. DOCUMENTACIÓN IDÓNEA

Esta se realizara cuando se tenga los datos de la caracterización morfológica. La entrega de esta base está sujeto a la normativa legal sobre acceso, Decisión 391 del Acuerdo de Cartagena).

VI. INTERCAMBIO DE MATERIALES

El intercambio con otras instituciones del proyecto está sujeto a la normativa legal sobre acceso, Decisión 391 del Acuerdo de Cartagena.

Se intercambiaron con la institución coordinadora INIA/ Maracay los siguientes materiales: Carica papaya ‘Solo’, Carica papaya Pajarera, Carica papaya ‘ Maradol’, Carica papaya ‘ Paraguanera’, Carica papaya ‘Cartagena roja’, Carica papaya ‘ Costa rica’, Carica papaya ‘Cotové’, Carica papaya ‘Sofia’, Vasconcellea goudotiana, Vasconcellea cauliflora y Vasconcellea cundinamarcensis

para los estudios de

Evaluación de Resistencia a patógenos (bacteriosis y nemátodos) en la familia Caricaceae a cargo de las investigadoras Ana Macelli y Carolina Rosales (Cuadro 12).

OTRAS ACTIVIDADES

a. Ponente en los siguientes eventos, así como su publicación (resumen) •

Rodríguez, D. 2000. Caracterización in situ de las especies Carica papaya ‘ Pajarera‘ y Vasconcellea cauliflora en Caripe estado Monagas. En: Memorias de la XIV Congreso de Botánica, Caracas del 18 al 21 de Julio/00

•

Rodríguez, D. 2000. Distribución de especies de la familia Caricaceae en Venezuela. Memorias de la VII Congreso Nacional de Frutales, San Cristóbal Táchira, 18 al 20 /10/00

•

Rodríguez, D. 2000. Distribución de especies de la familia Caricaceae en Venezuela. Memorias de la 46 Reunión Anual de la Sociedad de Horticultura Tropical en Miami. Florida. USA del 24 al 29/09/00.

b. Entrenamiento en Manejo de los Recursos Fitogenéticos de la Familia Caricaceae. El programa fue el siguiente: Revisión de los descriptores propuestos para la colección, caracterización y evaluación (Universidad Nacional Dpto. Agronomía); revisión de descriptores en las especies de altura (Centro de Investigación La Selva CORPOICARío Negro); visita a la colección de especies de tierra cálida (Centro de Investigación COTOVE de la Universidad Nacional Santa Fe de Antioquia); visita al banco de semillas de CORPOICA; visita al huerto de la colección de santa Fe para polinizaciones ínter especificas y manejo de información. Esto fue a cargo de los investigadores: M.Sc. Carlos Reyes (Universidad Nacional), PhD. Mario Lobo y Tec. Agr. María Clara Medina (CORPOICA)

c. Asesora de pasantías a estudiantes de la Universidad del Zulia (LUZ) y Universidad

Central

de

Venezuela

(UCV),

sobre

MANEJO

DE

BANCO

DE

GERMOPLASMA DE CARICÁCEAS en la Estación Experimental Bajo Seco /UCV.

d. Entrenamiento en el programa FLORAMAP en las instalaciones del IPGRI/ Cali/ Colombia, bajo la asesoría del PhD. Geo Coopens

AGRADECIMIENTOS

Al personal técnico del Centro Nacional de Conservación de Recursos Fitogeneticos /ONDB/ MARN por su valiosa colaboración en las colectas y multiplicación de papayas; al personal técnico de la estación Experimental Bajo Seco/ UCV por su participación en el Establecimiento de las papayas de altura y al personal del Instituto de Genética /Facultad de Agronomía/ UCV, en el Establecimiento de las papayas de zona cálida en campo; así como al profesor Víctor M. Badillo por su valiosa asesoría en la identificación de los materiales; y a todos los investigadores que participaron en este proyecto.

2.3 Extracciones de ADNs de especies de caricas autóctonas de Venezuela para estudios moleculares. INIA/CENIAP

INFORME DE ACTIVIDAD Extracciones de ADNs de especies de caricas autóctonas de Venezuela para estudios moleculares Responsable de la actividad: Inv. Ariadne Vegas García Esta actividad forma parte del proyecto ‘Aprovechamiento de los recursos genéticos de papaya, para su mejoramiento y promoción’, financiada por FONTAGRO.

Colaboradores: Tec. Zulay Gutierrez Tec. Gustavo Saldaña

Resumen de las actividades realizadas: Para la extracción del ADN se utilizaron 13 especies de caricas autóctonas de Venezuela, colectadas por las invs. Carolina Rosales, Dília Rodríguez y mi persona, y el Sr. Gustavo Robles (obrero de la Unidad de Biotecnología Agrícola). Se anexa lista de las especies. Se les extrajo el ADN a dos plantas por especie.

Se tomaron hojas nuevas de plantas mantenidas en condiciones de umbráculo, el mismo día de la extracción. Para la extracción del ADN se utilizó la metodología utilizada de Shure et al (1983).

Los ADNs se mantuvieron a –40 °C precipitados en acetato de amonio e isopropanol para que no se degradaran. Para observar la calidad y concentración de los ADNs, los mismos se precipitaron por centrifugación, se lavaron con etanol 70 % y se disolvieron en 50 ul de buffer TE. La cuantificación se hizo mediante comparación con el marcador lambda, de concetración conocida.

Resultados de la investigación: Las extracciones dieron ADNs de buena calidad, de una concentración de 100 ng/ul.

Literatura citada Shure M, Wessler S, Federoff N (1983). Cell 35: 225-233.

Lista de especies autóctonas venezolanas de Caricaceas y Vasconcelleas, a las cuales se les ha extraido el ADN, para enviar al CIRAD, Francia. Año 2003 Carica papaya Carica papaya Criolla Roja. Recolector: Carolina Rosales (CR) Carica papaya San Felipe. (CR) Carica papaya Paraguanera. (CR)

Vasconcellea cauliflora Vasconcellea cauliflora. El Limón. Maracay. Recolector: Gustavo Robles Vasconcellea cauliflora. Maturin. Monagas. Recolector: Dilia Rodríguez (DR)

Vasconcellea microcarpa pilifera Vasconcellea microcarpa pilifera. Vía Los Estanques. Los Colorados. Mérida (DR) Vasconcellea cundinamarcensis Vasconcellea cundinamarcensis. Las Lomas. Sector Los Pinos. El Valle. Mérida (DR) V. cundinamarcensis. Sector La Cuchilla. Municipio Campo Elias. La Azulita. Mérida (DR)

V. cundinamarcensis. Finca San Benito, vía La Azulita. Sector Chorotal. Mérida (DR) Vasconcellea cundinamarcensis. Parque Nacional La Porchera. Mérida (DR) Vasconcellea cundinamarcensis. Sector Quebrada Seca, vía La Lagunita. Trujillo (DR) Vasconcellea cundinamarcensis. Vía El Zumbador. Táchira (DR) Vasconcellea cundinamarcensis. La Venta. Mérida. (AV)

Total: 13 materiales autóctonos de Caricas y Vasconcelleas 04 especies 02 plantas/material 02 tubos de ADN/material (total: 52 tubos)

2.4 Susceptibilidad de las Vasconcelleas y Carica papaya a los virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P) y mosaico distorsionante de la hoja de la lechosa (PLMV). INIA/CENIAP

INFORME DE ACTIVIDAD Susceptibilidad de las Vasconcelleas y Carica papaya a los virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P) y mosaico distorsionante de la hoja de la lechosa (PLMV) Responsable de la actividad: Inv. Ariadne Vegas García Esta investigación fue realizada, en el laboratorio de Virología Molecular del Dr. Dennis Gonsalves. Departamento de Fitopatología, Universidad de Cornell, ubicado en la Estación Experimental de Agricultura del Estado de Nueva York (NY Agriculture Experimental Station- NYAES), Geneva, Nueva York, EEUU), durante el período 25 de abril 2001 al 11 de septiembre 2002. Esta actividad forma parte del proyecto ‘Aprovechamiento de los recursos genéticos de papaya, para su mejoramiento y promoción’, financiada por FONTAGRO.

Colaboradores: Dr. Dennis Gonsalves (USDA. EEUU) Dr. Gustavo Fermín (Universidad de los Andes. Venezuela)

Resumen de las actividades realizadas:

Se realizaron semilleros de las especies de caricas: C. papaya var. Sunrise (lechosa); C. cauliflora (HCAR 274 N93-42; HCAR 173 372); C. goudotiana HCAR 281 UHACC # 1030; C. microcarpa HCAR 288 N93-56); C. monoica, C. pubecens y C. cauliflora (sin números). Las tres primeras procedentes del USDA National Clonal Germplasm Repository de Hawai, enviadas por Dr. Francis Zee. Las tres últimas procedentes de Venezuela, colectadas en los estados Merida y Aragua.

Se inocularon las especies de caricas mencionadas con 5 aislamientos del virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P), procedentes de Venezuela (El Vigia), México (Tapachula), Hawai (HA), Taiwán y Tailandia, con la finalidad de estudiar la susceptibilidad o resistencia de estas especies. Se inocularon de 10-20 plantas/ especie/ aislamiento. Cada inoculación fue repetida al menos dos veces. Se utilizaron como plantas testigos C. papaya, Cucumis metuliferus y Chenopodium quinoa. Se evaluaron los síntomas de las plantas inoculadas cada 7

d., por espacio de 45 d. Los síntomas de las plantas se documentaron con la toma de fotos, con una cámara digital.

La infección viral fue confirmada a través de la recuperación del virus en cinco plantas de lechosa; la técnica serológica de ELISA (en inglés enzyme linked immunosorbent assay; en español prueba inmunoabsorbente ligada a la enzima), según el protocolo de Ling et al (1991), utilizando suero y conjugado antiraton IgG alkalina fosfatasa, para detectar su presencia en forma indirecta; la técnica de hibridación del ARN con una sonda especifica (en ingles, ARN blotting), según Sambrook et al (2001). En la técnica de ELISA, muestras de hojas inoculadas y hojas nuevas se analizaron para evaluar la presencia o ausencia del virus, 3, 7, 15 y 30 días después de la inoculación (DDI). Se registraron las lecturas del espectrofotometro a 405 nm. Se tomó el promedio de dos lecturas, a 30 mins después de la reacción. De la misma manera se tomaron muestras, a partir de hojas de vasconcelleas y lechosa, mostrando o no síntomas, se aisló el ARN, usando dos protocolos, Napoli, et al (1990) y Ruíz- Castro y Silva-Rosales (1997). El ARN desnaturalizado y transferido en una membrana de nylon se hibridizó con el ADN complementario de una sonda que contenía el gen que codifica para la proteína de la capside del virus PRSV-P, y por la tanto sirve para diagnosticar el virus en las plantas susceptibles. La muestra positiva emitió una señal que sensibilizó una película, dando como resultado una mancha característica. Se conoce que esta técnica es más sensible que la prueba de ELISA.

Existe controversia en la literatura sobre la susceptiblilidad de las caricas al PRSVP, en cuanto que algunas especies han resultado susceptibles para algunos autores y resistentes para otros, y viceversa. Estas especies podrían ser fuentes de genes de resistencia al virus a través de cruzamientos genéticos convencionales o mediante el aislamiento, clonaje e introducción de genes de resistencia mediante técnicas moleculares. Este estudio predende esclarecer la susceptibilidad o resistencia de seis especies de caricas usando cinco aislados geográficos de varias partes del mundo, y técnicas de diagnóstico más sensibles,

a las usadas en el pasado.

Se inocularon plantas de caricas con un aislamiento del virus de la distorsión y mosaico de la hoja de la lechosa (Papaya Leaf Distortion Mosaic potyvirus PLDMV). Se utilizaron cinco especies de caricas: C. monoica, C. pubecens, C. microcarpa accesion HCAR 288 No 93-56, C. goudotiana accesiones HCAR 278 UH ACC No. 1026, C. cauliflora accesion HCAR 173 372, las dos primeras procedentes de Venezuela y las otras de Hawai. La lechosa variedad Sunrise, Chenopodium quinoa y Cucumis metuliferus (Acc. 2459), se usaron como testigos. Se inocularon 10 plantas/especie. Cada inoculación fue repetida al menos dos veces. Las plantas inoculadas se mantuvieron en un invernadero, con condiciones controladas de humedad y temperatura, y se evaluaron los síntomas de las plantas inoculadas cada 7 d., por espacio de 45 d. Los síntomas de las plantas se documentaron con la toma de fotos, con una cámara digital. La infección viral fue confirmada a través de recuperación del virus en lechosa cinco plantas de lechosa; la técnica de RT-PCR (transcriptasa reversa-PCR; en inglés, polimerasa chain reaction, en español la reacción en cadena de la polimerasa), siguendo el protocolo estandarizado en el laboratorio de Kosiyachinda (2002) y la técnica de hibridación del ARN con una sonda específica (en ingles, ARN blotting), según Sambrook et al (2001). En la técnica RT-PCR se usan dos secuencias de los primers o sebadores que amplifican el gen de la proteína de la capside del PLDMV (de unos 1000 pares de bases) y por la tanto sirven para detectar el virus en las plantas susceptibles.

El PLMV es predominante en Japón, pertenece al mismo grupo que el PRSV-P, induce síntomas similares, tiene el mismo rango de plantas hospederas y se transmite también por áfidos. El conocimiento del virus y pruebas de diagnóstico que descarten la presencia del mismo en nuestro país es importante para el desarrollo de estrategias de control de enfermedades virales para este frutal. En este estudio se investiga por primera vez la reacción de otras especies de caricas hacia este virus, ya que estas podrían actuar como reservorio en algunas áreas y

pueden ser usadas como fuentes de resistencia en programas de mejoramiento genético (Maoka et al, 1995; Maoka et al, 1996) .

Resultados de la investigación:

En el cuadro 1 se resumen los síntomas y las plantas hospederas del virus del PRSV-P, después de haber sido inoculadas con cinco aislamientos del virus, procedentes de distintas áreas geográficas del mundo. En general, los síntomas expresados en las especies de caricas después de ser inoculadas con el virus de la mancha anillada de la lechosa dependieron de la especie, cepa y título del virus y edad de la planta. Las cepas de México, Venezuela y Tailandia fueron las más virulentas. La cepa de Hawai se portó como el aislado menos virulento y Taiwan como un aislamiento de virulencia media. Las especies: C. papaya, C. microcarpa, C. monoica y C. goudotiana dieron síntomas sistémicos para todos los aislados, sin embargo las dos últimas mostraron además lesiones locales con algunos de los ailados del virus. En las especies C. cauliflora y C. pubescens se observó lesiones locales y muerte regresiva. Sin embargo, algunas plantas de C. cauliflora desarrollaron mosaico sistémico y en C. pubescens necrosis sistémica, donde se detectó la presecia del virus, mediante pruebas biológicas (síntomas en plantas), serológicas y moleculares (Fig.1). Algunas plantas de C. pubecens y C. cauliflora se recuperaron de la infección, después de 21 a 35 días de la inoculación, respectivamente. Pasado este tiempo, las hojas nuevas no mostraban síntomas y no se detectó la presencia del virus en estas plantas. Se escogió la metodología de aislamiento de ARN de Napoli et al (1990), ya que resultó más eficiente, en cuanto a que fue menos laboriosa y se extrae el ARN en menor tiempo. Las pruebas biológicas y moleculares fueron más sensibles que la prueba de ELISA en demostrar la presencia de virus.

En este trabajo se señala por primera vez síntomas de lesiones locales, muerte regresiva y recuperación de plantas de caricas, después de la inoculación con el

PRSV-P. Se comprobó mediante pruebas moleculares que al recuperarse las plantas de C. pubecens y C. cauliflora, el virus no estaba presente.

En el cuadro 1 se resumen los síntomas y las plantas hospederas del virus de PLDMV. La lechosa, C. monoica, C. microcarpa, C. goudotiana muestran síntomas sistémicos y en el caso de C. goudotiana además se observaron síntomas de necrosis apical, por lo tanto consideraron susceptibles al PLDMV. C. cauliflora sólo se infecto en un porcentaje bajo (0,1 %) y C pubescens parece ser resistentes o inmune al virus. El virus fue recobrado de las plantas que mostraron síntomas sistémicos, incluyendo C. cauliflora, mientras que no fue así, en muestras procedentes de plantas de C. pubecens y C. cauliflora sin síntomas. Los testigos C. quinoa, C. metuliferus, y N. benthamiana no desarrollaron ningún síntoma. La técnica de RT-PCR usada permitió resultados confiables y rápidos en cuanto a la presencia del PLDMV, en las diferentes muestras de caricas y corroboran los resultados de las pruebas biológicas. Productos de PCR de unos 1000 pares de bases fueron obtenidos en las muestras positivas, C. papaya, C. monoica, C. microcarpa, C. goudotiana, comparables a los productos obtenidos del plásmido Ti-TLPLDMV (testigo positivo, incluye el gen de la proteína de la cápside del virus PLDMV) (Fig. 2). Estos primers diagnosticaron específicamente al virus PRSV-P. Los resultados de la prueba de hibridación del ARN fueron similares a las obtenidas en la prueba RT-PCR, sin embargo esta prueba significó más tiempo y laboriosidad.

Este trabajo de susceptibilidad de caricas al PLDMV es el primero en su área, y permitió identificar plantas hospederas que podrían servir de reservorio del virus en su habitat natural y otras que podrían servir de fuentes de resistencia. C. cauliflora muestra cierta resistencia y C. pubecens parece inmune al virus. En el caso que se quiera confirmar la presencia de este virus en países donde no este citado, se recomienda reforzar el diagnóstico con las técnicas moleculares descritas.

Se desconoce los mecanismos de resistencia presentes en las caricas hacia los virus PRSV-P y PLMV, sin embargo se sospecha que el silenciamiento de genes podría estar involucrado en estas respuestas, y pareciera que estos mecanismos fueran diferentes para cada especies.

Literatura citada Kosiyachinda, P. 2002. Risk assessment of recombination between transgene and attacking virus by using virus resistant transgenic papaya as a model system. Tesis de Doctorado. Universidad de Cornell. 212 p. Ling, K, Namba S, Gonsalves C, Slightom J, and Gonsalves D. 1991. Protection against detrimental effects of potyvirus infection in transgenic tobacco plants expressing the papaya ringspot virus. Molecular Breeding 3: 161-168. Maoka, T, S. Kawano and T. Usugi. 1995. Occurence of the P strain of papaya ringspot virus in Japan. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 61: 34-37. Maoka, T, S. Kashiwazaki, S. Tsuda, T. Usugi, and H. Hibino. 1996. Arch Virol. 141: 197-204. Napoli, C, C. Lemieux and R. Jorgensen. 1990. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppresion of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279-290. Ruiz-Castro S. and Silva-Rosales, L. 1997.Use of papaya ringspotyvirus detections in papaya (Carica papaya) from Veracruz, Tabasco and Chiapas. Rev. Mexicana de Fitopatología 15: 83-87. Sambrook, J, E. Fritsch and T. Maniatis. 2001. Molecular cloning. A laboratory manual, 3ra Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1659 p.

2.5 Evaluación de materiales de Caricáceas a nematodos. INIA/CENIAP

Evaluación de materiales de Caricáceas a nematodos. Carolina Rosales, Zoraida Suárez H y María Alejandra Gómez. INIA – CENIAP. Informe Final RESUMEN Evaluación de materiales de Caricáceas a nematodos. Con la finalidad de estudiar la acción de los nematodos Meloidogyne incognita Raza 1 y Rotylenchulus reniformis en Caricáceas, se evaluaron cinco materiales: Los materiales evaluados fueron: Carica papaya: ‘Pajarera’, ‘Red Lady’, ‘Maradol-Aragua’, Vasconcellea goudotiana tipo A y V. goudotiana tipo B. Otro grupo de materiales fue evaluado sólo con respecto a M. incógnita Raza 1: C. papaya‘Sofía’, ‘Paraguanera’, ‘Cartagena amarilla’, ‘Varadero’, ‘Criolla roja’, ‘Costa Rica’, ‘San Felipe’, ‘La Habana’, Maradol – Falcón, V. cauliflora, V. cundinamarcencis (Las Lomas, Trujillo, La Azulita, Chorotal, La Porquera), V. microcarpa microcarpa, V. microcarpa pilifera. Se usaron de cada material cinco plantas no inoculadas como testigo y cinco inoculadas con 2000 huevos+juveniles / planta de M. incognita raza 1 y Rotylenchulus reniformis. Para el caso de solo M. incógnita Raza 1, se usó un nivel de 2.500 huevos+juveniles/ planta. Después de doce semanas se evaluaron las variables agronómicas peso aéreo fresco y seco y peso radical fresco y seco; también se determinó el Factor de Reproducción (FR=Pf/Pi) y el Indice de Agallamiento. Todas las plantas inoculadas presentaron formación de agallas. Hubo diferencias significativas (Tukey, 5%) entre los materiales evaluados para el peso aéreo y radical fresco, entre las plantas inoculadas y las no inoculadas, a excepción de C. papaya ‘Red Lady’y ‘Maradol’- Aragua que no presentaron diferencias para el peso radical y aéreo respectivamente. Se realizó histolopatología de los materiales. Segmentos de raíces de cada especie fueron fijados en Craff III y deshidratados en una serie de alcohol butílico, embebidos en parafina y cortados en secciones de 15µ. Se tiñeron con la técnica cuadrúple de Triarch, modificada por Suárez et al. Todas los materiales de Carica inoculadas, mostraron células gigantes, núcleos y nucleolos y masas de huevos típicas de Meloidogyne. Además de ello, aquellas inoculadas simultáneamente con R. reniformis, mostraron las células del parénquima vascular formando un sincitio, con células hipertrofiadas, citoplasma granular, núcleos agrandados y nucleolos prominentes. Algunos de los materiales pertenecientes al género Vasconcellea pueden ser consideradas como resistentes - tolerantes a la acción del nematodo en virtud de la no reducción de las variables agronómicas evaluadas.

INTRODUCCIÓN La papaya o lechosa (Carica papaya L.) se encuentra entre los frutales de mayor importancia económica en los trópicos, por ser un alimento con alto valor nutritivo al contener un considerable contenido de vitaminas A, B y C, hierro calcio, azúcares y fibras. Además posee la papaína, un fermento proteolítico de múltiples usos en la industria (SilvaRosales et al., 1999). Para el año 1998, la Organización Mundial para la Alimentación y la Agricultura de la Organización de la Naciones Unidas (FAO) reportó un estimado de 5.1 millones de toneladas métricas cosechadas a nivel mundial, lo cual casi duplica la producción del año 1980 (Food and Agriculture Organization; Faostat Database Results, 2001). En Venezuela, para 1997, la producción de este rubro agrícola se ponderó en 87.117 TM Según se establece en el Anuario Estadístico del Ministerio de Producción y Comercio (MPC, 1999), las áreas de cultivo dedicadas a la papaya se han triplicado respecto al año

1

1997-98, pero no ha habido un significativo aumento de la producción desde hace cuatro años anteriores a dicho período (superávit de 12.8%), esto es, por la alta incidencia de plantas enfermas existentes en los cultivos a nivel nacional. Actualmente, los productores se han visto en la imperiosa necesidad de alternar las plantaciones luego de la primera cosecha de papaya por otros cultivos no tan tradicionales y menos productivos (yuca, en el caso del Zulia; cítricos en Sucre), cuando en condiciones normales una plantación rinde de tres a cinco cosechas en un menor período de tiempo que con la alternancia de cultivos en campo. Así mismo, algunos estudios indican que la producción tiende a la baja por la alta incidencia de enfermedades, entre las cuales se señalan bacterias, nematodos y principalmente de las de origen viral. En relación con los nematodos fitoparasíticos Meloidogyne incógnita y Rotylenchulus reniformis, se encuentran distribuidosa lo largo del país en plantaciones de papaya y contribuyen al deterioro y merma que ha sufrido la producción de la misma en los último años. Así mismo los diversos estudios que involucran a otros patógenos de este cultivo, permitirá conocer mas sobre la dinámica de los mismos y ofrecer a los agricultores alternativas que le permitan establecer de nuevo el cultivo de la papaya. Es con esta finalidad que este proyecto permite evaluar diversos materiales de Caricaceas, bien sean Carica o Vasconcellea, cultivados o silvestres, con la finalidad de detectar materiales que posean resistencia a este patógeno y puedan ser utilizados ulteriormente en planes de mejoramiento de la lechosa comercial.

MATERIALES Y MÉTODOS Para la extracción de nematodos del suelo, de cada bolsa se homogeneizó la muestra y se procesaron 100 cm3 de suelo por el método de Cobb modificado. Diez gramos de raíces se licuaron en 100 cc de agua, a velocidad media durante 30 s o hasta romper el tejido. Se tamizaron en cedazos de 30, 200 y 325 mallas. Se lavó con agua y se recogió lo retenido en los cedazos 200 y 325. La limpieza se realizó, tanto para el suelo como para las raíces, con el embudo de Baermann. Después de 24 h se recogió la suspensión, y se concentró (tamiz 500 mallas) en 50 cc de agua, contándose 2 alícuotas de 5 ml cada una. Para la observación de nematodos endoparasíticos en el tejido afectado se utilizó la tinción con fuscina ácida (1) El ensayo se llevó a cabo en el umbráculo del Laboratorio de Nematología del CENIAP, con una temperatura promedio de 34°C, HR: 78%, durante 12 semanas. Los materiales utilizados fueron divididos en dos grupos: Grupo 1: Carica papaya: ‘Pajarera’, ‘Red Lady’, ‘Maradol’- Aragua, Vasconcellea goudotiana tipo A y V. goudotiana tipo B. Grupo 2: : C. papaya‘Sofía’, ‘Paraguanera’, ‘Cartagena amarilla’, ‘Varadero’, ‘Criolla roja’, ‘Costa Rica’, ‘San Felipe’, ‘La Habana’, Maradol – Falcón, V. cauliflora, V. cundinamarcencis (Las Lomas, Trujillo, La Azulita, Chorotal, La Porquera), V. microcarpa microcarpa, V. microcarpa pilifera. Las plantas de un mes de edad fueron sembradas en potes de 1 kg con una mezcla estéril de tierra:arena (2:1). Se utilizaron 10 plantas por material y se inocularon la mitad

2

de ellas con 2000 huevos+juveniles/planta de una población mixta de Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitw. raza 1 (Taylor y Sasser, 1978) y Rotylenchulus reniformis Lidford & Oliveira provenientes de una siembra comercial de lechosa ubicada en el Estado Aragua. Cinco plantas se dejaron como testigos sin inocular. Las plantas de colocaron en mesones del umbráculo en un diseño Completamente Aleatorizado y recibieron riego y fertilización periódicamente. Al finalizar el ensayo se tomaron para cada planta los datos de las variables agronómicas peso radical fresco , peso aéreo fresco y el índice de agallamiento (Taylor y Sasser, 1978) en las raíces. Se procesaron suelo y raíz por el método de Cobb modificado y se limpiaron las muestras por el método de Baermann. Se calculó el Factor de Reproducción de nematodos (FR= Población final / Población inicial). Los datos fueron procesados con un análisis de Varianza y donde hubo diferencias se realizó la prueba de separación de medias (Tukey, 5%)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la Tabla I se observan los resultados de las variables agronómicas evaluadas al finalizar el ensayo. La acción del nematodo disminuyó en forma significativa los peso aéreo y radical fresco para C. papaya en todos los materiales comerciales. Es interesante destacas algunos materiales de Vasconcellea no presentaron diferencias significativas para ninguna de las variables evaluadas a excepción de V. Goudotiana Tipo B, V. cundinamarcencis, V. cauliflora y V. microcarpa microcarpa las cual mostraron diferencias en alguna de las variables agronómica evaluadas.. Al comparar los tratamientos para la prueba Tukey (5%), estos se separan en dos grupos los cuales reúnen a las plantas inoculadas y las testigos en otro grupo según sea el caso. Estos resultados son similares a los señalados por varios autores (Mc Sorley, 1981; Petit, 1990; Suárez H. y Rosales, 1998; Ramakrishnan y Rajandran, 1999; Bustillo, 1999) donde el nematodo M. incognita afecta agronómicamente el cultivo de la papaya, induciendo la formación de agallas en las raíces y disminuyendo variables, tales como, parte aérea, diámetro del tallo, peso radical y peso del follaje.

3

TABLA I. EFECTO DE Meloidogyne incognita Raza 1 y Rotylenchulus reniformis

SOBRE LAS VARIABLES AGRONÓMICAS EN PLANTAS DE CARICAS Peso Aéreo Fresco (g)

Peso Aéreo Seco (g)

Peso Radical Fresco (g)

Peso radical Seco (g)

Inoculado

14.96a

1.62a

2.50ª

2.30ª

Testigo

18.82b

2.14b

10.24b

7.78b

Inoculado

25.54a

2.30a

32.40a

2.28ª

Testigo

25.38a

2.72a

34.72a

11.46b

Inoculado

17.06ª

2.08a

23.58a

2.08a

Testigo

23.06b

2.16a

23.06a

4.90ª

Inoculado

36.02ª

6.24ª

23.66ª

2.90ª

Testigo

33.50ª

2.48ª

23.66ª

2.50ª

Testigo

25.36ª

5.12ª

24.98ª

2.86ª

Inoculado

22.60ª

2.82ª

31.74ª

6.66b

Material C. papaya ‘Pajarera’ C. papaya ‘Maradol’ C. papaya ‘Red Lady’ V. goudutiana “A”

V. goudutiana “B”

4

Tabla II. EFECTO DE Meloidogyne incognita raza 1 SOBRE LAS VARIABLES AGRONÓMICAS EN PLANTAS DE CARICACEAS. Peso Aéreo Fresco (g)

Peso Aéreo Seco (g)

Peso Radical Fresco (g)

Peso radical Seco (g)

Inoculado

16.46a

2.12a

5.50ª

2.30ª

Testigo

21.12b

3.34b

14.64b

5.78b

Inoculado

18.54a

2.90a

35.40a

3.68ª

Testigo

17.78a

2.82a

30.72a

7.96b

Inoculado

27.06ª

2.98a

23.58a

2.08a

Testigo

30.05ª

5.76b

31.31b

4.78b

Inoculado

15.45a

1.98a

17.98a

1.98a

Testigo

16.66a

2.76b

18.65a

2.76a

Inoculado

17.06ª

1.98a

18.58a

2.08a

Testigo

20.05ª

3.76b

21.31b

4.38b

Inoculado

25.45a

2.98a

23.98a

2.98a

Testigo

26.16a

5.66b

24.95a

4.76b

Inoculado

12.54a

1.90a

15.60a

1.68ª

Testigo

11.88a

1.82a

16.72a

5.26b

Inoculado

10.45a

1.08a

11.98a

0.98a

Testigo

9.66a 13.86ª

1.76b 1.34a

11.65a 16.46a

1.96a 0.32a

17.32b

1.30a

18.60b

2.51b

Inoculado

20.56a

3.87a

17.77a

2.09a

Testigo

23.02a 2.26ª

3.23a 0.15ª

15.98a 3.16ª

3.11b 0.24ª

1.17a

0.21a

2.32b

0.04b

1.48ª

0.13ª

1.94ª

0.06a

1.40a

0.16a

1.96a

0.28b

Material C. papaya ‘Sofía’ C. papaya ‘Paraguanera’ C. papaya ‘Cartagena amarilla’ C. papaya ‘Varadero’ C. papaya ‘Criolla roja’ C. papaya ‘Costa Rica’ C. papaya ‘San Felipe’ C. papaya ‘La Habana’ C. papaya Maradol - Falcón

Inoculado Testigo

V. cauliflora

V. cundinamarcencis Las Lomas

Inoculado Testigo

V. cundinamarcencis Trujillo

Inoculado Testigo

5

V. cundinamarcencis La Azulita

Inoculado

1.00a

0.15a

1.92a

0.12a

1.50a

0.11b

2.34a

0.23b

2.14a

0.10a

3.32a

0.15a

2.26a

0.14a

3.32a

0.22a

2.14a

0.19a

3.30a

0.12a

2.30a

0.18a

2.82b

0.31b

5.20a

0.53a

3.60a

0.58a

1.42b

0.05b

1.10b

0.25b

1.00a

0.15a

1.52a

0.24a

1.50a

0.11a

2.34b

0.23a

Testigo V. cundinamarcencis Chorotal

Inoculado Testigo

V. cundinamarcencis La Porquera

Inoculado Testigo

V. microcarpa microcarpa

Inoculado Testigo

V. microcarpa pilifera

Inoculado Testigo

* Valores con la misma letra no presentan diferencias significativas entre sí (Tukey, 5%)

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Tabla III. Factor de reproducción (FR) de M. Incógnita + R. reniformis e Indice de agallamiento de materiales de caricáceas. Materiales

FR

Indice Agallamiento

(Población final /

(Taylor y Sasser, 1978)

Población inicial) 2,46

3

2,35

3

1,94

3

V. goudotiana Tipo A

1,83

2

V. goudotiana Tipo B

1,29

2

C. papaya ‘Pajarera’ C. papaya ‘Red Lady’ C. papaya ‘Maradol’ - Aragua

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TABLA IV. FACTOR DE REPRODUCCIÓN (FR) DE M. INCÓGNITA RAZA 1 E ÍNDICE DE AGALLAMIENTO DE MATERIALES DE CARICACEAS. Materiales

FR

Indice Agallamiento

(Población final /

(Taylor y Sasser, 1978)

Población inicial) C. papaya ‘Sofía’ C. papaya ‘Paraguanera’ C. papaya ‘Cartagena amarilla’ C. papaya ‘Varadero’ C. papaya ‘Criolla roja’ C. papaya ‘Costa Rica’ C. papaya ‘San Felipe’ C. papaya ‘La Habana’ C. papaya Maradol - Falcón V. cauliflora

2.34

3

2.45

3

2.00

3

2,31

3

5.60

2

2.30

2

1.98

3

2.88

2

7.10

3

2.11

2

V. cundinamarcencis Las Lomas V. cundinamarcencis Trujillo V. cundinamarcencis La Azulita V. cundinamarcencis Chorotal V. cundinamarcencis La Porquera V. microcarpa microcarpa

0.56

2

0.81

2

0.98

2

2.02

3

0.88

2

0.43

2

V. microcarpa pilifera

0.81

2

8

En relación con el Factor de Reproducción en la Tabla II se presentan los valores para cada material, destacando V. Goudotiana Tipos A y B con un FR < 1 considerándose resistente, no así para C. payaya donde los tres tipos evaluados ‘Pajarera’ , ‘Red Lady’ y ‘Maradol’ permitieron la reproducción del patógeno, siendo el tipo ‘Pajarera’ la que presentó un valor más alto de 2,46 . El Indice de Agallamiento resultó para las Vasconcelleas un valor de 2, mientras que para los tres cultivares de C. papaya son superiores. No obstante en casi todos los materiales se afectaron las variables agronómicas por lo que se consideran no tolerantes. Por lo antes expuesto y en virtud de la reducción de las variables agronómicas presentadas al considerar el FR y el IA (Cook, 1974), se propone categorizar los materiales evaluados de la manera indicada en la Tabla III.

Raíces de Vasconcellea afectadas por nematodos M. incognita

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Tabla V. Reacción de los materiales ensayados a M. Incógnita y R. reniformis: Material

Reacción (Cook,1974)

Carica papaya ‘Pajarera’

Susceptible – No tolerante

Carica papapa ‘Red Lady’

Susceptible – No tolerante

Carica papaya ‘Maradol’ - Aragua

Susceptible – No tolerante

Vasconcellea goudotiana Tipo A

Susceptible – Tolerante

Vasconcellea goudotiana Tipo B

Susceptible – No tolerante

Tabla VI: Reacción de los materiales ensayados a M. incognita Material

Reacción (Cook,1974)

C. papaya ‘Sofía’ C. papaya ‘Paraguanera’ C. papaya ‘Cartagena amarilla’ C. papaya ‘Varadero’ C. papaya ‘Criolla roja’ C. papaya ‘Costa Rica’ C. papaya ‘San Felipe’ C. papaya ‘La Habana’ C. papaya Maradol - Falcón V. cauliflora V. cundinamarcencis Las Lomas V. cundinamarcencis Trujillo V. cundinamarcencis La Azulita V. cundinamarcencis Chorotal V. cundinamarcencis La Porquera V. microcarpa microcarpa V. microcarpa pilifera

Susceptible – No tolerante Susceptible - No tolerante Susceptible - No tolerante Susceptible - No tolerante Susceptible - No tolerante Susceptible - No tolerante Susceptible - No tolerante Susceptible - No tolerante Susceptible - No tolerante Susceptible – No tolerante Resistente - No tolerante Resistente - No tolerante Resistente - Tolerante Susceptible - Tolerante Resistente – No tolerante Resistente – No tolerante Resistente - Tolerante

10

HISTOPATOLOGÍA: Para cumplir con este objetivo se tomaron secciones de raíces jóvenes tanto de los tratamientos inoculación como testigo, fijadas craff III Las raíces fueron cortadas en secciones entre 0,5 y 1 cm de largo y colocadas en frascos de 8 mL. Las raíces se deshidrataron en alcohol butílico terciario (TBA) en una cadena ascendente de 50, 70, 85, 95 %, una mezcla de 75 mL de TBA y 25 mL de etanol al 98.9% y 100 % (TBA puro). Posteriormente embebidas en parafina fundida (2/3 TBA; 1/3 parafina con punto de fusión 60 °C) y llevadas a la estufa por una hora. Se trabajó la parafina con el material incluido en bloques piramidales pequeños, colocándose en tacos de madera para facilitar los cortes con el micrótomo, y así facilitar la obtención de delgadas secciones de parafina adecuadas para la tinción, y observación microscópica. Las muestras de tejido de todos los materiales inoculados y testigos, fueron cortadas con el micrótomo de rotación en secciones de 15 µm de grosor y coloreadas con la tinción cuádruple de Triarch modificada por Suárez (Suárez, et al., 1993). Se usó como medio de montaje el bálsamo de Canadá. Las láminas fueron identificadas, seleccionadas y ordenadas para su posterior observación al microscopio compuesto. RESULTADOS: En los cortes histológicos realizados a los materiales inoculados con Meloidogyne incógnita Raza 1, se evidencia el desarrollo normal de células multinucledas (Fig. 1, A, B y C) sin distorsión de los haces vasculares, necrosis alrededor de las células modificas (Fig. 1, A y C) y del cuerpo del nematodo (Fig.1, A y B) También se observa la presencia de masas de huevos. (Fig. 1, C) Aquellos que fueron inoculados además con Rotylenchulus reniformis, presenta las modificaciones típicas inducidas por este género de nematodos como es el denominado sincitio, es decir una alteración en el tamaño de las células del periciclo, las cuales muestran citoplasma denso y granular (Fig. 1 D). La presencia de necrosis, puede ser una reacción de resistencia de la planta si el factor de reproducción es < 1. Caso contrario puede deberse al ataque del nematodo por daño directo del mismo. Las alteraciones inducidas por estos nematodos, en todo los casos alteran la fisiología del a de la planta, además de impedir el paso normal de nutrientes del suelo hacia la misma. Estos estudios permiten evidenciar todos los efectos que causa el ataque de estos nematodos a las caricáceas Sobre la base de los resultados obtenidos en este estudio y bajo las condiciones ya expuestas, se considera que algunos materiales de Vasconcellea presentan algunas características que les permiten reaccionar como resistentes a una población mixta de M. incognita raza 1 y Rotylenchulus reniformis. Todos los materiales comerciales de C. papaya, presentaron alteraciones histológicas, disminuyeron alguna de sus variables agronómicas y presentaron susceptibilidad a los nematodos, por lo que los estudios de mejoramiento en la búsqueda de una papaya comercial resistente a los mismos, podría incluir algunos materiales silvestres

11

Actividades de difusión: 1. Rosales, L.C. y Suárez H., Z. 2001. Reacción de cinco materiales de papaya, al ataque del nematodo Meloidogyne incógnita. Nematología Mediterránea 29: 177-180. 2. Rosales, L.C. y Suárez H., Z. 2001. Importancia de nematodos asociados al lechoso y distribución geográfica en Venezuela. Fitopatología Venezolana 14: 21-23. 3. Rosales, L.C., Suárez H. Z y Gómez, M.A. 2002. Histological alterations in Caricaceae rotos caused by a mixed population of Meloidogyne incógnita Race 1 and Rotylenchulus reniformis. International Journal of Foundamental and applied Nematological Research. 4(2): 274. 4. Rosales, L.C., Suárez H., Z. y Gómez, M.A. 2003. Evaluación de materiales comerciales y silvestres de Caricáceas a la acción de Meloidogyne incógnita Raza 1. Fitopatología Venezolana (en Revisión). 5. Rosales, L.C., Suárez H., Z. y Gómez, M.A. 2003. Alteraciones histológicas de materiales comerciales y silvestres de Caricáceas afectadas por Meloidogyne incógnita Raza 1. Fitopatología Venezolana (en Revisión).

12

Ne N Ne

CM

A

B Si

CM

P

MH

C

N

D

Fig. 1. Corte transversal de raíces de Vasconcellea cundinamarcencis (A, B y C) inoculadas con M. incognita Raza 1 y de V. cauliflora (D) inoculada además con R. reniformis: Célula multinucleada (CM), Nematodo (Ne), Necrosis (N), Masa de huevos (Mh), Periciclo alterado (P), Sincitio (Si)

2.6 Estudio de la variabilidad de la bacteria Erwinia sp y selección de materiales resistentes a la bacteriosis en Lechosa (Carica papaya L.). INIA-/CENIAP

Estudio de la variabilidad de la bacteria Erwinia sp y selección de materiales resistentes a la bacteriosis en Lechosa ( Carica papaya L.) Anna Maselli1 , Asia Zambrano2 y Yolanda Guevara 1. INIA- Lab. Bacteriología1 – Biotecnología. Apdo postal 588, Fax 0058-0243-2471874-2471866, Telf. 0058-0243-2453075. Zona Universitaria – Maracay – Edo Aragua (2101) - Venezuela. E mail. [email protected]

RESUMEN La lechosa representa un cultivo de importancia económica, pero las variedades de este frutal

que están incluidas en las normas de comercialización para la exportación como

cultivares del grupo solo y los cultivares Taiwaneses, se han visto afectados severamente por bacterias del género Erwinia. Las cepas de la bacteria aisladas de las diferentes zonas del Caribe, han mostrado una alta variabilidad en las pruebas bioquímicas realizadas obteniéndose como resultado que las pudriciones bacterianas descritas en Java, Taiwán y en las Islas Marianas son causadas por cepas de Erwinia sp. con características bioquímicas muy distintas a la de las Antillas. Los estudios de las cepas de la bacteria Erwinia sp , aisladas en la

zonas de Islas Virgenes, Islas Marianas y Venezuela presentan una

combinación de características morfológicas, filológicas y bioquímicas que las distinguen de las especies de Erwinias ya conocidas. En el caso especifico de Venezuela fueron caracterizadas dos cepas de la bacteria Erwinia sp, aislada de lechosa con resultados diferentes en las pruebas realizadas. Estas diferencias presentadas en todas las zonas muestradas, han llevado a varios autores a concluir que se podría estar en presencia de una nueva especie de Erwinia que estaría afectando este frutal. El principal objetivo de este trabajo es la caracterización molecular de la bacteria Erwinia sp. Para ello, se realizó la extracción de ADN utilizando la metodología descrita por Chen y Kuo (1993). Una vez extraído y cuantificado el ADN se procedió a su amplificación según metodología descrita por Hélias et al. (1998), con oligonucleotidos específicos para Erwinia carotovora Y1(5’TTACCGGACGCC

GAGCTGTGGCGT-3’)

y

Y2(5’-

CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3’), seleccionados del gen de la pectato liasa según Darrasse et al (1994). Se realizó la amplificación de PCR específico de 8 ADN de las

cepas de la bacteria Erwinia sp. procedentes de la zona del Caribe y de 5 ADN de las cepas de Venezuela. Los resultados determinaron que los aislamientos St. Croix,-

Lagrange (82 y 84) aisl.1156 y aisl. 1353 de Venezuela, generaron un producto de amplificación de 9.000 pb, el cual se asocia a la especie Erwinia carotovora. El resto de los ADN no amplificaron con el primer. Esto permite a identificar los aislamientos St.

Croix,-Lagrange (82 y 84) aisl.11568 y 1353 de Venezuela como pertenecientes a la especie Erwinia carotovora.

Asì mismo, se puede señalar la amplificación de un

producto de aproximadamente 11.000 pb en los aislamientos 1179 y 1496 de Venezuela, lo cual puede relacionarse también con la especie E. carotovora pero un patovar o una raza diferente. El segundo objetivo de esta investigación fue la evaluación de la reacción de algunos genotipos y variedades comerciales ante la bacteria Erwinia sp. Se utilizaron 10 plantas de los siguientes materiales:.Genotipos: Maradol, Pajarera, Vasconcellea goudotiana tipo A y tipo B y V. Cauliflora y las Variedades comerciales fueron;

Cartagena amarilla ( San

Felipe), Varadero, Costa Rica , Criolla redonda, Paraguanera amarilla, y la var Solo utilizado como testigo susceptible. A los 45 días de edad las plántulas fueron inoculadas con la suspensión bacteriana del aisl 1497 de la bacteria

Erwinia sp. con una

concentracción de 10 8 ufc/ml, y se realizó produciendo heridas en la unión del pecíolo con el tallo con jeringa hipodérmica y heridas en las hojas. Las plantas inoculadas se colocaron en cámara humeda por 48 horas. El modelo estadístico utilizado fue completamente aleatorizado, se utilizo la var Solo como testigo susceptible y .se utilizo una escala arbitraria para la evaluación de la reacción de la enfermedad. En el cuadro 6 nos muestra como todas los materiales comerciales que fueron evaluados son susceptibles en menor y mayor grado a esta enfermedad, en este punto la var. Cartagena amarilla y var Costa Rica tuvieron un comportamiento tolerante, sin embargo, se requiere de un seguimiento mas detallado y en el campo del comportamiento de estas variedades. El genotipo Pajarera que es un material local también resulto susceptible, pero se observo que los genotipos Vasconcellea goudotiana (tipo A y Tipo B) y V. Cauliflora, son resistentes.

.INTRODUCCIÓN

El cultivo de este frutal es de gran importancia económica en los trópicos ya que muestra ventajas interesantes en el marco de la diversificación de frutales en las Antillas, debido a que presenta una fuente de demanda en los mercados locales y de exportación, rendimientos elevados, rusticidad etc. A pesar, de sus bondades, el cultivo de variedades de papaya que corresponde a las normas de comercialización para la exportación como cultivares del grupo solo y los cultivares Taiwaneses, se han visto afectados severamente por bacterias del género Erwinia. La enfermedad se encuentra distribuida en los que corresponde al arco antillano hasta Venezuela. Se han señalado desde las islas vírgenes hasta Venezuela, y 79 cepas de la bacterias han sido aisladas de las zonas mencionadas. Por otra parte, la enfermedad nunca ha sido observada en Barbados , ni en las antillas mayores al norte de las islas vírgenes. En Venezuela se ha venido presentando la enfermedad de origen bacteriano en lechosa, siendo considerada una de las mas importantes después de las infecciones virales. Se encuentra ampliamente distribuida en las zonas productores. Esta enfermedad presenta una gran variedad de síntomas entre los cuales se tienen cancros acuosos , de consistencia dura, en casos avanzados, coloración grisácea o negra , que se pueden localizar en cualquier parte del tallo, en la axilas foliares y/o ápices de la planta. Defoliaciones, marchíteces, manchas angulares oscuras, grasientas en las hojas, necrosis de las nervaduras y manchas acuosas ovales en los pecíolos , varios trabajos recientes han demostrado una gran variabilidad en las cepas bacterianas asociadas a esta enfermedad. Las pudriciones bacterianas descritas en Java, Taiwán y en las islas marianas son causadas por cepas de Erwinia sp. con características bioquímicas muy distintas de las antillas.

BREVE RESEÑA DE LA ENFERMEDAD El organismo causal de la primera aparición de la enfermedad en lechosero en el mundo fue realizado por VON RANDT, citado por FROSSARD el al, TRUJILLO y SHIROTH y WEBB en 1931, y fue identificado como Bacillus papayae Rant. Más tarde la bacteria fue reubicada dentro del género Erwinia por MAGROU en 1937. la enfermedad fue descrita como un declinio de la planta, en donde la infección ocurría en las hojas, pecíolo, tallos y muerte del ápice de la planta. En las antillas francesas, PRIOR et al, cita el agente causal como Erwinia sp., indicando que las características bioquímicas y fisiológicas de la bacteria no permiten su ubicación en los grupos amylovora, herbicola y carotovora. FROSSARD et al. identificó el agente causal como Erwinia sp. , probablemente del grupo amylovora. Los autores sugieren que se realicen los estudios serologicos y de homología de ADN, con cepas de diversas zonas geográficas para determinar si se trata de una nueva especie. TRUJILLO y SCHROTH en las islas marianas del norte describieron dos tipos de bacterias: •

Decline (Cepa D)

•

Mushy canker (cepa MC)

Cepa D se asemeja a E. chrysanthemi y la cepa MC causado por una bacteria con mayor semejanza a E. carotovora. Sin embargo, ninguna

de las dos cepas presentaba las

características de una especie definida de Erwinia, por lo que no se podía utilizar el término “patovar.” WEBB, describió en las Islas Vírgenes una marchitez en lechosero ocasionada por una bacteria del genero Erwinia que carece de flagelos y no es pectolítica, también sugirió estudios de homología de ADN para su ubicación taxonómica.

LAPEYRE, ET AL, contribuyeron al estudio de esta enfermedad en la región del Caribe, incluyendo selección masal ante la reacción de genotipos de tipo local para el mejoramiento y obtención de materiales resistentes o tolerantes a Erwinia. Los autores realizaron un diagnóstico fitosanitario en la región del Caribe y los aislamientos fueron ubicados en una colección de cepas de Erwinia aisladas en papaya siendo la mas representativa del área de distribución de la enfermedad. Las cepas fueron caracterizadas mediante pruebas bioquímicas, fisicoquímicas, fisiológicas e hibridación del ADN.

Cuadro 1:Características Morfológicas, Bioquímicas y Fisiológicas de Erwinia sp. en Carica Papaya L. Característica s

Islas

Islas

Vírgene Marianas s

Crec.

Venezuel a MC

D

E.am E.chrys yl.

.

E.mallot E.carot. E.cyp ri.

+

d

d

+

d

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Crec. 36oC

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+

+

-

+

-

+

+

Presencia de

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+

-

+

+

+

+

+

+

-

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+

+

-

+

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-

+

+

+

-

+

-

+

-

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+

+

-

+

+

-

+

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-

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+

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+

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-

-

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+

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-

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+

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+

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-

+

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-

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-

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-

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-

+

+

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nd

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+

+

+

+

-

Prod. H2S

nd

nd

-

-

+

Citrato

+

nd

+

Prod. Levan

-

nd

-

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-

nd

-

nd

nd

-

+

+

-

nd

nd

Anaerobico

Flagelos Liquef. Gelatina Degra. Pectato

Nacl -

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+ +

-

Almidon Hidrol.

+

Caseina Fenililamina

-

-

-

-

Los estudios presentados en el Cuadro 1, de las cepas de la bacteria Erwinia sp , aisladas en la zonas de Islas Virgenes, Islas Marianas y Venezuela presentan una combinación de características morfológicas, filológicas y bioquímicas que las distinguen de las especies de Erwinias ya conocidas. En el caso especifico de Venezuela fueron caracterizadas dos cepas de la bacteria Erwinia sp, aislada de lechosa con resultados diferentes en las pruebas realizadas. Las cepas fueron identificadas pertenecientes al género Erwinia sp. , una del tipo Musky canker (MC) siendo caracterizada por estudios de ácidos grasos similar a E. carotovora y la otra como decline (D) similar a E. chrysanthemi. Estos resultados con los aislamientos venezolanos reflejan similitud con los señalados por Trujillo y Schroth en las Islas Marianas del Norte, en donde dos cepas de la bacteria Erwinia sp. la que ocasiona el decline causado por una bacteria que sus características la acercan a E.chrysanthemi y el Musky canker con mayor semejanza a E. carotovora. En las Islas Vírgenes la sintomatología presentada es característica de Musky canker y la bacteria carece de flagelos, esto la hace muy similar a MC de los aislamientos Venezolanos. Sin embargo, no podemos establecer ningún resultado definitivo de la identificación correcta de la especie, mediante el uso de las técnicas rutinarias de bacteriología, ya las cepas de la bacteria Erwinia sp. aisladas de las zonas mencionadas difieren entre si en alguna características que es relevante para poder ser ubicada en una especie dentro de la Taxonomia de las Erwinias. Estas diferencias han llevado a varios autores a concluir que se podría estar en presencia de una nueva especie de Erwinia que estaría afectando este frutal.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Frossard, P., R. Hugon and C.H. Verniere.1995 Un Deperissement du papyer aux Antilles francaise associe a un Erwinia sp. du groupe amylovora. Fruist. 40(9) 583-595. Guevara , Y. A. Rondon, A. Maselli, F. Salcedo y J. Betancourt.1993. Marchitez bacteriana del lechosero Carica papaya L. en Venezuela. Agronomia Tropical. vol 43 , nos 3-4, pp107-116. Soto , M. 1994. Identificación y estudio de algunos aspectos >epidemiologicos de las bacterias que afectan al lechosero ( Carica papaya L..). Trabajo de grado presentado para optar al titulo de Magíster scientiarum en Agronomia. UCV. Postgrado en Agronomia. Venezuela. Trujillo ,E. E and Schroth; M.,N: 1982. Two bacterial diseases of papaya tress caused by Erwinia species in the Northern Mariana Islands. Plant Diseases. 66: 116-120. Von Rant, a. 1931. Ubereine bakterienkrankeheit bei dem melonenbaume (Carica papaya l.) auf Java. Zentralbl. bakteriol. Parasitenkd: 84:481-487. WEBB ; R.R. 1983. Variations in response of 24 papaya varieties infected with bacterial canker( abstr.) Phytopathology 73: 811.

Objetivo Principal de la Investigación: ESTUDIOS DE LA VARIABILIDAD Y CARACTERIZACIÖN MOLECULAR DE LA BACTERIA ERWINIA sp. EN LA REGIÓN DEL CARIBE.

Recolección de las cepas de Erwinia sp. en la Región del Caribe en Carica papaya LUC DE LAPEYRE , et al. realizaron una campaña de visitas a las zonas del Caribe afectadas por la enfermedad bacteriana, este trabajo se efectuó en cooperación con organismos interesados en esclarecer la problemática de la región. El diagnóstico permitió la recolección de las diferentes cepas de la bacteria Erwinia sp. en el Arco Antillano incluyendo Venezuela. Esta información se presenta en el siguiente cuadro:

Cuadro 2: Recolección de cepas de la bacteria Erwinia sp. en Carica papaya L. en la región del Caribe Procedencia

Año de recolección

Recolectores

No de Aislamientos recolectados

Jamaica

1994

L. de Lapeyre

0

Republica Dominicana

1993

L. de Lapeyre

0

St. Croix

1995

L. de Lapeyre

3

St Thomas

1995

L. de Lapeyre

15

Guadalupe

1993

29

Dominique

1995

L. de Lapeyre Ph. Prior M. Beramis A. Darasse

Martinique

1995

L. de Lapeyre

21

Ste. Lucie

1994

L. de Lapeyre

3

St. Vincent

1994

L. de Lapeyre

27

Granada

1994

L. de Lapeyre

15

Barbados

1994

L. de Lapeyre

0

Trinidad

1995

A.Darasse

6

Venezuela

1996

L. de Lapeyre

1

13

En el CIRAD-FLHOR se encuentran depositadas las cepas de la bacteria Erwinia sp. de las siguientes regiones: Jamaica, Republica Dominicana, St. Thomas, Guadalupe, Martinica, St. Vincent, Granada , Barbados, Trinidad, y Venezuela. En Jamaica, Republica Dominicana y Barabados no presentaron la enfermedad. Las cepas que fueron recolectadas se ubicaron en la estación de Neufchateau en el CIRADFLHOR, en Guadalupe. Cada cepa de la colección fue identificada con los siguientes datos: número dentro de la colección, número de aislamiento y procedencia. Las cepas fueron caracterizadas bioquimicamente para observar su comportamiento a la diferentes pruebas y establecer semejanzas o diferencias entre las mismas ( Luc de lapeyre,), Cuadro 3 y las cepas venezolanas fueron caracterizadas por Y.Guevara, A. Maselli y Soto, M. Cuadro 4. Las cepas mostraron una alta variabilidad en las pruebas bioquímicas realizadas, y se tomo como criterio agruparlas de manera de observar cuales presentaban el mismo comportamiento bioquímico.

Cuadro 3. Características Bioquímicas realizadas a las cepas de Erwinia sp. seleccionadas de la colección del CIRAD-FHLOR para el estudio molecular. C

Su La ma

a.

m

D. So c.S

e

t

g

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srs

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-

-

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-

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+

-

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+

-

-

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+

-

-

+

-

+

+

-

-

+

-

-

-

-

+

+

-

-

+

+

-

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+

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-

+

-

+

+

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-

+

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-

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+

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-

-

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-

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-

-

-

-

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-

-

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+

-

-

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-

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-

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+

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+

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-

-

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-

-

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+

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-

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+

-

-

-

-

-

+

-

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-

-

-

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-

-

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-

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+

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-

-

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-

-

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-

-

-

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-

-

-

-

-

+

-

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-

-

-

-

-

-

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-

-

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+

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-

-

-

-

Sut. Sutton inu: inule man: manitol Lec: Lecitine Mal:malonate raf n.cNaCl5% tartrate. Lactosa Cas: caseina

Dt D(-)

ind: indol Agl:Alphamet. Glucoside ADH Moller Mel: melibiose D ab: D(-) Arabinosa D.a: D(+) arabitol Sor. Sorbitol C,S citatro de Simmons

Cuadro 4. Características Bioquímicas y Fisiológicas de las cepas Venezolanas seleccionadas para el estudio molecular. Características

Crec.

Venezuela Aisl 1353 Aisl 1182 MC D d +

E.amyl.

E.chrys.

E.mallot

E.carot.

E.cypri.

d

+

+

+

+

Anaerobico Crec. 36oC

+

+

-

+

-

+

+

Presencia de

-

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

-

+

-

Degra. Pectato

+

+

-

+

-

+

-

Red. Sucrosa

-

+

+

-

+

+

-

Crec. 5% Nacl

+

+

+

-

+

+

Prod. Indol

-

v

+

-

-

-

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+

+

+

-

-

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Prod. Ureasa

-

v

-

-

-

-

-

Red. Nitratos

-

v

-

+

-

+

+

+

+

+

+

-

-

-

+

+

+

-

Flagelos Liquef. Gelatina

-

Fosfatasa

Acetoin

+

Prod. H2S

+

Citrato

+

Prod. Levan

-

Hidrol.

-

-

Almidon Hidrol.

-

+

Caseina Fenililamina

-

-

-

-

De acuerdo a los resultados obtenidos se aprecia la variabilidad de la bacteria y por esta razón se plantea el objetivo de realizar los estudios moleculares de las cepas esclarecer la identificación de la bacteria Erwinia sp

para

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR

METODOLOGÍA Fueron seleccionadas de la colección del CIRAD-FLHOR, cepas representativas de cada zona muestreada , realizándose la extracción del ADN de cada cepa en los laboratorios del CIRAD-FLHOR en Guadalupe bajo la asesoria de la Dra Marie France Duval. Los estudios de caracterización molecular del ADN de las cepas fueron realizados en el Laboratorio de Biotecnología del INIA, Venezuela con la asesoria de la Dra. Asia Yusely Zambrano. Cepas seleccionadas para la extracción de AND en Guadalupe: St. Thomas -Bolongo (2) aisl 11562, St. Vincent-Pembroke, (8) aisl. 11528 y (11)aisl 11.531, St. Vincent- South rives (21), aisl 11543, Martinique – Riviere pilote, (47), aisl 11609, Dumanoir (64), Guadalupe-Moule (68),aisl. 10429, Guadalupe –Capesterre (76), aisl. 10431, St. Croix,Lagrange (82 y 84) aisl.11568, Ste. Lucie Rabot (85), aisl. 11526, Ste. Lucie Richefonds (86), aisl. 11525,

EXTRACCIÓN DE ADN: Se realizó la extracción de ADN utilizando la metodología descrita por Chen y Kuo (1993), la cual consiste en colectar colonias de bacterias de 24 h por centrifugación en agua destilada estéril a 12.000 rpm por 3 min. El pellet fue resuspendido y lisado en 200 µl de buffer (Tris acetato pH 7,8 40 mM, sodio acetato 20 mM, EDTA 1mM y SDS 1%) a través de agitación vigorosa. Para remover proteínas y restos celulares se adicionó 66 µl de NaCl 5 M, mezclando vigorosamente procediéndose a centrifugar a 12.000 rpm por 10 min a 4 °C. Se transfirió el sobre nadante a un ependorf y se le adicionó un volumen igual de cloroformo mezclando por inversión del tubo en forma suave. Posteriormente se centrífugo a 12.000 rpm por 3 min, transfiriendo el sobre nadante a otro ependorf provocando la precipitación del ADN por adición de Etanol al 100%. Se lavo el ADN por dos veces con Etanol al 70% y se resuspendió finalmente el ADN en Buffer TE. Se determino la cantidad y calidad de ADN a través de electroforesis en un gel de agarosa al 1 %.

AMPLIFICACIÓN DE ADN: Una vez extraído y cuantificado el ADN se procedió a su amplificación según metodología descrita por Hélias et al. (1998), con oligonucleotidos específicos para Erwinia carotovora Y1(5’-TTACCGGACGCC

GAGCTGTGGCGT-3’)

y

Y2(5’-

CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3’), seleccionados del gen de la pectato liasa según Darrasse et al (1994), en una mezcla de reacción de 25 µl de volumen final constituida por 2,5 µl de Buffer B 10X, 1,5 mM de MgCl2, 0,1 mM de cada uno de los dNTPs (A, C, G y. T), 50 pM de cada uno de los oligonucleotidos, 1 U de Taq ADN polimerasa y 50 ng de ADN. La amplificación fue realizada en un Termociclador MJ Research PTC 200, empleando un ciclo de de-naturalización inicial a 94 ºC por 5 min, seguido de 35 ciclos de amplificación con un segmento de de naturalización a 94 ºC por 30 s, un segmento de alineamiento a 65 ºC por 30 s, y uno de elongación a 72 ºC por 45 s. La separación de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa al 1,5% corridos por 2 h a 80 voltios y visualizados con bromuro de etidio bajo luz UV. Para el análisis de los resultados se procedió a la cuantificación de los productos de PCR detectados para cada caso a través de la asociación de la movilidad relativa con su peso molecular en pares de bases por comparación con el marcador de peso (ADN del fago λ digerido con Hind III).

RESULTADOS

La metodología de extracción de ADN descrita es rápida, sencilla y permite la obtención de ADN de buena calidad y cantidad para PCR, aproximadamente 100 ng/µl. Los resultados determinaron que los aislamientos St. Croix,-Lagrange (82 y 84) aisl.1156 y aisl. 1353 de Venezuela, generaron un producto de amplificación de 9.000 pb, el cual se asocia a la especie Erwinia carotovora. El resto de los ADN no amplificaron con el

primer. Esto permite a identificar los aislamientos St. Croix,-

Lagrange (82 y 84) aisl.11568 y 1353 de Venezuela como pertenecientes a la especie Erwinia carotovora. Asì mismo, se puede señalar la amplificación de un producto

de aproximadamente 11.000 pb en los aislamientos 1179 y 1496 de Venezuela, lo cual puede relacionarse también con la especie E. carotovora pero un patovar o una raza diferente. Los resultados se muestran a continuación en la figura 1 donde se observan los polimorfismos en los productos de amplificación obtenidos con los oligonucleotidos específicos para Erwinia carotovora Y1 y Y2.

Figura 1.

Productos de Amplificación de PCR específica para los ADN de las cepas de la bacteria Erwinia sp.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Chen, W.P., T.T. Kuo. 1993. A simple and rapid method for the preparation of gramnegative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21(9):2260. Darrasse, A., A. Kotoujansky, Y. Bertheau. 1994. Isolation by genomic subtraction of DNA probes specific for Erwinia carotovora subsp atroseptica. Appl. Environ Microbiol. 60:298-306. Hélias, V., A.C. Le Roux, Y. Bertheau, D. Andrivon, J.P. Gauther, B. Jouan. 1998. Characterisation of Erwinia Carotovora Subspecies and detection of Erwinia Carotovora subsp. Atroseptica in potato plants, soil and wateer extracts with PCR based methods. Eur J. Plant Path. 104:685-699.

EVALUACIÓN DE REACCIÓN DE GENOTIPOS Y VARIEDADES DE CARICA PAPAYA

PARA

LA

SELECCIÓN

DE

MATERIALES

RESISTENTE

O

TOLERANTES A LA BACTERIA ERWINIA SP. La selección de materiales que presenten una respuesta de resistencia o tolerancia y que además reúna las características deseables para los mercados nacionales e internacionales a esta enfermedad representa un gran logro, debido a que la bacteriosis en lechosa ocasiona grandes pérdidas y en muchos países del Caribe han tenido que eliminar este frutal ya que es imposible su cultivo. Trabajos previo de Webb, reporta cierta resistencias en cultivares silvestres de la zona del Caribe, sin embargo cuando son probados con inoculaciones artificiales han resultado susceptibles , caso Guadalupe, (Prior). La región del Caribe es considerad un centro secundario de diversificación de la lechosa y es frecuente el cruzamiento natural entre poblaciones silvestres. El segundo objetivo de esta investigación fue la evaluación de la reacción de algunos genotipos y variedades comerciales ante la bacteria Erwinia sp.

METODOLOGÍA El ensayo fue realizado en los invernaderos del Edf. 02 Protección Vegetal INIA-CENIAP ( 450msnm) con una temperatura promedio de 32oC. Los genotipos evaluados fueron Maradol, Pajarera, Vasconcellea goudotiana tipo A y tipo B y V. Cauliflora y las Variedades comerciales fueron; Cartagena amarilla ( San Felipe), Varadero, Costa Rica , Criolla redonda, Paraguanera amarilla, y la var Solo utilizado como testigo susceptible. Los aislamientos bacterianos para la inoculación han sido obtenidos

de lechosa con

síntomas de cancro bacteriano, provenientes de Valle Guanape –Edo Monagas ( Asil. 1497). La patogenicidad de la cepa fue evaluada en plántulas de la var. Solo. Las semillas de los materiales mencionados se colocaron a germinar en potes de plástico con sustrato enriquecido estéril. Se utilizaron 10 plantas por cada material a evaluar. A los 45 días de edad las plántulas fueron inoculadas con la suspensión bacteriana del aisl 1497

de la bacteria Erwinia sp. La concentración utilizada para la inoculación fue de 10

8

ufc/ml, y se realizó produciendo heridas en la unión del pecíolo con el tallo con jeringa hipodérmica y heridas en las hojas. Una vez inoculadas las plantas se colocaron en cámara húmeda durante 48 horas. El modelo estadístico utilizado fue completamente aleatorizado, se utilizo la var Solo como testigo susceptible y un testigo por cada material evaluado, inoculado con agua destilada estéril. Se utilizo una escala arbitraria para realizar la evaluación de la reacción de la enfermedad, en donde se utilizaron criterios de evaluación y grados de severidad de los síntomas. Las plantas fueron evaluadas a partir de la aparición de los primeros síntomas hasta 6 semanas.

ESCALA DE EVALUACIÓN DE LOS SÍNTOMAS

Grado

Criterio

0

Plantas sin síntomas, desarrollo normal

1

Inicio de manchas aceitosas en punto de inoculación, en tallo o pecíolo, hoja o ápice.

2

Avance de manchas aceitosas, prolongación del tallo o pecíolo, marchitamiento de hoja o ápice.

3

Inicio de pudrición de los tejidos inoculados

4

Marchitamiento de la plantas, muerte del ápice y del pecíolo.

RESULTADOS De 4 a 5 días después de la inoculación se comienzan a observar los síntomas de la enfermedad en los materiales que son susceptibles. Primeramente

aparecen manchas

acuosas en el punto de inoculación posteriormente los síntomas se incrementan en tamaño y comienzan también ha desarrollarse los síntomas foliares, y la diseminación de manchas grasientas en el tallo iniciándose en el punto de inoculación. El alto grado de degradación de los tejidos en los puntos de inoculación provoca una marchitez de las plantas y su muerte, en algunos casos ( var. Solo).

Cuadro 6. Evaluación de la Reacción de materiales a la bacteria Erwinia sp. Materiales Maradol Pajarera

Grado de la enfermedad 4 3

Plantas con síntomas 8/10 8/10

V. goudotiana A V. goudotiana B V. cauliflora Cartagena amarilla

0 0 0 2

0/10 0/!0 0/10 3/10

Varadero

3

5/10

Costa Rica

1

2/10

Criolla redonda

3

7/!0

Paraguanera amarilla

3

6/10

Solo (T susceptible)

4

10/!0

Testigo

0

0/!0

Observaciones Marchitez severa Muerte del ápice y pudrición parcial del tallo Sin síntomas Sin síntomas Sin síntomas Manchas aceitosas punto inoculación Muerte del ápice y manchas aceitosas en el tallo Manchas pequeñas aceitosas en el tallo Muerte del ápice y Pudrición parcial del tallo Muerte del ápice y manchas aceitosas en el tallo Marchitez severa, pudrición del tallo y muerte de ápice Sin síntomas

En el cuadro 6 nos muestra como todas los materiales comerciales que fueron evaluados son susceptibles en menor y mayor grado a esta enfermedad, en este punto la var. Cartagena amarilla y var Costa Rica tuvieron un comportamiento tolerante, sin embargo, se requiere de un seguimiento mas detallado y en el campo del comportamiento de estas variedades. El genotipo Pajarera que es un material local también resulto susceptible, pero se observo que los genotipos Vasconcellea goudotiana (tipo A y Tipo B) y V. Cauliflora resultaron inmunes a la enfermedad , esto coincide, con los trabajos de Luc de Lapeyre et al, en el CIRAD-FLHOR. Esta investigación permite evidenciar que la gran mayoría de las variedades que son comerciales presentan una alta susceptibilidad a la enfermedad. Este trabajo fue realizado con una cepa de la bacteria Erwinia sp, la descrita como Musky canker, se requieren seguir la evaluación de genotipos con varias cepas de la bacteria para evidenciar posibles fuentes de resistencia que sean incluidos en los programas de mejoramientos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Frossard, P. R. Verniere, and C. Hugon. 1985. Un deperissement bacterien de papayer aux Antilles francaises associe a un Erwinia sp. do groupe amylovora. Fruist 40 (9): 583-593 Prior P., M. Beramis, M. Th. Rousseau. 1985. Le deperissement bacterien de papayer aux Antillees francaises. Revue d´agronomie. No 10 . p: 877-885. Webb, R.R. 1985. Epidemiology and control of bacterial canker of papaya caused by an Erwinia sp. on St Croix, U.S. Virgin Islands. Plant Disease, 69(4):305-309 WEBB ; R.R. 1983. Variations in response of 24 papaya varieties infected with bacterial canker( Abstr.) Phytopathology 73: 811. De Lapeyre L. and L.P. Lyannaz. 1996. Evidence for Resistance to Bacterial Canker in Local Guadaloupe Populations of Carica papaya. Abstracts and News. Pp 5-6

ACTIVIDADES REALIZADAS EN EL MARCO DE LA INVESTIGACIÓN Tesis de Grado titulado” Evaluación de materiales Resistentes a la marchitez bacteriana en Lechosa ( Carica papaya L.) realizada por Br. Juan Cardozo para optar al titulo de Ingeniero Agrónomo. Febrero del 2002. Presentación del trabajo: “Reacción de genotipos de caricaceae ante la bacteriosis de cancro producida por Erwinia sp”. XVII congreso de Fitopatología, Maracay 14-16 de Noviembre del 2001. Presentación del Trabajo: “ Control “in vitro” de bacterias fitopatogenas.” (Control químico de la bacteriosis de cancro en lechosa). I Simposio Internacional sobre vigilancia Fitosanitaria y su relación con la protección al entorno. Palacio de Convenciones La Habana – Cuba. 28 de octubre al 1 de noviembre del 2002. Publicación científica: “ Evaluación de la reacción de materiales de lechosa a la bacteria Erwinia sp.” Fitopatologia Mexicana ( en Revisión) Limitaciones de la investigación •

Pasantia en Guadalupe El personal de CIRAD-FHLOR, no tenia un protocolo de la extracción de ADN adecuado para las bacterias. El tiempo bajo el asesoramiento de la Dra. María Franer Duval, fue de 2 semanas, la tercera semana no hubo asesoria (El tiempo apropiado fue empleado en buscar protocolo de extracción) • El traslado de los ADN a Venezuela afecto la calidad del mismo, por lo tanto no se pudo recuperar el ADN de todas las cepas de Erwinia traidas. No me informaron de cómo era el mecanismo de transporte de ADN. • La literatura consultada tanto por la Dra. Asia Zambrano y mi persona, no informa sobre el primer de E. Chysanthemi por lo tanto las cepas que no amplificaron a E. Carotovora no pudieron ser caracterizadas.

2.7 Caracterización molecular de aislamientos del virus PRSV (papaya Ringspot) en Venezuela; informe final de actividades. IVIC/MCT

Dra. Edgloris E. Marys S Laboratorio de Biotecnología y Virología Vegetal Centro de Microbiología y Biología Celular

Apartado 21827

Caracas 1020-A, VENEZUELA. Teléfono Directo: +58-0212 504.11.89 504-1500 FAX: +58-2 504.1372

APROVECHAMIENTO DE LOS RECURSOS GENETICOS DE LAS PAPAYAS PARA SU MEJORAMIENTO Y PROMOCION

CARACTERIZACION MOLECULAR DE AISLAMIENTOS DEL VIRUS PRSV (PAPAYA RINGSPOT) EN VENEZUELA; INFORME FINAL DE ACTIVIDADES Investigadores Responsables: Dra. Edgloris Elena Marys Saravia Dra. Maria Luisa Izaguirre MSc. Octavio Carballo Lic. Miguel A. Sánchez Mercado

INTRODUCCION En Venezuela, la incidencia de enfermedades de origen viral ha limitado drásticamente la producción de las papayas (Carica papaya L.), obligando a los agricultores a suplantar los cultivos por otros menos tradicionales y productivos (Sánchez, 2002).

Estudios

recientes han señalado que el virus PRSV (Papaya ringspot virus) es el de mayor incidencia en los pocos cultivos de lechosa que aún prevalecen en el país (Marys y col., 2000). Estos estudios también

indican que es posible distinguir entre una gran diversidad de síntomas que se atribuyen a la infección por PRSV, lo cual implica la existencia de aislamientos del virus más o menos severos y/o la existencia de variedades de papaya

más o menos susceptibles a dichos

aislamientos (Marys y col., 2000). Para lograr la obtención de plantas resistentes a la infección viral, es preciso conocer las diferencias a nivel molecular de los diferentes aislamientos del virus que pudieran incidir sobre el cultivo. Por esta razón, y a fin de evaluar la variabilidad genética dentro de la población viral, el presente trabajo de investigación tiene como objetivo la caracterización molecular de diferentes aislamientos de PRSV colectados en Venezuela. MATERIALES Y METODOS 1) Area de estudio y toma de muestras:

Material vegetal de C.

papaya fue colectado en distintas regiones del país con reconocida incidencia de PRSV (Fig.1). Dicho material consistió principalmente en hojas jóvenes con síntomas (clorosis, filodia marcada, presencia de mosaico), tomadas separadamente dentro de las regiones visitadas, mantenidas a 4°C en bolsas plásticas debidamente identificadas hasta su posterior almacenamiento en el lab. a -20°C.

Fig.1. Puntos de muestreo a nivel nacional de las regiones con reconocida presencia de PRSV: A) Región Zuliana: 1) Estación Agroexperimental CENZUFRU (CZF), San Rafael del Moján, Municipio Mara; 2) Caserío "Carmen Hernández" (CmH), Noreste del Municipio La Concepción; 3)Sector "Palito Blanco" (PIB), Norte del Municipio La Concepción; 4) Caserío "Los Tres Locos" (3Lc), Sector El Carmelo, Municipio La Concepción. B) Región Central: 5)Chuao de La Costa (Ch), Estado Aragua; 6)Sector "Puerta Morocha" (PM), región limitrofe Miranda-Aragua; 7) Sector La Ceiba (LCb), región Tuy, Edo Miranda. C) Región Oriental (Estado Sucre): 10) Sector Guaraguao (Gua), región limítrofe Cumaná-Carupano, Municipio Andrés Eloy Blanco; 11) Guaca (Gca), Municipio Andrés Mata, 12) Sector "Las Peonías" (LPn), Municipio Andrés Mata; 14) Región "Punta del Lebranche" (Leb) Municipio Andrés Mata, 15) Hacienda "El Muco" (Mco), salida Este de Carúpano, Municipio Bermúdez.

2)Caracterización de las partículas virales. 2.1) Microscopía electrónica. Extractos de hojas de C. papaya sintomáticas colectadas en el campo, fueron absorbidas sobre rejillas previamente ionizadas y cubiertas con una capa de colodión y carbón durante tres minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente, las

rejillas se tiñeron negativamente con 2% fototungstato de sodio, pH 6.8, para su observación en un microscopio electrónico Phillips CM-10. El promedio de la longitud y el diámetro de las partículas virales se determinó por comparación con estándares internos del microscopio. 2.2) Serología.

Con la finalidad de detectar el virus PRSV en

muestras de hojas infectadas, se utilizó un ensayo inmunoenzimático

del tipo DAS-ELISA (Clark y Adams, 1997). Para ello, se utilizaron placas de microtitulación Inmulon Ι (Dynatech Laboratories Inc.). Estas se sensibilizaron durante 12 h a 4°C con un anticuerpo policlonal comercial dirigido contra la cápside proteica del PRSV (PVAS-520; American Type Culture Collection; ATTC, Maryland, USA), diluído 1:1000 en tampón 0.05 mol/L carbonato-bicarbonato pH 9.5. Después de lavar con Tween 20 al 0.1% en tampón fosfato salino pH 7.4 (PBST), las placas se cubrieron con los extractos de plantas. Para preparar los antígenos, 0.1 g de hojas se maceraron en tubos de microcentrífuga con 1 ml de 0.1 mol/L en PBS-T. Diluciones de estos extractos foliares en tampón carbonato se agregaron a las placas, absorbiéndose a los pozos alícuotas de 100 µl de estas diluciones, dejándose incubar a durante 2 h a 37°C. Posteriormente, los pozos de las placas se lavaron con PBS-T.

Para bloquear los sitios no

reactivos, las placas se cubrieron con 100 µl/pozo de una solución de BSA en PBS, seguido de incubación por 30 min a 37°C. A continuación, las placas se lavaron nuevamente con PBS-T y se cubrieron con alícuotas de 100 µl de la preparación de IgGs conjugadas a fosfatasa alcalina en tampón PBS. Luego de 60 min de incubación a 37°C, las placas se lavaron por tres veces con PBS-T, agregándose posteriormente 100 µl/pozo del substrato (1 mmol/L pnitrofenilfosfato, 1 mM CaCL2 en 50 mmol/L tampón dietanolamina pH 9.5), dejándose incubar a 37°C durante 60 min. La reacción colorimétrica se detuvo mediante la adición de 50 µl/pozo de 0.5 N NaOH, y se cuantificó en un espectrofotómetro Multiskan MK ΙΙ (Labsystem Inc, Vancouver, Ca), utilizándo un filtro de 460 nm de

longitud de onda. Como controles negativos, se incluyeron en el ensayo extractos de hojas de lechosa libres de virus crecidas en el invernadero; mientras que los controles positivos consistieron en extractos de hojas infectadas con PRSV (colección del lab. de Biotecnología y Virología Vegetal, IVIC). Cada muestra se agregó por triplicado, y se tomaron como valores positivos, aquellos cuyo promedio de densidad óptica fue tres veces mayor que el control negativo en cada caso (Sutula y col., 1986).

3) Purificación, transcripción reversa y amplificación de ácidos nucleicos virales.

Se extrajo RNA total a partir de cada muestra

empleando el producto TRIzol Reagent, según las instrucciones de la casa comercial (Life Technologies, USA, 1999). La síntesis de ADN complementario (ADNc) se desarrolló empleándo un kit comercial que utiliza una retrotranscriptasa inversa y hexámeros al azar (SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR, (Life Technologies, USA). Aproximadamente 50 ng de ADNc se usaron como templado en una reacción de amplificación (PCR), utilizándo como cebadores o "primers"

los

oligos

CCCGAATTACTAGTGTACCATGAA-3')

PRSVcp9196F

(5'-

y

(5'-

PRSVcp10152R

ATAAGGTGAAACAGGGTCGAG-3'), diseñados en base a secuencias de la región de cápside viral

obtenidas en la base de datos

(GENEBANK). La reacción de PCR se realizó en un termoregulador PersonalCicler

(Eppendorf),

según

las

siguientes

condiciones:

desnaturalización inicial a 94°C/5 min, 45 ciclos de 94°C/1min, 55°C/1 min y 72°C por 3 min; y una elongación final a 55°C por 3 min.

Alícuotas de 2 µl de cada reacción fueron analizadas mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%.

4) Análisis de conformaciones polimórficas de cadena simple (SSCP).

A fin de mejorar la resolución de los estudios con la

técnica de SSCP, los productos amplificados (>700 bp) fueron digeridos con la enzima EcoRI (Gibco), la cual posee un sitio de corte que arroja dos fragmentos de 738 y 185 (Fig.2). La adecuada digestión de los productos se verificó mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%. Una vez digeridos, los productos de PCR fueron analizados mediante la técnica de SSCP. Para ello, se mezclaron 2 µl de las reacciones de digestión con 18 µl de solución desnaturalizante (95% formamida deionizada, 20 mM EDTA y 0.5% azul de bromofenol). La mezcla se incubó a 100°C por espacio de 10 min, colocándose seguidamente en hielo durante 5 min. Esta mezcla se cargó en geles de poliacrilamida al 8%, corriéndose durante 5 horas a un campo electrico constante de 200 V/4°C. La tinción de los geles obtenidos se realizó mediante el procedimiento Fotografía Científica del IVIC. de tinción rápida en solución de nitrato de plata (Rubio y col., 1996). Los geles fueron fotografiados y digitalizados en el Servicio de Fotografía Científica del IVIC.

Fig.2) Esquema del corte enzimático con EcoRI realizado al DNA amplificado de la región CP.

3) Análisis de secuenciación. Luego del estudio de las variantes génicas obtenidas por el análisis de SSCP, se procedió a amplificar siete (7) de los puntos en cuestión (PM, StL-1, Ch-1, Ch2, LCb y Ocu3)

empleando

la

enzima

Taq

Platinum

High

Fidelity

(Life

Technologies), la cual tiene actividad correctora e introduce un muy bajo índice de errores en el proceso de amplificación. Los productos amplificados fueron purificados con el sistema PCR Purification System Concert (Life Technologies) y procesados en un secuenciador ABI PRISM 377 (Perkin-Elmer) por el servicio del Centro de Secuenciación y Análisis de Acidos Nucleicos (CeSAAN), ubicado en el Centro de Microbiología y Biología Celular (CMBC) del IVIC. Para los

análisis

filogenéticos,

las

secuencias

nucleotídicas

fueron

analizadas en base a los 500 bp centrales, que comprenden las regiones más conservadas dentro del genoma correspondiente a la cápside viral en PRSV (Bateson y col., 1994) (Fig. 3).

Este

procedimiento fue realizado tanto para las secuencias obtenidas a nivel nacional como en aquellas secuencias seleccionadas de la colección del GeneBank. Los dendogramas correspondientes se calcularon empleando el método del vecino más cercano (Saitou y

Nei., 1987), aplicando el programa DNAMAN Versión 3.2 (Lynnon Biosoft, 1997); siendo estimados con 30000 iteraciones.

Fig.3) Estrategia diseñada para el análisis filogenético de las regiones de cápside viral secuenciadas.

RESULTADOS Durante visitas realizadas a zonas productoras de lechosa localizadas en diversas áreas del país, fue posible plantas con sintomatología diversa atribuible al virus PRSV. Observaciones al miscroscopio electrónico de extractos crudos de estas plantas mostraron la presencia de partículas con forma de filamentos flexuosos de ~700 x 12 nm, típicas de los virus en el grupo Potyviridae. Las infección de las muestras colectadas con el virus PRSV se confirmó por serología, reaccionando las mismas positivamente en las pruebas de DAS-ELISA con anticuerpos específicos contra PRSV. Empleando los cebadores PRSVcp9196F y PRSVcp10152R, se amplificaron bandas de ~ 1000 pb, lo que corresponde al tamaño del gen de la cápside para PRSV. Se verificó la ausencia del producto amplificado en muestras de plantas sanas, las cuales fueron empleadas como control (Fig. 4).

Así mismo, se realizó la

amplificación del resto de los aislamientos muestreados en las distintas regiones venezolanas (Fig. 5).

Fig.4) Ensayos iniciales de PCR para la amplificación del gen de la cápside viral. 1)Planta sana; 2)PM; 3)StL-1; 4)Ch-1; 5)GuaC-2; 6)Cpb-4; 7)Ocu-3; 8)3Lc-1. MK1: Marcador de peso molecular de 100pb; Mk2: Marcador de peso molecular 1 kb.

Fig.5) Productos resultantes de la PCR obtenidos para cápside viral. 1)StL-2; 2)Ocu-1; 3)Ocu-2; 4)Ocu-4; 5)LCb; 6)Ch-1; 7)Ch-2; 8)GuaB-1; 9)Gca; 10)Cpb-3; 11)Cpb-4; 12)LPN-1; 13)Leb-1; 14)Mco-5; 15)3Lc-4; 16)3Lc-5; 17)3Lc-13; 18)CmH-5; 19)CZF-2; 20)CZF-6; 21)PIB-5. Las flechas indican el nivel del marcador a 1000pb.

En relación al análisis polimórfico de cadena simple (SSCP), de las 24 muestras estudiadas dentro de las distintas localidades indicadas, 17 presentan distintos tipos de patrones de migración para los polimorfismos formados (Fig. 6, patrones desde B hasta R); cinco de estas muestras se distribuyeron en patrones de bandeo similar entre sí, caracterizándose entre ellos dos grupos; uno conformado por tres muestras (Ocu-3; Ocu-4 y 3Lc-1; Fig. 6, columnas 2, 3 y 4) y el

otro grupo de dos muestras (CmH-5 y PIB-5 (Fig 6, columnas 22 y 23). Por otro lado destacan las muestras 3Lc-4 y 3Lc-13 (Fig. 6, columnas 5 y 24), las cuales presentaron un patrón de bandeo múltiple, indicando la presencia de variantes de PRSV en una misma planta, lo que se considera como una infección mixta en cada una de estas muestras vegetales.

Fig.6) Patrones de SSCP para los distintos aislados de la región de cápside viral de PRSV. Las letras en la base de cada columna indica los patrones similares y distintos. 1)StL-1; 2)Ocu-3; 3)Ocu-4; 4)3Lc-1; 5)3Lc-4; 6)GuaB-1; 7)CmH-2; 8)Cpb-4; 9)PM; 10)Ch-1; 11)CH-2; 12)LPn-1; 13)igual a 22; CmH-5; 14)CZF-2; 15)StL-2; 16)Ocu-1; 17)Cpb-3; 18)LCb; 19)PIB-4; 20)GuaC-2; 21)CZF-6; 23)PIB-5; 24)3Lc-13. Los asteriscos indicados en la base de (5) y (24), representan patrones de bandeos múltiples, lo que sugiere que se trata de infecciones mixtas en cada muestra implicada.

Tomando en cuenta esta población total de 23 muestras, se estima un índice de variabilidad para el genoma de cápside viral analizado de

78.26%. Este índice de variabilidad se estima tomando en cuenta la relación N. de muestras con variabilidad/N. total de muestras X 100 (Foissac y Duran-Villa, 2000). El análisis de las secuencias nucleotidicas para las siete muestras de los distintos puntos de la región central venezolana (PM, StL-1, StL2, Ch-1, Ch-2, LCb y Ocu-3), revela que existe un alto porcentaje de similitud entre las mismas (62.59%), tal como lo indica el alineamiento aplicado a dichas secuencias (Tabla I). Consecuentemente, se determina una matriz de homología que muestra una alta similitud entre los aislados regionales de Ch-2 y LCb, y estos a su vez, de PM (Tabla II). A partir de los datos aportados por el alineamiento de dichas secuencias nucleotídicas, se generó un árbol filogenético que relaciona las siete variantes regionales (Fig. 7). Consecutivamente, se seleccionó un grupo de las secuencias del GeneBank para la región de CP y se relacionaron con las secuencias obtenidas, originando el dendograma filogenético que se muestra en la Fig. 8 (ver detalle de leyendas en la tabla III). Cada dendograma presenta en la base de cada nodo los valores de elasticidad o "bootstrap" con respecto a las iteraciones aplicadas.

Tabla I. Secuencias nucleotidicas de los distintos aislados obtenidos para la región génica de cápside viral (CP).

La relación de alineamiento se obtuvo mediante la aplicación del programa DNAMAN

versión 3.2 (Lynnon BioSoft, 1997).

Tabla II. Matriz de homología para las secuencias obtenidas posterior al proceso de escisión de ambos extremos en la secuencia de CP.

Los % indicados en azul representan los mayores valores de

homología en relación al total.

Fig. 7. Dendograma filogenético para las secuencias centrales de la proteína de cápside de PRSV dentro del Territorio Nacional. Los cálculos para estimar las distancias de sustitución nucleotidica se realizaron con el método del vecino más cercano (Neighbor-joining; Saitou y Nei; 1987) con 30000 iteraciones. La leyenda de cada rama corresponde a la indicada en la Tabla III. Los valores indicados sobre cada nodo, indican el % de elasticidad o “bootstrap”.

Fig. 8. Dendograma filogenético para las secuencias centrales de la proteína de cápside de PRSV obtenida dentro del Territorio Nacional y las correspondientes a las publicadas en el GeneBank a nivel mundial. Los cálculos para estimar las distancias de sustitución nucleotídica se realizaron con el método del vecino más cercano (Neighbor-joining; Saitou y Nei; 1987) con 30000 iteraciones.

La

leyenda de cada rama corresponde a la indicada en la Tabla III. Los valores indicados sobre cada nodo, indican el % de elasticidad o “bootstrap”.

Tabla III. Referencias de los distintos aislados empleados en el análisis filogenético de las regiones procesadas de cápside viral de PRSV, biotipo P.

CONCLUSIONES 1) Análisis de polimorfismos de cadena simple (SSCP). Los datos de variabilidad que se desprenden del análisis de los patrones de SSCP (78.26%) no descartan que el ensayo detecte cambios dentro de las regiones conservadas de CP, ya que existen evidencias que indican que dentro del genoma de PRSV pueden presentarse recombinaciones entre aislamientos las cuales afectan parte de las regiones de CP, Nia y Nib (Silva-Rosales y col., 2000). Estos análisis ofrecen además la oportunidad de verificar otras posibilidades

dentro

de

estudios,

tales

como

deleciones,

recombinaciones e inserciones de regiones o infecciones mixtas en

virus (Koening y col., 1995; Rubio y col., 1996).

En esta

investigación, se ha podido verificar la presencia de infecciones cruzadas o mixtas en parte de las muestras analizadas del Estado Zulia: las correspondientes al sector "Los Tres Locos" (3Lc-4 y 3Lc13; ver Fig. 6), región El Carmelo, Municipio La Concepción. Como se mencionó en la sección anterior, dicha región se caracteriza por una alta incidencia viral en todas las plantaciones visitadas, con sintomatologías muy drásticas en las plantas, por lo que probablemente

la

presencia

de

infecciones

mixtas

en

las

plantaciones de esta región puede aumentar la severidad de la patología causada por el virus. En relación al estudio filogenético, observamos que para las regiones obtenidas, la tipología del dendograma muestra, en forma general, el alto grado se sustituciones nucleotídicas dentro de una región génica relativamente conservada (CP) (Fig. 7). En este trabajo, el aislamiento StL-1 (Santa Lucía del Tuy, Estado Miranda) se presenta como el antecesor común a las demás variantes obtenidas, en contraposición con las variantes del sector agrícola de Chuao de La Costa, Estado Aragua (Ch-2), la cual se muestra como la de menor evolución. Existe entre esta última y las variantes del sector Puerta Morocha (PM) una estrecha homología; aunque PM sea una especie con mayor número de cambios nucleotídicos, y por tanto, un origen más reciente. Sin embargo, y debido al bajo valor de elasticidad o bootstrap (7), es de suponer que estos dos antecesores son una misma variante. Así mismo, es interesante el caso de los aislados pertenecientes al sector poblado de Santa Lucía del Tuy (StL-2), el cual presenta la tasa de sustituciones más

alta de todo el dendograma, y por tanto, sea la variante más reciente dentro de la relación filogénica establecida, y que dentro de una región geográfica relativamente pequeña, coexista con la variante más antígua para toda la Región Central (StL-1). Casos similares han sido reportados por Jain y col., (1998), los cuales atribuyen el fenómeno a un discontinuo de las prácticas de labores como talas, quemas, empleo de herbicidas o combinaciones de todas, lo que puede resultar en distintos niveles de presión selectiva para el virus.

Se destaca la utilidad de emplear la técnica de SSCP como método básico para el análisis de la variabilidad en una región génica a estudiar. Esta metodología reduce los costos en el análisis de secuenciación de los productos de PCR, ya que puede discriminar variantes génicas en geles de poliacrilamida; los cuales pueden ser montados en la mayoría de los laboratorios de Virología de Plantas. Su aplicabilidad se extiende a estudios moleculares en los cuales se sospeche la presencia de infecciones mixtas, las cuales pueden ser una de las causas de la severidad de la patología correspondiente al individuo en estudio (Hall y col., 2001). Los aislados que integran una región geográfica relativamente pequeña, como es el caso de la región central del territorio nacional (Miranda y Aragua), presentan notables niveles de divergencia evolutiva entre si y respecto a los aislados comparados a nivel mundial, por lo que en estudios futuros, se hace necesario el continuar con el análisis para el resto de las regiones productoras de lechosa estableciendo un marco que comprenda la generación y

divergencia evolutiva a nivel nacional para la región de la cápside viral.

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Sutula, MM., Gillet, JM., Morrissey, SM and Ramsdell, DC (1986). Interpreting ELISA data and establishing the positive-negative threshold. Plant Disease 70, 722-726. RESUMEN El potivirus Papaya ringspot (PSRV) es el patógeno de mayor incidencia y prevalencia en el cultivo de papayas a nivel mundial. Estudios epidemiológicos en Venezuela, han mostrado que el virus es el mayor limitante de la producción nacional, la cual se ha visto severamente reducida en las ultimas décadas. El objetivo de este trabajo de investigación fue establecer un sistema de diagnostico altamente sensible como la PCR para detectar el virus en el campo, y poner a punto la técnica denominada SSCP, que permitió diferenciar entre aislamientos del virus en el pais a nivel molecular. Análisis de secuenciación de los productos de PCR arrojaron un índice de variabilidad para la región que codifica para la cápside del virus (CP) de 78.26%. La técnica de SSCP permitió reconocer la presencia de infecciones mixtas en una misma planta en la región Zuliana. Los cálculos de alineamiento de 9 secuencias correspondientes al de gen la cápside indicaron una similaridad del 62.59%. Los dendogramas filogenéticos obtenidos señalaron la presencia de nuevas variantes del virus presentes en el pais.

2.8 Obtención de híbridos interespecíficos entre lechosa (Carica papaya L.) y otras especies de Vasconcelleas (Caricas). INIA/CENIAP

INFORME DE ACTIVIDAD Obtención de híbridos interespecíficos entre lechosa (Carica papaya L.) y otras especies de Vaconcelleas (Caricas)

Responsable de la actividad: Inv. Ariadne Vegas García. Esta actividad forma parte del proyecto ‘Aprovechamiento de los recursos genéticos de papaya, para su mejoramiento y promoción, financiada por FONTAGRO.

Colaboradores: Prof. Jonas Mata (Universidad Central de Venezuela) Prof. Roger Vargas (Agricultor) TAI. Lic. Gustavo Saldana (CENIAP) Obrero Marlene Martinez (CENIAP) Obrero Gustavo Robles (CENIAP)

Periodo: Años 2000-2001

Resumen de las actividades realizadas: 1. Actividades del cultivo in vitro de los híbridos interespecíficos. Los híbridos intergenéricos se obtuvieron en investigaciones realizadas en años anteriores a esta actividad (Vegas, A, 1997) y se mantuvieron en cultivos in vitro. Para la realización de esta actividad, se germinaron los híbridos intergenéricos en medios de cultivo de germinación o multiplicación. El medio de germinación consistió en: medio base MS, vitaminas MS, cinetina (CIN) 0,1/BA 0,2 mg.l-1, sacarosa 30 g.l-1 (Fitch, 1993, modificado); y el medio de multiplicación contenía: medio base MS, vitaminas MS, BA 0,4/ANA 0,08 mg.l-1, sacarosa 30 g.l-1 (Tovar,1989). Plántulas procedentes de embriones germinados mayores de un

cm se colocaron en el medio base MS sólido simple para su posterior elongación y desarrollo. Las plántulas de tres cm o más fueron transferidas a macetas con una mezcla de suelo estéril, cubiertas con una bolsa plástica por 15 d aproximadamente. Posteriormente se llevaron a condiciones de umbráculo y campo para su aclimatación y evaluación, respectivamente. Las plantas aclimatadas se sembraron a 500 y 1500 m.s.n.m. en los estados Anzoategui y Aragua, respectivamente.

2. Ensayo. Granja Mis Oscares. Tasajera. Sector Los Naranjos. Edo. Aragua. 1.500 msnm. En el año 2000, se sembraron en el campo plantas de Caricas (Vasconcellas), con la finalidad de realizar cruces entre ellas, en la granja Mis Oscares, ubicada en Tasajera, Sector Los Naranjos. Sabaneta. Edo. Aragua, a 1500 msnm, en fecha 14/08/2000. Vasconcella cauliflora (8 plantas), Vasconcella pubescens (8 plantas), Vasconcella monoica (1 planta), híbrido intergenérico (clone n° 6: C. papaya x V. cauliflora). Para la primera semana de enero ese año, todas las plantas estaban en fase de floración y la V. monoica en fase de fructificación. Para esta fecha se comenzó con las polinizaciones controladas entre V. monoica x V. Cauliflora; V. pubescens x V. Cauliflora; y V. Monoica x V.cauliflora. Estos cruces se realizaron cada 7-15 días hasta tratar de completar todos los cruces posibles. Se espera compatibilidad completa entre los cruces de estas 3 especies.

En el año 2001, se sembraron en el campo plantas de lechosa, de las variedades Sofia (procedente de Colombia) y Maradol (procedente de Cuba), 5 plantas/variedad y 2 plantas hibridas C. papaya x C. cauliflora, clones 4 y 6. Las plantas se ubicaron en el mismo ensayo donde están ubicadas las otras caricas, sembradas en el año 2000.

Se cosecharon frutos de C. monoica, se extrajeron las semillas y se realizaron semilleros. Las plantas se usaron para la siembra de más plantas en el campo y para estudiar su susceptibilidad con respecto a el virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV).

2. Ensayo. Valle Guanape. Edo. Anzoategui. 500 msnm. En una siembra comercial de lechosa, de 4.5 Ha., ubicada en Valle Guanape, Edo. Anzoátegui, a 500 msnm. se sembraron híbridos interespecíficos: clones n° 4 y 6 entre C. papaya x V. cauliflora (6 plantas), en Valle Guanape, Edo. Anzoátegui, a 500 msnm, entre el período 31/07 y 11/10/2000.

De esta siembra comercial se selecionaron plantas madres de las poblaciones Paraguanera (roja y amarilla, porte alto y porte bajo), Cartagena (roja y amarilla), Costa Rica y las variedades Maradol y Red Lady, con rendimientos estimados superiores a 100 Kg/planta. Las plantas seleccionadas se decapitaron en la segunda visita 11/10/2000, cosechandose los ápices terminales y en la tercera visita 27/11/2000, se cosecharon los brotes nuevos, para las siembras in vitro.

Se realizaron 2 siembras in vitro, de ápices terminales, axilares y yemas florales de las poblaciones y variedades mencionadas, en total se sembraron 120 explantes. Estas yemas se han reciclado a medios frescos y encuentran en fase de brotación. Otras Actividades Se han reciclado in vitro periódicamente (cada 1 a 2 meses) híbridos intergenéricos (C. papaya x V. cauliflora) procedentes de cruces sembrados en 1995 y 1999. Igualmente, se reciclaron in vitro, los brotes de las plantas de lechosa seleccionadas en el campo. Estas vitroplantas se llevaron a una cámara a 8 °C, para que los reciclajes sean menos frecuentes, cada 3-4 meses.

Se realizaron semilleros de las variedades Sofia y Red Lady que se sembraron en Tasajera, Edo. Aragua, para incorporar a la Carica papaya en los cruces realizados.

Se sembraron 7 materiales, de cruces segregantes de lechosa, entre la variedad ‘Sunrise’ y la poblacion criolla, de las semillas enviadas Ing. Eric Mora, de la Universidad de Costa Rica. Este material fué sembrado por el Prof. Roger Vargas en Valle Guanape. Edo. Anzoategui.

Se envió por correo certificado semillas de la población Paraguanera y la variedad Red Lady, a los investigadores Eric Mora (Costa Rica) y Carlos Reyes (Colombia).

Se escribió el articulo ‘Obtención, regeneración y evaluación de híbridos intergenéricos entre Carica papaya y Vasconcella (Carica) cauliflora. Vegas, A, G. Trujillo, J. Mata, L. Castro, M. Martinez y G. Robles, que fue revisado por el Prof. Gustavo Trujillo y el Prof. Jonas Mata. Será enviado a la revista Interciencia. Se anexa el resumen de la publicación.

En el año 2001, entregó material vegetal al Prof. Jonas Mata, 3 plantas híbrido (clon 6) aclimatadas y vitroplantas híbridos, clones 4, 6 y 11, para estudios citogenéticos.

Resultados de la investigación: Las plantas híbridas in vitro y en el umbráculo mostraron fenotipos que fueron consistentes con su origen paterno, tuvieron hojas más verdes y más brillantes, con márgenes más punteagudas, que las plantas in vitro de lechosa (Figura 1).

En el umbráculo y en el campo, los híbridos presentaron un crecimiento lento, en comparación con plantas de lechosa in vitro (Figuras 1 y 2). En el campo, los híbridos florecieron a los 3-4 meses después de la siembra presentando flores normales tipo macho (con o sin ovario primitivo) y flores hermafroditas en las dos localidades (Figura 2). Estos resultados son corroborados parcialmente por los obtenidos por Magdalita et al. (1997), cuyas plantas híbridas entre C. papaya y V(C) cauliflora solo produjeron flores hermafroditas.

En el ensayo ubicado en la Granja Mis Oscares, Tasajera, Sector Los Naranjos, Edo. Aragua a 1.500 msnm, una planta híbrido C. papaya x C. cauliflora, clon 6, floreció y produjo 4 flores solitarias, a los 3 meses después de la siembra. Las primeras flores cosechadas (11/00) tenían aspecto normal, una de ellas era macho con 5 anteras largas y 5 cortas, y la otra flor era macho con un ovario primitivo, 10 anteras y dos estigmas. Las otras dos flores cosechadas (12/00) fueron analizadas por el Prof. Jonas Mata.

En el ensayo de campo en Valle Guanape, Edo. Anzoategui a 500 msnm. Se visitó la siembra en fecha 12-13/02/2001. Las 6 plantas híbridos C. papaya x C. cauliflora, clones 4 y 6, murieron por falta de disponibilidad de agua. En Valle Guanape no se logró cosechar flores de las plantas híbridos antes que murieran por sequía. Sin embargo en la visita anterior (11/00) se observó la floración de la planta más desarrollada (clon 6), se formaron 8 racimos de flores más 3 flores solitarias, la primera flor se presentó a 40 cm. del suelo, a los 4 meses después de la siembra.

Se produjeron 2 frutos por cada cruce entre: C. pubecens x C. monoica; C. pubecens x C. cauliflora y ; C. monoica x C. cauliflora, sin embargo sólo se logró cosechar los dos frutos del último cruce, que contenían semillas. Estas semillas se usarán para continuar con las actividades de los cruces interespecíficos.

Conclusiones y recomendaciones Estos estudios demuestran que la hibridación intergenérica entre C. papaya y Vasconcellea (C) cauliflora seguida del cultivo de óvulos y de embriones inmaduros parece ser un método factible para la transferencia de genes entre la especie silvestre y la cultivada. El uso de vasconcelleas geneticamente más relacionadas (como V. (C) quercifolia y cundinamarcensis) en los cruces con la lechosa, y la evaluación de un gran número de plantas híbrido en el campo garantizará híbridos fértiles útiles en los programas de mejoramiento genético.

Literatura citada Fitch, M (1993). High frecuency somatic embryogenesis and plant regeneration from papaya hypocotyls callus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 32: 205212. Magdalita P, Drew R, Adkins S, Godwin I (1997) Morphological, molecular and cytological analyses of Carica papaya x C. cauliflora interspecific hybrids.Theor. Appl. Genet. 95: 224-229. Tovar R (1989) Estudio preliminar sobre la propagación in vitro de la lechosa (Carica papaya L.) a partir de yemas apicales y axilares. Tesis de Grado. Facultad de Agronomía Universidad Central de Venezuela. 74 p. Vegas, A. 1997. Control del virus de la mancha anillada de la lechosa vía cultivo de tejidos, protección cruzada e ingeniería genética. Tesis de Doctorado. Universidad Central de Venezuela. 200 p.

a

b Figura 1. Comparación entre plantas de híbrido intergenérico y lechosa procedentes del cultivo in vitro, a nivel de umbráculo. a) lechosa (izquierda) e híbrido (derecha), después de tres meses del transplante a suelo. b) Morfología característica del híbrido, antes del transplante a campo.

a

b

c

Figura 2. a) Comparación entre plantas de híbrido intergenérico (derecha) y lechosa (izquierda), procedentes del cultivo in vitro, después de cuatro meses del transplante a campo. b) Híbrido intergenérico en fase de floración. c) Detalle de la floración del híbrido.

ANEXO 3 Informes de Colombia

3.1 Colección y caracterización in situ de especies de la familia Caricaceae de tierra caliente y caliente moderada en Colombia. Ver anexo 9, informe de progreso 2002

3.2 Informe final de Proyecto. CORPOICA

CORPORACIÓN COLOMBIANA DE INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA CORPOICA

INFORME FINAL PROYECTO

APROVECHAMIENTO DE LOS RECURSOS GENETICOS DE LAS PAPAYAS PARA SU MEJORAMIENTO Y PROMOCION

BID/IICA ATN/SF-6486-RG FONTAGRO

Centro de Investigación “La Selva” Rionegro, Antioquia, Colombia

Abril de 2003

Personal Proyecto:

Mario Lobo A., Ph.D., Investigador Titular, Corpoica Clara Inés Medina C., Candidata a M.Sc., Investigadora Cooperante, Corpoica Oscar Delgado P, Ing. Agr., Corpoica Ana Cristina Cadavid R., Ing. Agr., Tesista, Universidad Nacional Blanca Estela Villegas V., Ing. Agr., Tesista, Universidad Nacional Sandra Patricia Benítez G., Ing. Agr., Tesista, Universidad Nacional Juan David Toro B., Ing. Agr., Pasante, Universidad Nacional

Alianzas Estratégicas: Carlos Reyes S., M.Sc., Universidad Nacional Leticia Serna, M.Sc., Universidad de Caldas

1. INTRODUCCIÓN

A partir de la entrada en vigencia del Convenio sobre Diversidad Biológica, en diciembre de 1993, cambió el paradigma de que “los recursos genéticos eran patrimonio de la humanidad” por el precepto de soberanía nacional sobre estos. En virtud de lo anterior, cada Estado, firmante del instrumento, adquiriò la capacidad de determinar las normas de acceso a su capital biológico y la obligaciòn de desarrollar Sistemas de Conservación de los Recursos Genéticos. Por otro lado, la finalización del libre intercambio de material genético entre naciones, puntualiza que es estratégico la conservación de los recursos genéticos, con varias finalidades como son: evitar la pérdida de materiales en peligro, disponer de variabilidad para planes de desarrollo agrícola e igualmente tener materiales para alianzas estratégicas internacionales y para intercambio, lo cual permite un acceso a beneficios derivados del acceso a los recursos genéticos. Para la realización del potencial de los recursos genéticos, como fuente de desarrollo social y económico del país, es necesario contar con colecciones bien estructuradas y conocidas en sus atributos, con énfasis en los materiales de los cuales se es Centro de Diversidad Primaria, como es el caso de las Caricáceas de altura. Por ello, se presentó y llevó a cabo el proyecto, objeto del presente informe, a través del cual se apoyaron objetivos del Sistema de Bancos de Germoplasma para Alimentación y Agricultura del Estado Colombiano manejado por la Corporaciòn Colombiano de Investigación Agropecuaria, Corpoica, mediante un Convenio de Cooperación Técnica y Científica. A travès del apoyo financiero, recibido de FONTAGRO, se logró enriquecer con nuevas poblaciones, la colección de Caricáceas, tanto de altura, como de papaya, se adelantaron acciones de caracterización morfológica en forma directa, isoenzimática mediante una alianza con la Universidad de Caldas, entidad participante en el proyecto y química para evaluar el potencial agroindustrial de las especies. Igualmente, se realizaron estudios de semillas relacionados con la germinación y latencia de éstas, aspectos básicos para las estrategias de conservación de duplicados de seguridad de las colecciones de campo. Mediante el apoyo financiero del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, se pudo establecer colecciones de campo, y con las partidas de Fontagro se realizaron actividades de valor agregado, quedando en marcha un proceso de colecta y caracterización isoenzimática de nuevos materiales, el cual se ve favorecido por los protocolos transferidos por la Universidad de Caldas y los reactivos conseguidos a través del financiante del proyecto presente. En el informe, se presenta una relación de las diversas actividades llevadas a cabo en el proyecto, con financiamiento de Fontagro y cofinanciamiento del

Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia. Estas incluyen: Colecta, llevada a cabo conjuntamente con la Universidad Nacional, sede Medellín, socio del proyecto, establecimiento de la colección de campo, procesos de caracterización y estudios de germinación y latencia de las semillas.

2. INVESTIGACIÓN Y ACTIVIDADES REALIZADAS

2.1.

Establecimiento del huerto colección

Antecedentes: Corpoica ha venido desarrollando un Sistema de Bancos de Germoplasma a partir de colecciones de trabajo preexistentes Las colecciones han sido consideradas como los Bancos de Germoplasma para Alimentación y Agricultura del Estado Colombiano, cuyo manejo se delegó en la Corporación mediante un Convenio Especial suscrito al tenor de la Ley de Ciencia y Tecnología. Uno de los objetivos del Sistema es conservar y potenciar el capital biológico de la nación, incluyendo especies promisorias. Dentro de este grupo se han incluído las caricáceas de altura, de las cuales se disponía de algunas colectas. A través del proyecto presente se buscó enriquecer la colección de Caricáceas de altura, con dos finalidades: evitar procesos de erosión genética en marcha y potenciar este grupo de especies. Igualmente, se obtuvo germoplasma de las colectas de papaya, realizadas por el Profesor Carlos Reyes de la Universidad Nacional, seccional Medellín, Colombia, quien depositó un duplicado de las poblaciones obtenidas en diferentes localidades de Colombia, material que se envìo a la colección de campo establecida en el C.I. “La Libertad”, Villavicencio, Colombia, el cual está localizado en la altillanura del país. De caricáceas se contaba con un número reducido de colectas provenientes de las colecciones de trabajo y de materiales colectados a través de una convocatoria realizada en el altiplano norte de Antioquia. Con el proyecto presente se buscò establecer en campo el material preexistente y el colectado durante el transcurso de éste, para estudiar sus atributos y promover, por esta vía, su utilización. Objetivos: Conformar una colección de papayuelas de altura, para a través de procesos de caracterización, promover su utilización sostenible per se y como fuente de genes para la papaya común Carica papaya. Procedimientos: Colecta e introducción de materiales en diversas zonas, en las cuales generalmente se encuentran árboles aislados a nivel de huertos caseros o rurales.

Evaluación y caracterización in situ, sobre lo cual rinde informe el profesor Carlos Reyes de la U. Nacional. Extracción de la semilla y establecimiento de la colección de campo con 5 a 10 ejemplares por accesioón. Esta incluyó material preexistente, enviado de otras localidades e igualmente material colectado en huertos caseros de Santa Rosa de Osos, Antioquia. Resultados: En la Tabla 1 se incluye una relación de los materiales presentes en la colección, los cuales suman 98 accesiones, incluidas en 2 géneros 8 especies identificadas y 1 sin categorización específica En una primera instancia se caracterizaron y evaluaron morfológicamente 44 accesiones de papayuelas, resultados que se incluyen en el informe actual. A partir de la colección del C.I. “La Selva”, establecida en campo se enviaron a Manizales materiales para procesos de caracterización isoenzimática. Resultados que son reportados por la Universidad de Caldas. También el huerto sirvió para el proceso de caracterización físico-química, incluido en el informe y para la toma de semilla que se utilizó en los estudios de latencia y germinación reportados por el equipo de Corpoica. La colección se empleó por parte de los socios de la Universidad Nacional de Medellín para la toma de polen de papayuelas, necesario para el estudio de hibridación interespecífica con papaya, llevado a cabo por el profesor Rodrigo Hoyos de la Universidad Nacional de Medellín. En este huerto se evaluó y modificó el descriptor desarrollado por diferentes socios del proyecto, con participación de los funcionarios de Corpoica incluidos en el proyecto, el doctor Geo Coppens y estudiantes de la Universidad de Caldas. A partir del huerto se colectó semilla y se almacenó, como duplicado de seguridad, en neveras a 10°C, con 10% de contenido de humedad en las unidades de propagación, depositadas en bolsas herméticamente selladas, con un mínimo de 1500 semillas viables por accesión. En la actualidad se tiene una nueva colección de campo que incluye 20 materiales no sembrados previamente y se tienen procesos de germinación de las nuevas accesiones obtenidas a través de colecta e introducción para su establecimiento en los huertos colección. Con el material no caracterizado isoenzimáticamente, se ha iniciado un trabajo de caracterización de ésta índole, para el cual se está recibiendo apoyo metodológico del laboratorio de la Profesora Leticia Serna de la Universidad de Caldas.

Tabla 1. Colección de Caricáceas presente en el C.I. “La Selva”

Especie

Origen

Jacaratia dolictioula V. cauliflora

Cordoba Antioquia Valle Choco Valle Antioquia Quindío Caldas Antioquia Boyaca Nariño Quindio Santander del sur Magdalena Antioquia Antioquia Boyaca

V. goudotiana

V. pubescens

V. spherocarpa

V. sp TOTAL

2.2.

Número de entradas

Caracterizadas

1 7 1 1 20 3 2 2 42 2 9 1 1 1 1

0 0 0 0 14 0 2 2 25 0 0 1 0 0 0

3 1 103

0 0 44

Evaluación y Caracterización Morfológicas de Caricáceas de Altura Ana C. Cadavid R., Blanca E. Villegas V., Clara I. Medina C., Mario Lobo A.

Antecedentes: En Colombia las papayuelas de altura, no han adquirido desarrollo como cultivo. Estas son utilizadas a nivel local, a partir de unos pocos árboles por finca, lo cual se deriva del desconocimiento por parte de la mayoría de la población de éstas especies. En contraste, en otros países, como es el caso de Chile, han adquirido importancia y se producen comercialmente tanto para consumo interno, como para exportación. Lo anterior, señala que hay un potencial no explotado, de un recurso biológico que es abundante en el país por ser éste parte del centro de diversidad primaria de este grupo de especies. El aprovechamiento de las papayuelas podría darse en diversas formas: a. Como nueva alternativa productiva para los agricultores de la zona andina, lo cual se magnifica por el potencial agroindustrial de estos taxa; b. Como material genético al cual se podría dar acceso a países productores, caso Chile, que disponen de poca variabilidad genética para el cultivo, con beneficios para Colombia derivados del acceso al germoplasma y c. Como fuente de genes para la papaya (Carica papaya L.), frutal importante a nivel nacional. Para que lo anterior sea realidad, se precisa, en primera instancia consolidar colecciones de este grupo taxonómico, conservar adecuadamente el material

colectado y estudiar los atributos presentes en el mismo tanto a nivel fenotípico, como genético. Esto da valor agregado al capital biológico y permite un aprovechamiento de la riqueza genética almacenada en el mismo. Objetivo: Conocer la variabilidad fenotípica de atributos cualitativos y cuantitativos, existente en la colección de Caricáceas de altura (Vasconcellea spp), como un medio para promover la utilización de ésta, diseñar estrategias de conservación y determinar necesidades de colecta futuras. Procedimiento: El trabajo se realizó en la colección de Caricáceas de altura establecida en el Centro de Investigación “La Selva”, de la Corporación Colombiana Agropecuaria, Corpoica, Rionegro, Antioquia, Colombia. El Centro de Investigación está ubicado en la zona ecológica Bosque Húmedo Montano Bajo, a una altura de 2120 msnm, con una temperatura promedio de 17ºC, humedad relativa media del 78% y 1700 mm de precipitación anual. En el estudio se incluyeron 44 materiales de las especies: Vasconcellea goudotiana (26 accesiones), y Vasconcelle pubescens (18 accesiones). La información se registró, en forma individual, en 5 árboles por accesión, mediante la utilización de un listado de descriptores desarrollados por el IPGRI, para la especie papaya (Carica papaya L.) , con modificaciones introducidas por el programa de Recursos Genéticos y Biotecnología de Corpoica, el profesor Carlos Reyes de la Universidad Nacional y el doctor Geo Coppens del IPGRI. La información obtenida se clasificó para árboles machos y hembras. Los datos se incluyeron en una hoja electrónica Excel 6.0 y luego se procesaron en forma independiente las variables cualitativas y cuantitativas. Con los atributos de índole cualitativa se hizo estadística descriptiva, con obtención de modas, desviación estándar y coeficiente de variación para cada uno de ellos. Lo anterior permitió seleccionar las características polimórficas para la realización de análisis de conglomerados. Para el efecto, a partir de la matriz de información se construyó una matriz de similitud entre materiales mediante el empleo del Coeficiente Simple de Similitud (Sneath y Sokal,19731), lo cual permitió obtener un fenograma a través del algoritmo de las medias no ponderadas, conocido comúnmente en la literatura como UPGMA. En el caso de las variables cuantitativas, se obtuvieron promedios, desviaciones estándar y coeficientes de variación para cada uno de ellas, seleccionando para los análisis multivariados las que exhibieron variación. Con los atributos polimórficos, y a partir de la matriz de información con valores estandarizados, se 1

Sneath, P.H.; Sokal, R.R. 1973. Numerical Taxonomy. W.H. Freeman and Co., San Francisco, CA, USA. 573p

elaboró una matriz de distancia simple a través del Coeficiente de Diferencia Promedio de Características (Cain y Harrison, 19582), y se construyó el fenograma cuantitativo mediante el empleo del algoritmo UPGMA. Las hipótesis experimentales planteadas en el trabajo fueron que los descriptores empleados tenían poder discriminante y que existía amplia variabilidad morfológica tanto cualitativa como cuantitativa en la colección estudiada. Resultados: Los descriptores utilizados para el análisis de variabilidad de la colección de papayuelas, fueron de fácil aplicación a nivel de campo y presentaron poder discriminante. Esto concuerda con la hipótesis nula planteada al respecto y señala que la lista de variables y estados por atributo empleados fueron adecuados para el estudio de diversidad fenotípica. En la Tabla 2, se incluyen los valores modales, la desviación estándar y el coeficiente de variación obtenidos con cada uno de los atributos cualitativos para los árboles hembras, especimenes en los cuales se registraron características vegetativas y reproductivas y en la Tabla 3, puede verse la información cualitativa recabada en los árboles macho de las diferentes accesiones estudiadas. En el estudio se encontró que los atributos cualitativos presentaron poder discriminante taxonómico, para los dos taxa estudiados, tanto a nivel de los árboles femeninos como de los masculinos, lo cual puede apreciarse en la Figuras 1 y 2. En el caso de los árboles hembra (Figura 1), se presentó polimorfismo para el 90.7% de las características cualitativas, y un nivel mínimo de similitud del 47% entre pares de materiales, Esto indica que existen diferentes arreglos de los polimorfos cualitativos a nivel de accesiones, lo cual puede favorecer procesos de selección de individuos con combinaciones de atributos deseados. En la colección estudiada, como puede apreciarse en los fenogramas de las Figuras 1 y 2, cada accesión correspondió a un ecotipo diferente, lo cual fue evidente tanto a nivel de los árboles machos como en de los especimenes femeninos. En la tabla 4, se incluyen los promedios, los coeficientes de variación y las desviaciones estándar para cada uno de los atributos cuantitativos registrados en la evaluación en los árboles hembra y en la Tabla 5, los pertinentes a los ejemplares de sexo masculino. Como puede apreciarse en las Gráficas 3 y 4, se presentó amplia variabilidad cuantitativa tanto a nivel de hembras como de árboles machos, con una baja coincidencia en cuanto a agrupamientos cualitativos y 2

Cain, J.; Harrison, GF.A. 1958. An analysis of the Taxonomist’s Judgement of Affinity. Zoological Society of London., Proceedings. 131:85.

cuantitativos. Este resultado ha sido obtenido en estudios realizados con diferentes especies, lo cual fue atribuido a patrones de evolución diferentes para las dos categorías de atributos (Lobo y Medina, 20013), con una selección antrópica importante para características cualitativas específicas, especialmente de aquellas que están relacionadas con aceptación por parte de los consumidores y una asociación importante de la variabilidad cuantitativa con genes menores responsables de adaptación y rendimiento con los lugares de colecta de los materiales (Rosso, Medina y Lobo, 20024).

Tabla 2. Análisis univariado variables cualitativas árboles hembra

VARIABLE Color de tallo Pigmentación del tallo Tallos multiples Ramificación del talllo Presencia de corcho en la hoja Forma y dentación general de la hoja Numero y forma de los lobulos de las hojas Color del peciolo de las hojas Color del limbo de las hojas Cerosidad de las hojas Pubescencia de las hojas Forma general del seno del peciolo Tipo de floración Tamaño de la flor Color del pedúnculo Color de la corola Longitud de la corola Altura del primer fruto Forma del fruto Color de la piel fruto maduro Forma de inserción pedunculo en el fruto Textura piel del fruto maduro Lóbulos en la superficie del fruto maduro Forma del ápice del fruto Hombros del fruto Forma cavidad central del fruto Grosor del la piel del fruto Aroma de la pulpa 3

MODA 2 4 0 1 1 2 8 4 3 0 0 1 1 0 1 2 7 3 4 1 3 3 3 2 1 2 3 3

DS 0.50 1.03 0.07 0.49 0.17 0.43 2.64 1.14 0.63 0.00 0.48 0.43 0.79 2.12 1.11 1.94 0.66 1.52 6.06 1.38 1.52 1.23 1.39 0.68 0.75

CV 23.10 35.48 1466.29 79.48 16.98 24.64 34.01 30.10 25.93 0.00 130.21 36.21 53.75 154.04 61.29 52.76 9.59 33.34 81.73 68.87 49.06 39.33 34.69 27.43 46.58

1.49 0.19 1.44

39.58 6.45 35.19

VALOR MAX 3 4 1 1 1 2 11 5 4 0 1 4 3 9 5 7 7 7 18 6 7 7 7 4 4 6 3 7

VALOR MINI 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 3 3 1 1 1 1 3 1 1 2 1 3

Lobo, M.; Medina, C.I. 2001. Variabilidad morfológica en el tomate pajarito (Lycopersicon esculentum var. Cerasiforme), precursor del tomate cultivado. Revista Corpoica 3(2):39-50. 4 Rosso, C.A.; Medina, C.I.; Lobo, M.L. 2002. Morphologic characterization and agronomic evaluation of a Colombian collection of arracacha (Arracacia xanthorhriza Bancroft). Plant Genetic Resources Newsletter No. 132:1-8.

Color del pedúnculo Pigmentación del fruto maduro Color del latex Color fruto de la piel fruto maduro Densidad de la pulpa Presencia de fribra en la pulpa Tejido placentario Color del tejido plancetario Color de la semilla Tipo de la superficie de la semilla Brillo de la superficie de la semilla (sin arilo) Forma de la semilla Mucilago de la semilla Forma de la esclerotesta Tamaño de la semilla

1 3 1 7 9 0 7 2 1 2 3 3 7 3 3

0.89 1.60 2.48 2.53 3.10 0.00 1.13 1.00 1.09 0.00 0.00 0.33 1.12 0.49 0.66

55.77 40.35 78.00 57.08 50.79 0.00 18.53 52.24 66.12 0.00 0.00 11.35 18.13 18.96 27.58

3 6 6 8 9 0 7 6 6 2 3 3 7 3 3

1 0 1 1 1 0 3 1 1 2 3 2 1 2 1

Tabla 3. Análisis univariado variables cualitativas árboles macho Variable Color del tallo Pigmentación del tallo Tallos múltiples Ramificación del tallo Corchoso Forma y dentación general de la hoja Numero y forma de los lóbulos de las hojas Color del pecíolo de las hojas Color limbo de las hojas Cerosidad de las hojas Pubescencia en las hojas Forma general del seno del pecíolo Tipos de floración Tamaño de la inflorescencia Color del pedúnculo Color de la corola Longitud de la corola

Moda Desviación estándar

Coeficiente de variación

Valor Máximo

Valor Mínimo

2 4 0 1 1 2

0.53 1.04 0 0.48 0 0.44

24.66 35.71 0 73.63 0 24.91

3 4 0 1 1 2

1 1 0 0 1 1

8

2.93

38.79

15

1

4

1.19

32.16

5

1

3 0 0 1

0.65 0.14 0.49 0.45

26.96 726.27 123.48 38.13

3 1 1 4

1 0 0 1

2 5

162.15 1.93

1242.84 35.09

2347 9

1 0

2 5 3

0.85 1.91 0.114

45.61 41.64 4.57

5 7 3

1 0 1

Tabla 4. Análisis univariado de variables cuantitativas árboles hembra VARIABLE Distancia media entrenudos Altura del árbol Diámetro del árbol Longitud del pedúnculo hoja madura Longitud de hoja madura Ancho de hoja madura Tamaño de la flor Long pedunculo inflorescencia Numero de frutos en el tronco Longitud del pedúnculo Peso del fruto Longitud del fruto Diametro del fruto Diámetro cavidad central Grados brix pulpa Grados brix plancenta Contenido de latex Peso de semilla por fruto más arilo Numero de semillas por fruto Peso semilla total Peso de 1 semilla

MEDIA 3.21 2.02 10.36 26.75 28.11 41.18 3.06 4.89 53.29 7.27 123.52 10.98 4.55 2.67 9.63 13.36 0.30 37.89 79.27 7.49 0.03

DS 1.13 0.48 3.85 8.45 6.28 10.34 0.57 3.20 121.26 3.08 40.11 1.84 0.78 0.48 2.28 2.62 0.21 12.68 38.44 9.57 0.01

CV 35.25 24.11 37.17 31.61 22.34 25.12 18.72 65.5 227.52 42.29 32.46 16.72 17.18 18.03 23.71 19.65 68.32 33.46 48.49 127.69 31.92

VALOR MAX VALOR MIN 7.7 1 3.5 1.1 27.1 2.4 54 7 60 10 67 13 4.5 1 30 1 743 1 19 2 276.48 46.39 16.32 4.2 9.7 2.9 4 1.3 22 3 20.5 5.2 1.281 0.0106 71.9 11.17 200 32 48.3 0.88 0.07 0.01

Los atributos cuantitativos de los machos permitieron una mayor discriminación taxonómica que aquellos de las hembras. Esto es atribuible al hecho de que la clasificación de los machos está basada en características vegetativas y de flores, no sometidas a selección antrópica, dependientes del aislamiento reproductivo entre los taxa y las subpoblaciones a nivel de cada especie. La información de modas para las variables cualitativas y de medias para los atributos cuantitativos, al ser incluida en catálogos y bases de datos en medios electrónicos, por accesión, será de gran valor en la selección de materiales con atributos específicos y de parentales para programas de mejoramiento, lo cual da un valor agregado al capital biológico conservado en las colecciones. Tabla 5. Análisis univariado variables cuantitativas árboles macho VARIABLE Distancia media entrenudos Altura del árbol Diámetro del árbol Longitud peciolo hoja madura Longitud de hoja madura Ancho de hoja madura Tamaño de la flor Longitud pedúnculo inflorescencia

X 3.03 2.13 11.31 24.29 27.02 38.55 2.82 8.08

DS CV VALOR MAX VALOR MIN 1.13 37.30 7.6 1 0.61 28.65 3.5 0.8 5.07 44.78 26.3 3.4 10.03 41.29 50 1 7.18 26.59 46 10 13.45 34.89 78 10 5.79 205.26 40 0.5 4.73 58.56 23 0

Figura 1: Dendograma cualitativo hembras

2259 2275 2272 2274 2273 2375 2278 2276 2376 2279 2270 2374 ILS307 2269 2271 2266 2300 2260 2263 2268 2277 2265 Paproja ILS238 ILS313 ILS328 ILS331 ILS324 ILS340 ILS274 ILS441 ILS 245 ILS264 ILS268 ILS326 ILS325 ILS341 ILS357 ILS285 ILS327 ILS443

0.3

0.4

0.6

Coeficiente de

0.8

1.0

Figura 2: Dendograma cualitativo árboles macho

2260 2279 2265 2276 2300 2374 2375 2264 ILS 307 ILS 321 2270 2277 2376 Paproja 2266 2274 2275 2272 2273 2269 2268 CDRLLG 2ILS 27 309 ILS 310 331 8ILS ILS 312 ILS 326 ILS 443 2263 C1042280 ILS 245 ILS 264 ILS 268 ILS 341 ILS 325 ILS 327 ILS 328 ILS 288 ILS 315 ILS 324 ILS 314 ILS 340

C. goudotiana C. pubescens

0.47

0.60

0.73

0.87

Coeficiente de similitud

1.00

Figura 3: Dendograma cuantitativo hembras 2259 2266 2273 PAPROJA 2265 2376 2260 2275 2268 2270 2272 2277 ILS313 2300 2374 ILS357 ILS341 ILS 443 2271 2375 ILS340 ILS245 ILS328 ILS285 2263 2279 C1042280 2269 2276 2274 ILS331 ILS307 2278 ILS441 ILS268 ILS325 ILS324 ILS326 ILS238 ILS264 ILS327 ILS274

0.0

0.2

0.4

Distancia

0.67

0.8

Figura 4: Dendograma cuantitativo machos

2260 2264 2265 2375 2276 2376 2278 2273 paproja 2300 2263 ILS315 ILS245 ILS264 ILS340 ILS326 ILS324 ILS101 ILS321 ILS331 ILS325 ILS341 ILS327 ILS268 ILS288 ILS312 ILS328 ILS443 2266 2279 2270 2274 C1042280 2268 2272 2275 ILS314 2269 2276 ILS309 ILS310 ILS307 2374

0.00

0.28

0.57 Distancia

0.85

1.14

2.2. Caracterización química de especies de Caricáceas Juan David Toro, Clara Inés Medina C., Mario Lobo A.

Antecedentes: Las papayuelas de altura se utilizan, en especial, para el desarrollo de preparados caseros y para la elaboración de procesados. Adicionalmente, los dos taxa producen un latex rico en papaìna. Lo anterior puntualiza que en estas taxa hay potencial agroindustrial, con valor agregado tanto de forma, como de tiempo. Para que lo anterior se vuelva realidad, es necesario conocer la composiciòn quìmica de los frutos y utilizar la información, con el apoyo de expertos en el área de alimentos, evaluar el potencial de producción de prototipos agroindustriales y, en forma posterior, la aceptación de éstos. Objetivo: Caracterizar fìsico-químicamente los frutos de las papayuelas Vasconcellea pubescens y Vasconcellea goudotiana, con el fin de evaluar el potencial de desarrollo de productos agroindustriales a partir de èstos. Procedimientos: El estudio se realizó con las especies: Vasconcellea pubescens, Vasconcellea goudotiana y Carica papaya cv. “Cotové”, a nivel de especie. Para ello se tomaron frutos de cada una de los taxa, sembrados en el C.I. “La Selva”, con diferente grado de maduración: verde, pintón (50% de desarrollo de pigmentos en la cáscara) y completamente maduros (100% de desarrollo de pigmentos en la epidermis). A partir de los mismos, y por especie, se tomaron frutos aleatoriamente para las mediciones fìsicas y los análisis químicos realizados. Las variables fìsicas registradas a los frutos fueron: pesos total, del mesocarpo, de las semillas y el arilo, medidas de los frutos y mililitros y peso de latex por fruto. En cuanto a atributos quìmicos se registró pH, grados Brix, contenido de azùcares totales y reductores, % de almidones, contenido de fenoles diméricos, oligoméricos y poliméricos, pectinas de alta y baja metilaciòn, protopectina y contenido de vitamina C. Resultados: En las Tablas 6,7 y 8, se presentan los resultados obtenidos con las especies Vasconcellea pubescens, Vasconcellea goudotiana y Carica papaya. En los mismos se puede apreciar el cambio en atributos químicos luego de que los frutos alcanzan el estado verde maduro. Lo obtenido se utilizarà para discutir con profesionales del área de tecnología de alimentos con el fin de proyectar prototipos de procesados que podrìan obtenerse a partir de las frutas, en especial en el caso de las papayuelas de altura. Cabe señalar que es importante obtener información acerca de la actividad enzimática de la papaína en las dos especies de papayuela evaluadas. Al respecto, se pudo observar que la enzima proveniente de Vasconcellea goudotiana solidifica más rápidamente que la proveniente de Vasconcellea pubescens.

También es importante, una vez determinado el potencial agroindustrial de los frutos, determinar la variabilidad existente, para los atributos quìmicos de mayor relevancia, en diversas accesiones, seleccionadas con base en los agrupamientos cualitativos y cuantitativos y en los obtenidos a través del análisis de conglomerados derivado d e la caracterización sioenzimática. 2.3.

Estudios de germinación con semillas de papayuela Sandra Patricia Bernítez G., Oscar A. Delgado P., Mario Lobo A.

Antecedentes: Para el aprovechamiento de la variabilidad genética es un requisito tener las colecciones debidamente conservadas, lo cual permite un acceso fácil y rápido al germoplasma. A través del proyecto presente se logró colectar tanto papayas como papayuelas de altura, las cuales se han depositado en la colección del Estado Colombiano para Alimentación y Agricultura. Las papayas se sembraron en el C.I. “La Libertad”, Villavicencio, Meta, como colección de campo y se conservó un duplicado de semillas. Con las papayuelas se estableció una colección de campo en el C.I. “La Selva”, Rionegro, Antioquia, con un duplicado de semillas, por material, conservado en neveras a 10ºC, con 10% de contenido de humedad en las unidades de propagación, condiciones apropiadas para la semilla de categoría intermedia, como es el caso de las Caricáceas. Esto implica monitorear la viabilidad a través del almacenaje para determinar el momento en que se debe colocar un nuevo duplicado como semilla e igualmente para la medición de ésta, mediante pruebas de germinación, en forma previa al almacenamiento de la semilla. Al respecto, la semilla de las Caricáceas posee latencia, siendo necesario categorizar esta y desarrollar protocolos para su remoción lo que permite utilizar la prueba de germinación como indicador real de la viabilidad del material a ser conservado o en conservación. El aspecto anterior es más desconocido en papayuelas, por lo cual se llevó a cabo el presente estudio para categorizar la latencia presente en semillas de Vasconcellea pubescens y Vasconcellea goudotiana y buscar protocolos de remoción de la latencia. Objetivo: Categorizar la latencia presente en las semillas de las papayuelas Vasconcellea pubescens y Vasconcellea goudotiana, y desarrollar protocolos de remoción de la latencia, para poder monitorear la viabilidad de éstas a través de pruebas de germinación en los procesos de conservación de germoplasma. Procedimientos: El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Fisiología de Semillas, del programa de Recursos Genéticos y Biotecnología Vegetal, de Corpoica, ubicado en el C.I. “La Selva”, Rionegro, Antioquia, Colombia. Las semillas para el estudio se obtuvieron a partir de las colecciones de campo establecidas en el centro de investigación. La extracción de estas se realizó a través de procesos de

Tabla 6. Caracterizaciòn físico-química de frutos de la especie Vasconcellea pubescens en diferente estado de maduración. Vascocellea pubescens Variable Estado de maduración Verde Pinton Diámetro basal cm 1.91 2.49 Diámetro medio cm 5.84 5.66 Diámetro ápical cm 1.30 1.45 Longitud fruto cm 9.48 7.67 Peso de fruto gr. 123.40 127.54 Látex ml 0.67 0.20 Peso de latex por fruto 1.13 0.66 Peso de mesocarpo 74.69 82.37 Peso semilla + arilo 43.81 43.30 Peso de cascara 3.78 1.21 PH mesocarpo 4.28 2.54 PH arilo 4.32 2.82 Grados Brix mesocarpo 7.8 10 Grados Brix arilo 10.3 14.2 Vitamina C mesocarpo 570.10 473.54 (mg/100gr) Vitamina C arilo 155.08 304.0 (mg/100gr) % azucares totales 2.027 4.73 mesocarpo % azucares totales arilo 3.64 8.67 % azucares reductores 2.12 3.53 mesocarpo % azucares reductores 0.71 7.05 arilo % almidones mesocarpo 0.20 2.81 % almidones arilo 0.30 1.13 Fenoles mesocarpo 0.25 0.05 • Dimeras 0.20 0.06 • Oligomericas 0.006 0.00 • Poliméricas Fenoles arilo 0.034 0.281 • Dimeras 0.028 0.207 • Oligomericas 0.00082 0.095 • Poliméricas Pectina Total .

0.020008

0.020004

Maduro 1.98 5.63 1.27 10.10 126.90 0.00 0.35 87.58 38.02 0.95 2.74 2.97 10 14.2 576.77 300.72 5.18 8.77 2.11 5.65 0.8031 2.14 0.25 0.24 0.0008 0.113 0.163 0.006 0.034

Tabla 7. Caracterizaciòn físico-química de frutos de la especie Vasconcellea goudotiana en diferente estado de maduración.

Vascocellea goudotiana Variable Diámetro basal cms Diámetro medio Diámetro ápical Longitud fruto Peso de fruto Látex ml Peso de latex por fruto Peso de mesocarpo Peso semilla + arilo Peso de cascara PH mesocarpo PH arilo Grados Brix mesocarpo Grados Brix arilo Vitamina C mesocarpo (mg/100gr) Vitamina C arilo (mg/100gr) % azucares totales mesocarpo % azucares totales arilo % azucares reductores mesocarpo % azucares reductores arilo % almidones mesocarpo % almidones arilo % Fenoles • Dimeras • Oligomericas • Poliméricas % Fenoles arilo • Dimeras • Oligomericas • Poliméricas % Pectina Total mesocarpo % Pectina Total arilo

Estado de maduración Verde Pinton 1.82 1.79 4.97 5.53 0.67 1.23 10.23 10.70 20.17 216.63 0.70 0.33 1.53 0.97 120.61 131.20 56.93 60.67 24.09 23.80 5.35 4.63 5.05 4.42 8.0 8.3 11.8 13.6 338.86 368.81

Maduro 2.29 5.62 1.01 12.36 148.96 0.60 0.91 86.62 39.85 21.57 4.52 4.13 7.6 12.5 495.21

214.29 0.70

386.49 2.04

319.36 1.49

2.31 1.41

5.74 1.41

4.66 3.51

1.39 3.31 2.64

4.95 1.32 1.31

4.22 1.47 2.31

0.018 0.018 0.006

0.034 0.017 0.001

0.247 0.214 0.006

0.4597 0.3093 0.1915

0.1094 0.1408 0.062

0.02321 0.02319 0.01200

0.027 0.049

0.029 0.054

0.016 0.029

Tabla 8. Caracterizaciòn físico-química de frutos de la especie Carica papaya L. en diferente estado de maduración.

Carica papaya Variable Diámetro basal cms Diámetro medio Diámetro ápical Longitud fruto Peso de fruto Látex ml Peso de latex por fruto Peso de mesocarpo Peso semilla + arilo Peso de cascara PH mesocarpo PH arilo Grados Brix mesocarpo Grados Brix arilo Vitamina C mesocarpo (mg/100gr) Vitamina C arilo (mg/100gr) % azucares totales mesocarpo % azucares totales arilo %azucares reductores mesocarpo % azucares reductores arilo % almidones mesocarpo % almidones arilo % Fenoles mesocarpo • Dimeras • Oligomericas • Poliméricas % Fenoles arilo • Dimeras • Oligomericas • Poliméricas % Pectina Total mesocarpo % Pectina Total arilo

Estado de maduración Verde Pinton

Maduro

2.25 8.79 2.47 12.2 485.84 2.10 3.29 393.2 Nd. Nd 6.08 Nd 8.6 Nd 629.3

5.2 16.3 2.76 18.2 1981.5 0.00 0.0 1705.1 Nd Nd 5.14 Nd 11.7 Nd 395.95

8.2 17.2 3.7 17.3 2108.7 0.00 0.0 1861.9 Nd Nd 5.19 Nd 14 Nd 444.13

Nd 3.61 Nd 3.41

Nd 8.94 Nd 3.59

Nd 9.81 Nd 6.37

Nd 0.53 Nd

Nd 0.63 Nd

Nd 1.47 Nd

0.073 0.090 0.001

0.017 0.010 0.0008

0.25 0.10 0.0008

Nd

Nd

Nd

0.034 Nd

0.012 Nd

0.032 Nd

fermentación, con lavado posterior para eliminar el arilo. En forma previa, se hicieron estudios, no incluidos en el informe presente para disminuir el tiempo de fermentación, a través del empleo de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Luego de la extracción las semillas se secaron con silica gel, con una relación1:1 (peso de sílica : peso de semilla), hasta que las unidades de propagación alcanzaron un 10% de contenido de humedad, condición recomendada para el almacenamiento del tipo de semilla presente en las papayuelas (intermedio).

Las pruebas de germinación se realizaron en cajas de petri, con papel filtro en su interior, colocadas en cámaras de germinación, en las cuales se mantuvo una temperatura constante de 28.5ºC. Las semillas se prehumedecieron por espacio de 48 horas en una cámara húmeda en forma previa a la prueba de germinación, procedimiento que es rutinario en el manejo de las semillas en el banco de germoplasma para evitar daños mecánicos en las primeras fases de toma de humedad. Las evaluaciones se llevaron a cabo por espacio de 60 días. Todos los estudios se llevaron a cabo con 4 repeticiones, estando integrada cada unidad experimental por 100 semillas. La evaluación de la viabilidad se llevó a cabo a través de la prueba de tetrazolio. Para lo anterior, se evaluaron diversos protocolos y se encontró que los mejores resultados se obtuvieron con inmersión de la semilla en soluciones de tetrazolio durante 24 horas. Para determinación del grado de latencia se realizaron pruebas de germinación con semillas extraidas luego de fermentación (15 días) y sobrefermentación (hasta pudrición de frutos). Las pruebas se llevaron a cabo durante 60 días. Posteriormente, las unidades de propagación que no presentaron germinación, se sometieron a tinción con tetrazolio, con el fin de categorizar la viabilidad de éstas. Una vez categorizada la latencia, se aplicaron tratamientos de remoción de ésta, con base en ácido giberélico y nitrato de potasio. En el informe se presentan los resultados más sobresalientes obtenidos con relación a los objetivos de los estudios. Las hipótesis experimentales fueron: a. Las semillas de las especies de papayuela evaluadas presentan latencia y b. Hay protocolos sencillos que permiten remoción de la latencia de las semillas. Resultados: Como puede apreciarse en la Tabla 9, las semillas de los dos especies de papayuela estudiadas, Vasconcellea pubescens y Vasconcellea goudotiana, exhibieron un alto grado de latencia, lo cual se reflejó en la baja germinación y la diferencia entre la viabilidad y la germinación. Esto fue crítico en el caso de Vasconcellea pubescens, taxón en el cual no se obtuvo germinación alguna luego de la extracción de la semilla. Lo anterior señaló que la prueba de germinación, sin remoción de la latencia no era un indicativo real de la viabilidad de la semilla. Igualmente, como puede verse en la Tabla 9, los períodos de fermentación empleados afectaron sensiblemente la viabilidad de la semilla, lo cual se colige del elevado porcentaje de semillas con embrión no viables, lo cual fue debido en alto

grado a pudrición de los embriones debido al ataque de patógenos. Esto indicó la necesidad de disminuir los tiempos de fermentación para liberar la semilla del arilo, lo cual se logró mediante la aplicación de la levadura Saccharomyces cerevisia al medio de fermentación. La levadura permitió remover completamente el arilo en períodos cortos. Para los ensayos posteriores se seleccionó como tiempo de fermentación con la levadura 60 horas.

Con base en lo resultados anterior, se realizó un ensayo de remoción de latencia luego de fermentación durante 60 horas con y sin levadura y con aplicación de AG y nitrato de potasio. Como puede verse en la Tabla 10, la remoción de la sarcotesta fue detrimente en las dos especies, lo cual se debió al ataque de patógenos. También pudo apreciarse que la levadura per se causó incremento significativo en la germinación en comparación con la fermentación sin levadura. Esto señala que ambas semillas presentan latencia exógena ya que la levadura contribuye a ablandar la testa. Los mejores resultados se obtuvieron con semillas extraídas mediante fermentación con la levadura, sin remoción de la testa y con aplicación de AG (200 ppm) y nitrato de potasio (1.5%), lo cual indica que hay tanto latencia endógena como exógena en ambos taxa.

En un ensayo posterior, realizado con Vasconcellea pubescens, se logró obtener germinaciones de alrededor del 50% con semilla extraída por fermentación con levadura a la cual se le aplicó los tratamientos: AG3 600 ppm + KNO3 2.5% y AG3 1000 ppm + KNO3 1.5%. En este no hubo repetibilidad del resultado obtenido con Vasconcellea goudotiana con el tratamiento de AG3 200 ppm + KNO3 1.5%. Con el taxón se obtuvo una germinación superior al 80% al aplicar AG3 + KNO3 2.5%.

Los resultados de las investigaciones señalan: 1. Que las semillas, de ambas taxa, exhiben tanto latencia exógena, como endógena. 2. Que las semillas de Vasconcellea pubescens presentan mayor latencia y se degradan más fácilmente por efecto de tratamientos de fermentación, 3. Que puede haber variabilidad en cuanto a la respuesta a rompimiento de la latencia, lo cual puntualiza la necesidad de evaluar la profundidad de latencia en relación con la época de cosecha de la semilla y con los factores climáticos imperantes en el tiempo de desarrollo de la semilla y 4. Que es igualmente evaluar tratamientos de remoción de latencia endógena en Vasconcellea pubescens , acompañados de pruebas de tetrazolio, a las semillas no germinadas, que indiquen cual fue el grado de remoción de latencia con los protocolos.

Tabla 9. Clasificación de las semillas germinables y no germinables de papayuelas de altura, de acuerdo con pruebas de viabilidad y germinación, luego de extraídas mediante fermentación y sobrefermentación.

CLASE

ESPECIE* V. pubescens V. goudotiana Sem Sem. Sem Sem Fermen sobrefer ferme sobrefer 0.0 dB 0.0 dB 18.7 bA 0.0 dB SEMILLAS VIABLES GERMINABLES % 21.0 dB 22.7 bB 39.9 aA 30.4 bA SEMILLAS VIABLES LATENTES % SEMILLAS VIABLES TOTALES % 21.0 C 22.7 C 57.6 A 30.4 B 66.1 aB SEMILLAS NO VIABLES CON EMBRIÓN % 72.8 aA 74.8 aA 41.3 aC 6.2 cA 2.5 cA 1.0 cA 3.5 cA SEMILLAS VANAS SIN EMBRIÓN % SEMILLAS NO VIABLES TOTALES % 79.0 A 77.3 A 42.3 C 69.6 B * Entre promedios marcados con la misma letra minúscula, en cada una de las columnas, y con la misma letra mayúscula , en cada una de las hileras, no hay diferencias estadísticas significativas (Prueba de Duncan p=0.05). Diferencias basadas en el arcoseno del porcentaje

Tabla 10. Porcentajes de germinación obtenidos luego de remoción de latencia exógena con levadura y endógena con AG3 y KNO3, en semillas con y sin sarcotesta. TRATAMIENTO SEMILLAS Con sarcotesta, levadura Sin sarcotesta, levadura Con sarcotesta, levadura, AG3 200ppm + KNO3 1.5% Sin sarcotesta, levadura, AG3 200ppm + KNO3 1.5% Con sarcotesta, sin levadura

2.4. 3.

V. pubescens V. goudotiana % germinación % germinación 8.8 bB 66.6 bA 0.0 cA 2.8 cA 39.4 aB 88.4 aA 0.4 cA 1.4 cA 0.0 cA 3.8 cA

Caracterización isoenzimática de la colección de papayuelas de altura PRODUCTOS OBTENIDOS A PARTIR DEL PROYECTO

•

Colección de caricáceas de las taxa Vasconcellea pubescens y Vasconcellea goudotiana establecida en campo, con duplicados de semilla conservados a 10ºC, con un contenido de 10% de humedad en la semilla.

•

Colección con datos de evaluación y caracterización morfológicas, debidamente procesados y documentados en bases de datos en medios electrónicos.

•

Base de datos de caracterización físico-química de las especies Vasconcelea pubescens y Vasconcellea goudotiana. Información que discutida con expertos

en procesos agroindustriales, permitirá conocer el potencial de obtención de procesados y la producción de prototipos para evaluación de éstos. Lo anterior da un valor agregado a los materiales de estas especies incluidas en el Sistema de Bancos de Germoplasma del Estado Colombiano para alimentación y Agricultura. •

Información de caracterización bioquímica de parte de la colección de papayuelas, presente en el C.I. “La Selva”, mediante una unión estratégica con la Universidad de Caldas, sitio donde se desarrollaron los protocolos isoenzimáticos y se hizo el proceso. Esto se complementará con caracterización isoenzimática de nuevas accesiones incorporadas a la colección y que se encuentran en campo.

•

Categorización de la latencia de las semillas de Vasconcellea pubescens y Vasconcellea goudotiana y desarrollo de protocolos de remoción de latencia. Esto posibilita el monitoreo de la semilla a incorporarse al sistema de conservación a baja temperatura y al monitoreo de la viabilidad de ésta a través del tiempo de almacenamiento.

•

Incremento de la colección de papaya Carica papaya L., del Sistema de Bancos de Germoplasma del Estado para Alimentación y Agricultura, a cargo de Corpoica. El material se encuentra en campo, con un duplicado de semilla y con este se están llevando a cabo procesos de evaluación. La semilla fue suministrada por el Profesor Carlos Reyes S.,de la Universidad Nacional, participante del Proyecto.

•

Unión estratégica con la Universidad de Caldas, donde se hizo caracterización isoenzimática de parte de la colección disponible en el Sistema de Bancos de Germoplasma del Estado Colombiano para Alimentación y Agricultura. La Universidad entregó la información y adquirió el compromiso de transferir los protocolos y dar orientación a las personas de Corpoica que continuarán con el proceso.

•

Dos tesis de grado, para optar al título de Ingeniero Agrónomo, concluidas y una tesis de M.Sc. en marcha.

•

Lista de descriptores para caracterización morfológica de papayuelas de altura Vasconcellea spp. Desarrollada a partir de los descriptores de papaya, en forma conjunta con otros actores del proyecto.

4. 4.1.

TESIS DE GRADO Y PASANTIAS DESARROLLADAS Nivel Pregrado

CADAVID, A.C.; VILLEGAS, E. 2001. Evaluación y caracterización morfológicas de Caricáceas de altura. Tesis para optar al título de Ingenieras Agrónomas, Universidad Nacional, Medellín, Colombia. Directores: Mario Lobo A.; Clara I. Medina, Carlos Reyes S. BENITEZ, S.P.; 2003. Estudios de germinación de la semilla de papayuela Vasconcellea cundinamarcensis (pubescens) y Vasconcellea goudotiana. Tesis para optar al título de Ingeniero Agrónomo. Universidad Nacional Medellín. Directores: Mario Lobo A., Oscar A. Delgado P. 4.2.

Nivel posgrado

CADAVID A.C. 2003. Caracterización isoenzimática de Caricáceas de altura. Tesis para optar al título de M.Sc., Universidad Nacional, Medellín, Colombia. En ejecución. Directores: Mario Lobo A., Lucía Afanador, Clara I. Medina C. 5.

PUBLICACIONES

CADAVID, A.C.; VILLEGAS, E.; MEDINA, C.I.; LOBO, M.; REYES, C. 2002.Caracterización morfológica de Caricáceas de altura. En: Memorias IV Seminario Nacional de Frutales de Clima frío moderado. Medellín, Colombia. 20 a 22 de Noviembre de 2002.CDTF, UPB, Corpoica. P. 55-60.

6. • • • • • • •

DIRECCIÓN FUTURA Continuar con colecta en zonas del país no muestreadas Completar procesos de caracterización de diversa índole para dar valor agregado al capital biológico representado en las papayuelas Diseñar prototipos industriales a partir de los frutos y evaluar la aceptación de los mismos por parte de consumidores Estudiar el potencial de las papayuelas de altura como fuente de atributos importantes para la papaya Documentar adecuadamente la información existente sobre las colecciones y la derivada de procesos de caracterización Evaluar el potencial de desarrollo de las papayuelas de altura como alternativa de diversificación de la zona andina tanto para producción de productos comestibles, como desde el punto de vista de extracción de papaína. Conservar adecuadamente los materiales de las colecciones

3.3 Caracterización y estudio de la diversidad genética en los géneros Vasconcellea y Carica (Caricaceae) en Colombia, Costa Rica y Ecuador por medio de marcadores isoenzimáticos. Universidad de Caldas, CIRAD-FHLOR/IPGRI

Caracterización y estudio de la diversidad genética en los géneros Vasconcellea y Carica (Caricaceae) en Colombia, Costa Rica y Ecuador por medio de marcadores isoenzimáticos.

Daniel Jiménez, Leticia Serna (Universidad de Caldas), Geo Coppens d’Eeckenbrugge, María Teresa Restrepo y John Ocampo. (CIRAD-FHLOR/IPGRI)

JUSTIFICACIÓN Los frutales andinos son considerados recursos genéticos valiosos. Los géneros Carica (papaya común) y Vasconcellea (papayuelas o papayas de montaña) son los géneros de mayor importancia económica en la familia Caricaceae. El primero por tener la cuarta fruta tropical en importancia económica a nivel mundial, Carica papaya L. (FAO, 1996) y el segundo por incluir especies frutales conocidas comúnmente como papayas de montaña y contar con la segunda especie en importancia económica de la familia, el babaco (V. x heilbornii Badillo) cultivada en países como Australia (Cossio, 1988; Kempler y Kabaluk, 1996), Ecuador, Estados Unidos, Israel, Italia (Council, 1989), España (Merino Merino, 1989) y Nueva Zelanda (Endt, 1981; Harman, 1983). Teniendo en cuenta que Colombia y Ecuador son los centros de origen de la mayoría de las especies del género Vasconcellea (Badillo, 1993), estudios de diversidad genética llevados a cabo en estos países aumentan las perspectivas en la obtención de resultados que nos acercan mas a conocer el grado de diversidad entre y dentro de los géneros. Así mismo nos permiten identificar los materiales a tener en cuenta en programas de mejoramiento genético o la necesidad eventual de preservarlos. En la familia Caricaceae han sido escasos y con muestras reducidas los estudios de diversidad basados en marcadores isoenzimáticos (menos de dos plantas por especie). Por esta razón, se propuso la caracterización isoenzimática de estas especies en Colombia, Costa Rica y Ecuador e investigar las distancias genéticas entre ellas teniendo en cuenta su distribución geográfica.

1

ANTECEDENTES Los marcadores isoenzimáticos tienen la ventaja de no verse afectados por variables ambientales y ser apropiados para la identificación de especies frutícolas perennes (Ferreira y Grattapaglia, 1998). La característica más importante de

este tipo de

marcadores es su expresión codominante que lo convierte en el tipo de marcador adecuado en un estudio de diversidad. Además el costo de la técnica es bajo en comparación con otro tipo de marcadores, los cuales exigen equipos de laboratorio más sofisticados. Por medio de marcadores isoenzimáticos se han identificado cultivares y determinado los niveles de diversidad genética en especies frutícolas (Arulsekar y Parfitt 1986; Mallikarjuana et al., 1994; Segura et al., 1998). Igualmente han sido utilizados para estudiar la diversidad de Carica y Vasconcellea y sus especies (Morshidi, 1996; Jobin-Decor et al., 1997). En C. papaya, estudios con marcadores isoenzimáticos en almidón detectaron polimorfismo en los sistemas ADH, PGM, PGI, SOD, PRX y monomorfismo en los sistemas LAP, EX, IDH, MDH y SKDH en el germoplasma de Venezuela y del arco antillano (Ocampo, 2000).

METODOLOGÍA

Descripción del material: Un total de 271 plantas fueron evaluadas, representando 147 accesiones y siete especies: V. cundinamarcensis, V. goudotiana, V. sphaerocarpa, V. cauliflora, V. crassipetala, V. stipulata, V. x heilbornii y C. papaya. La cantidad de material evaluado se presenta en la tabla 1. Tabla 1. Material de Carica y Vasconcellea evaluado

Especie V. cundinamarcensis V. goudotiana V. sphaerocarpa V. cauliflora V. crassipetala V. stipulata V. x heilbornii C. papaya

N° accesiones Evaluadas 38 20 2 4 2 9 33 39

N° de plantas 104 58 5 11 3 9 33 48

2

La Unidad de Recursos Genéticos CIAT fue el lugar donde se realizó la estandarización de técnicas para la extracción de las isoenzimas, electroforesis, fijación, tinción de los sistemas enzimáticos, almacenaje de los geles. y donde se realizó la electroforesis en almidón y poliacrilamida. Personal involucrado: Daniel Debouck Ph.D líder del programa de recursos genéticos. Cesar Ocampo MSc. Coordinador de Actividades en el Laboratorio. En la Universidad de Caldas se realizó la electroforesis en poliacrilamida. Personal involucrado: Leticia Serna Ángel MSc. Profesora titular de genética (Coordinadora del Laboratorio Biología molecular de la Facultad de Ciencias Agropecuarias) Las colecciones evaluadas pertenecen a la Universidad de Caldas (23; accesiones.), CORPOICA La Selva (Colombia; 33 accesiones.), la Universidad Técnica de Ambato (Ecuador; 47 accesiones.) y la Universidad de Costa Rica (32 accesiones.). Doce muestras fueron colectadas in situ. El material brindado por cada una de las instituciones se presenta en la tabla 2. Tabla 2. Material de Caricaceae suministrado por las Instituciones en el estudio.

ESPECIE

V. cundinamarcensis V. goudotiana V. crassipetala V. cauliflora V. sphaerocarpa C. papaya V. x heilbornii V. stipulata Total

C.L.S

In Situ

U.T.A

11 10

5 4 2

5

4 2 6

33

1

12

U.C.R

U de C

Total

17 6

38 20 2 4 2 39 33 9 147

32 33 9 47

32

23

C.L.S= CORPOICA La Selva; U.T.A= Universidad Técnica de Ambato; U.C.R= Universidad de Costa Rica; U de C= Universidad de Caldas

Personal involucrado: Luis Miguel Álvarez (U de C), Mario Lobo, Clara Inés Medina (CORPOICA), Jorge Vega (U. T. Ambato), Eric Mora (U. Costa Rica)

3

Catorce sistemas enzimáticos fueron evaluados (tabla 3). La metodología de Ramírez (1987) fue utilizada para la extracción, electroforesis y tinción de las isoenzimas. Las diferentes electroformas (bandas) obtenidas de los sistemas enzimáticos fueron evaluadas como descriptores binarios. Las bandas de cada sistema fueron numeradas según su orden de migración cátodo-ánodo. Los individuos se identificaron por presencia o ausencia de cada electroforma. El índice de similitud de Dice se utilizó para calcular las distancias. La matriz resultante fue sometida al análisis de agrupamiento del vecino más cercano (neighbor joining). Los cálculos se procesaron con el programa Winstat. Tabla 3. Sistemas enzimáticos utilizados en el estudio de diversidad de Vasconcellea y Carica

ENZIMA

Abreviatura

Ecuación

Tinción

Polimorfismo

Acido Shikimico

SKDH

1.1.1.25

**

**

Alcohol deshidrogenasa

ADH

1.1.1.1

-

*

α Esterasa

α EST

3.1.1

**

**

Diaforasa

DIA

1.6.4.1

**

**

Enzima málica

ME

1.1.1.40

*

-

Formato deshidrogenasa

FDH

1.2.1.1

-

-

Fosfatasa ácida

ACP

3.1.3.2

**

**

Fosfoglucomutasa

PGM

5.4.2.2

**

**

Fosfogluco isomerasa

PGI

5.1.3.9

**

**

Glutamato oxalacetato

GOT

2.6.1.1

**

**

Isocitrato deshidrogenasa

IDH

1.1.1.49

**

-

Peroxidasa

PER

1.11.1.7

-

-

Super oxido dismutasa

SOD

1.15.1.1

-

-

6 PGDH

1.1.1.43

**

**

Dehidrogenasa

transaminasa

6-Fosfogluconato dehidrogenasa

4

RESULTADOS CLASIFICACIÓN El dendograma obtenido con el análisis de agrupamiento por mayor proximidad separa claramente cinco ramas principales. (figura 1).

Figura 1. Arbol de clasificación (Neighbor Joining, distancia de Jaccard) obtenido con los datos del análisis enzimático. Identificación de las accesiones: ver tabla 1 o códigos a continuación. cun=V. cundinamarcensis, sti=V. stipulata, Vxh pent= V. x heilbornii var. pentagona, T2= V. af x heilbornii var. chrysopetala, T1= V. x heilbornii var. chrysopetala, gou=V. goudotiana, pap=C. pap cau=V. cauliflora, crass=V. crassipetala, sph=V. sphaerocarpa. Cun=Cundinamarca,

Cal=Caldas,

Boy=Boyacá,

Qui=Quindio,

Tol=Tolima,

Ant=Antioquia,

Ris=Risaralda, Val=Valle, Mag=Magdalena, cuz=Cuzco(Perú) Letras= A-G: Municipio; Números= 1-5 Localidad.

La primera rama está conformada por las accesiones ecuatorianas. Se ubica aparte por tener bandas excepcionales en sus accesiones que a su vez son compartidas entre las especies. Está subdividida en dos ramas, una que reúne las accesiones de V. stipulata y de V. x heilbornii var. chrysopetala y var. pentagona, y otra que agrupa las accesiones 5

de V. cundinamarcensis y de V. af x heilbornii var. chrysopetala. Las accesiones de V. cundinamarcensis son las menos distantes del grupo de V. cundinamarcensis colombianas debido a que en sistemas como α EST, DIA, PGM comparten al menos una banda. La diferenciación entre las accesiones ecuatorianas de V. cundinamarcensis y V. af x heilbornii var. chrysopetala y los demás taxones de rama ecuatoriana se explica por la presencia de patrones únicos en las enzimas ACP, PGM y SKDH. V. stipulata, V. x heilbornii var. pentagona y V. x heilbornii var. chrysopetala muestran afinidad debido a la presencia de patrones idénticos en los sistemas ACP, PGM y por compartir al menos una banda en PGI y α EST; a pesar de esto V. x heilbornii var pentagona se muestra un poco distante del grupo al enseñar electroformas únicas en los sistemas GOT, 6PGDH y SKDH. La segunda rama agrupa las accesiones colombianas de V. cundinamarcensis. Es la rama con mayor representación de individuos, no se observa agrupación de origen geográfico. La accesión de V. cundinamarcensis de Rionegro muestra relativamente poca afinidad con las demás accesiones por la presencia de patrones diferentes en las enzimas α EST, GOT, PGM y PGI. Es muy notable el monomorfismo en las accesiones de la colección de la Universidad de Caldas, a pesar de la supuesta diversidad en los orígenes geográficos. La tercera rama se caracteriza por bandas particulares en PGI y 6 PGDH. Agrupa las accesiones de V. goudotiana, V. sphaerocarpa y V. crassipetala, manteniendo una subestructura por especie. La diferenciación de V. crassipetala y V. sphaerocarpa se relaciona con la presencia de patrones únicos en DIA, ACP, α EST en la primera especie y por sus electroformas exclusivas en ACP y GOT en la segunda. Las dos accesiones de V. crassipetala se agrupan perfectamente por ser idénticas en todos los sistemas. V. sphaerocarpa enseña poca similitud entre sus accesiones como resultado de los patrones enzimáticos en GOT. Dentro de V. goudotiana, aparece un patrón geográfico. Las accesiones del Valle de Cauca se diferencian bien de las demás como resultado de las electroformas que enseñan en las enzimas α EST, GOT, PGI y 6 PGDH. Las accesiones de Caldas, Quindío y Risaralda también muestran particular afinidad debido a sus electroformas en la enzima ACP. La cuarta rama separa las accesiones de V. cauliflora, es la rama con menor representación de individuos y no se observa agrupación de origen geográfico.

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Las accesiones de C. papaya se agrupan en la quinta rama, es la más distante, en la cual aparece una fuerte diferenciación entre países. Los materiales costarricenses, en su mayoría de origen silvestre o subespontáneo, muestran variación entre sus accesiones. Nueve de ellos se diferencian como consecuencia de sus electroformas en los sistemas ACP, SKDH, α EST y 6 PGDH. Pero esta diferenciación no sigue un patrón geográfico o de estado silvestre o cultivado. Las accesiones colombianas, de origen cultivado, aparecen muy distantes de las de Costa Rica. Sorprendentemente, muestran un variación comparable y hasta superior. La accesión de Rionegro se diferencia más particularmente como resultado de sus patrones exclusivos en las enzimas α EST y GOT. La accesión de Cuzco (Perú) se separa claramente por sus patrones electroforéticos en las enzimas α EST, ACP, GOT y 6 PGDH, DISCUSIÓN

Nuestro estudio ha evidenciado una alta diversidad isoenzimática y una fuerte estructuración. Los ocho sistemas enzimáticos presentan en su mayoría bandas o combinaciones de éstas exclusivas de una especie o un grupo. En cuanto a las relaciones entre especies, nuestro estudio confirma la afinidad entre las dos principales especies de papaya de montaña del Ecuador, V. cundinamarcensis y V. stipulata., y el parentesco de V. x heilbornii con las dos. Diferencia claramente las especies

colombianas,

V. cundinamarcensis,

V. goudotiana,

V. sphaerocarpa

y

V. crassipetala y aún más la especie V. cauliflora. A nivel intergenérico, confirma la fuerte diferenciación entre Carica y Vasconcellea. La distancia entre los dos géneros supera la distancia entre ciertas especies de Vasconcellea, confirmando los resultados obtenidos con marcadores que cubren mejor el genoma, como los RAPD (Jobin et al., 1997); AFLP (Droogenbroeck et al.,2002; Kim et al.,2002) y RFLP sobre ADNcp (Aradhya et al., 1999), pero también con marcadores isoenzimáticos (Jobin et al., 1997). A nivel intraespecífico la situación varía con las especies. Es limitada en las cuatro accesiones de V. cauliflora e importante en las dos accesiones de V. sphaerocarpa. En tres de las siete especies, C. papaya, V. goudotiana y V. cundinamarcensis, aparece una diferenciación según el origen geográfico. En C. papaya la estructuración geográfica se manifiesta claramente por la diferenciación entre y dentro de los países. Las diferencias a nivel de poblaciones dentro de los países contrastan con los resultados obtenidos por

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Morishidi (1998) con marcadores isoenzimaticos y por Stiles et al. (1993) con RAPD . En V. goudotiana, se observa una leve estructuración geográfica con ciertas agrupaciones entre accesiones por grupos de departamentos colombianos. El carácter poco marcado de la diferenciación entre accesiones de diferentes regiones de Colombia puede explicarse en parte por el carácter estrictamente alógamo de la planta (dioica), el cual favorece una fuerte diversidad intra-poblacional y limita la diversidad entre poblaciones (Schoen y Brown, 1991). El caso de V. cundinamarcensis es más complejo. La estructuración geográfica se manifiesta claramente por la diferenciación entre accesiones ecuatorianas y colombianas, pero no aparece entre las accesiones de Colombia. La separación de las accesiones ecuatorianas de V. cundinamarcensis y su agrupamiento con las demás especies del Ecuador puede explicarse por un importante flujo de genes entre V. cundinamarcensis y V. stipulata, en relación con su gran afinidad (Sharon et al., 1992; Jobin et al., 1997; Kim et al.,2002) y su compatibilidad (Horovitz y Jiménez, 1967). Las dos especies son consideradas simpátricas por Badillo (1993). En un estudio más fino, Scheldeman (2002) ha mostrado que sus áreas de distribución son diferentes pero adjuntas, lo que ha permitido contactos e intercambios frecuentes entre ellas. Según Badillo, (1993) V. x heilbornii resultaría precisamente de una hibridación entre V. cundinamarcensis y V. stipulata. Esta hipótesis fue corroborada por los estudios morfológicos de Scheldeman (2002) y moleculares de Van Droogenbroeck et al., (2002). La afinidad de V. cundinamarcensis con V. af x heilbornii var. chrysopetala confirma los resultados obtenidos por Van Droogenbroeck et al. (2002), quienes afirman que el fenómeno de introgresión se da en ambas direcciones, provocando una división de los híbridos en dos grupos que pueden presentar una notable similitud con cualquiera de sus parentales. La ausencia de una diferenciación entre las accesiones de V. cundinamarcensis de diferentes regiones de Colombia, comparada con la estructuración geográfica observada en la especie silvestre V. goudotiana, igualmente dioica, indica la existencia de otros factores limitantes de la diversidad entre poblaciones. La selección humana y los intercambios de semilla de material domesticado de la especie podrían ser dos de ellos. La uniformidad observada en la colección de la Universidad de Caldas contrasta con la riqueza de las dos otras colecciones de Vasconcellea, en la Universidad de Ambato y en CORPOICA. Al tomar las muestras, encontramos errores de identificación taxonómica en ciertas accesiones, con presencia de plantas de diferentes especies bajo un mismo código. La caracterización isoenzimática confirma graves errores en la instalación de 8

esta colección, por lo que es aconsejable re-instalarla a partir de las semillas, asegurándose de la identificación inicial de los materiales. El análisis de estos resultados será profundizado para una publicación en una revista científica internacional.

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3.4 Informe Universidad Nacional, Sede Medellín

Materiales y Métodos Material Vegetal. El rescate de embriones se realizó de hibridaciones interespecíficas entre C. papaya var. UN Cotové y C. cauliflora. Todas las plantas donantes se sembraron en la estación experimental de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín Cotové, el cual esta ubicada en el municipio de Santa Fe de Antioquia, Antioquia. La estación está ubicada a 700 m.s.n.m con una temperatura promedio anual de 30 ± 2ºC. Los frutos utilizados fueron colectados entre los 90 y 120 días después de la polinización (Figura 1).

Figura 1. Fruto de 90 días después de polinizado Desinfección superficial del los frutos. Una vez colectado los frutos, se lavaron con abundante agua para remover partículas gruesas de polvo, luego se limpiaron cuidadosamente con algodón y alcohol al 70% por 1 a 2 min, seguidamente, se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio a una concentración de 1% del ingrediente activo por espacio de 10 minutos, finalmente se lavaron con abundante agua destilada y estéril. Extracción de los embriones inmaduros. La disección de los frutos y la extracción de los embriones se realizo en una cámara de flujo laminar. La extracción de los embriones híbridos se realizó con la ayuda pinzas bajo un estereomicroscopio. Medios de Cultivo. Con el propósito de evaluar en el campo, en el futuro, los híbridos y al mismo tiempo conservar en in vitro clones (F1s), los embriones se sembraron inicialmente en un medio de cultivo para inducir embriogénesis somática, El medio contenían las sales y vitaminas completas de Murashige y Skoog (MS) (1962) complementado con 2,4-ácido diclorofenocciacetico (2,4-D) (4.5 µM). En este medio permanecieron por espacio de 20 a 30 días, luego fueron trasferidos a los medios reportados por Magdalita y col 1996. los cuales consistieron de las sales y vitaminas básicas de Murashige y Skoog (1962) reducidas a la mitad de su concentración mas BAP 0.25 µM + ANA 0.25 µM . Se evaluó el efecto del ácido giberélico (GA3 10.0 µM). En nuestro caso el GA3 se utilizo con las sales de MS y no con medio denominado DF (De Fossard y col. 1974). Los medios se designaron como Medio 1 (½ MS + BAP 0.25 µM + ANA 0.25 µM + GA3 10.0 µM) y Medio 2 (½ MS + BAP 0.25 µM + ANA 0.25 µM.

Todos los medios de cultivo se esterilizaron en un autoclave horizontal a 120 ºC por espacio de 20 min a una presión de 20 lp-2

Resultados. Polinizaciones. De 670 flores polonizadas, 120 desarrollaron frutos. Sin embargo, en estos frutos algunas semillas tenían embrión otras no. De los embriones sembrados en medio para embriogénesis somática, el 40% presentaron tejidos embriogénicos y se logró clonar el material. Los tejidos embriogénicos obtenidos se trasfirieron a los medios reportados para la maduración y crecimiento de los embriones somáticos. El GA3 tuvo un efecto marcadamente positivo en el desarrollo y crecimiento de los embriones somáticos (Figura 2). Contrariamente en el medio 2 los embriones somáticos no presentaron el mismo comportamiento que en el medio de cultivo 1. Los embriones somáticos se individualizaran y sembrarán en un medio para enraizamiento para luego llevar unos al campo para la evaluación contra el virus del anillado de la papaya y otros clones permanecerán in vitro. Una véz se tenga los resultados de campo se multiplicaran solamente aquellos que tengan una buena evaluación a la infección.

Figura 2 Desarrollo de embriones somáticos a partir de embriones híbridos en el medio de cultivo ½ MS + BAP 0.25 µM + ANA 0.25 µM + GA3 10.0 µM después de 20 días de crecimiento.

A

B

D

C

E

Figura 2 Desarrollo de embriones somáticos a partir de embriones híbridos en el medio de cultivo ½ MS + BAP 0.25 µM + ANA 0.25 µM. después de 20 días de crecimiento.

A

B

Magadalita, P.M., Adkins, S.W. and Godwin, I.A. 1996. An improved embryo-rescue protocol for Carica interspecific hybrid.

ANEXO 4 Informes de Ecuador

4.1 Colección, caracterización y conservación de caricáceas andinas en Ecuador. UTA

APROVECHAMIENTO DE LOS RECURSOS GENÉTICOS DE LAS PAPAYAS PARA SU MEJORAMIENTO Y PROMOCIÓN "COLECCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y CONSERVACIÓN DE CARICÁCEAS ANDINAS EN ECUADOR"

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO FACULTAD DE INGENIERIA AGRONÓMICA UNIDAD OPERATIVA DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS AGROPECUARIAS

Ambato – Ecuador Abril, 2003

2

APROVECHAMIENTO DE LOS RECURSOS GENÉTICOS DE LAS PAPAYAS PARA SU MEJORAMIENTO Y PROMOCIÓN

"COLECCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y CONSERVACIÓN DE CARICÁCEAS ANDINAS EN ECUADOR"

INFORME FINAL DE ACTIVIDADES

PERSONAL TÉCNICO: ING. JORGE VEGA Ch. M.Sc.

Director

ING. MARCO CASTILLO T. M Sc. ING. EDUARDO CRUZ T. M. Sc. ING. FIDEL RODRÍGUEZ A. M. Sc.

Investigador Investigador Investigador

Ambato – Ecuador Abril, 2003

3

I.

INTRODUCCIÓN

En el Ecuador existe una alta variabilidad genética de caricáceas tanto cultivadas como en estado silvestre, de gran importancia económica y social debido a la producción continua y a su desarrollo en jardines, huertos familiares y en fincas de pequeños y medianos productores. Las especies más difundidas a nivel del callejón interandino son: babaco (Vasconcellea pentagona), chamburo (Vasconcellea pubescens) y jigacho (Vasconcellea stipulata) Las actividades del proyecto se fundamentaron en los siguientes objetivos: colectar plantas, estacas y/o semillas de caricáceas silvestres o cultivadas, caracterizándolas preliminarmente in situ; caracterizar agromorfológicamente ex situ las accesiones colectadas y regenerarlas; conservar a nivel de invernadero (plantas) y cámara fría (semillas) el mayor número de accesiones; documentar las accesiones colectadas con la información más relevante de cada una de ellas y poner a disposición de instituciones afines nacionales e internacionales; e incrementar el banco germoplásmico de la Universidad Técnica de Ambato con caricáceas andinas y propiciar la relación interinstitucional a través de acciones recíprocas. Con este propósito la Universidad Técnica de Ambato y el IPGRI suscribieron el Acuerdo LOA/AM-002-2000, para la realización de acciones sobre “Colección, caracterización y conservación de caricáceas andinas en Ecuador”, dentro del proyecto “Aprovechamiento de los recursos genéticos de las papayas para su mejoramiento y promoción” financiado por el Fondo Regional de Tecnología Agropecuaria – FONTAGRO, a través del IICA / IPGRI.

II.

METODOLOGIA A.

COLECCIÓN DE MATERIAL GERMOPLÁSMICO.

Mediante el uso de material cartográfico, como son: mapas de división política, de regionalización, topográficos, climáticos y de la literatura bibliográfica consultada, se realizó la identificación de las zonas de muestreo de las especies de caricáceas en las provincias de la sierra ecuatoriana. Las expediciones de recolección se realizaron en diferentes cantones, parroquias y localidades, comprendidas entre 1500 y 3200 msnm., tomando información sobre, ubicación geográfica, altitud, características edáficas, nombre común o local de la especie, fuente y tipo de la muestra colectada, estado fenológico, origen, uso, destino del material, entre otros, los cuales constituyen datos pasaporte (Anexo 1). Las muestras ó accesiones se tomaron de un conjunto de cinco plantas que representaron a la variabilidad existente en la zona, tanto de las especies silvestres como de las cultivadas, estos materiales además fueron seleccionados en función de sus condiciones físicas y sanitarias. La identificación de las muestras en el campo se realizó mediante etiquetas adhesivas en las que constaron el número de la muestra, las iniciales de los colectores y la fecha. El embalaje del material vegetal se realizó en cubetas plásticas, precautelando la sanidad del mismo.

4 Las accesiones colectadas mediante estacas de 0.20 m. de longitud fueron sometidas a un proceso de “desaviado” o “endulzado” durante 15 días, como paso previo a la plantación en el estaquero, luego desinfectadas y sumergidas la base de éstas en Rootone (Hormona para enraizamiento), con lo cual se obtuvo un mejor enraizamiento de las mismas; en el caso de las accesiones obtenidas mediante plántulas, éstas fueron plantadas inmediatamente en el lugar definitivo; en tanto que las accesiones colectadas a través de frutos, fueron sometidos a un período de 20 – 30 días de posmaduración para la extracción de semillas. B.

CARACTERIZACIÓN AGROMORFOLÓGICA 1.

Caracterización in situ

Esta actividad se realizó al momento de extraer la muestra, tomando información más importante sobre la organografía presente, tales como: tallos, hojas, flores y frutos La compilación de información in situ se registró en los descriptores elaborados para el efecto, éstos fueron reajustados en cada expedición, en función de su aplicación y que sea lo más completo posible. 2.

Caracterización ex situ

La caracterización ex situ, agronómica y morfológica se inició conforme a la presencia de la organografía en cada una de las accesiones, mediante la utilización de una ficha que contiene 100 items ó descriptores específicos.

C.

CONSERVACIÓN DEL MATERIAL COLECTADO

Las accesiones colectadas se vienen manteniendo a nivel de invernadero (plantas) y en cámara fría a 4º C ± 1 (semillas), en fundas de papel aluminio herméticamente selladas. Las actividades de manejo y conservación consisten en: riegos, deshierbas, abonadura orgánica, fertilización, controles fitosanitarios y pruebas de germinación, esta última en el caso de la conservación de semillas en cámara fría.

III.

RESULTADOS A.

COLECCIÓN DE MATERIAL VEGETAL

Las expediciones de recolección se cumplieron de acuerdo a lo planificado, en las provincias de Bolívar, Chimborazo, Tungurahua, Cañar, Azuay, Loja, Cotopaxi, Pichincha, Imbabura y Carchi (Figura 1), observándose una gran variabilidad de estas especies aún en estado silvestre, confirmándose lo descrito por Badillo, V. M. (1993).

5

AREAS MUESTREADAS

CarchiCarchi Imbabura Imbabura Pichincha Pichincha

Cotopaxi Cotopaxi Bolívar Tungurahua BolívarTungurahua

Chimborazo Chimborazo

Cañar Cañar Azuay Azuay

Rango Altitudinal 1500 – 3200 msnm

Figura 1.

Loja

Loja

Ecuador

Provincias (10) de la región interandina muestreo

en las que se realizó el

Se logró colectar 149 accesiones (cuadro 1), correspondientes a diferentes especies del género Vasconcellea. CUADRO 1. TIPO DE MUESTRA RECOLECTADA EN LAS 10 PROVINCIAS DE LA SIERRA ECUATORIANA Provincias Bolívar Chimborazo Tungurahua Cañar Loja Azuay Cotopaxi Pichincha Imbabura Carchi TOTAL PORCENTAJE

Estacas 15 18 14 7 19 12 9 18 3 115 77.18

Ti pos de muestras Frutos Plántulas TOTAL 5 20 1 19 14 7 14 2 1 22 3 15 6 15 4 1 23 1 4 3 3 31 .3 149 20.81 2.01 100

6

Por ser las caricáceas especies vegetales que se caracterizan por su forma de reproducción asexual, el 77.18 % de las accesiones fueron recolectadas a través de “estacas”, el 20.81% como frutos especialmente de V. pubescens, V. spituplata y V. monoica; y, el 2.01% como plántulas fundamentalmente de V. pentágona provenientes de huertos comerciales ( Figura 2).

90 80 70 Porcentaje

60 50 40 30 20 10 0 Estacas

Frutos

Plántulas

Material vegetal

Figura 2. Tipo de material vegetal colectado

B.

ENRAIZAMIENTO DE ESTACAS

El proceso de enraizamiento de las accesiones recolectadas, va desde los 70 a 90 días con un prendimiento que oscila entre el 50 y 60%, porcentaje que está influenciado por el tipo de estaca utilizada (media, basal y apical en su orden). C.

TRASPLANTE

Previo al trasplante en el invernadero, se diseñó la densidad de plantación, esto es la distancia entre plantas a 1m x 1,50m entre hileras; procediéndose a efectuar el hoyado y desinfección de los mismos, 8 días antes de esta actividad. D.

PRUEBAS DE GERMINACIÓN

Esta actividad se realizó con semillas de las accesiones correspondientes a chamburo (V. pubescens) y jigacho (V. spituplata) a los seis meses de almacenadas las mismas, en un período de 30 días; para lo cual se utilizó papel filtro como sustrato. En la Figura 3 se puede apreciar que el porcentaje de germinación es variable, lo cual puede estar en función de muchos factores, como: tamaño del fruto,

7 estado de madurez de las semillas, latencia, contenido de humedad, entre otros; el rango de germinación oscila entre el 50 y 92%.

100

90

80

70

5. Caracterización ex situ 60

50

40

30

20

10

0 E06

E10

E11

E14

E20

E57

E59

E61

E63

E64

E65

E66

E68

E69

E94

E100 E102 E114

E117 E118 E119

E121 E122

E124 E127 E129

E144 E148

E151 E152 E153

ACCESIONES

Figura 3. Porcentaje de germinación en 31 accesiones En el Cuadro 2, se presenta un resumen de los principales índices de dispersión y de tendencia central de las pruebas de germinación realizadas para las 31 accesiones de la colección de caricáceas. En términos generales se observa una relativa concentración de la capacidad germinativa de las accesiones alrededor de la media general, con una desviación estándar de 10.31% y un coeficiente de variación de 14.09%. Sin embargo se puede observar que el rango entre el valor máximo y el mínimo (42%) es bastante amplio como consecuencia probablemente de la diversidad genética así como también del diferente estado fenológico en que fue posible realizar las colecciones. CUADRO 2. ÍNDICES DE DISPERSIÓN Y DE TENDENCIA CENTRAL DE LAS PRUEBAS DE GERMINACIÓN

Coeficiente Variación

Desviación Estándar

Promedio

Valor Máximo

Valor Mínimo

Rango

14.09 %

10.31 %

73.19 %

92 %

50 %

42 %

8

E.

CARACTERIZACIÓN IN SITU

La caracterización in situ, consistió en la toma y registro de la información más importante de las plantas madres, de donde se obtuvieron las muestras; se utilizó un listado de 46 descriptores cuantitativos y cualitativos, sobre: tallos, hojas, flores y frutos, los mismos que serán procesados en una etapa posterior de desarrollo de este proyecto. A continuación se presentan las características más relevantes de las especies que agrupan a la mayor parte de las accesiones colectada 1.

2.

Vasconcellea pentagona

Tallo: Altura Diámetro

2.5 m 0.12 m

Hojas: Longitud Ancho

0.34 m 0.46 m

Flor: Sépalos Pétalos Estilo

0.001 m 0.025 m 0.005 m

Fruto: Longitud Diámetro Peso

0.22 m 0.11 m 520 g

Vasconcellea stipulata Tallo: Altura Diámetro

7.0 m 0.30 m

Hojas: Longitud Ancho

0.28 m 0.42 m

Flor: Sépalos Pétalos Estilo

0.001 m 0.020 m 0.008 m

Fruto: Longitud Diámetro Peso

0.11 m 0.06 m 91 g

Semilla: Número

20

9

3.

4.

Vasconcellea pubescens Tallo: Altura Diámetro

8.5 m 0.25 m

Hojas: Longitud Ancho

0.24 m 0.35 m

Flor: Sépalos Pétalos Estilo

0.019 m 0.045 m 0.004 m

Fruto: Longitud Diámetro Peso

0.09 m 0.05 m 110 g

Semilla: Número

35

Longitud Diámetro

0.006 m 0.004 m

Tallo: Altura Diámetro

2.35 m 0.08 m

Hojas: Longitud Ancho

0.20 m 0.18 m

Flor: Sépalos Pétalos

0.001 m 0.03 m

Fruto: Longitud Diámetro Peso

0.07 m 0.05 m 80 g

Semilla: Número

13

Longitud Diámetro

0.01 m 0.005 m

Vasconcellea monoica

10 F.

CARACTERIZACIÓN EX SITU

A nivel de invernadero del banco germoplásmico de la UTA, se ha procedido a describir las características agromorfológicas de las accesiones (40), conforme alcanzan su etapa reproductiva, para lo cual se consideró un listado de 100 ítems o descriptores, tanto cuantitativos y cualitativos, una vez que se concluya con la toma de datos se realizarán los análisis estadísticos correspondientes para identificar con precisión las especies colectadas; sin embargo utilizando la clave de las especies de Badillo, V.M., preliminarmente se ha identificado las especies que se señalan a continuación con la descripción de algunas de las características consideradas importantes: 1.

Vasconcellea pentagona

Fotografía 1. Tallo

Fotografía 2. Hoja

Color: 5Y 5/4 Distancia entre nudos : 0. 11 m Diámetro: 0. 25 m Longitud: 1.90 m

Color: 5 GY4/6 Numero de lobos: 5 Ancho: 0. 35 m Longitud: 0.27 m

11

Fotografía 3. Flores

Tipo de floración: Solitaria Color pétalos: 2.5 GY 8/10 Longitud: 0.28 m

2.

Fotografía 4. Frutos

Color : 2.5 Y 6/6 Longitud: 0.24 m Diámetro: 0.14 m

Vasconcellea stipulata

Fotografía 5. Tallo

Fotografía 6. Hoja

Color: 2.5GY 5/4 Distancia entre nudos : 0. 22 m Longitud: 2.90 m

Color: 5 GY3/4 Numero de lobos: 5 Longitud: 0.33 m

12

Fotografía 7. Flores

Fotografía 8. Frutos

Tipo de floración: Inflorescencia Color pétalos: 5 Y 8/10 Longitud: 0.05 m

Color : 2.5 Y 6/6 Longitud: 0.16 m Diámetro: 0.09. m

3.

Vasconcellea pubescens

Fotografía 9. Tallo

Fotografía 10. Hoja

Color: 2.5GY 5/2 Distancia entre nudos : 0. 12 m Diámetro: 0. 26 m Longitud: 3.20 m

Color: 7.5 GY3/2 Numero de lobos: 7 Ancho: 0. 36 m Longitud: 0.40 m.

13

Fotografía 11. Flores

Fotografía12. Frutos

Tipo de floración: Inflorescencia Color pétalos: 2.5 Y 8/10 Longitud: 0.03 m

Color : 2.5 Y 7/12 Longitud: 0.08 m Diámetro: 0.06. m

4.

Vaconcellea palandensis

Fotografía 13. Tallo

Fotografía 14. Hoja

Color: 2.5GY 5/4 Distancia entre nudos : 0. 16 m Diámetro: 0. 07 m Longitud: 1.20 m

Color: 7.5 GY3/6 Numero de lobos: 5 Ancho: 0. 33 m Longitud: 023 m

14 G.

CONSERVACIÓN DE ACCESIONES EN INVERNADERO Y CÁMARA FRÍA

Las accesiones colectadas mediante: estacas y plántulas, se conservan en invernadero. Las actividades de manejo y conservación son permanentes, tales como: toma de datos para la caracterización de las accesiones, controles fitosanitarios, abonadura orgánica, fertilización, deshierbas y riegos.

UTA - IPGRI

Banco de germoplasma caricáceas

En tanto que, las accesiones colectadas mediante frutos (semillas) se conservan en cámara fría a 4º C. de temperatura, realizándose pruebas de germinación para determinar la capacidad germinativa de la semilla almacenada. H.

REGENERACIÓN DE MATERIAL

Se realizó la regeneración vegetativa de las accesiones que luego del transplante no sobrevivieron. En relación a la colección que se mantiene en cámara fría se ha iniciado un proceso de regeneración mediante el reemplazo con semilla fresca proveniente de las accesiones conservadas en el invernadero que están en la fase de producción de frutos y semillas, como es el caso de V. pubescens y V. stipulata. I.

CREACIÓN BANCO DE DATOS

La base de datos que se mantiene en hojas electrónicas del computador, esta conformada por los descriptores en los que se ingresa la información recolectada a nivel de campo, es decir valores cuantitativos y cualitativos; y, los datos pasaporte. J.

BENEFICIARIOS

Los principales beneficiarios del proyecto han sido profesionales de la zona, estudiantes de Ciencias Agropecuarias de las universidades: Estatal de Bolívar, Cuenca, Técnica del Norte y UTA, Colegio Pedro Fermín Cevallos, quienes recibieron

15 charlas sobre colección, conservación, manejo y tecnología de producción de las especies en estudio. IV.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

- Se recolectaron 149 accesiones, de las diferentes especies de caricáceas, cuya información se encuentra debidamente documentada en la base de datos computarizada. - El rango altitudinal cubierto en las recolecciones, abarcó la mayoría de nichos agroecológicos del callejón interandino, ubicados entre los 1500 y 3 200 metros sobre el nivel del mar. - La caracterización preliminar in situ y ex situ de las accesiones permiten establecer las características particulares para cada una de ellas. - Los descriptores utilizados para la caracterización agromorfológica son instrumentos adecuados para la recolección y registro de información. El uso de claves taxonómicas ha permitido la identificación parcial de accesiones que pertenecen a: Vasconcellea pentágona, Vasconcellea stipulata, Vasconcellea pubescens y Vasconcellea monoica. - El 79.19% de las accesiones que forman parte de la colección viva se mantienen a nivel de invernadero; en tanto que, el 20.81% se conserva en cámara fría mediante semilla. - Es necesario concluir la caracterización agromorfológica y evaluar este importante recurso genético para identificar las bondades de las diferentes accesiones desde el punto de vista agronómico, agroindustrial, etc. - También deben realizarse estudios sobre: selección, fisiología de semillas, biología floral, etc.

V.

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16 5.

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Cultivo de babaco en Loja.

17 17.

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18.

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18 ANEXO 1. Provincia Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Bolívar Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo

DATOS PASAPORTE DE CARICACEAS Cantón Guaranda Guaranda Guaranda Guaranda Guaranda Guaranda Guaranda Guaranda Chillanes Chillanes Chillanes Chillanes Chillanes Chillanes Chillanes San Miguel San Miguel Chillanes San Miguel San Miguel Alausí Alausí Alausí Alausí Alausí Alausí Alausí Alausí Alausí Alausí

Parroquia Guanujo Guanujo Guanujo Guanujo Guanujo Guanujo Guanujo Guanujo La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz San Pablo San Pablo La Matriz La Matriz La Matriz La Moya La Moya Guasuntos La Matriz La Matriz Sibambe Sibambe Sibambe Sibambe Sibambe

Localidad 4 Esquinas 4 Esquinas 4 Esquinas 4 Esquinas Partidero La Matriz La Matriz La Matriz Centro Centro Centro Centro Centro Centro Centro Centro Entrada Centro Entrada Ciudad Entrada Ciudad Centro Aguaisa Guasuntos Control Norte Control Norte Pepinales Pepinales Cascarilla Cascarilla Cascarilla

Altitud (msnm) 2832 2832 2832 2832 2823 2789 2789 2789 2345 2345 2345 2345 2380 2367 2410 2510 2460 2345 2803 2803 2430 2434 2577 2577 2577 2169 2130 1905 1921 1980

Longitud (W) 79° 00' 58" 79° 00' 58" 79° 00' 58" 79° 00' 58" 79° 00' 54" 79° 02' 06" 79° 02' 24" 79° 02' 42" 79° 02' 35" 79° 02' 35" 79° 02' 35" 79° 02' 35" 79° 04' 44" 79° 04' 13" 79° 04' 23" 79° 04' 16" 79° 04' 02" 79° 02' 35" 79° 02' 50" 79° 02' 51" 78° 48' 01" 78° 48' 01" 78° 46' 12" 78° 50' 11" 78° 50' 11" 78° 55' 39" 78° 56' 05" 78° 57' 02" 78° 56' 55" 78° 56' 55"

Latitud (S) 01° 34' 48" 01° 34' 47" 01° 34' 47" 01° 34' 47" 01° 34' 43" 01° 34' 11" 01° 31' 45" 01° 33' 20" 01° 42' 06" 01° 42' 06" 01° 42' 06" 01° 42' 06" 01° 52' 16" 01° 54' 13" 01° 42' 06" 01° 48' 29" 01° 47' 32" 01° 42' 06" 01° 41' 30" 01° 41' 32" 02° 14' 09" 02° 14' 09" 02° 13' 15" 02° 11' 14" 02° 11' 14" 02° 14' 54" 02° 15' 15" 02° 14' 59" 02° 15' 13" 02° 15' 13"

Accesión # ECU001 ECU002 ECU003 ECU004 ECU005 ECU006 ECU007 ECU008 ECU009 ECU010 ECU011 ECU012 ECU013 ECU014 ECU015 ECU016 ECU017 ECU018 ECU019 ECU020 ECU021 ECU022 ECU023 ECU024 ECU025 ECU026 ECU027 ECU028 ECU029 ECU030

Tipo Muestra Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Frutos Estacas Estacas Estacas Fruto/Estaca Fruto/Estaca Estacas Estacas Frutos Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Fruto/Estaca Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas

19 Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Chimborazo Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Tungurahua Cañar Cañar Cañar Cañar Cañar Cañar Cañar Cañar Cañar Cañar Cañar Cañar

Alausí Alausí Alausí Alausí Alausí Alausí Pallatanga Pallatanga Píllaro Píllaro Píllaro Píllaro Píllaro Píllaro Píllaro Píllaro Patate Patate Patate Patate Patate Patate El Tambo El Tambo El Tambo Biblian Azogues Azogues Deleg Deleg Azogues Cañar El Tambo El Tambo

Sibambe Sibambe Sibambe Sibambe Sibambe Sibambe Pallatanga Pallatanga La Matriz San Miguelito San Miguelito Marcos Espinel E. Terán E. Terán E. Terán E. Terán La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz Juncal Juncal La Matriz Biblián Luis Cordero Luis Cordero La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz Juncal Juncal

Padrehurco Padrehurco Padrehurco Huigra Alpachaca Alpachaca El Guapo Huaracpo La Matriz Centro Centro Entrada Centro Plazuela Centro Centro Mundug Mundug La Pradera La Pradera La Pradera Leito Charcay Charcay Centro La Baquería Leonan Quillupongo El Rocío El Rocío Playa Río Burgay Sur de la ciudad Chanchoguso Chanchoguso

2575 2620 2620 1725 2753 2250 2047 2502 2672 2618 2618 2639 2585 2515 2585 2588 2634 2634 2607 2606 2606 2758 2944 2944 3004 2919 2995 2902 2811 2850 2797 2816 2845 2845

78° 56' 57" 78° 57' 05" 78° 57' 05" 78° 57' 13" 78° 55' 43" 78° 56' 53" 78° 58' 27" 78° 55' 20" 78° 31' 17" 78° 30' 47" 78° 30' 47" 78° 32' 57" 78° 32' 17" 78° 28' 37" 78° 32' 17" 78° 29' 21" 78° 29' 28" 78° 29' 27" 78° 29' 47" 78° 29' 47" 78° 29' 47" 78° 33' 26" 78° 59' 18" 78° 59' 18" 78° 55' 39" 78° 53' 29" 78° 48' 31" 78° 48' 48" 78° 55' 04" 78° 55' 04" 78° 54' 12" 78° 56' 01" 78° 58' 03" 78° 58' 03"

02° 15' 13" 02° 12' 47" 02° 12' 47" 02° 15' 43" 02° 10' 35" 02° 08' 13" 01° 57' 47" 01° 59' 15" 01° 18' 39" 01° 17' 49" 01° 17' 49" 01° 18' 34" 01° 17' 29" 01° 16' 27" 01° 17' 29" 01° 17' 36" 01° 17' 43" 01° 17' 34" 01° 17' 04" 01° 17' 04" 01° 17' 04" 01° 19' 21" 02° 28' 55" 02° 28' 55" 02° 30' 11" 02° 41' 10" 02° 43' 42" 02° 44' 15" 02° 45' 36" 02° 45' 36" 02° 42' 35" 02° 33' 10" 02° 29' 58" 02° 29' 58"

ECU031 ECU032 ECU033 ECU034 ECU035 ECU036 ECU037 ECU038 ECU039 ECU040 ECU041 ECU042 ECU043 ECU044 ECU045 ECU046 ECU047 ECU048 ECU049 ECU050 ECU051 ECU052 ECU053 ECU054 ECU055 ECU056 ECU057 ECU058 ECU059 ECU060 ECU061 ECU062 ECU063 ECU064

Estacas Plántula Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Frutos Estacas Frutos Estacas Frutos Estacas Frutos Frutos

20 Cañar Cañar Chimborazo Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Azuay Azuay Azuay Azuay Azuay Azuay Azuay Azuay Azuay

El Tambo El Tambo Chunchi Loja Loja Loja Loja Quilanga Quilanga Gonzanamá Gonzanamá Gonzanamá Gonzanamá Gonzanamá Gonzanamá Gonzanamá Gonzanamá Gonzanamá Quilanga Quilanga Quilanga Loja Saraguro Saraguro Saraguro Cuenca Cuenca Sigsig Sigsig Sigsig Chordeleg Gualaceo Guachapala Guachapala

Juncal Juncal Chunchi Valladolid Valladolid Valladolid Yangana La Matriz Quilanga Quilanga Gonzanamá Ginzanamá Gonzanamá La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz Quilanga La Matriz La Matriz La Matriz San Lucas San Lucas Urdaneta Baños San Joaquín La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz San Bartolomé La Matriz La Matriz

Chanchoguso Chanchoguso Compud Centro Centro Centro Centro Centro Anganuma Portete El Pilar El Pilar El Pilar Centro Centro Panamá Panamá Panamá Tizaca Centro Tizaca Vía Malacatos Centro Centro Urdaneta Minas Chugchogan Callancay Callancay Callancay Pitagna Centro Sacroalto Sacroalto

2845 2858 2754 1620 1625 1617 1782 1900 2355 2354 2193 2193 2193 2123 2123 2138 2138 2138 1915 1900 1918 2215 2485 2530 2544 2825 2888 1650 1650 1650 1628 2200 2400 2240

78° 58' 06 78° 58' 06 78° 02' 54" 79° 07' 25" 79° 07' 06" 79° 07' 06" 79° 10' 32" 79° 24' 45" 79° 25' 39" 79° 25' 04" 79° 26' 05" 79° 26' 12" 79° 26' 12" 79° 26' 12" 79° 26' 24" 79° 26' 04" 79° 26' 04" 79° 25' 56" 79° 24' 07" 79° 24' 37" 79° 24' 39" 79° 11' 07" 79° 15' 01" 79° 14' 17" 79° 13' 49" 79° 06' 13" 79° 05' 18" 78° 47' 49" 78° 47' 37" 78° 47' 37" 78° 47' 35" 78° 25' 37" 78° 42' 15" 78° 42' 15"

02° 30' 28" 02° 29' 58" 02° 26' 07" 04° 33' 01" 04° 33' 01" 04° 33' 02" 04° 21' 14" 04° 18' 22" 04° 17' 31" 04° 18' 01" 04° 15' 08 04° 15' 08" 04° 15' 08" 04° 13' 56" 04° 13' 48" 04° 13' 47" 04° 13' 47" 04° 12' 45" 04° 18' 47" 04° 18' 26" 04° 18' 27" 04° 03' 07" 03° 43' 53" 03° 37' 41" 03° 37' 08" 02° 55' 52" 02° 55' 41" 02° 58' 02" 02° 58' 02" 02° 58' 02" 02° 02' 16" 02° 10' 15" 02° 46' 30" 02° 46' 30"

ECU065 ECU066 ECU067 ECU068 ECU069 ECU070 ECU071 ECU072 ECU073 ECU074 ECU075 ECU076 ECU077 ECU078 ECU079 ECU080 ECU081 ECU083 ECU084 ECU085 ECU086 ECU088 ECU091 ECU092 ECU093 ECU094 ECU095 ECU096 ECU097 ECU098 ECU099 ECU100 ECU101 ECU102

Frutos Frutos Estacas Semilla Frutos Plántula Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Frutos Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Frutos Estacas Frutos

21 Azuay Azuay Azuay Azuay Azuay Azuay Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Cotopaxi Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha

El Pan El Pan Sevilla d Oro El Pan Paute Paute Salcedo Salcedo Salcedo Salcedo Salcedo Latacunga Latacunga Pujilí Pujilí Pujilí Pujilí Pujilí Saquisilí Saquisilí Saquisilí Mejía Mejía Mejía Rumiñahui Rumiñahui Rumiñahui Rumiñahui Rumiñahui Tabacundo Mejía Quito Quito Quito

El Pan San Vicente La Matriz San Vicente Bulán Bulán Matriz Matriz Matriz Yanchiliví Santa Ana San Buenaventura San Buenaventura La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz La Matriz Guaytacama Pastocalle Machachi Tambillo Uyumbicho Sangolquí Alangasí Alangasí Pintag Pintag La Esperanza Cochasqui San José de Minas Tababela Yaruquí

San Francisco Centro Centro Entrada parroquia Tierra Blanca Chaupicruz Yanayacu Yanayacu Yanayacu Vía a Napo Chisilivi Santa Bárbara Bellavista Vía a Isinchi Vía a Isinchi Isinche Isinche Tingo Chico Centro Centro Tandacoto Tesalia Grande Centro Centro Entrada ciudad Centro Centro Centro Centro Centro Pirámides Teodomiro Cueva Vía principal Vía principal

2440 2550 2410 2420 2500 2437 2672 2672 2672 2689 2740 2800 2800 3014 3014 3030 3030 3033 2850 2860 3165 2995 2529 2524 2516 2629 2629 2599 2599 2900 3072 2428 2583 2581

78° 10' 19" 78° 39' 07" 78° 39' 09" 78° 40' 19" 78° 35' 46" 78° 40' 58" 78° 35' 49" 78° 40' 58" 78° 40' 58" 78° 42' 35" 78° 46' 23" 78° 36' 41" 78° 36' 41" 78° 42' 09" 78° 42' 09" 78° 43' 07" 78° 43' 07" 78° 43' 07" 78° 40' 01" 78° 38' 30" 78° 38' 64" 78° 33' 13" 78° 30' 18" 78° 30' 14" 78° 25' 35" 78° 25' 02" 78° 25' 02" 78° 22' 16" 78° 22' 16" 78° 14' 56" 78° 18' 34" 78° 24' 39" 78° 20' 46" 78° 20' 46"

02° 46' 31" 02° 47' 31" 02° 47' 46" 02° 46' 28" 02° 44' 49" 02° 45' 56" 01° 45' 26" 01° 45' 56" 01° 45' 56" 01° 53' 44" 01° 57' 19" 00° 52' 22" 00° 52' 22" 00° 57' 34" 00° 57' 34" 00° 58' 19" 00° 58' 19" 00° 58' 19" 00° 58' 19" 00° 49' 29" 00° 44' 32" 00° 27' 44" 00° 22' 44" 00° 22' 34" 00° 18' 14" 00° 18' 20" 00° 18' 20" 00° 22' 39" 00° 22' 39" 00° 02' 25" 00° 03' 35" 00° 10' 17" 00°10' 53" 00° 10' 53"

ECU103 ECU104 ECU105 ECU106 ECU107 ECU108 ECU109 ECU110 ECU111 ECU112 ECU113 ECU114 ECU115 ECU116 ECU117 ECU118 ECU119 ECU120 ECU121 ECU122 ECU123 ECU124 ECU125 ECU126 ECU127 ECU128 ECU129 ECU130 ECU131 ECU132 ECU133 ECU134 ECU135 ECU136

Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Frutos Estacas Estacas Frutos Frutos Frutos Estacas Frutos Frutos Estacas Frutos Estacas Estacas Frutos Estacas Frutos Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas

22 Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Carchi Carchi Carchi Carchi Imbabura Imbabura Imbabura

Quito Quito Quito Quito Quito Tabacundo Quito Quito Quito Quito Espejo Dacha Dacha Montúfar Otavalo Atuntaqui Atuntaqui

Calacali Atahualpa Checa Quinche Azcasubi Tabacundo Puéllaro Nono Tumbaco Cunuyacu El Angel Huaca Huaca Cristóbal Colón Caranqui La Matriz La Matriz

Partidero a Nono Atahualpa Centro Vía Ibarra Vía Ibarra La Matriz Centro El Cortijo Villa Vega Cunuyacu Centro Centro Centro San Gabriel Centro Agualongo Agualongo

2518 2279 2581 2600 2585 2905 2083 2600 2427 2460 2983 2961 2961 2840 2388 2529 2529

78° 33' 34" 78° 22' 28" 78° 20' 46" 78° 17' 49" 78° 17' 53" 78° 13' 09" 78° 24' 11" 78° 35' 34" 78° 23' 08" 78° 26' 49" 77° 56' 52" 77° 43' 30" 77° 43' 30" 77° 48' 30" 78° 07' 25" 78° 14' 06" 78° 14' 06"

00° 00' 41"N 00° 07' 59" 00° 10' 53" 00° 06' 44" 00° 04' 55" 00° 02' 43" 00° 03' 54" 00° 00' 41"N 00° 12' 34" 00° 15' 01" 00° 37' 16"N 00° 38' 35"N 00° 38' 35"N 00° 36' 45"N 00° 18' 49'"N 00° 17' 40'"N 00° 17' 40'"N

ECU137 ECU138 ECU139 ECU140 ECU141 ECU142 ECU143 ECU144 ECU145 ECU146 ECU147 ECU148 ECU149 ECU150 ECU151 ECU152 ECU153

Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Estacas Frutos Plántula Estacas Estacas Frutos Estacas Estacas Frutos Frutos Frutos

4.2 Diversidad morfológica de las principales especies de papayas de montaña en el Ecuador. UTA, CIRAD-FLHOR / IPGRI

Diversidad morfológica de las principales especies de papayas de montaña en el Ecuador Jorge Vega (UTA), María Teresa Restrepo, Daniel Jiménez y Geo Coppens d’Eeckenbrugge (CIRAD-FLHOR / IPGRI) La caracterización morfológica de la colección reunida en el campo experimental de la Universidad de Ambato se realizó basándose en la lista de descriptores desarrollada en el proyecto. El análisis de estos datos sigue el mismo patrón usado para los datos colectados en Costa Rica. Sin embargo no se analizaron los datos de los machos, relativamente poco numerosos en la colección, porque los cultigenes más frecuentemente cultivados en el Ecuador son hembras propagadas por vía vegetativa. La muestra estudiada está compuesta de V. cundinamarcensis (tres accesiones), V. stipulata (tres accesiones, caracterizadas in situ), de jigacho, incluyendo V. x heilbornii var. chrysopetala (17 accesiones “T1”) y una forma vecina de ésta, que se diferencia por el tamaño de las estípulas y el color verdoso de las flores, que llamamos V. af. x heilbornii var. chrysopetala (seis accesiones “T2”) y de babaco, V. x heilbornii var. pentagona (14 accesiones). Recordemos que la taxonomía actual del género considera que los dos primeros taxones son los parentales de los babacos y jigachos. Los componentes de la varianza de los caracteres cuantitativos están presentados en la (figura 1). Todos los descriptores presentan un índice de repetibilidad elevado, indicando una heredabilidad relativamente alta y permitiendo su uso en los análisis siguientes. Las diferencias entre taxones contribuyen fuertemente a la variación observada. 100

Estimated Relative Variance (%)

80

60

40

20

0 LPEC AHO NLOB DSEN LFL LPÉT LEST DPEC LHO NLOBU LPED LSEP LOVAR LESTG

Error 2-ACCESION 1-ESPECIE

Figura 1. Componentes de la varianza. LPEC= Longitud del peciolo, DPEC= Diámetro del peciolo, AHO= Ancho de la hoja, LHO= Longitud hoja, NLOB= Número de lobos, NLOBU= Número de lobulillos, DSEN= distancia al seno derecho, LPED= Longitud del pedúnculo, LFL= Longitud flor, LSEP= Longitud sépalos, LPET= Longitud pétalos, LOVAR= Longitud ovario, LEST= Longitud estilo, LESTG= Longitud de los estigmas.

El análisis de componentes principales destaca cuatro factores, relacionados respectivamente con (1) el tamaño de la hoja, (2) la longitud de la flor, (3) la longitud del estigma y del pedúnculo, y (4) el número de lobos y lóbulos de la hoja y la longitud de los sépalos, explicando en su conjunto 76% de la varianza total. La proyección de las accesiones en el plano principal (figura 2); muestra un fuerte efecto de los valores excepcionales medidos en V. stipulata ‘Chiquiribamba’ sobre la dispersión en el primer eje. Muestra una agrupación de los babacos y una dispersión de V. x heilbornii var. chrysopetala y de V. cundinamarcensis. 3.5

2.5

T2-8 T2-51B st2-9 T2-52 cun3 T2-7A

FACTOR2 (22%)

1.5

T2-51 Taquil

T2-48

T1-79 T1-21 T1-73 bab50 T1-2 T1-7B T1-81 T1-4 T1-17 T1-19 bab47 bab51B bab85 T1-56 bab13 bab77 bab42

0.5

-0.5

T1-5

cun4 T1-12

Chiquiri

T1-78 T1-67 cun1 T1-60 T1-71 T1-26

bab44 bab41bab39 bab23 bab46 bab45

-1.5

bab40

-2.5 -2

-1

0

1

2

3

4

FACTOR1 (24%)

Figura 2. Proyección de las accesiones en el plano principal. (46% de la varianza)

El dendrograma elaborado con los cuatro factores principales (figura 3); muestra la misma tendencia, pero con una agrupación de V. x heilbornii var. chrysopetala en dos ramas principales y la separación de los babacos 47, 50, 85, 51B y 77 de los demás. El dendograma obtenido con los caracteres cualitativos (figura 4); muestra una clara agrupación de los pocos representantes de las especies parentales, V. cundinamarcensis y V. stipulata. Separa claramente cada una de las dos formas de jigacho en dos grupos principales, revelando una heterogeneidad insospechada de estos cultigenes. Los dos grupos de V. x heilbornii var. chrysopetala se situan entre el babaco y V. stipulata, mientras que V. af. x heilbornii var. chrysopetala expresa una mayor afinidad con V. cundinamarcensis. La separación de los babacos 47, 50, 85, 51B y 77, que alcanzan a formar un subgrupo, confirma claramente las observaciones cuantitativas. Esta heterogeneidad morfológica es la primera confirmación de resultados obtenidos con marcadores AFLP en la Universidad de Gante.

Figura 3. Dendrograma elaborado con los cuatro componentes (Variación cuantitativa; neighbor joining, distancia euclidiana)

V.x h. pentatona (bab)

V. x h. chrysopetala (T1)

V. stipulata

V. cundinamarcensis

V. x. h af chrysopetala

Figura 4. Dendograma obtenido con los caracteres cualitativos. (Neighbor Joining, distancia de Soakal y Michener)

Los resultados obtenidos son compatibles con la hipótesis según la cual el babaco y el jigacho son frutos de la introgresión mutua entre V. stipulata y V. cundinamarcensis. La heterogeneidad observada sugiere que el rol de la reproducción sexual podría ser más importante que lo suponíamos en la evolución de estos cultigenes. Prácticamente, la existencia de subgrupos claros dentro del babaco y del jigacho es un elemento nuevo y muy importante para tomar en cuenta en el mejoramiento y la promoción de estos dos cultivos en pleno desarrollo comercial en el Ecuador. El análisis de estos resultados será profundizado para una publicación en una revista científica internacional.

4.3 Estudio de cepas ecuatorianas del virus de la mancha anular. INIAP

Aprovechamiento de los Recursos Genéticos de las Papayas para su Mejoramiento y Promoción Lenin Paz Carrasco Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), Estación Experimental Boliche, P.O.BOX 09-01-7069, Guayaquil-Ecuador.

INTRODUCCIÓN En el Ecuador el cultivo de papaya (Carica papaya L.) es de importancia socioeconómica. Según el III Censo Nacional Agropecuario (INEC/MAG/SICA, 2002) existen 1.608 has sembradas en monocultivo y 2.309 has sembradas en asocio con otros cultivos cuya producción se destina al consumo interno y a la exportación como fruta fresca o elaborados de conserva. La mayor parte de la producción se concentra en las regiones tropicales y subtropicales. Este cultivo no está exento de agentes bióticos que merman los rendimientos paulatinamente, un problema serio es el originado por virus fitopatógenos. Por síntomas reportados en la literatura internacional se sospecha que el virus de la mancha anular de la papaya (papaya ringspot potyvirus, PRSV) es el responsable del detrimento y deterioro de las plantas cultivadas en monocultivo o asociados. El PRSV es un virus de transmisión no persistente realizada por áfidos y no se conocen en el país los especímenes involucrados en la transmisión de este virus. Esta enfermedad causa pérdidas al originar frutos con características no deseables y muerte de las plantas afectadas. La situación expuesta ha permitido que muchos agricultores no siembren esta fruta por la manifestación endémica que presenta esta enfermedad en papaya lo que se evidencia por el número reducido de superficie sembrada.

REVISIÓN DE LITERATURA Es necesario hacer una historia breve respecto al PRSV-W (tipo watermelon) y el PRSV-P (tipo papaya). El PRSV-W fue formalmente llamado watermelon mosaic virus-1 (WMV-1), posteriormente este virus fue caracterizado y se estableció que el virus presenta dos entidades distintas el WMV-1 y el WMV-2 (Zitter et al., 1996). Estos autores demostraron que el WMV-1 y el PRSV son serológicamente idénticos pero que incluyen dos diferentes patotipos el PRSV-P (tipo papaya) y el PRSV-W (tipo watermelon). Concluyen que el PRSV-P infecta a la papaya y muchas cucurbitáceas mientras que el PRSV-W está confinado exclusivamente a las cucurbitáceas. Taxonómicamente el PRSV es un virus que pertenece a la familia potyviridae, género potyvirus cuyo ácido nucleico es de RNA de cadena sencilla de polaridad positiva (ssRNA+), sus partículas presentan formas alargadas y flexuosas que no poseen envoltura con dimensiones aproximadas de 760-780x12 nm (Agrios, 1997). Respecto a los insectos vectores, en Hawai se realizaron investigaciones para estudiar el comportamiento biológico de los áfidos en la transmisión del PRSV (Jensen, 1949). Los resultados evidenciaron que Myzus persicae (Sulzer) es un áfido eficiente para transmitir el PRSV seguido de otros especímenes como Aphis gossypii (Glover), Aphis medicaginis (Koch) y Aphis rumicis (L.). En otra investigación realizada en el Valle de Zapolitán en El Salvador identificaron varias especímenes de áfidos asociados al cultivo de la papaya (Rivas et al., 1991) los especímenes más frecuentes fueron Aphis citricola,

Rhopalosiphum maidis, Acyrtosiphum pisum, Aphis craccivora (Koch), Aphis illinoisensis (Shimer), A. middletoni y A. coreopsidis. Iguales trabajos fueron realizados en Colombia donde el PRSV es de alta incidencia y fácil diseminación (Varón y Aguilera, 1983). Mediante pruebas de transmisión biológica con áfidos se estableció la capacidad transmisora que tienen Acyrtosiphon solani, Toxoptera citricidus, Aphis gossipii (Glover) , Hysteroneura setariae, Myzus persicae (Sulzer), Aphis citricola, Macrosiphum rosae y T. aurantii. Las plantas inoculadas manifestaron síntomas de mosaico, vejigas, deformación foliar, manchas aceitosas en tallos y peciolos y un leve retardo en su crecimiento. Yeh et al. (1984) mencionan que el PRSV tiene como hospederos alternos a las cucurbitáceas cultivadas y silvestres. Estos investigadores estudiaron nueve aislados del PRSV de diferentes países mediante inoculación mecánica a Cucumis metuliferus (Acc. 2459) y Cucumis anguria var. longipes. Estos aislados del PRSV produjeron síntomas del virus al inocularse y su identidad viral se comprobó por inmunodifusión con dodecil sulfato sódico. Estos resultados evidencian que a pesar de ser aislados diferentes, el PRSV presenta propiedades biológicas y serológicas similares. La importancia del PRSV es evidente por las diversas investigaciones realizadas sobre su incidencia y distribución, un ejemplo es el trabajo realizado por Wan y Conover (1983) en diversos condados del sur de la Florida. Ellos determinaron que la incidencia del PRSV está ampliamente presente en los condados Dade (100%), Monroe, (64%) y Sarasota (14%).

MATERIALES Y MÉTODOS Recolección de muestras Se recolectó 31 muestras de hojas con síntomas virales y dudosos de cultivos de papaya de cuatro provincias del Ecuador (Guayas, Los Ríos, Pichincha, Manabí). El material vegetal recolectado se introdujo en fundas plásticas y conservadas dentro de una hielera portátil. Cada muestra foliar se identificó y llevó información específica como: localidad, variedad, etapa de crecimiento del cultivo y tipo de síntomas. También se fotografiaron las muestras. Serología Para identificar el virus de la mancha anular (papaya ringspot potyvirus, PRSV) y el virus del mosaico de la papaya (papaya mosaic potexvirus, PapMV) se utilizaron procedimientos de ensayos inmunológicos con conjugados enzimáticos (Clark y Adams, 1977). Para la detección del PRSV se empleó una ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) indirecta utilizando un anticuerpo monoclonal específico para el grupo de los potyvirus producido por la compañía Agdia® (Elkhart, Indiana). Para la detección del PapMV se utilizó ensayos inmunológicos con conjugados enzimáticos doble anticuerpo sandwich (DAS-ELISA) cuyo anticuerpo reconocen epitopes de Cassava comonn mosaic potexvirus (CCMV). Las reacciones serológicas se leyeron en un lector de ELISA marca MRX a una absorbancia de 405 nm. Microscopía electrónica Extractos de hojas de papaya se tiñeron negativamente con acetato de uranilo, pH 3.0, posteriormente fueron examinadas en un microscopio electrónico de transmisión. RT-PCR Para este análisis se tomaron de entre las muestras que reaccionaron positivas a la prueba de ELISA dos muestras aleatorias para posteriormente realizar una extracción

total del RNA viral con un Kit de Qiagen (Rneasy Plant Mini Kit Cat. No. 74904) y luego realizar una RT-PCR. El control negativo consistió sólo de reactivos y el control positivo un DNA complementario (cDNA) de tomate. El producto de la RT-PCR se corrió en electroforesis. Los resultados de las bandas se estimaron con un marcador de DNA de 1 Kb (Invitrogen). RESULTADOS La prueba de ELISA para el PRSV (Cuadro 1) determinó que 23 de las 31 muestras de hojas de papaya colectadas (Guayas, Los Ríos, Pichincha, Manabí) fueron positivos para este virus lo que representa el 74.1% de muestras infectadas distribuidas de la siguiente manera: Guayas 38.7%, Los Ríos 6.4%, Pichincha 9.7% y Manabí 19.3%. Los síntomas foliares consistieron de clorosis, mosaico, mosaico suave, mosaico vistoso y pata de rana. No se detectó ninguna muestra afectada por potexvirus. El 25.9% restante de las muestras se relacionaron a deterioro y posibles efectos nutricionales. Cuadro1. Distribución del papaya ringspot potyvirus (PRSV) y papaya mosaic potexvirus (PapMV) en el cultivo de papaya en muestreos hechos en cuatro provincias del Ecuador (Guayas, Los Ríos, Manabí y Pichincha). Provincias

Muestras foliares

Número de muestras en prueba de ELISA PRSV PapMV

Número de muestras

Porcentaje

Número de muestras

Porcentaje

Número de Porcentaje muestras

Guayas

16

51.6

12

38.7

0

0

Los Ríos

2

6.5

2

6.4

0

0

Pichincha

6

19.3

3

9.7

0

0

Manabí

7

22.6

6

19.3

0

0

Total

31

100

23

74.1

0

0

El PRSV posee partículas alargadas y flexuosas (Figura 1) de aproximadamente 800 x12nm.

Figura 1. Morfología de la partícula viral del papaya ringspot potyvirus (PRSV)

Control (-)

cDNA

bp

Manabí

Guayas

En la figura 2 se observa la corrida de electroforesis de las muestras procedentes de la provincia del Guayas (cantón Naranjal) y Manabí (cantón El Carmen) en gel de agarosa 1%. Las bandas de las provincia del Guayas y Manabí presentan un peso molecular aproximado de 600 pares de bases.

3054 2036 1636 1018 517/506

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa de productos de RT-PCR generados de la extracción de ssRNA viral de papaya (Guayas, Manabí). Control positivo (cDNA de tomate) y control negativo (reactivos).

RECOMENDACIONES Identificar y realizar pruebas de transmisión biológica con áfidos confinados en los sistemas de producción de papaya. Comparar secuencias genéticas del PRSV con aislados de otros países. Seleccionar plantas de papaya que manifiesten tolerancia al virus de la mancha anular de la papaya y proceder a una mejora genética en cultivares de siembra tradicional.

BIBLIOGRAFÍA Agrios, GN. 1997. Plant Pathology. Academic Press. A. Harcourt Science and Technology Company, San Diego, California, 635 p. Clark, MF.y Adams, AN. 1977. Characteritics of the microplate method of enzyme – linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34:475-483. INEC (Instituto Nacional de Estadística y Censos, EC)/MAG (Ministerio de Agricultura y Ganadería, EC)/SICA (Proyecto Servicio de Información y Censo Agropecuario,

EC). 2002. III Censo Nacional Agropecuario: Resultados Nacionales y Provinciales. Ecuador, EC. V.1, 255 p. Jensen, DD. 1949. Papaya ringspot virus and its insect vector relationships. Phytopathology. 39:212-220. Rivas, GG.; Larios, JF.; Reyes, R.; Meneses, R. 1991. Afluencia de áfidos en papayo en el valle de Zapotitan, El Salvador. Manejo Integrado de Plagas. Programa de Mejoramiento de Cultivos Tropicales. Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza. Turrialba, Costa Rica. 22:14-17 Varón, F.; Aguilera, E. 1983. Insectos involucrados en la transmisión de la mancha anular de la papaya (PRSV). ASCOLFI Informa. Boletín de la Asociación Colombiana de Fitopatología y Ciencias Afines. 9(6):36-37 Wan, S.-H. y Conover, RA. 1983. Incidence and distribution of papaya viruses in southern Florida. Plant Dis. 67 (4):353-356. Yeh, S. –D.; Gonsalvez, D.; Provvidenti, R. 1984. Comparative studies on host range and serology of papaya ringspot virus and watermelon mosaic virus 1. Phytopathology 74(9):1081-1085 Zitter, TA.; Hopkins, DL.; Thomas, CE. (eds). 1996. Compendium of Cucurbit Diseases. American Phytopathological Society, APS Press. St. Paul, Minnesota. 87 pp.

ANEXO 5 Informes de Costa Rica

5.1 Caracterización in situ y colecta de muestras de papayas silvestres y cultivadas de Costa Rica para estudios de diversidad. UCR, CIRAD-FLHOR / IPGRI

Caracterización in situ y colecta de muestras de papayas silvestres y cultivadas de Costa Rica para estudios de diversidad Eric Mora (UCR), Maria Teresa Restrepo, Geo Coppens d’Eeckenbrugge (CIRAD-FLHOR / IPGRI), Daniel Jiménez (CIRAD-FLHOR / IPGRI / U. Caldas) La papaya común tiene su origen en América central. Se encuentran papayos silvestres desde sur de México y Yucatán hasta Panamá, y posiblemente el noroeste de Colombia. Por esta razón, la caracterización del material de Costa Rica presenta un interés particular dentro del proyecto. Podemos considerar los materiales silvestres como referencias para cualquier estudio de la diversidad presente en los otros países participantes. Costa Rica también presentaba una alta diversidad de materiales cultivados tradicionalmente, sin embargo la evolución de la producción costarricense ha llevado a una fuerte y rápida erosión genética, lo que nos ha impedido hacer un verdadero estudio de las relaciones entre los dos tipos de materiales, silvestres y cultivados. Para diseñar la metodología para estos estudios, tuvimos que tomar en cuenta la imposibilidad de constituir una colección de campo, por las mismas normas del proyecto que prohíben la utilización de mano de obra, aún para trabajos excepcionales como la instalación del germoplasma. El estudio está basado en tres componentes complementarios: caracterización morfológica, caracterización isoenzimática y caracterización molecular por medio de microsatélites nucleares y de PCR-RFLP (CAPS) del ADN cloroplástico. En la presente sección del informe, presentamos los resultados de las caracterizaciones morfológica e isoenzimática. Los resultados de la caracterización molecular están presentados en los informes respectivos de John Ocampo y María Teresa Restrepo.

Figura 1. Distribución geográfica del material estudiado

Origen de los materiales La figura 1 muestra la repartición geográfica de las 39 muestras estudiadas in situ. En su gran mayoría, son materiales silvestres. El material CH15 proviene de un cultivo comercial del cultivar local Lucía. Unos pocos se encuentran cultivados o tolerados en huertos caseros, y presentan indicios de introgresión mutua, como pulpa amarilla y hojas poco cortadas en ejemplares cultivados o frutos medianos en ejemplares silvestres. Se completó la muestra con siete plantas de variedades cultivadas, ‘Maradol’, ‘Solo’ y ‘Criolla’, para efectos de comparación. Caracterización morfológica La caracterización se hizo sobre la base de la lista de descriptores desarrollada en el contexto del proyecto. Los caracteres cuantitativos fueron sometidos al análisis de los componentes de la varianza, al análisis de los componentes principales (con rotación varimax normalizada) y a un análisis de clasificación por el método del vecino más próximo (neighbor joining). Los caracteres con distribución plurimodal o que muestran un poder discriminante entre especies u orígenes se codificaron para incluirlos en el estudio de los caracteres cualitativos. El conjunto de caracteres cualitativos fue sometido a análisis factorial de correspondencia y de clasificación por el método del neighbor joining.

100

80

80

A)

Error

LEST

LESTG

LPET

LOVAR

LFL

LSEP

LPED

LOBULHO

DSEN

SENLHO

NLOBU

LHO

0

NLOB

20

AHO

LPISTI

LTUBCAL

LLOBCAL

LFL

LSEP

LPED

LOBULHO

DSEN

SENLHO

NLOBU

LHO

NLOB

AHO

LPEC

0

DPEC

20

40

LPEC

40

60

DPEC

60

DENT

Estimated Relative Variance (%)

100

DENT

Estimated Relative Variance (%)

En un primer análisis de la varianza, se compararon los valores tomados por los descriptores cuantitativos en función del sexo. En los caracteres vegetativos, sólo se encontró un efecto significativo sobre la longitud del lobo central de la hoja, mayor en el caso de las hembras, y sobre la densidad de lóbulos sobre este lobo. Las figuras 2A y 2B presentan el resultado del análisis de los componentes de la varianza para los machos y las hembras. Todos los descriptores muestran un índice de repetibilidad ampliamente superior al 50%, con excepción de la longitud del sépalo en los machos, lo que permite usarlos para los análisis siguientes.

B)

1-ACCESION

Figura 2. Análisis de los componentes de la varianza para los descriptores cuantitativos. A: machos; B: hembras. DENT= Distancia entre los nudos, LPEC= Longitud del peciolo, DPEC= Diámetro del peciolo, AHO= Ancho de la hoja, LHO= Longitud hoja, NLOB= Número de lobos, NLOBU= Número de lobulillos, DSEN= distancia al seno derecho, SENLHO= Forma del seno proximal del peciolo, LPED= Longitud del pedúnculo, LFL= Longitud flor, LSEP= Longitud sépalos, LTUBCAL= Longitud del tubo del cáliz, LLOBCAL= Longitud de los lóbulos del cáliz, LPSTI= Longitud del pistilodio, LPET= Longitud pétalos, LOVAR= Longitud ovario, LEST= Longitud estilo, LESTG= Longitud de los estigmas.

En la muestra de las hembras, el análisis de componentes principales destaca cinco factores, respectivamente relacionados con el tamaño de la hoja, el tamaño de la flor, la longitud del estilo, la longitud del estigma, y el número de lobos de la hoja. Estos componentes explican 85% de la variación total. En el plano principal (figura 3A), los tipos cultivados se sitúan a la derecha, mientras que los tipos silvestres, con hojas más grandes y flores más pequeñas, se esparcen más a la izquierda, sin mostrar agrupación por proximidad geográfica.

Scatterplot (machofsccru.STA 4v*11c)

Scatterplot (hembrafsccru.STA 6v*16c)

1.6

2.0

SM18 SM20

Criolla

1.5

1.2

CH15

SH8

SM5

0.8

SM12

SH38

0.5

0.4

SH9

Maradol Maradol1

SH13

0.0

SH6

SH30 SH21

-0.5

SH24

-1.5

-0.8

SM25

SM31

-0.8

Femenina Femenin1 SH19

-1.2

0.0 -0.4

-1.0

-2.0 -1.6

FACTOR2

FACTOR2 (17% varianza total)

SM14 SH17

1.0

-0.4

0.0

SM22

-1.2

0.4

0.8

1.2

1.6

-1.6 -1.6

-1.0

-0.4

0.2

0.8

1.4

2.0

FACTOR1

FACTOR1 (43% varianza total)

A)

Criollo1 Criollo

SM1

B)

Figura 3.Análisis de componentes principales. A: hembras; B: machos .

En la muestra de los machos, sólo tres componentes explican el 83% de la varianza total. Están relacionados con el tamaño del pedúnculo y de la flor, el tamaño de las hojas y la forma más o menos cortada de la hoja (profundidad del corte entre los lobos y número de lóbulos). Nuevamente, los tipos cultivados se separan claramente de los tipos silvestres, con flores más grandes y hojas menos grandes pero más cortadas (figura 3B). El análisis de los datos cualitativos confirma esta clara separación entre los tipos silvestres y mejorados. Los segundos se diferencian principalmente por caracteres como color del tallo (gris marrón), menor tamaño de hoja, mayor número de lóbulos, mayor separación entre lobos, ausencia de brácteas en el pedúnculo, mayor tamaño y permanencia de los sépalos, disposición radial de los pétalos, color del estilo (crema), además del tamaño menor y de la pulpa amarilla de los frutos, cuyos caracteres no pudieron ser incluidos sistemáticamente en la base de datos. Cuando los individuos están separados por sexo, aparece una leve estructuración geográfica entre los tipos silvestres, como se puede apreciar en el dendrograma obtenido con las hembras (figura 4).

Hawaiana Hawaiana

Figura 4. Dendograma de caracteres cualitativos (hembras).

Caracterización isoenzimática Los datos isoenzimáticos obtenidos sobre las muestras costarricenses fueron analizados separadamente por el método de clasificación del vecino más próximo. Como la muestra no corresponde (la muestra para este análisis es más numerosa que para el análisis morfológico), es difícil comparar los resultados de los dos análisis. Sin embargo, con ocho zimotipos para 31 plantas silvestres, la variación isoenzimática aparece muy limitada y no refleja la variación morfológica observada. Lógicamente, como se puede observar en la figura 5, esta poca variación no permite evidenciar una estructura geográfica de la diversidad dentro de Costa Rica. Tampoco se observa una diferenciación entre plantas cultivadas y silvestres.

Figura 5. Arbol de clasificación (Neighbor Joining, distancia de Jaccard) obtenido con los datos del análisis enzimático.

Conclusiones y perspectivas La literatura ofrece poca información sobre las papayas silvestres. Ciertos autores ignoran o refutan su existencia. Este estudio ha mostrado que las formas silvestres de C. papaya existen todavía en relativa abundancia y que, en el aspecto morfológico, se diferencian claramente de los tipos cultivados, a pesar de la evidente introgresión observada en el campo. En el caso de la papaya, los marcadores bioquímicos y moleculares aparecen limitados para estructurar toda la diversidad agro-morfológica que interesa al fitomejorador. Por lo tanto, vale la pena seguir estudiando estos materiales silvestres para detectar otros caracteres que podrían ofrecernos, particularmente en relación con resistencias a enfermedades. El análisis de estos resultados será profundizado para una publicación en una revista científica internacional.

5.2 Informe final de actividades realizadas en Costa Rica. UCR

APROVECHAMIENTO DE LOS RECURSOS FITOGENÉTICOS DE LAS PAPAYAS PARA SU MEJORAMIENTO Y PROMOCION INFORME FINAL DE ACTIVIDADES REALIZADAS EN

COSTA RICA

ANTECEDENTES: La Universidad de Costa Rica y el Ministerio de Agricultura y Ganadería realizan desde 1999 un proyecto de mejoramiento genético en papaya (Proyecto cooperativo UCR-INTA). El objetivo de dicho proyecto es el de dotar a los agricultores nacionales con híbridos de alto potencial comercial para mercados nacionales e internacionales que posean además características fisiológicas favorables para su cultivo bajo las condiciones locales. Las labores principales se han centrado en la hibridación de materiales con características favorables complementarias con el fin de producir generaciones segregantes a partir de los cuales seleccionar y estabilizar líneas de alto valor comercial. Las líneas así generadas se seleccionan luego en base a sus habilidades combinatorias específicas para la formación de los híbridos comerciales. Para enriquecer las actividades de dicho proyecto, se aceptó el ofrecimiento del IPGRI para participar en el proyecto “Aprovechamiento de los recursos fitogenéticos de las papayas para su mejoramiento y promoción” con el fin de complementar aquellos aspectos técnicos en los cuales no se había podido trabajar por falta de recursos. Estos aspectos se centraban básicamente en ensanchar la base genética del proyecto con la caracterización de materiales silvestres, así como el establecimiento de un protocolo para determinar posibles fuentes de resistencia a la antracnosis de la fruta causado por el hongo Colletotrichum gloesporioides.

LOGROS ALCANZADOS: Debido a las limitaciones impuestas por el IICA en cuanto a la utilización de los recursos, los objetivos básicos no pudieron llevarse a cabo. La imposibilidad de contratar mano de obra para trabajos de campo impidió el establecimiento de una colección de germoplasma silvestre y cultivado. Evidentemente, al no contarse con dichas colecciones, todos los demás objetivos de caracterización y

determinación de sus potenciales para su uso en mejora genética se vieron frustrados. Debido a lo anterior, se decidió utilizar una pequeña fracción de los recursos asignados originalmente para complementar las labores rutinarias del proyecto de mejoramiento en curso. Básicamente se utilizaron dichos recursos para la compra de insumos con el fin de utilizarlos en las parcelas de segregación que se detallan a continuación.

Establecimiento de parcelas de segregación: Los trabajos se realizaron en la Estación Experimental “Los Diamantes” del Ministerio de Agricultura y Ganadería. Dicha estación se ubica en la región Atlántica de Costa Rica, a una altura de 240 msnm y cuenta con una temperatura promedio y una precipitación anual promedio de 24.6°C y 4380 mm respectivamente. El trabajo consistió en la caracterización, selección y autofecundación de segregantes de cuatro híbridos producidos en el marco del proyecto cooperativo de papaya UCR-INTA. Los materiales genéticos parentales utilizados en dichos híbridos corresponden a germoplasma proveniente de Costa Rica, Hawaii y Cuba básicamente. Concretamente, se sembraron 300 plantas segregantes del híbrido LM, así como 200 plantas cada uno de los híbridos LH, 6X30 y 70X30. Dicha siembra se realizó en campo en Marzo del 2002. En Setiembre, se procedió a ralear aquellas plantas con evidentes problemas de esterilidad femenina y carpelodia. También se realizó una autopolinización de aquellas plantas que manifestaban un buen potencial productivo en ese período fenológico. A partir del mes de Enero del 2003, se procedió a caracterizar las plantas autopolinizadas y a seleccionarlas básicamente en base a criterios de productividad, así como de características organolépticos y de vida poscosecha sus frutas (Cuadros 1,2,3 y 4 ). También se utilizaron como criterios de selección la apariencia cosmética externa de las frutas (datos no presentados). Para dicha caracterización se tomaron tres frutas representativas de cada planta. Se tomó un registro fotográfico digital de las plantas seleccionadas con el fin de compararlas con las generaciones posteriores de estabilización. Los resultados obtenidos hasta la fecha demuestran que los segregantes seleccionados del híbrido MH tienen capacidad de producir frutas de altos brix aún en las condiciones de alta precipitación de la zona. Presentan también en algunos casos frutas de tamaño aceptable para exportación a nivel regional. Por su parte, los segregantes del híbrido LM poseen un tamaño más adecuado para mercados nacionales y para agroindustria. Los materiales provenientes de los híbridos 6X30 y 70X30 poseen menor potencial comercial y por ende se han seleccionado sólo tres plantas en cada caso

Cuadro 1: Principales características de plantas F2 del híbrido “MH” seleccionadas Altura de inserción de Peso No. frutas a primera fruta promedio de primera Código de (cm) frutas (g) Brix cosecha árbol MH1 60 1233.67 12.73 80 MH2 79 500.00 11.07 96 MH3 55 700.00 12.90 92 MH4 67 350.00 12.30 91 MH5 MH6 37 800.00 11.47 87 MH7 58 800.00 12.00 94 MH8 65 850.00 11.50 108 MH9 MH10 28 1800.00 11.60 92 MH11 42 300.00 11.60 111 MH12 90 1600.00 10.40 108 MH13 75 760.33 12.26 118 MH14 45 1283.00 11.80 89 MH15 96 533.00 13.30 79 MH16 43 560.00 12.26 69 MH17 77 1000.00 12.27 118 MH18 70 383.33 12.67 103 MH19 75 700.00 13.87 85 MH20 38 366.67 12.13 102 MH21 46 400.00 12.53 83 MH22 72 333.33 12.27 100 MH23 61 350.00 11.60 85 MH24 40 800.00 11.47 90 MH25 70 404.53 13.20 93 MH26 48 650.00 13.20 99 MH27 65 733.33 13.90 104 MH28 58 666.67 12.33 82 MH29 MH30 76 700.00 12.27 84 MH31 36 850.00 11.50 65 MH32 58 566.67 12.93 86 MH33 75 600.00 12.33 89 MH34 66 633.33 12.27 96 MH35 61 966.67 13.33 95 MH36 45 1333.33 12.33 99

Escala de firmeza relativa 2 1 2 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 3 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2 1 2 3 2

Cuadro 1. continuación... MH37 MH38 MH39 MH40 MH41 MH42 MH43 MH44 MH45

76

650.00

13.90

88

2

35

900.00

11.80

90

1

55

766.67

12.23

86

2

74

533.33

12.50

105

3

27

1000.00

12.00

80

1

32

1350.00

12.90

103

2

32

566.67

13.43

101

1

55

866.67

12.93

113

2

98

800.00

12.93

92

2

Cuadro 2: Principales características de plantas F2 del híbrido “LM” seleccionadas

Código de árbol LM1 LM2 LM3 LM4 LM5 LM6 LM7 LM8 LM9 LM10 LM11 LM12 LM13 LM14 LM15 LM16 LM17 LM18 LM19 LM20 LM21 LM22

Peso No. frutas a promedio de primera frutas (g) cosecha

Brix

Altura de inserción de primera fruta (cm)

Escala de firmeza relativa

46

2900.00

9.80

89

2

60

2300.00

11.77

91

1

53

1866.67

10.87

82

2

58

2050.00

10.60

91

2

31

1700.00

12.00

80

2

37

1700.00

10.20

82

1

31

2400.00

10.73

90

2

38

1866.67

10.07

81

2

28

3400.00

9.60

105

2

66

1700.00

11.27

103

2

52

3600.00

9.40

98

1

58

2200.00

8.50

87

2

49

2433.33

11.20

79

3

56

2233.33

9.60

105

1

36

2500.00

10.20

85

2

35

1750.00

9.10

80

2

48

1600.00

10.27

93

1

73

82

56

92

66

2350.00

9.80

91

1

70

2366.67

10.53

93

2

59

90

Cuadro 2. continuación... LM23 LM24 LM25 LM26 LM27 LM28 LM29 LM30 LM31 LM32 LM33 LM34 LM35 LM36 LM37 LM38 LM39 LM40 LM41 LM42 LM43 LM44 LM45 LM46 LM47 LM48 LM49 LM50 LM51 LM52 LM53 LM54 LM55 LM56

63

1300.00

10.60

88

2

80

1600.00

11.00

80

1

59

79

57

1700.00

10.40

80

2

31

2300.00

8.40

78

1

51

1600.00

11.00

79

1

36

3000.00

10.40

88

2

62

2600.00

11.00

94

1

60

2700.00

9.80

98

2

54

500.00

12.40

88

1

72

2200.00

8.90

105

2

70

1750.00

8.60

66

1

53

2900.00

9.20

90

2

33

1866.67

8.20

81

1

46

1500.00

11.00

66

2

62

90

45

1500.00

10.60

64

1600.00

9.60

34 45

90

2

67

1

85 1633.33

9.40

39

77

1

91

56

2016.67

10.20

84

2

87

1566.67

10.47

87

2

57

1800.00

10.90

103

2

64

1400.00

9.35

79

2

62 56

140 2100.00

10.50

96

56

96

90

62

65

109

39

2000.00

10.80

66

87

2

2

84

57

1850.00

10.80

80

2

64

2900.00

9.50

72

2

Cuadro 3: Principales características de plantas F2 del híbrido “70X30” seleccionadas

Código de árbol 70X30-1 70X30-2 70x30-3

Peso No. frutas a promedio de primera frutas (g) cosecha 80 65 45

1433 700 1933

Brix

Altura de inserción de primera fruta (cm)

Escala de firmeza relativa

10.6 9.9 9.7

75 80 93

1 2 3

Cuadro 4: Principales características de plantas F2 seleccionadas del híbrido “60X30”

Código de árbol 6x30-1 6x30-2 6x30-3

Brix

Altura de inserción de primera fruta (cm)

Escala de firmeza relativa

800

12

100

2

800

12.4

105

2

Peso No. frutas a promedio de primera frutas (g) cosecha 55 66 91

NOTA: Los datos promedios reportados se refieren en la mayoría de los casos a tres frutas seleccionadas por planta. En aquellos casos en que no se ha concluido la caracterización, el dato representa el promedio de dos frutas o de una sola fruta. En los casos en que no se presentan datos, se debe a que el árbol aún no ha comenzado a madurar sus frutas.

ANEXO 6 Informes de CIAT

6.1 Establecimiento de métodos de conservación para semillas de Carica papaya. Informe Unidad de Recursos Genéticos, CIAT. Ver anexo 4 del informe de progreso de 2002

6.2 Caracterización molecular del virus de la mancha Anular de la papaya (PRSV) en Colombia y Ecuador. Laboratorio de Virología, CIAT-IPGRI, Colombia

CARACTERIZACION MOLECULAR DEL VIRUS DE LA MANCHA ANULAR DE LA PAPAYA (PRSV) EN COLOMBIA y ECUADOR

Francisco Morales. Jefe del Laboratorio de Virología, CIAT-IPGRI Introducción En la América Latina y en el mundo en general, el Virus de la mancha anular de la papaya (Papaya ringspot virus) es el patógeno de mayor importancia para la utilización de este cultivo. En Colombia la mancha anular de la papaya ha reducido el área sembrada en más del 50% (Sanchez de Luque y Martinez, 1976; Sanchez de Luque et al. 1980). Los síntomas causados por virus en papaya fueron descritos por primera vez hace 63 años (Smith 1939 citado por Jenzen, 1949), y varían de manera apreciable de una localidad a otra, desde un mosaico suave hasta la muerte de la planta. En las visitas recientes efectuadas a plantaciones de papaya en el Ecuador, se observó la manifestación más severa del PRSV, consistente en la deformación foliar total y en la caída de todo el follaje y los frutos. Hasta el momento solo se ha logrado el control de la enfermedad mediante la transformación genética de variedades de papaya. Debido a que el Virus de la mancha anular de la papaya (Potyviridae) presenta variabilidad genética (C.-H. Wang y S.-D. Yeh, 1997), es necesario estudiar este fenómeno a nivel regional, con el fin de estandarizar las medidas de control. En este informe se describen los últimos trabajos de caracterización molecular de cepas del PRSV recolectadas en Colombia y Ecuador. El proyecto también contempla la caracterización molecular de cepas del PRSV en la República de Venezuela. Este trabajo esta siendo desarrollado paralelamente en ese país.

Materiales y Métodos Muestras Se analizaron muestras de tejido foliar de Carica papaya L. cultivada en diferentes localidades de la región noroccidental de America del sur. Las muestras se recolectaron en el territorio de Colombia y Ecuador en las siguientes localidades (de note a sur): En Santa Marta en el departamento del Atlantico, Santafe de Antioquia en Antioquia, Viterbo en Caldas, Yotoco en el Valle del Cauca y en una localidad sur de Colombia en territorio Ecuatoriano. Purificación, Transcripción y amplificación de ácidos nucleicos virales Particulas con apariencia potyviral fueron detectadas mediante microscopía electronica en tejido foliar fresco de plantas de Carica papaya L. siguiendo el procedimiento descrito por Morales et al. (1990). De este material se utilizaron 100 mg de tejido foliar, para purificar de ARN total (t) (1362 ng/µL), desarrollando el procedimiento indicado para células y tejido de plantas (“RNeasy”, QUIAGEN Inc, Santa Clarita, CA, USA). La extraccion de RNA total apto para RT-PCR se obtuvo de tejido recientemente colectado, que aun presentaban un estado suculento en su apariencia. Contrasta con la pobre calidad y cantidad

de RNA total obtenida de tejido seco de hojas de papaya que fueron inmunoreactivamente positivas a potyvirus en una prueba de ELISA. La síntesis de ADN complementario (c) a partir del ARN total (t), se realizó desarrollando una reacción con la trascriptasa reversa “Superscript II” (Stratagene, La Jolla, CA, USA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Aproximadamente 5200 ng del ARNt fueron utilizados como precursor, mezclado con el oligonucleótido ATGRTITGGTGYATIGAIAAYGG denominado U341, como iniciador para el extremo 3’ del potyvirus de una parte del gen de la proteína de la cubierta (CP). También se utilizó un iniciador de 19 tíminas denominado “cola de poli-dT”, como iniciador complementario a la región viral no codificante (UTR). El ADNc se amplificó en 25 µL de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando 1.2 unidades de polimerasa “Taq” (Promega, Madison, WI, USA), 50 pM de cada iniciador (U341/oligo-d-A), mezcla de deoxinucleótidos (A, C, G y T) 0.2 mM y cloruro de magnesio 2.5 mM. La PCR se desarrolló en un termorregulador (MJ Research, Watertwon, MA, USA), programado de la siguiente forma: Una primera incubacion a 94 ºC/2min seguida por 29 ciclos de 94 ºC/30 s.; 40 ºC/2 min.; 72 ºC/2 min; y una incubación final de 72 º C/10 min. Clonación de copias de ADN viral El producto obtenido por la PCR se purifico según el procedimiento para limpieza de soluciones de ácidos nucléicos en muestras de PCR “Magic PCR preps” (Promega, Madison, WI, USA). Esté fue directamente clonado en un vector con el paquete "Original TA Cloning® Kit" (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La reacción de ligación resultante se utilizó para transformar Escherichia coli (DH5 α) (Sambrook et al.,1989). La reacción de secuencia se realizó por el procedimiento de terminación en cadena de dideoxinucleótidos (Sanger et al., 1977) Secuenciación de Acidos nucleicos vírales El clon de ADNc viral contenido en plasmidos bacterianos se concentro por el procedimiento para purificación de ácidos nucleicos "Wizard plus Minipreps" (Promega, Madison, WI, USA). Tal producto de clonacion, libre de enzimas y nucleotidos exedentes, en una concentración suficiente para visualizar DNA con 2 µL de muestra en un gel de Agarosa (1%), fue precipitado preparándolo para la reacción de secuencia con NaAC 3M y Etanol al 100% . Para la secuencia se utilizaron los iniciadores M13 reverso y T7. La reacción de secuencia se desarrollo con el paquete de secuenciacion "BigDye ™ terminator cycle sequencing ready reaction" ( Perkin Elmer, USA) diseñado para el equipo de secuenciacion automática "ABI PRISM ™ 377 DNA sequencer" siguiendo las instrucciones del fabricante. En un volumen total de 7 microlitros se mezclaron 3.2 pMol del oligonucleotido, aproximadamente 500ng de DNA y la mezcla del kit (cuyas concentraciones no son especificadas por el fabricante). La reacción se termorregulo en un equipo PTC 100 (MJ Research, Inc) de la siguiente manera: Una incubacion a 96 °C por 20 segundos, 50°C por 10 seg., 60c°C por 4 min. sucesivamente durante 25 ciclos. Los productos de la secuenciación fueron separados electroforeticamente en poliacrilamida al 4.5% durante 4 horas y el análisis espectográfico de la fluorescencia emitida por la marca atada en cada uno de los cuatro nucleotidos se realizo con el programa "ABI ™ DNA

Sequencing Analisys" (Sequencher 3.0 manual del usuario, 1995). El análisis de secuencia se desarrolló utilizando el programa estadístico "DNAMAN 4.1" (Lynnon Biosoft®), con secuencias obtenidas a través del servicio de búsqueda de similaridad de secuencias del “National Center for Biotechnology Information”, desarrollado por Altschul et al. (1997). Resultados Las muestras de hojas de papaya que presentaron partículas como potyvirus, amplificaron un producto del RT-PCR, de 800 pares de bases con los oligonucleótido degenerado U341 y el iniciador complementario PolidT. Esto es lo esperado para un potyvirus en la region terminal de la proteina de la cubierta y la region que no codifica (Langeveld et al. 1991; Nicolas y Laliberte, 1991; Frenkel et al. 1989). La secuencia parcial de nucleotidos de las muestras de Santafe de Antioquia y Ecuador presentan la menor similitud (75.6%) entre los aislados de colombia y Ecuador (Tabla 1). Todos los aislados virales presentaron homologia con el Potyvirus del la mancha anular de la papaya (Papaya Ring Spot virus: PRSV) a partir de la comparación de secuencias publicadas de potyvirus en Carica papaya L. Las muestras de Colombia se agrupa consistentemente al compararse con 16 diversos aislados PRSV de America y Asia (Figura 1). Los aislados PRSV en Colombia se agrupan con un 85% de similitud con aislados PRSV de Mexico, Las indias occidentales, Hawaii y Taiwan de manera mas consistente que con los aislados de la India (en el 87% de 1000 submuestreos de construcción del árbol). Conclusiónes Las evidencias reunidas con la amplificación de PCR y la secuencia de nucleótidos indica que los aislados de Colombia y Ecuador pertenecen al grupo del PRSV. Los análisis de similitud de las muestras de Colombia y Ecuador indican que a pesar de la variación geográfica en mas de 2000 Km en la esquina noroccidental de la América del sur, tales agentes presentan un similitud de secuencias para la región que codifica por la proteína de la cubierta y el UTR, comparable con la variación observada en otros aislados obtenidos en el territorio mexicano, lo cual sugiere una variación genética relativamente baja en los aislados colombianos. Estos resultados continúan siendo prometedores para el desarrollo de resistencia genética al PRSV en la región Andina.

Tabla1. Similitud de las secuencias parciales de potyvirus aislados de Carica papaya L. en Colombia y Ecuador. Nucleotidos Fuente del aislado viral secuenciados 570 Col-Yotoco-Valle del Cauca 900 Col-SantamartaMagdalena 673 Ecuador 650 Col-Ginebra-Valle del Cauca 230 Col-Viterbo-Caldas 499 Col-Santafe-Antioquia

Similitud de secuencias de nucleotidos 100 96.1

100

94.9 93.8

94.3 87.4

100 86.1

100

96.9 86.6

95.6 79.9

96 75.6

98.2 78.8

100 96.5

Pie de Figura 1. Arbol de porcentaje de similitud de secuencias de aislados PRSV.

Literatura Citada

C.-H. Wang y S.-D. Yeh, 1997. Divergence and Conservation of the genomic RNAs of Taiwan and Hawaii strains of papaya ringspot potyvirus. Archives of Virology 142:271-285. Jensen, D. D. 1949. Papaya ringspot diseases with special reference to papaya ringspot. Phytopatology 39: 191-211. Sanchez de Luque C. y Martinez R. 1976. Algunas observaciones sobre el virus de la mancha anular de la papaya en Colombia. Noticias Fitopatologicas. Vol 5 No 2 p62. Sanchez de Luque C., Varon de Agudelo F., C.J. de Giraldo y Torres R. 1980. Posibles parametros para evaluar material de Carica papaya L. resistente al virus de la mancha anular de la papaya (PRSV). Fitopatologia Colombiana. Vol 9 No 1 p 3. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. y Lipman D. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Frenkel, M.J., Ward, C.W. y Shukla, D.D. 1989. The use of 3’ non-coding nucleotide sequences in the taxonomy of potyviruses: Application to watermelon mosaic virus 2 and soybean mosaic virus-N. J. gen. Virol, 70: 2775-2783. Langeveld, S., Dore, J.M., Memelink, J., Derks, A., Van der Vlugt, C., Asjes, C. y Bol J. 1991. Identification of potyviruses using the polymerase chain reaction with degenerate primers. J. gen. Virol. 72: 1531-1541.

Morales F. J.; Niessen, A. I.; Castaño, M. y Calvert, L. 1990. Detection of a soybean mosaic virus strain affecting tropical forage species of Centrosema spp. Plant. Dis. 74(9):648-650. Nicolas, O. y Laliberte, J-F. 1991. The use of PCR for cloning of large cDNA fragments of turnip mosaic potyvirus. J. Virol Methods. 32: 57-66. Sambrook, J., E. Fritsh, T. Maniatis. 1989. Preparation and transformation of competent E. coli. Book 1, chapter 1.74. In: Molecular cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. Sanger, F., F. Nicklen, A. R. Coulson 1977. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci., USA 74: 5463-5467. Shukla, D. D., Ward y Brunt A.A.1994. The sugarcane mosaic virus subgroup. Pp 360-371 In: The Potyviridae. CAB international, Wallinford, United Kingdom.

ANEXO 7 Informes CIRAD-FLHOR

7.1 Inventaire et collecte de Carica papaya aux Antilles Françaises. CIRAD-Guadeloupe

Inventaire et collecte de Carica papaya aux Antilles Françaises Coordinateur de l’inventaire : Fabrice LE BELLEC – Cirad Guadeloupe

Cette collecte « Carica papaya » a été réalisée dans le cadre d’un inventaire des espèces et variétés fruitières aux Antilles Françaises (Guadeloupe et Martinique) encore en cours actuellement. La méthode de prospection utilisée se décompose en plusieurs étapes : 1/ prospection et localisation de la nouvelle accession. 2/ Identification de l’espèce ou de la variété. 3/ Description de la variété grâce à une fiche et un référentiel de collecte (annexes 1 et 2) comprenant 150 indicateurs/descripteurs botaniques, pomologiques, agronomiques et ethnobotanique. 4/ Saisie des caractéristiques des accessions dans la base de données et création d’un répertoire de photographies (arbre, fleur, fruit entier, fruit coupé…). Pour Carica papaya (Papayer) : 50 accessions en Guadeloupe et 30 en Martinique. Gestion des données de l’inventaire Afin de gérer efficacement les très nombreuses données des collectes (plus de 150 indicateurs et 5 à 7 photos par accession répertoriées), une base de données a été développée sous Access de Microsoft. Différents utilitaires y ont été rattachés afin de faciliter les recherches lors de la consultation. Ainsi, il est possible de rechercher dans cette base une accession sur son nom d’espèce, sur son nom commun, sur sa famille ou encore grâce à un échantillon botanique. Les référentiels de collecte sont également consultables à partir de cette base ainsi que toutes les photos des accessions. Enfin, il est possible d’éditer une fiche synthétique de collecte qui reprend toutes les caractéristiques botaniques, pomologiques, ethnobotaniques (utilisations), agronomiques (état sanitaire) et les photos ainsi qu’un bilan général (conclusions et intérêts) de l’accession. La version de cette base de données fournit dans le cadre du projet Fontagro (CD rom joint à ce rapport) ne concerne que Carica papaya ; certaines fonctions de cette base ont été désactivées. Base de donnée (menu d’accueil)

Sauvegarde, évaluation et multiplication des accessions collectées Les accessions ont été toutes précisément localisées (annexe 3), ces données seront ensuite relier aux résultats de l’analyse génétique actuellement en cours de réalisation de ces dernières. Les accessions sont provisoirement conservées sous forme de graines en attendant que les techniques de multiplication in vitro soient efficientes (prélèvement de bourgeon axillaire, mise en culture in vitro, amplification et sevrage) ; travaux de recherches actuellement en cours. Une première approche de leur tolérance à la bactériose a également débuté grâce au semis d’une partie de ces semences collectées et à leur inoculation avec les souches de bactériose les plus sévères des Antilles Françaises (résultats juillet/août 2003 pour la Guadeloupe). L’objectif final de toutes ces expérimentations étant : de connaître, d’évaluer et de sélectionner une ou des accessions de Carica papaya présentant une bonne tolérance à la bactériose et de bonnes qualités pomologiques afin de fournir aux producteurs antillais une papaye dessert et/ou légumes répondant à leurs exigences de production et du marché.

Annexes 1 et 2 : fichiers

ANNEXE I.2 : Référenciel de collecte – page 1/4

REFERENTIEL DE LA FICHE DE COLLECTE – TOUTES ESPECES Fabrice LE BELLEC – Cirad-Flhor Vieux Habitants – [email protected] – 0590 98 37 60 Dessins originaux et inspirés de “Descriptors for 1/ Mango, 2/ papaya et 3/ avocado”(IBPGR, 1989, 1988 et 1995) de 4/ “tropical fruit descriptor” (IBPGR, 1980) ; 5/ “Flore des Mascareignes” (ORSTOM, 1987) ; 6/ “Botanique systématique des plantes à fleurs” (Presses Polytechniques et Universitaires Romandes, 2000).

1. Forme et port de l’accession

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

a : arbre à port élancé ; b : arbre à port en boule ; c : arbre à port pyramidale ; d : arbre à port retombant : e : faux tronc ; f : arbuste ; g : liane ; h : cactus ou succulente ; i : grand arbre à frondaison haute ; j : arbre à port étagé. (F. Le Bellec)

2. Position des feuilles

Feuilles simples (a à d) : a : opposées ; b : alternes ; c : verticillées ; d : opposées-décussées. a

b

c

d Feuilles composées (e à g) : e : paripennées ; f : imparipennées ; g : palmées. (original référence 6)

e

f

g h : Bouquet terminal (PAPAYER)

ANNEXE I.2 : Référenciel de collecte – page 2/4 3. Forme du limbe de la feuille et du lobe (papayer) a : linéaire ; b : lancéolé ; c : elliptique ; d : ovale ; e : obovale ; f : orbiculaire ; g : rhomboïdale ; h : cordée ; a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

i : obcordée ; j : cunéiforme.

k : spatulé ; l : sagitté ; m : hastée ; n1 : palmatilobée n2 : palmatifide ; n3 : palmatipartite k

l

m

n1

n2

n3

n4

n4: palmatiséquée o : réniforme ; p : panduriforme q : pédalée ; r1 : pennatilobée r2 : pennatifide ; r3 : pennatipartite

o

p

q

r1

r2

r3

r4

s

t

r4: pennatiséquée ; s : lyrée t : roncinée. (original référence 6)

Longueur Note 1 : Pour la feuille du papayer, choisir entre n1 à n4 ; concernant les lobes de la feuille, choisir entre r1 à r4 Note 2 : Mesure du limbe de la feuille du papayer.

Largeur

Note 3 : 1 lobe entouré.

4. Bords de la feuille

a : crispé ; b : cilié ; c : droit ; d : ondulé e : biserrulé ; f : serreté ; g : crénelé. (d’après référence 5)

a

b

c

d

e

f

g

5. Bases de la feuille

a : cunéiforme ; b : sagittée ; c : dissymétrie ; d : tronquée e : hastée ; f : auriculée. (d’après référence 5)

a

b

c

d

e

f

ANNEXE I.2 : Référenciel de collecte – page 3/4 6. Sommet de la feuille

a : caudé ; b : vrillé ; c : acuminé ; d : aigu ; e : obtu ; f : tronqué ; g : échancré ; h : mucroné ; i : apiculé. (d’après référence 5) a

b

c

d

e

f

g

h

i

7. Position du pétiole par rapport au limbe (papayer uniquement)

a : très ouvert ; b : ouvert ; c : fermé. (d’après référence 2)

a

b

c

8. Type de fleurs (particularité du papayer et de l’avocatier) 8.1 Fleur d’avocatier : 2 groupes (A et B) en fonction des périodes de maturité des organes sexuels (dichogamie) (d’après référence 3)

Dite du « groupe A »

Dite du « groupe B »

a.m (Jour 0)

p.m (Jour +1)

Phase ♀ jusqu’à 12h00

Phase ♂

p.m (Jour

a.m (Jour +1)

Phase ♀ l’après-midi

Phase ♂

8.2 Fleurs du papayer

Femelle

8.3 Fleur du manguier (d’après référence 1)

Mâle

3 Types de fleurs hermaphrodites ‘pentadria’ ‘elongata’ ‘carpelloïde’

ANNEXE I.2 : Référenciel de collecte – page 4/4 9. Formes des fruits ou des graines

a : elliptique ; a1 : étroitement elliptique ; a2 : largement elliptique ; a

b

c

f

d

b : ovale ; b1 : étroitement ovale ; b2 : largement

h

ovale c : obovale ; c1 : étroitement obovale ; c2 : largement obovale ; a1

b1

c1

e

g

i

d : orbiculaire ; e : aplatie ; f : rhomboïdale ; g : réniforme ; h : triangulaire ; i : pyriforme. (inspiré référence 6)

j: autre forme a2

b2

c2

10. Forme du fruit à l’insertion du pédoncule

a : en dépression ; b : aplatie ; c : arrondie ; d : pointue. (inspiré références 2 et 3)

a

b

c

d

11. Forme de l’apex des fruits a : arrondie ; b : pointue ; c : aplatie ; d : en dépression ; a

b

c

d

e

e1

e2

e3

e (mangue exclusivement) : bec absent ; e1 : bec en pointe ; e2 : bec proéminent ; e3 : bec en forme de mamelon. (inspiré références 1, 2 et 3)

12. Forme de la coupe transversale du fruit (ou de la cavité pour la papaye)

a : irrégulière ; b : ronde ou elliptique ; c : angulaire ; d : en étoile ; e: lobulée (plus ou moins profondément). a

b

c

d

13. Type de sinus (manguier exclusivement)

a

b

c

a : absent ; b : peu marqué ; c : très marqué

e

(inspiré références 1, 2 et 3)

14. Forme du pédicelle (avocatier exclusivement)

a

b

c

a : cylindrique ; b : conique ; c : arrondie

Annexe 3. Localisation des accessions guadeloupéennes de Carica papaya Accession

Espèce

Lieu de collecte

Longitude

Latitude

Altitude(m)

PA 001

Carica papaya

St louis Baillif

-61,44023699

16,01024711

123

PA 002

Carica papaya

Trois Rivières

-61,37373388

15,59237996

270

PA 003

Carica papaya

Trois Rivières

-61,37250384

15,59515849

270

PA 004

Carica papaya

La plaine Capesterre B/E

-61,37247719

15,59517361

250

PA 005

Carica papaya

Neufchâteau Capesterre B/E@

-61,3605497

16,04522901

235

PA 006

Carica papaya

Neufchâteau Capesterre B/E@

-61,36059003

16,04522936

235

PA 007

Carica papaya

Trois Rivières

-61,38233671

15,58424558

145

PA 008

Carica papaya

Anse dupuy Trois Rivières

-61,42258092

15,57124351

50

PA 009

Carica papaya

Malendure Bouillante

-61,46541211

16,10336082

70

PA 010

Carica papaya

Val de l'orge Vieux- Habitants

-61,45159237

16,02494911

80

PA 011

Carica papaya

Val de l'orge Vieux- Habitants

-61,45161253

16,02492319

80

PA 012

Carica papaya

Val de l'orge Vieux- Habitants

-61,45165249

16,02498187

79

PA 013

Carica papaya

Val de l'orge Vieux- Habitants

-61,45161973

16,02487783

79

PA 014

Carica papaya

Val de l'orge Vieux- Habitants

-61,45146385

16,02502651

90

PA 015

Carica papaya

Val de l'orge Vieux- Habitants

-61,45161361

16,02479287

75

PA 016

Carica papaya

Cousinière Vieux- Habitants

-61,44064445

16,03054264

300

PA 017

Carica papaya

Cousinière Vieux- Habitants

-61,44069161

16,03053652

300

PA 018

Carica papaya

Cousinière Vieux- Habitants

-61,44065093

16,03059484

300

PA 019

Carica papaya

Tarare Vieux- Habitants

-61,44483981

16,05089136

230

PA 020

Carica papaya

Tarare Vieux- Habitants

-61,44494241

16,05083988

220

PA 021

Carica papaya

Tarare Vieux- Habitants

-61,44500145

16,05086364

225

PA 022

Carica papaya

Plantin Vieux- Habitants

-61,4540584

16,03078218

501

PA 023

Carica papaya

Plantin Vieux- Habitants

-61,45404508

16,03073034

501

PA 024

Carica papaya

Plantin Vieux- Habitants

-61,45405876

16,0306911

50

PA 025

Carica papaya

Plantin Vieux- Habitants

-61,45409836

16,03079551

50

PA 026

Carica papaya

Laroche Morne- à- l'eau

-61,27598386

16,1935659

5

PA 027

Carica papaya

Labatte Morne- à- l'eau

-61,27183367

16,18418143

65

PA 028

Carica papaya

Chomette Morne- à- l'eau

-61,27224549

16,18323425

20

PA 029

Carica papaya

Chomette Morne- à- l'eau

-61,27221849

16,18323425

20

PA 030

Carica papaya

Bovis Baillif

-61,43556031

16,01514353

280

PA 031

Carica papaya

Réduit Trois Rivières

-61,38039316

15,59110837

272

PA 032

Carica papaya

Doillon Capesterre B/E

-61,33422642

16,04349772

20

PA 033

Carica papaya

Bonfils Baie- Mahault

-61,37422757

16,14436936

65

PA 034

Carica papaya

Bonfils Baie- Mahault

-61,37421137

16,144369

65

PA 035

Carica papaya

Bonfils Baie- Mahault

-61,37419265

16,14436648

65

PA 036

Carica papaya

Wonche Baie- Mahault

-61,37180056

16,15250801

35

PA 037

Carica papaya

Le bouchu Vieux- Habitants@

-61,45429754

16,03474365

10

PA 038

Carica papaya

Monpierre Morne- à- l'eau

-61,27161301

16,18501664

60

PA 039

Carica papaya

Monpierre Morne- à- l'eau

-61,27278235

16,19180268

14

PA 040

Carica papaya

Belair Vieux- Habitants@

-61,45276507

16,04042346

48

PA 041

Carica papaya

Belair Vieux- Habitants@

-61,45280611

16,04033274

46

PA 042

Carica papaya

Tarare Vieux- Habitants

-61,44509431

16,05024443

270

PA 043

Carica papaya

Tarare Vieux- Habitants

-61,44509648

16,05032507

260

PA 044

Carica papaya

Tarare Vieux- Habitants

-61,44507524

16,05026532

270

PA 045

Carica papaya

Wonche Baie- Mahault

-61,37218899

16,15189203

35

PA 046

Carica papaya

Wonche Baie- Mahault

-61,37152805

16,15259442

30

PA 047

Carica papaya

Collin Petit- Bourg

-61,36045722

16,12197666

2

PA 048

Carica papaya

Bovis Baillif

-61,43495336

16,0153743

290

PA 049

Carica papaya

Bovis Baillif

-61,434953

16,01541318

290

PA 050

Carica papaya

Le bouchu Vieux- Habitants@

-61,45441238

16,03468569

10

@ = Station cirad

7.2 Développement de marqueurs microsatellites et analyse de la diversité dans les genres Carica et Vasconcellea (Caricaceae). CIRAD-FHLOR/IPGRI

PROJET FONTAGRO

Développement de marqueurs microsatellites et analyse de la diversité dans les genres Carica et Vasconcellea (Caricaceae)

John A. OCAMPO PEREZ

Avec la collaboration de : M. Geo COPPENS * Mlle. María Teresa RESTREPO* M. Daniel Ricardo JIMENEZ* M. Dominique DAMBIER** M. Patrick OLLITRAULT** M. Ange Marie RISTERUCCI*** * CIRAD-FLHOR/IPGRI ** CIRAD-FLHOR *** CIRAD-AMIS

Montpellier (France) Avril 2003

INTRODUCTION

D'après Badillo (1971, 1993, 2000) la famille Caricaceae comprend six genres et 35 espèces ; 21 dans le genre Vasconcellea; 7 dans le genre Jacaratia; 3 dans le genre Jarilla; 2 dans le genre Cylicomorpha; et un dans les genres Horovitzia et Carica. Presque tous les genres et espèces sont originaires d’Amérique tropicale, hormis Cylicomorpha qui est originaire d’Afrique équatoriale. L'Equateur et la Colombie sont les pays qui posent le plus grand nombre d'espèces. Toutes les espèces de la famille étudiées sont diploïdes avec un nombre chromosomique de 2n=18 (Chandler, 1958). Elles sont dioïques, rarement monoïques. La taille du génome chez Carica papaya L. est de 372 Mpb (Armuganathan et Earle, 1991). Elle varie dans le genre Vasconcellea entre 372 Mbp et 744 Mbp (Kyndt,, communication personnelle). La papaye commune Carica papaya L. est l'espèce la plus importante de cette famille. En plus c'est une plante d'importance dans le tropique et sous tropique de par sa production continue, sa valeur nutritive et su large rang d'adaptation qui va de 0 à 1600 m d’altitude. Le fruit de la papaye est riche en provitamine A et acide ascorbique. Il est consommé comme fruit frais ou dans la préparation de desserts, sorbets, compotes, glaces, etc, (Beyers et al., 1979). En plus de ses avantages agro-industriels la plante produit un latex qui contient une enzyme protéolytique appelé papaïnase, d'utilisation multiple dans l'industrie de l'alimentation, cosmétique et pharmacopée (Geurts, 1981). La papaye occupe la quatrième position au niveau mondial parmi les fruitiers tropicaux, avec une production annuelle de 7,2 millions de tonnes, dont presque la moitié au Brésil (FAO, 2002). Le plus grand importateur sont les Etats Units et le Mexique le plus grand exportateur. Les espèces du genre Vasconcellea sont connues sous le nom de papayes de montagne. Elles sont distribuées le long des Andes, entre 300 et 3500 m d’altitude. V. x heilbornii nm. pentagona Badillo ou babaco, un hybride naturel présumé entre V. stipulata Badillo et V. cundinamarcensis Solms-Laud, est également cultivé dans quelques régions sous-tropicales (Kempler et Kabul, 1996; Scheldeman, 2002; Villareal et al., 2003). D’autres espèces semi-domestiquées, comme V. cundinamarcensis, V. goudotiana Triana et Planchon, V. cauliflora Jacq et V. stipulata, sont quelquefois cultivées pour leurs fruits et feuilles, lesquelles ont un usage médicinal. Ces espèces sont une source de gènes de résistance aux maladies comme le bunchy top et le virus des taches annulaires (papaya ringspot virus). Les genres Carica et Vasconcellea se différencient principalement par le nombre de locules de l’ovaire, est uniloculaire dans le premier et pentaloculaire dans le deuxième. L'industrie de la papaye commune est limitée par des problèmes de qualité incluant la saveur, le faible teneur en solides solubles (ºBrix), et par des maladies. Parmi ces maladies, les plus graves sont le virus des taches annulaires (papaya ringspot potivirus, PRSV) amplement distribué dans les régions productrices (Purciful et al.,

2

1984) et la bactériose (Erwinia sp) qui constitue un facteur limitant du développement durable de cette culture dans les Antilles et au Venezuela. (Fusagri, 1978) L’amélioration génétique de la papaye a été réalisée au cours des siècles par choix des graines des meilleurs plants et fruits, l’élimination des plantes mâles et la sélection de types hermaphrodites. Dans les dernières décennies, sa base génétique a été étendue du genre Carica aux espèces apparentées. L’hybridation artificielle entre Carica papaya et les espèces du genre Vasconcellea vise l’introgression de caractères importants comme la résistance aux maladies. Les croisements interspécifiques conventionnels sont limités par l’incompatibilité des génomes et n’ont pu être menés à terme qu’avec la technique de sauvetage d’embryons (Horovitz et Jiménez,1967; Magdalita et al., 1998; Manshardt et Wenslaff 1989). Selon Geurts (1981), les programmes d’amélioration intra- et interspécifique démarrèrent à Hawaii en 1915, en Afrique du Sud en 1931, en Colombie en 1963, au Pérou en 1964, et en Côte d’Ivoire en 1967. Leurs objectifs sont basés sur les nécessités du marché de chaque pays. Les principaux sont : production élevée, précocité, taille du fruit, cavité séminale réduite, teneur en solubles solides supérieur à 12°Brix, absence de carpelloïdie, hermaphrodisme, résistance aux maladies et contenu de papaïne. Il existe peu de variétés stables (Geurts, 1981). La plus connue, la variété hawaïenne ‘Solo’, provient de 30 générations de croisements et sélection. Elle a été introduite de la Barbade à Hawaii en 1910. Les analyses de diversité des marqueurs morphologiques, biochimiques et moléculaires ont commencé à être appliquées à l’étude génétique de la papaye et à la compréhension de ses relations avec les espèces voisines. Ocampo (2000) a employé des marqueurs phénotypiques et isozymatiques pour étudier la variabilité génétique de la papaye commune dans l’arc Antillais et au Venezuela. L’analyse multivariée sur les caractères phénotypiques a montré trois composantes principales liées à la taille du fruit, de la plante et de la feuille. Dix systèmes isozymatiques furent évalués, mais seulement les systèmes ADH, PRX, PGM, PGI et SOD ont révélé du polymorphisme. La Guadeloupe, le Venezuela et la Barbade sont les pays qui ont présenté la plus grande diversité génétique pour les deux types de marqueurs. La classification, par la méthode du neighbor joining, n’a révélé qu’un faible structuration géographique. Seules les accessions de la Barbade et du Venezuela ont été groupées lors de l’étude phénotypique, tandis que les isozymes ont seulement permis de séparer les accessions du Nord (Guadeloupe, Martinique et Grenade) de celles du Sud (Barbade, Trinidad et Venezuela). Plus récemment, les isozymes ont été employés pour une étude de diversité sur 66 accessions de papaye commune et de papayes de montagne de Colombie et d’Equateur. Huit des 14 systèmes isozymatiques étudiés ont révélé du polymorphisme (EST, GOT, DIA, PGM, PGI, SkDH et 6PGDH). La classification par la méthode du neighbor joining a séparé les accessions de Vasconcellea par espèce, sauf dans le cas de V. cundinamarcensis, dont les accessions équatoriennes se classent en position intermédiaire entre les accessions colombiennes et celles de V. stipulata, espèce équatorienne qui leur est sympatrique. C. papaya s’est placée à une distance relativement importante des espèces de Vasconcellea, mais cependant comparable aux distances maximales observées entre celles-ci (Jiménez, 2002).

3

Sharon et al. (1992) ont utilisé des sondes de microsatellites et minisatellites pour l’identification et l’analyse génétique de 10 variétés de C. papaya et neuf représentants des espèces du genre Vasconcellea. Un haut degré de polymorphisme fut détecté parmi les espèces de Vasconcellea. En revanche le niveau de polymorphisme était faible entre les variétés de C. papaya. Stiles et al. (1993) ont employé la technique RAPD pour analyser les relations entre 10 variétés de C. papaya. Un total de 102 fragments différents furent obtenus à partir de 11 combinaisons d’amorces. Le dendrogramme a associé sept des 10 variétés de Hawaï. Le minimum de similarité (indice de Jaccard) fut 0,7, montrant un faible variation dans le germoplasme étudié. Jobin-Decor et al. (1997) ont combiné marqueurs RAPD et isozymes pour étudier les relations génétiques entre C. papaya et Vasconcellea. Les distances génétiques se sont avérées très proches pour les deux types de marqueurs. C. papaya a montré 70% (indice de Sokal et Sneath) de dissimilarité avec les espèces du genre Vasconcellea, tandis que le moyenne de dissimilarité fut de 50% à l’intérieur de ce genre. V. pubescens et V. stipulata étaient les espèces les plus proches, avec un indice de 87% pour les isozymes et 82% pour les RAPD. Douze espèces cultivées et sauvages des genres Carica, Vasconcellea et Jacaratia furent analysées avec la technique RFLP-PCR à partir de régions intergéniques d‘ADN chroplastique. L’analyse de classification a confirmé l’étroite association entre les espèces de Vasconcellea. La divergence de C. papaya par rapport aux espèces de Vasconcellea indique que cette espèce s’est développée en isolement et que les relations phylogénétiques entre les deux genres sont peu étroites (Aradhya et al., 1999). Carica semble même plus apparenté avec Jacaratia. Récemment, Kim et al. (2002) ont étudié les relations entre 71 accessions de variétés de C. papaya et six espèces de Vasconcellea au moyen du polymorphisme de longueur des fragments amplifies (AFLP). C. papaya a montré peu de variation génétique, avec un indice de similitude de Dice de 0,88, et peu d’affinité avec Vasconcellea, l’indice de similitude moyen étant de 0,43, tandis que l’indice moyen entre les espèces de Vasconcellea était de 0,72. Van Droogenbroeck et al. (2002) ont aussi étudié avec des marqueurs AFLP les relations génétiques entre six accessions de C. papaya, 83 accessions de cinq espèces du genre Vasconcellea et quatre accessions de deux espèces du genre Jacaratia, toutes originaires d’Equateur. L’analyse des coordonnées principales a montré une claire séparation des trois genres étudiés, Jacaratia prenant une position intermédiaire entre Carica et Vasconcellea. Sur le dendrograme obtenu, les accessions de Carica sont très distantes de celles de Vasconcellea, avec un indice de similarité de Dice de 0,23 entre ces deux genres, tandis qu’il est de 0,24 entre Vasconcellea et Jacaratia. Les coefficients entre espèces de Vasconcellea varient de 0,39 à 0,81, avec une valeur moyenne de 0,54. Au sein des accessions de C. papaya l'indice de similitude est de 0,71. Les études de diversité appuient la réhabilitation du genre Vasconcellea, opérée par Badillo (2000) à partir de ses données morphologiques et des données moléculaires d’Aradhya et al. (1999), puisqu’elles séparent clairement la papaye commune et la papaye de montagne. Les microsatellites ou SSRs sont constitués d'un nombre variable de séries de répétitions mono, di, tri ou tétranucléotides, telles que (A)n, (GA)n, (TAT)n, (GATA)n,

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etc., la valeur de n pouvant aller de quelques unités à plusieurs dizaines. Ces séquences simples ne sont pas codantes. Dans les génomes eucaryotes, elles sont plus fréquentes, mieux distribuées et fortement polymorphes. Les microsatellites ont été largement exploités dans la cartographie génomique et dans les études d'évolution de divers organismes comme l’homme (Lezguien et al., 1996), des mammifères comme le cheval (Breen et al., 1997), les poissons (Guillemaud et al., 2000), les insectes (Schug et al., 1998) et, dans les espèces végétales, principalement chez Arabidopsis (Virk et al., 1998), dans des cultures annuelles comme le riz (Cho et al., 2000), ainsi que pour des espèces pérennes comme, les agrumes, le manioc et le palmier à huile (Kijas et al., 1997; Chavarriaga et al., 1998; Billotte et al., 2001). Pour démarrer un programme d’amélioration génétique, avec l’objectif d’obtenir des variétés présentant de bonnes caractéristiques pomologiques ou tolérantes aux maladies, il faut connaître la biologie florale, le système reproducteur, les ressources génétiques et leur structure, y compris les relations avec les espèces voisines. L’utilisation des marqueurs microsatellites peut permettre de connaître la variabilité génétique intra- et interspécifique et la structuration de la diversité. En outre, ils peuvent être utilisés pour construire une carte génétique, permettant de localiser les gènes intéressants et de suivre leur transmission au long d’un programme de croisements (introgression). Seules quelques études moléculaires ont analysé la diversité génétique chez C. papaya et la plupart ont porté sur des matériels avec un haut degré de domestication. La présente étude, la première effectuée au moyen de marqueurs microsatellites, se situe dans le contexte du projet régional FONTAGRO. Le germoplasme étudié a été fourni par certains partenaires du projet. Il provient essentiellement de l'Equateur (Vasconcellea spp.), du Costa Rica (C. papaya) et de la collection du CIRAD-FLHOR, laquelle provient de l'Arc Antillais et du Venezuela, outre quelques rares accessions d'autres pays (Colombie, Inde, Hawaii). L'Université de Gand (Belgique) a également fourni quelques accessions de Vasconcellea. Les objectifs sont (i) de développer de tels marqueurs microsatellites chez la papaye, (ii) d’observer les niveaux de polymorphisme, (iii) de vérifier s’ils peuvent être utilisés pour les espèces du genre Vasconcellea, (iv) de déterminer les relations génétiques dans une collection de différentes origines géographiques, et (v) comparer les résultats des marqueurs microsatellites avec ceux issus de caractérisations morphologiques, isoenzymatiques, d'ADN (RFLP, RAPD et AFLP).

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MATERIELS ET METHODES

DEVELOPPEMENT D'UNE BANQUE ENRICHIE EN MICROSATELLITES La procédure pour la construction d'une banque enrichie en microsatellites a été réalisée selon la méthode de Billotte et al. (1999) présenté à la figure 1.

DEFINITION ET EVALUATION DES AMORCES La première phase de création des amorces est la sélection de chaque séquence, pour trouver le microsatellite ou éliminer les clones qui se répètent. Ensuite, on définira les couples d’amorces avec les logiciels BioEdit et Primer 3 avec les paramètres suivants: teneur de GC entre 40 et 60%, longueur des amorces entre 15 et 27 pb, rang des fragments amplifiés entre 50 et 350 pb., caractérisés par une énergie interne décroissante en extrémité 3', a un ∆G du pentamère de l'extrémité 3' supérieur à -10Kca/mole.et une température d’annealing entre 40 et 65°C. Les amorces seront évaluées sur trois génotypes de C. papaya et sept espèces du genre Vasconcellea (V. cundinamarcensis, V. monoica, V. stipulata, V. x heilbornni, V. goudotiana, V. sphaerocarpa et V. cauliflora) sur un gel d’agarose à trois concentrations différentes (1, 1,5 et 2%) pour observer la résolution et l’intensité des bandes amplifiées. Les paramètres de la PCR : (1) dénaturation a 94 °C par 4 minutes; (2) 94 °C pendant 30 seconds; (3) trois températures d’annealing (45 °C, 50 °C et 55 °C) par 1 minute; (4) 72°C par 1 minute; (5) 30 cycles avec le pas 2.

CARACTERISATION DES MICROSATELLITES Les couples d’amorces qui présentent une meilleure résolution sur le gel de agarose sont évalués sur un échantillon de 40 accessions des genres Carica et Vasconcellea qui provient de l’arc antillais, du Venezuela, de Colombie et d'Equateur (tableau 1). Pour l’amplification (PCR), les couples des amorces sont marqués radioactivament (γ-33P), puis les produits de l’amplification sont separés par électrophorèses sur un gel de polyacrylamide et révélés par autoradiographie. A partir des données obtenues, chaque microsatellite est caractérisé parla taille et le nombre d'allèles par locus.

STRUCTURE DE LA DIVERSITE GENETIQUE CHEZ Carica papaya. A partir de la caractérisation de chaque microsatellite on prend en compte les plus polymorphes pour être utilisés dans un étude de diversité sur un échantillon de 57 individus provenant de l’arc antillais, du Costa Rica, et du Venezuela, représentant 12 accessions.

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ADN total

(CT) n

Microsatellite

Adaptateur

Extraction et purification d’ADN

Digestion par l’enzime de Restriction RsaI

Ligation d’adaptateurs RsaI

Amorce

Amplification PCR

Biotine

Denaturation et hybridation avec un oligonucleotide biotine

Microbille - Avidine Aimant

Reaction PCR

Insert Plasmide Escherichia coli

Transfert sur membrane

Capture des fragments microsatellites avec un complexe (Avidine-microfile metallique)

Control et amplification PCR des fragments captures

•Insertion des fragments sélectionnés dans un plasmide •Transformation de la bactérie •Sélection de colonie blanche •Extraction d’ADN plasmidique

•Analyse par électrophorèses •Transfert l'ADN sur membrane •Hybridation de la sonde microsatellite •Sélection des clones positifs

Séquence microstellite

TCAGTTCGCTCTCTCTCTCTCTCTGAGTACGGCTA

•Séquençage des clones positifs •Définition d'amorces (logiciel, primer3)

Figure 1. Procédure pour la construction d'une banque enrichie en microsatellites. 7

ANALYSE DE DONNEES Les résultats seront encodés dans une matrice de présence/absence des différentes bandes observées et soumis à l'analyse de classification selon la méthode du voisin le plus proche « neighbor joining » (Saitou et Nei, 1987) en utilisant la distance génétique de Dice. L'analyse sera développée avec le logiciel WinStat. Tableau 1. Liste d'accessions des genres Carica et Vasconcellea employées dans l'étude. Espèce Carica C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya C. papaya

Nombre d'accessions

Vasconcellea V. cundinamarcensis V. sphaerocarpa V. goudotiana V. cauliflora V. stipulata V. x heilbornii V. monoica

Origine

26 8 7 5 4 3 1 1 1 1 1

Costa Rica Guadeloupe Venezuela Grenade Barbade Saint Croix Martinique Antigua Saint Vicente Inde Hawaii

3 2 2 1 1 1 1

Colombie Colombie Colombie Colombie Equateur Equateur Equateur

RESULTATS

DEVELOPPE D'UNE BANQUE Enrichissement de la génothèque Des 507 colonies évaluées, seulement 147 clones positifs ont été isolés (29%) et séquencés. L'analyse des séquences a montré que les tailles des insertions des clones se situent entre 86 et 348 paires de bases. 48,3% des insertions analysées ont été éliminées pour ne pas inclure de clones (faux positifs) des microsatellites, pour éviter une redondance de clones ou à cause de l'emplacement du microsatellite dans une des extrémités de l'insertion. Des insertions avec le microsatellite, 51,7 % sont de type parfait, c'est-à-dire de celles qui sont simples et sans interruption dans le motif répété. Les résultats montrent que les motifs (TC)n et (GA)n sont ceux de plus grande répétabilité.

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DEFINITION ET EVALUATION DES AMORCES A partir de 147 clones positifs séquencés on a défini un total de 76 paires d’amorces (52 %). Ces microsatellites ont été évalués sur trois génotypes de Carica papaya et dans sept espèces du genre Vasconcellea sur un gel d’agarose à 2%, et à une température de 50 °C, lesquelles ont permis une claire résolution et une bonne amplification des bandes. Un total de 70 amorces sur 76 ont fonctionné dans le genre Carica et seulement quatre pour les sept espèces de Vasconcellea (5,71 %), ce qui confirme une nette différenciation génomique entre les genres Carica et Vasconcellea. La figure 2 présente un exemple du chromatogramme de la séquence du clone 2F08.

Figure 2. Chromatogramme de la séquence du clone 2F08 avec le microsatellite (CT)9, logiciel BioEdit.

CARACTERISATION On a choisi 35 paires d’amorces à partir des résultats sur l'agarose basées sur le microsatellites qui montrent les meilleures résolution et différentiation allélique. En outre, on a inclus les couples d'amorces utilisables dans le genre Vasconcellea. Tous ces couples d'amorces ont été évalués sur 29 individus de Carica papaya et sur 11 individus de Vasconcellea représentant sept espèces. Ces amorces ont été marquées par radioactivité et testées sur un gel de polyacrylamide. Des 35 couples d'amorces 26 amorces sont polymorphes chez Carica et quatre chez Vasconcellea. Tous ont montré une claire résolution (tableau 2). Les couples des amorces 2F10, 1A08 et 1H03 sont ceux qui présentent le plus grand nombre d'allèles chez Carica (7-9) tandis que chez Vasconcellea c'est le couple 1H05 avec des six allèles. Deux des quatre couples d'amorces qui fonctionnent chez Vasconcellea sont monomorphes chez Carica.

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Tableau 2. Nombre d'allèles des microsatellite dans les deux genres étudiés. Amorce

Cp2F10 Cp1A08 Cp1H03 Cp1C08 Cp2F11 Cp1B03 Cp2F08 Cp1H02 Cp1H05 Cp1B08 Cp1G12 Cp1E02 Cp2D07 Cp1D08 Cp1H12 Cp1H11 Cp2A05 Cp2D04 Cp1E03 Cp2C11 Cp1F02 Cp1G05 Cp1B12 Cp2E05 Cp1C04 Cp2E02

(TC)14 (CT)18..(GA)3 (TC)24 (AG)7 (GA)10 (TC)14 (CT)20..(AC)5 (CT)9 (CT)18 (TC)10 (TA)4..(AG)18 (GA)5..(GA)13..A..(AG)4 (AG)8 (TC)15 (TC)9 (TC)11 (CT)13 (CT)9...(TC)11 (CT)9 (GA)5.AC.(GA)9 (CT)9…(CT)9 (CT)8..CC..(CT)9 (AG)16 (GA)12 (TC)8 (TC)12 (GA)9..CA..(AG)6 (AG)9

Carica Nombre d'allèles 9 7 7 6 6 6 5 5 5 5 5 4 4 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 1 1

Tailles des allèles 185 - 240 312 - 340 258 - 280 268 - 280 222 - 235 275 - 303 130 - 148 315 - 342 163 - 190 338 - 349 215 - 232 315 - 325 320 - 333 150 - 160 205 - 228 267 - 273 281 - 286 130 - 136 290 - 296 224 - 227 281 - 284 282 - 286 280 - 283 348 - 351 283 299

Vasconcellea Nombre d'allèles 6 2 5 5

Tailles des allèles 145 – 163 335 – 340 264 – 286 277 – 296

Par exemple, l'amplification d'amorce Cp1H05 (TC)10 dans les genres Carica et Vasconcellea est présentée à la figure 3. Outre la grande différence entre les deux genres, il est possible d’observer clairement les différents niveaux alléliques pour chaque individu.

190 pb 185 pb 180 pb 167 pb 163 pb 158 pb 156 pb 150 pb 145 pb

Carica

Vasconcellea

Figure 3. Profils alléliques obtenus sur gel de polyacrylamide après amplification avec l'amorce Cp1H05 : nette différenciation des genres Carica et Vasconcellea.

10

STRUCTURE DE LA DIVERSITE GENETIQUE CHEZ Carica papaya. La variation génétique entre 57 individus de 12 accessions a été estimée par l'indice de similarité de Dice (tableau 3). La moyenne de similarité entre pays est de 0,53, avec un rang de 0,34 à 0,75. La valeur la plus élevée est de 0,72 pour Saint Vincente et Antigua. En revanche, les accessions d'Hawaii et de Guadeloupe présentent une similarité génétique de 0,34. Entre les accessions d'un même pays, celles de Sainte Croix montrent une similarité de 0,75. Le cultivar Solo d'Hawaii montre plus d'affinité pour les individus de Barbade (0,59).

Tableau 3. Similarité génétique entre les papayes de différents pays (indice de Dice). CR Costa Rica Guadeloupe Venezuela Grenade Barbade Saint Croix Martinique Antigua Saint Vincente Inde Hawaii

Gnd

Bbd

SC

Mtq

Atg

SV

Inde

Haw

n=26

Guad Vene n=8

n=7

n=5

n=4

n=3

n=1

n=1

n=1

n=1

N=1

0.67 0.47 0.47 0.47 0.50 0.54 0.56 0.50 0.46 0.54 0.46

0.52 0.47 0.42 0.45 0.52 0.40 0.43 0.41 0.49 0.34

0.61 0.46 0.51 0.57 0.46 0.51 0.48 0.58 0.39

0.68 0.52 0.61 0.53 0.55 0.60 0.50 0.41

0.67 0.61 0.53 0.58 0.59 0.55 0.59

0.75 0.63 0.57 0.60 0.59 0.56

1 0.43 0.49 0.50 0.47

1 0.72 0.46 0.48

1 0.41 0.48

1 0.50

1

Analyse de classification (neighbor joining) Pour construire l'arbre on a utilisé les distances de Dice. L'arbre de classification illustre les relations génétiques parmi les individus des différentes régions géographiques prises dans cette étude. L’arbre montre cinq branches principales où l’on peut observer que la distance parmi les individus est supérieure aux distances entre les branches (figure 4). On peut observer une structure d'origine géographique dans la plupart des pays. Tel est le cas des accessions du Costa Rica, de Guadeloupe, du Venezuela et de Grenade. Pour chaque pays il y a au moins un individu qui sort de son groupe. Chez les individus du Costa Rica il n'y pas de différenciation entre la Côte Pacifique et la Côte Atlantique. En outre, les individus sauvages sont mélangés avec les cultivés. Pour la Guadeloupe, cinq accessions sont bien groupées, tandis que les individus G2, G66 et G77 sont dispersés dans des groupes différents (1B, 4 et 5C). De manière analogue, les accessions du Venezuela sont dispersées et se rapprochent des individus de Guadeloupe. L'accession d'Hawaii (`Solo`), dans la branche 5C, se rapproche fortement de l’accession de Barbade (BBD6), ce qui confirme qu'elle proviendrait de plusieurs cycles de sélection des papayes de ce pays. En termes généraux, les individus du Venezuela et de Guadeloupe sont les plus proches et il y a une forte association dans les accessions du Costa Rica.

11

Figure 4. Classification pour le genre Carica (« neighbor joining », distance de Dice).

RELATIONS PHYLOGENETIQUES ENTRE LES GENRE CARICA ET VASCONCELLEA. Classification - neighbor joining On a construit une matrice à partir des résultats obtenus de l'évaluation de 70 des couples d'amorces qu'on a testés sur trois génotypes de C. papaya et sept espèces de Vasconcellea. Les données ont été encodées comme présence et absence en 0 et 1, c'est à dire, présence pour chaque microsatellite amplifié pour une espèce. La figure 5 présente le dendrogramme obtenu pour l'ensemble des espèces étudiées en tenant en compte la distance de Dice. Il est possible d'observer une différenciation claire entre les espèces, plus particulièrement entre C. papaya et les espèces de Vasconcellea. L'hybride présumé Babaco (V. x heilbornii) apparaît éloigné de ses parents putatifs, V. stipulata et V. cundinamarcensis.

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Figure 5. Classification par espèces dans les genres Carica et Vasconcellea (« neighbor joining », distance de Dice).

DISCUSSION Le pourcentage des clones positifs (29%) trouvés est supérieur aux proportions rapportées dans les études (3,2 % - 25 %) de marqueurs des microsatellites des autres espèces (Martinez, 2001; Hodgetts et al., 2001). Les motifs (TC)n et (GA)n sont ceux de plus grande répétabilité, ce qui correspond avec les observations chez d'autres espèces comme Elymus alaskanus et Cucumis sp. (Sun et al., 1998; Poleng et al., 2001). Des 76 couples d'amorces définies, 70 ont fonctionné dans le genre Carica, soit 92%, un pourcentage élevé par rapport à d'autres études (Billotte et al., 2001). Seulement quatre (5,71 %) de ces séquences microsatellite ont pu être utilisées pour les sept espèces du genre Vasconcellea, ce qui confirme la différenciation des génomes de Carica et Vasconcellea (Aradhya et al., 1999; Badillo, 2000) Les valeurs de similarité génétique obtenues ont un rang entre 0,34 et 0,75 (Dice). C'est un rang inférieur au résultat d'Ocampo (2000) qui a utilisé des marqueurs isozymatiques (0,76 - 0,98, Nei). La donnée la plus divergente est entre les accessions de Guadeloupe et Martinique, car on a obtenu 0,40 contre 0,93. Une possible explication est que dans l'étude isozymatique ont été trouvés seulement quatre systèmes polymorphes sur 10 évalués. Le type d'indice de similarité avait en compte est également différent. Non seulement nos résultats ont montré des indices de similarité bien différents de ceux obtenues avec les isozymes, mais aussi avec les travaux réalisés avec des marqueurs d'ADN comme ceux publiés par Stiles et al. (1993) et Kim et al. (2002), qui montrent des indices moyens de similitude de 0,78 et 0,88 par rapport à 0,53

13

dans nos résultats. Néanmoins, la plupart de ces études sont basées sur des cultivars à haut degré de domestication, comme les cultivars hawaiiens 'Rainbow' et 'SunUp', qui proviennent de plusieurs cycles de sélection. Dans notre liste de germoplasme, la plupart des accessions n'ont pas subi de domestication. Tel est le cas des accessions du Costa Rica qui sont pour la plupart des plantes sauvages. La classification des accessions dans l'arbre et le regroupement de certain individus n'est pas toujours en accord avec les résultats obtenus par Ocampo (2000) avec des marqueurs isoenzymatiques et morphologiques sur les mêmes individus. Les microsatellites ont permis un meilleur regroupement d'origine géographique, bien que celui-ci soit encore peu marqué. Les relations génétiques des sept espèces de Vasconcellea et C. papaya sont très semblables à celles obtenues par Aradhya et al (1999). D’abord la papaye commune se sépare clairement des papayes de montgne. V.stipulata apparaît distante de V. cundinamarcensis, comme c'est le cas également pour V. monoica et V. cauliflora, et en revanche V. goudotiana et V. sphaerocarpa se rapprochent. En général, nos résultats montrent certaines affinités avec les études basées sur des marqueurs d’ADN (Jobin et al., 1997; Aradhya et al., 1999; Van Droogenbroeck et al., 2000), mais avec certaines différences avec des marqueurs biochimiques (Jiménez, 2001). Néanmoins, il faut prendre en compte que nos résultats sont exprimés en présence ou absence de chaque microsatellite. Ce resultat n'est pas surprenant, étant donné que les travaux de Badillo (1971, 1993) basés sur la morphologie de l’ovaire et les barrières de reproduction interspécifiques (Horovitz et Jimenez, 1967) montrent que C. papaya est distant de Vasconcellea. La variation génétique détectée entre les différents groupes de matériels de notre germoplasme ne correspond pas avec la forte variation morphologique observée sur le terrain, notamment dans les caractéristiques du fruit (taille, forme, couleur, et saveur; caractères végétatifs comme les dimensions de la feuille.

CONCLUSIONS

Soixante dix couples d’amorces ont fonctionné dans le genre Carica et seulement quatre pour les sept espèces de Vasconcellea (5,71 %). La moyenne de similarité entre pays est de 0,53, avec un rang de 0,34 à 0,75. Structuration d'origine géographique dans la plupart des pays, notamment pour les accessions du Costa Rica, de Guadeloupe, du Venezuela et de Grenade. Cette étude appuie la réhabilitation du genre Vasconcellea, opérée par Badillo (2000), puisque les marqueurs microsatellites séparent clairement la papaye commune et les papayes de montagne.

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Hauts niveaux de différenciation allélique indiquant que les microsatellites obtenus dans C. papaya seront un outil puissant pour l'étude génétique du genre Carica, dont l'identification variétale et la cartographie génétique. Ceci est la première étude de développement et caractérisation par marqueurs microsatellites chez C. papaya.

PERSPECTIVES Les résultats de cette étude permettront la mise au point d’un programme d’amélioration assistée au moyen de marqueurs microsatellites pour la sélection des accessions les plus intéressantes.

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18

7.3 Desarrollo de marcadores CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (PCR/RFLP) en Vasconcellea y Carica. CIRAD-FLHOR / IPGRI

DESARROLLO DE MARCADORES CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (PCR/RFLP) EN Vasconcellea y Carica M.T. Restrepo, M.F. Duval, G. Coppens d’Eeckenbrugge

GENERALIDADES ADN cloroplastico El ADN cloroplastico es una molecula grande, redonda, muy estable en tamaño y estructura. El ADNcp se encuentra en muchas más copias por célula que las sucesiones del ADN nuclear y su evolución es más lenta. La organización de sus genes es más estable y la taza de sustitución de sus nucleótidos es cuatro veces menos alta que en el nuclear. Por desarrollarse clonalmente el ADNcp es una fuente de marcadores originales muy útil en filogenia a nivel interespecífico o superior aunque puede presentar problemas en los estudios de poblaciones o para el estudio de especies fuertemente emparentadas. El análisis de los sitios de restricción es cada vez más usado para el estudio de la filogenia, ya sea por el análisis directo de los fragmentos obtenidos por la restricción del ADNcp total purificado, o por la hibridación de sondas citoplásmicas del ADNcp sobre el ADN total restringido.

Marcadores CAPS Los marcadores CAPS son la técnica de digestión del producto polimórfico de amplificación. Generalmente se conocen como CAPS o PCR/RFLP. La técnica de CAPS consiste en digerir el fragmento amplificado, con unas o varias enzimas de restricción, en sitios de reconocimiento tetranucleotídico. Posteriormente se revela el polimorfismo de la restricción por medio de electroforesis clásica en gel de agarosa o acrilamida no denaturada. La selección de bases que cortan el ADN en segmentos de 256 bases (44) es impuesto por la longitud mediana del producto de la PCR, comprendido entre 0,5 y 3 kb, lo que permite tener una alta probabilidad de corte. Como los RFLP clásicos, esta técnica genera marcadores codominantes y específicos de cada locus. El polimorfismo contenido unicamente en el interior del fragmento de amplificación es a veces difícil de poner en evidencia. Sinembargo la técnica de PCR/RFLP es sobre todo útil cuando pocos marcadores deben ser manipulados sobre un gran numero de plantas.

Etapas del desarrollo de la técnica Accesiones El ADN utilizado para el desarrollo de la técnica proviene de muestras de la Universidad Técnica de Ambato (Ecuador; género Vasconcellea), de la Universidad de Ghent (Bélgica; Vasconcellea y Carica) y de la Universidad Central de Costa Rica (Carica silvestre y cultivada). Cualificación y cuantificación del ADN Se realizó una electroforesis sobre gel de agarosa para determinar la cantidad usando concentraciones de referencia de 25, 50 y 100 ng/µl de un ADN de 100 pb, y la calidad según el revelado de las bandas. Con base en estos resultados se seleccionó una muestra de siete individuos de V. cundinamarcensis, V. stipulata, V. weberbaueri, V. cauliflora, V. monoica, V. x heilbornii y C. papaya, para ajustar los protocolos de CAPS a las especies evaluadas. Muestra total La muestra total incluye nueve especies y 68 individuos, distribuidos de la siguiente manera : V. cundinamarcensis (16), V. candicans (1), V. x heilbornii (19), V. monoica (3), V. stipulata (8), V. palandensis (2), V. parviflora (3), V. weberbaueri (2), C. papaya (14). Iniciadores Tomando como referencia el articulo ‘cpDNA and plant mtDNA iniciadores’ de Petit et al. (1996), se desarrolló un protocolo sobre la muestra predeterminada. En esta etapa se tuvo en cuenta la temperatura de hibridación porque todos los iniciadores no amplifican sobre las siete especies a la misma temperatura. Un total de nueve pares de iniciadores amplificaron sobre la muestra (trnH-1/trnK-2, trnK-2/trnK-3, rpoC2-7/rpoC1-8, trnC-9/trnD-10, trnD-11/trnT1-12, psbC-15/trnS16, trnS-21/trnT-22, rbcL-29/trnM-28) a 52, 55 y 60°C.

Enzimas Diagrama de digestión del producto PCR

La selección de las endonucleasas se realizó bajo el criterio del número de bases, ya que este tipo de marcador requiere enzimas hasta con 3 pb. Un total de 12 enzimas se utilizaron para la digestión de los productos de la PCR, (Tas I /AATT, Aci I CCGC/, Nla III CATG/, Hinf I G/ANTC, Msp IC/CGG, Rsa IGT/AC, Alu IAG/CT, Mbo I/GATC, Mse I T/TAA, Eco R V GAT/ATC, Bsu R IGG/CC). La digestión se realizó durante toda la noche. Posteriormente se realizó la electroforesis sobre gel de agarosa y el revelado en bromuro de etidio.

Marcadores Una vez los geles revelados se evaluó el polimorfismo de cada marcador, obteniéndose 51 marcadores polimórficos, nueve de los cuales presentaron baja definición. Cuarenta y dos muestran polimorfismo intergenérico e interespecífico y nueve presentan polimorfismo unicamente intergenérico. Enzymes / 1-2 Fragments trnH/trnK Tas I /AATT X Aci I CCGC/ X Nla III CATG/ X Hinf I G/ANTC X Msp I C/CGG non restreint Rsa I GT/AC = Alu I AG/CT X Mbo I /GATC X Mse I T/TAA = Eco R V GAT/ATC non restreint Bsu R I GG/CC

3-4 7-8 9 - 10 11 - 12 15 - 16 trnK/trnK rpoC2/rpoC1 trnC/trnD trnD/trnT psbC/trns = = X X = = X = X = pas net = X X X X X X X X = pas net pas net non restreint X X X X X = pas net X X X = X X X X = X pas net X = X X X non restreint non restreint X =

21 - 22 trns/trnt X = X = X = X X X X

28 - 29 30 - 31 trnM:rbcL rbcL:rbcl = = = X = X = = pas net = X = X X = X X = non restreint non restreint =

Etapa actual Para desarrollar el protocolo en el total de la muestra, se han preseleccionado tres pares de iniciadores con el conjunto de enzimas que mostraron polimorfismo en la digestión. Perspectivas Aplicar la técnica con el total de marcadores polimórficos obtenidos sobre el conjunto de la muestra. De esta manera se tendrá una mayor cobertura del genoma de Vasconcellea y Carica y se comprenderá mejor su filogenia. En la medida de lo posible incrementar número de especies y de origen para lograr una muestra más representativa de los dos géneros.

ANEXO 8 Informes del Proyecto CIRAD-FLHOR/IPGRI para Frutales Neotropicales

8.1 Diversidad morfológica de papayas (Carica papaya L.) y papayuelas (Vasconcellea spp.). Análisis sintético de los datos obtenidos sobre materiales de Costa Rica y del Ecuador . CIRAD-FLHOR / IPGRI

Diversidad morfológica de papayas(Carica papaya L.) y papayuelas (Vasconcellea spp.). Análisis sintético de los datos obtenidos sobre materiales de Costa Rica y del Ecuador María-Teresa Restrepo, Daniel Jiménez y Geo Coppens d’Eeckenbrugge (CIRAD-FLHOR / IPGRI)

La disponibilidad de datos morfológicos completos sobre accesiones de papayas comunes y de montaña nos da una oportunidad de estudiar la diversidad morfológica en los dos géneros de Caricaeae de mayor interés económico, contestando la pregunta central para el mejoramiento de la papaya, la cual concierne la distancia entre los géneros Carica y Vasconcellea y los posibles intercambios genéticos, espontáneos o artificiales. La muestra disponible presenta además el interés particular de comparar las especies de Vasconcellea, generalmente en un estado poco avanzado de domesticación, con tipos de papaya común en un estado comparable. Para el análisis estadístico se siguió el mismo patrón de los análisis anteriores en cada género. Los componentes de la varianza de los caracteres cuantitativos están presentados en la figura 1. Todos los descriptores muestran una fuerte repetabilidad, permitiendo su utilización en los análisis siguientes. Las especies contribuyen fuertemente a la varianza, aún en los caracteres vegetativos. La comparación con el diagrama obtenido para las solas papayas de montaña indica que buena parte de esta contribución corresponde a diferencias intergenéricas.

Relative Variance Components (in Percent) 100

Estimated Relative Variance (%)

80

60

40

20

Error 0 LPEC AHO NLOB DSEN LFL LPÉT LEST DPEC LHO NLOBU LPED LSEP LOVAR LESTG

2-ACCESION 1-ESPECIE

Figura 1. Los componentes de la varianza de los caracteres cuantitativos teniendo en cuenta las accesiones y las especies.

El análisis de componentes principales destaca cuatro factores, relacionados respectivamente con el tamaño de la hoja, el tamaño de la flor, el tamaño del estigma y el número de lobos y lóbulos. Explican 79% de la varianza total. El primer eje opone claramente las papayas silvestres, con hojas muy grandes, a las papayas de montaña, las papayas seleccionadas tomando una posición intermedia (figura 2). 3 cun3 Taquil

Chiquiri

T2-8

FACTOR2 (14% de la varianza total)

2 cun4 Hawaii1 Maradfem Hawaii2 Maradfe1

1 SH9 SH6

SH19

0

-1

T1-51 T2-7A bab50 T1-12 T1-9 cun1 T1-5 T2-52 T2-51 bab13 T1-2 T1-78T1-48 T1-79 T1-60 T1-71T1-17 T1-21 bab47 CH15 bab51B bab85 T1-19 T1-7B bab42 T1-67T1-81 T1-73 T1-4 T1-56 bab39 T1-26bab77 bab44

SH24 SH21 SH30 Criofem SH13 SH38

SH17

SH8

bab45 bab41 bab46 bab23

-2 bab40

-3 -3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

FACTOR1 (46% de la varianza total)

Figura 2. Representación gráfica de las accesiones en el plano principal.

En el dendograma elaborado con los cuatro componentes principales (figura 3), muchas accesiones se separan de manera coherente con su identificación taxonómica. Así observamos una rama para cada tipo de jigacho (V. x heilbornii var. chrysopetala y V. af. x heilbornii var. chrysopetala) y una rama para el babaco. Cerca de ésta, aparece una rama común para las dos presuntas especies parentales, V. cundinamarcensis y V. stipulata. Volvemos a observar que ciertos babacos no se agrupan con su presuntos congéneres, aunque no llegan a formar un grupo coherente, como aparecía en el estudio del solo género Vasconcellea. La sorpresa viene de las papayas comunes. Los tipos silvestres forman un grupo distante, aunque con fuerte variación interna, mientras las formas cultivadas se agrupan cerca de V. af. x heilbornii var. chrysopetala.

Figura 3. Análisis de clasificación de los descriptores cuantitativos (neighbor joining)

El análisis de los datos cualitativos confirma la mayor separación de las papayas silvestres. La figura 4 muestra que el análisis factorial de correspondencia separa tres grandes grupos, (1)Vasconcellea, con tres subgrupos integrando (1.1) las dos papayuelas silvestres y V. af. x heilbornii var. chrysopetala, (1.2) el otro jigacho y (1.3) los babacos, (2) las papayas silvestres y (3) las papayas seleccionadas, con muy poca variación interna. La separación de las papayas seleccionadas se basa esencialmente en la forma de la hoja (número de lóbulos y profundidad del corte), en una leve diferencia en el color del estilo y en la permanencia de los sépalos. El grupo de las papayas silvestres se caracteriza esencialmente por hojas grandes con gran número de lobos. Pocos caracteres florales contribuyen específicamente a la separación de las papayas comunes, con excepción del número de lóculos del ovario.

Figura 4. Análisis factorial de correspondencia en los géneros Carica y Vasconcellea.

El dendograma basado en los caracteres cualitativos (figura 5) nos da una imagen más completa, con una fuerte separación entre Carica y Vasconcellea. Confirma que las papayas silvestres no son más cercanas de las papayas de montaña. Al contrario, las papayas cultivadas se insertan en una posición intermedia. V. cundinamarcensis y V. stipulata forman grupos específicos. Los dos tipos de jigacho vuelven a formar dos grupos cada uno, V. af. x heilbornii var. chrysopetala tomando una posición intermedia entre las dos especies parentales y V. x heilbornii var. chrysopetala una posición intermedia con los babacos. Entre éstos, se vuelve a observar un grupo “disidente”, conformado por las accesiones 47, 50, 51B, 77, y 85.

Figura 5. Análisis de clasificación de los descriptores cualitativos (neighbor joining)

En conclusión, el principal aporte de este estudio conjunto de los dos géneros es que la domesticación más intensiva de la papaya común no tiene relación con la distancia entre los dos géneros. Al contrario, las papayas silvestres se separan de las papayas cultivadas, con distancias comparables a las distancias observadas entre especies de Vasconcellea. Debemos conservar en mente que, aparte el carácter uni- o pentalocular del ovario, los caracteres de la hoja están entre los que más contribuyen a la diferenciación entre los dos géneros y entre los dos tipos de papaya.

8.2 Estudios citogenéticos y palinológicos en Caricaceae para su utilización en programas de mejoramiento. CIRAD-FLHOR / IPGRI

Aprovechamiento de los recursos genéticos de las papayas para su mejoramiento y promoción: Estudios citogenéticos y palinológicos en Caricaceae para su utilización en programas de mejoramiento Creuci Maria Caetano1 y Cristian Andrés Olaya Arias2 Colaboradores: José Alejandro Arroyave Posada2, Jorge Vega C3, Daniel Ricardo Jiménez4 y Ana Luisa Triana Jacome4. 1

IPGRI Américas/UNIMEO-CTESOP,

2

CIAT-Unidad de Virología,

3

UTA-F.Agronomía,

4

IPGRI

Americas.

Introdución En la família Caricaceae se destacan el género Carica, monoespecífico, tropical, y el género Vasconcellea, el cual cuenta con veinte especies, además de V. x heilbornii (V. Badillo) V. Badillo (véase Badillo 2000, 2001). V. x heilbornii n.m. pentagona, conocido como babaco, este es un supuesto híbrido natural de V. cundinamarcensis y V. stipulata. El babaco y las especies V. cundinamarcensis (chamburo), V. stipulata (siglalon), V. monoica (col de Monte) y V. goudotiana (papayuelo), son en conjunto denominados ‘papayas de montañas’ por su distribución geográfica andina (Kempler y Kabaluk 1996). Aunque el babaco es considerado como la más promisoria opción frutícola, por la calidad y tamaño de su fruto, las otras especies referidas son interesantes para el cultivo y también como posibles fuentes de genes para el mejoramiento de C. papaya, teniendo en cuenta su introducción en regiones subtropicales. En todo programa de mejoramiento, sea para selección de material o para producción de híbridos, se debe conocer la base genética y la estabilidad meiótica del germoplasma. Además, el conocimiento de la diversidad genética es de máxima importancia en lo que se refiere al establecimiento de estratégias de conservación y manejo de los recursos fitogenéticos. Aunque las Caricaceae han sido estudiadas en algunos aspectos citogenéticos y muy escasos palinológicos (véase Heilborn 1921, Badillo 1971, Zerpa 1980, Magdalita et al. 1997, Mehetre y Dahat 2000), otros de ellos carecen de comprensión. El objetivo del presente trabajo, por tanto, fue ampliar el conocimiento citogenético del género Vasconcellea, lo que permitirá el manejo y el uso más adecuado de las especies investigadas.

Objetivos “Caracterización citogenética de las especies para conocer y manejar racionalmente las relaciones interespecíficas en los programas de mejoramiento”.

Materiales y métodos Materiales Fue recolectado material botánico en Ecuador y Colombia (ver Tabla 1). El germoplasma colombiano pertenece a la colección de CORPOICA LA SELVA, ubicada en Rionegro, Antioquia. El germoplasma ecuatoriano fue recolectado de la colección de la Facultad de Agronomía de la UTA, ubicada en Ambato, Tungurahua, y parte del material polínico en campo (Chiquiribamba y Taquil, Loja). El estudio se desarrolló en los laboratorios de microscopía de luz y electrónica/Unidad de Virología, CIAT. Tabla 1. Accesiones de Vasconcellea y Carica (Caricaceae) evaluadas en los estudios citogenéticos (mitosis MIT, microsporogénesis MIC, megasporogénesis MEG) y/o palinológicos (acetólisis y viabilidad polínica MOC, MEB). Especie

Accesión*

Material**

Citogenética

Palinología

V. stipulata

VstipEcChiq1

PO

-

MOC, MEB

V. stipulata

VstipEc Chiq2

PO

-

MOC

V. stipulata

VstipEcTaquil

PO

-

MOC

V. stipulata

VstipEc74

PO

-

MOC

V. stipulata

VstipEc8

PO

-

MOC

V. stipulata

VstipEc12

RE, BFF

MIT, MEG

-

V. cundinamarcensis

VcundEc20

BFF

MEG

-

V. cundinamarcensis

VcundEc24

RS, BFM, PO

MIT, MIC

MOC, MEB

V. cundinamarcensis

VcundEc51

PO

-

MOC

V. cundinamarcensis

VcundEc54

PO

-

MOC

V. cundinamarcensis

VcundEcTaquil

PO

-

MOC

V. cundinamarcensis

VcundCol

RS, BFM, PO

MIT, MIC

MOC, ,MEB

V. sphaerocarpa

VsphaCol

BFM, PO

MIC

MOC, MEB

V. cauliflora

VcaulCol

BFM, PO

MIC

MOC, MEB

V. crassipetala

VcrasCol

PO

-

MOC, MEB

V. goudotiana

VgoudCol1

RS, PO, BFM

MIT, MIC

MOC, MEB

V. goudotiana

VgoudCol2

PO

-

MOC

V. monoica

VmonEc3

RS

MIT

-

V.xheilbornii var. pentagona

VxheilpEc40

RE, BFF

MIT, MEG

-

C. papaya

CpapCol1

PO

-

MOC, MEB

C. papaya

CpapCol2

PO

-

MOC

*Ec= Ecuador, Col= Colombia, Chiq= Chiquiribamba, **RS= raíces semillas, RE= raices estacas, BFM= botones florales masculinos, BFF= botones florales femininos, PO= polen.

Métodos Caracterización citogenética a) Microsporogénesis: metodologías convencionales para estudios de la meiosis, descritas por Belling (1926) y McClintock (1929) y adaptadas por Dempsey (1993). b) Megasporogénesis: técnicas descritas por Robinson-Beers et al. (1992) y, adicionalmente, las técnicas para aclaramiento de sacos embrionarios descritas por Herr (1971) y Young et al. (1979). c) Número cromosómico: técnica de aplastamiento com tinción de cromosomas mitóticos con reactivo de Schiff. De las mejores metafases son obtenidos los valores de longitud de brazos cromosómicos y a partir de ellos la longitud absoluta, la longitud relativa, la relación de brazos y el índice de simetría (Huziwara, 1962), con los cuales se determinan la fórmula cariotípica y la nomenclatura, de acuerdo a Levan et al. (1964). También se puede evaluar el patrón de bandas (heterocromatina constitutiva) según la metodología descrita por Sumner (1972), y Verma y Babu (1989). d) Núcleo interfásico: las características del núcleo interfásico, especialmente cromocentros, son analizadas tanto en células preparadas por coloración convencional como por bandeo de acuerdo a lo propuesto por Guerra (1985).

Caracterización palinológica a) Viabilidad polínica: técnica de coloración por carmín acético y observaciones en microscopía óptica, complementando el estudio de microsporogénesis. b) Acetólisis: caracterización morfológica general del polen y de la sola exina, de acuerdo a Erdtman (1986). Observaciones en MOC. c) Caracterización del polen por empleo de microscopía electrónica de barrido MEB: las muestras son fijadas en glutaraldehido 2,5% en buffer fosfato 0,1M pH 7.2 durante 24 horas, deshidratadas en serie alcohólica, secadas al punto crítico e ionizadas con oro paladio. d) Descripción general del polen según descriptores cuantitativos y cualitativos. Se agregó a las caracterizaciones citogenéticas y palinológicas un estudio con SIG empleando FloraMap (Jones y Gladkov 1999).

Resultados y discusión Caracterización citogenética Todas las especies de Caricaceae estudiadas son diplóides con 2n=18, similar a lo reportado por Chandler (1948, citado por Mehetre y Dahat 2000). El núcleo interfásico es del tipo arreticulado. Los complementos cromosómicos de las especies estudiadas son asimétricos. Asimetría cariotípica en C. papaya y otras especies, particularmente V. cauliflora, indica que las mismas están en proceso de evolución (Mehetre y Dahat 2000). Entre todas las accesiones, VcundEc24, VcundCol, VsphaCol y VcaulCol son las que mejor pudieron ser evaluadas en su comportamiento meiótico (Tabla 2). Los valores ‘Anormal’ en la Tabla 2 se refieren por lo tanto a las irregularidades meióticas, y a los comportamientos diferenciados, entre ellos, presencia de micronucleolos en profases y telofases I y II, asociaciones cromosómicas secundarias observadas principalmente en metafases I y II, y además una condensación cromatínica tardía en profases (ver Tabla 3). Así, VcaulCol fue la que presentó mayor irregularidad en su comportamiento meiótico (68.04%), seguida por VcundEc24 (58.61%), VcundCol (37.79%) y finalmente VsphaCol (35.41%). Tabla 2. Comportamiento meiótico (valores en %) en diferentes accesiones y especies de Vasconcellea. Accesión Fase

VcundEc24 Normal

Anormal

V cundCol Normal

Anormal

VsphaCol Normal

VcaulCol

Anormal

Normal

Anormal

Profase I

6.96

3.48

14.29

5.06

4.23

10.02

1.37

3.65

Metafase I

0.00

3.98

4.70

13.56

6.90

4.34

2.74

12.56

Anafase I

0.00

4.97

6.87

6.51

6.79

1.34

0.23

17.12

Telofase I

0.83

3.15

3.62

0.36

6.27

2.45

1.60

1.14

Profase II

2.16

3.65

9.04

1.08

6.68

4.57

3.42

19.63

Metafase II

1.16

6.79

3.62

0.90

7.13

4.12

1.83

0.68

Anafase II

0.83

4.14

3.07

2.35

9.47

1.78

1.37

0.00

Telofase II

4.14

15.40

1.45

0.36

8.35

4.45

3.88

5.94

Tétradas

25.34

13.08

15.6

7.59

8.80

2.34

15.53

7.31

Total %

41.39

58.61

62.21

37.79

64.59

35.41

31.96

68.04

Total cels

604

553

898

438

Además de los comportamientos diferenciados, entre las anormalidades se destacaron la presencia de univalentes, trivalentes y tetravalentes en diacinesis, diversas irregularidades de huso, y la segregación precoz o retardada de cromosomas (Tabla 3). En VcundEc24, la ausencia de huso e irregularidades afines fue la de mayor frecuencia

(37.08%).

Asociaciones

cromosómicas

anormales

también

fueron

reportadas por Zerpa (1980), en híbridos de V. cundinamarcensis y V. stipulata. Irregularidades de huso, siendo multipolares y tripolares (16.67%) o curvilíneos (4.57%) fueron observadas principalmente en VcaulCol. Husos multipolares y tripolares fueron también reportados en C. papaya (véase Mehetre y Dahat 2000), pero husos curvilíneos son reportados por primera vez en VcaulCol y VcundCol. La segregación cromosómica irregular fue notable para un bivalente, igual que al observado por Zerpa (1980) en V. cundinamarcensis, pero para nosotros esta conducta no es indicativo final de un par heteromórfico, porque no fue un comportamiento común en todos los meiocitos evaluados en las fases afines, por el contrario, ocurrió en baja frecuencia. La presencia de un par heteromórfico relacionado con la expresión sexual en las diferentes especies es una cuestión ampliamente discutida pero que carece aún de validez (para revisión véase Badillo 1971, Mehetre y Dahat 2000). Otro aspecto que debe ser estudiado es la condensación cromatínica tardía y su papel para el comportamiento meiótico general en las Caricaceae. Tabla 3. Principales anormalidades o comportamientos meióticos diferenciados (valores en %) en las accesiones y especies de Vasconcellea evaluadas. VcundEc24 VcundCol VsphaCol VcaulCol Asociaciones cromosómicas ≠ 9II

3.15

2.17

3.45

0.68

Condensación cromatínica tardia

3.64

5.97

2.00

1.60

Asociaciones cromosómicas secundarias

-

9.58

5.12

3.88

Segregación cromosómica irregular

0.34

3.61

5.46

4.57

Micronucleolos

-

2.71

14.25

27.63

Ausencia de huso e irregularidades afines

37.08

-

-

-

Irregularidades de husos

-

2.17

0.33

21.24

Microcitos

8.27

4.88

0.11

5.25

% /celulas evaluadas

52.48 / 604

31.09 / 553

30.72 / 898

64.85 / 438

De todas las anormalidades y comportamientos diferenciados, se destaca la ausencia de huso y una serie de irregularidades como consecuencia de la misma (irregularidades afines), en VcundEc24 (Figura 1). En los bivalentes de las diacinesis normales, los quiasmas son en su mayoría del tipo terminal. En las células afectadas, se observan primero en la transición de diacinesis a prometafase, univalentes, bivalentes y multivalentes y más tarde en metafase I la no formación de huso. Los cromosomas se encuentran dispersos por todo el citoplasma (Figura 1a). La segregación casual al final de la meiosis I (Figura 1b) resulta en numerosos núcleos (micronúcleos), con diferentes cantidades de cromatina, lo que persiste en la meiosis II

(Figura 1c). La citocinesis es también irregular (Figura 1d), resultando en tétradas con microcitos (Figura 1e). La mayoría de los productos finales resultantes es estéril (Figura 1f). La ausencia de huso en la accesión VcundEc24 es un fenómeno reportado por primera vez en Vasconcellea, y que además de contribuir a la inviabilidad de los productos finales, tiene importante implicación

citogenética.

La

segregación

cromosómica relacionada a la formación del huso es uno de los eventos claves de la meiosis. Posiblemente la ausencia de huso en esta accesión es un caracter monogénico, recesivo, pero para confirmarlo será necesaria la continuidad de estudios en un mayor número de germoplasma recolectado en condiciones naturales, ya que la accesión afectada se ha desarrollado en invernadero. Esta VcundEc24, y también VcundCol, no constituyen desde el punto de vista citogenético, germoplasma favorable para uso en programas de mejoramiento.

Figura 1. Ausencia de huso en V. cundinamarcensis (VcundEc24). a) meiocitos en metafase I con diferentes asociaciones cromosómicas dispersas en el citoplasma; b) telofase I exibiendo núcleos con diferentes cantidades de cromatina; c) telofase II con número de núcleos mayor que cuatro; d) segunda citocinesis, en planos irregulares, lo que dará origen a microcitos; e) tétrada de microsporos com dos microcitos; f) productos finales, la mayoria esteril (no teñidos), el central mas pequeño, resultante de microcito.

La Tabla 4 muestra una comparación entre la regularidad meiótica y los productos finales viables. Tabla 4. Comparativo entre frecuencia de meiocitos normales y productos meióticos viables (valores en %) en las accesiones y especies de Vasconcellea evaluadas. Accesión Meiocitos normales Productos meióticos viables VcundEc24

41.39

16.52

VcundCol

62.21

47.93

VsphaCol

64.59

90.75

VcaulCol

31.96

42.98

Las anormalidades meióticas presentadas por las accesiones de V. cundinamarcensis (véase Tabla 3), sobre todo la ausencia de huso en VcundEc24 (37.08%), han comprometido la viabilidad de los productos finales de meiosis (Tabla 4), pero no explican, aisladamente, la alta frecuencia de inviabilidad (83.48 y 52.07%, respectivamente). Otro factor actuante en la pos-meiosis debe haber llevado al degeneramiento polínico en VcundEc24 y VcundCol, siendo mas intenso en la primera. En VsphaCol, la anormalidad meiótica que más comprometió la viabilidad fue la segregación cromosómica irregular, mientras en VcaulCol fueron las irregularidades de huso y luego la segregación cromosómica irregular. Para VsphaCol, la alta frecuencia de productos viables (90.75%) se explica por los comportamientos meióticos diferenciados (21.37%), que considerados adicionalmente a las anormalidades totalizan el 35.41% presentados en las Tablas 2 y 3. Estos comportamientos, presencia de micronucleolos (14.25%), asociaciones cromosómicas secundarias (5.12) y condensación cromatínica tardía (2.00%) efectivamente no interfieren en el proceso meiótico. Antes, los primeros son indicativos de un posible origen híbrido para V. sphaerocarpa, lo que vale también para V. cauliflora. En esta especie, los mismos comportamientos corresponden respectivamente a 27.63, 3.88 y 1.60%, totalizando 33.11% de los 68.04% mostrados en la Tabla 3. Presencia de numerosos NOR (1.7% de los meiocitos evaluados) en V. sphaerocarpa está relacionada a los micronucleolos y corroboran su origen híbrido. En células mitóticas de V. goudotiana también fueron observados cuatro a cinco cromosomas satelitados. Micronucleolos fueron reportados en híbridos de V. cundinamarcensis y V stipulata (Zerpa 1980), mientras asociaciones cromosómicas secundarias en C. papaya (Kumar et al. 1945). En el presente estudio, estos dos comportamientos fueron observados solamente en la accesión colombiana de V. cundinamarcensis (VcundCol), lo que muestra una diferenciación entre ésta y la

accesión ecuatoriana, VcundEc24. Las accesiones diferen también en los patrones de husos y tétradas (ver Tabla 5), en aspectos palinológicos y en la distribución geográfica, de acuerdo a los estudios de SIG (FloraMap). Todos estos datos sugieren un origen o una coevolución divergente para ambas. Finalmente, fueron evaluados los patrones de husos en meiosis II y tétradas de microsporos en las mismas VcundEc24, VcundCol, VsphaCol y VcaulCol (Tabla 5). Fueron contadas 300 células normales en meiosis II, y lo mismo para las tétradas de microsporos. Mientras Zerpa (1980) reporta tan solo la orientación perpendicular para los husos en metafases II de V. stipulata, se observaron husos convergentes y perpendiculares en VcundEc24, y convergentes, perpendiculares y paralelos para Vcundcol, VsphaCol y VcaulCol. Los patrones de tétradas observados en VcundEc24 fueron el tetraédrico y el entrecruzado. VcundCol presentó cuatro diferentes tipos de tétradas, siendo tetraédrico, entrecruzado, isobilateral y romboidal. VsphaCol y VcaulCol presentaron tres patrones, pero siendo tetraédrico, entrecruzado e isobilateral para la primera y tetraédrico, entrecruzado y romboidal para la última. La menor diversidad de patrones de tétradas asociada a la mayor frecuencia del tipo tetraédrico en VcundEc24 sugiere que esta es más primitiva en relación a las demás. Tabla 5. Patrones de husos y tétradas de microsporos (en %) en dos accesiones de V. cundinamarcensis (VcundEc24 y VcundCol), V. sphaerocarpa y V. cauliflora. Accesión VcundEc24 VcundCol VsphaCol VcaulCol Huso Convergente

56.60

35.71

57.67

56.25

Perpendicular

43.40

25.00

28.67

37.50

Paralelo

0.00

37.50

13.67

6.25

Tetraedrico

59.50

46.70

61.33

72.33

Entrecruzado

40.5

37.80

38.33

25.33

Isobilateral

0.00

2.60

0.34

0.00

Romboidal

0.00

12.90

0.00

2.33

Tétradas de microsporos

Caracterización palinológica Polen tricolporado, mediano y de un mismo patrón fue observado en todas las accesiones evaluadas en las diferentes metodologías del estudio palinológico. Las vistas ecuatorial y polar son mostradas respectivamente en las Figuras 2a y 2b. Diferencias en el tamaño del polen y el contenido cromatínico también ocurrieron,

siendo representados por microcitos y polen 2n, siendo el último tetracolporado. Un factor importante a considerar en relación a la antesis y la consecuente receptividad del estigma es la emisión precoz del tubo polínico (Figuras 2c-d).

Figura 2. Polen en el género Vasconcellea. a) vista ecuatorial; b) vista polar; c, d) emisión precoz del tubo polínico.

Tabla 6. Viabilidad polínica en accesiones de Vasconcellea y Carica papaya (Caricaceae). Accesión

PV

%PV

PNV

%PNV

Total

VstipEcChiq1

1099

95.40

53 (5)

4.60 (0.49)

1152

VstipEcChiq2

908

96.50

33 (6)

3.50 (0.64)

941

VstipEcTaquil

614

65.05

330 (3)

34.95 (0.32)

944

VstipEc74

1440

84.17

271 (12)

15.83 (0.71)

1711

VstipEc8

212

15.37

1168 (216 )

84.63 (15.66)

1380

VcundEc24

215

16.52

1087 (122)

83.48 (9.37)

1302

VcundEc51

1307

66.79

650 (44)

33.21 (2.25)

1957

VcundEc54

1046

71.94

408 (34)

28.06 (2.34)

1454

VcundEcTaquil

871

89.52

102 (4)

10.48 (0.42)

973

VcundCol

266

47.93

289 (34)

52.07 (6.13)

555

VsphaCol

1089

90.75

111 (14)

9.25 (1.17)

1200

VcaulCol

624

42.98

828 (87)

57.02 (6.00)

1452

VgoudCol1

922

93.80

61 (8)

6.20 (0.82)

983

VgoudCol2

944

94.69

53 (1)

5.31 (0.10)

997

CpapCol1

868

88.49

113 (1)

11.51 (0.11)

981

CpapCol2

258

54.43

216 (0)

45.57 (0.00)

474

PV= polen viable; PNV= polen no viable; ( *) indican frecuencia de microcitos dentro del polen no viable.

La viabilidad polínica para diferentes especies y accesiones de Vasconcellea, es presentada en valores absolutos y porcentuales en la Tabla 6. VstipEc8 presentó la mayor variación en el tamaño del polen, entre normales, microcitos y 2n, bajo tinción con el carmín acético, y el mayor índice de polen inviable (84.63%), siendo un poco más que VcundEc24 (83.48%). De modo general, las frecuencias variables en la viabilidad, sea en accesiones recolectadas en campo como en colecciones, incluyendo invernadero, son indicativo del grado de estabilidad meiótica y de las diferencias genéticas entre accesiones de una misma especie. Así, de las accesiones de V. stipulata, no se recomienda el uso de VstipEc8 (15.37% de viabilidad) en programas de mejoramiento, y lo mismo para VcundEc24 (16.52%). Una planta de invernadero de VcundEc24, ha producido tres frutos de su primera floración. La producción de frutos en plantas consideradas masculinas es un comportamiento también observado en VcundCol, en determinadas condiciones ambientales. CpapCol2, hermafrodita, presentó poco polen, con incidencia relativa de degeneramiento (54.43% de viabilidad). Aunque las accesiones de C. papaya evaluadas se desarrollaron en condiciones ambientales impropias, CpapCol1, masculina, exibió regularidad en la viabilidad polínica (88.49%). Las mediciones de los granos de polen realizadas bajo acetólisis (MOC) y MEB fueron comparadas, y la diferencia entre las dos extraída. El promedio para las accesiones evaluadas es presentado en la Tabla 7. Las diferencias entre las mediciones son debidas a la técnica, siendo considerada la primera (acetólisis) en la caracterización del polen. Las mismas mediciones se utilizaron para definir el tamaño del polen, el índice P/E (eje polar x diámetro ecuatorial), y el índice del área polar PAI, todos en micrómetros (µm), además de otros caracteres generales. Tabla 7. Mediciones de granos de polen en vista ecuatorial (eje ecuatorial x eje polar, en µm) bajo acetolisis (MOC) y MEB en accesiones de Vasconcellea, y C. papaya (MEB). Accesión Acetolisis (MOC) MEB Diferencia ejes MOC/MEB VstipEcChiq1

35.46 x 42.31

23.27 x 28.20

6.85 / 4.93

VcundEc24

36.26 x 42.75

16.71 x 27.50

6.49 / 10.79

VcundCol

30.79 x 34.56

23.51 x 29.59

3.77 / 6.08

VsphaCol

34.61 x 36.89

21.82 x 33.64

2.28 / 11.82

VcaulCol

34.24 x 41.19

26.82 x 33.64

6.95 / 6.82

VgoudCol1

35.54 x 36.88

21.22 x 31.02

1.34 / 9.80

VcrasCol

37.40 x 45.47

30.00 x 30.43

8.07 / 0.43

CpapCol1

-

22.45 x 26.53

- / 4.08

En adición al análisis en MEB (Figuras 3 y 4), los datos mostrados en la Tabla 7 permitieron verificar diferencias entre las especies, pero también entre las accesiones de V. cundinamarcensis de Ecuador (VcundEc24) y Colombia (VcundCol), confirmando las diferenciaciones ya observadas en el estudio del comportamiento meiótico, incluyendo los patrones de huso y tétradas. Para VcundEc24 y VcundCol se hizo también un comparativo del promedio de las medidas del polen bajo tinción por carmín acético (CA), acetólisis y MEB (Tabla 8). Este promedio fue obtenido del número de granos de polen evaluados, en cada técnica. Considerando el eje ecuatorial x eje polar, se verifica en la diferencia CA/acetólisis/MEB una constancia entre los valores, para ambas las accesiones (3.9 / 6.49 / 10.79 para VcundEc24, y 1.2 / 3.77 / 6.08 para VcundCol). Tabla 8. Promedio del polen en las accesiones de Ecuador y Colombia de V. cundinamarcensis bajo tinción por carmín acético, acetólisis y MEB. Accesión

VcundEc24

VcundCol

Carmín acético CA

30.9 x 34.8

35.7 x 36.9

Acetólisis

36.26 x 42.75

30.79 x 34.56

MEB

16.71 x 27.50

23.51 x 29.59

Diferencia CA /acetolisis/MEB

3.9 / 6.49 / 10.79

1.2 / 3.77 / 6.08

Para las especies evaluadas, la colorabilidad por carmín, el tamaño y la morfología (heteromorfismo - polen tricolporado y tetracolporado) son indicadores de la viabilidad polínica, ya que para el polen normal con las tres características se observó la emisión del tubo polínico (Figuras 2c-d).

Descripción general del polen en el género Vasconcellea (Caricaceae), según las especies evaluadas 1. Unidad polínica: monomórfico, mónadas (Figura 2a, b) 2. Polaridad: isopolar 3. Vista ecuatorial: (Figura 2a) 4. Vista polar: (Figura 2b) 5. Simetría: radial isopolar (radiosimétrico isopolar) 6. Número de aberturas según NPC (número, posición, caracter): tres, como en la mayoría de las Dicotyledoneae. Presencia de colpo y poro (‘os’), colporado, por tanto tricolporato (Figura 2b); nomotreme 7. Posición de las aberturas: zonoaperturado; zonocolporado

8. Estructura y escultura de la esporodermis: tectado, cavado, foveolado, columelas presentes (véase Figuras 3 y 4) 9. Morfología: según el índice P/E (eje polar/diámetro ecuatorial), prolato-esfeiroidal (V. sphaerocarpa y V. goudotiana) a subprolato (V. cauliflora, V.crassipetala, V. stipulata, y V. cundinamarcensis VcundEc24 y VcundCol). En vista polar, contorno angular, triangular obtuso, convexo, más pronunciado en V. cundinamarcensis de Ecuador (VcundEc24), V. stipulata y V. sphaerocarpa. En vista ecuatorial, no angular, elíptico acuminado obtuso para V. cundinamarcensis (VcundEc24 y VcundCol), V. goudotiana y V. sphaerocarpa, aunque con variación en el diámetro ecuatorial, la menor en VcundEc24, y la mayor en V. sphaerocarpa. Elíptico truncado para V. stipulata, y elíptico emarginado para V. cauliflora y V. crassipetala (ver Figuras 3 y 4) 10. Tamaño: mediano (25-50 µm) 11. Indice del área polar IAP (µm): muy grande (>0.75). Los caracteres del polen tienen importancia taxonómica y filogenética, sobre todo el número de aberturas, que presentan lugar definido con relación al ecuador y a los polos. El tamaño generalmente permanece constante dentro de la misma especie, siendo heterogéneo en los híbridos, y relacionado con el número de cromosomas. Erdtman (1952) describió al polen de las Caricaceae, incluyendo Vasconcellea, como tricolporados y subprolatos, y similares a los encontrados en Passifloraceae, Achariaceae y Cucurbitaceae. De acuerdo a nuestros resultados los mismos son tricolporados y subprolatos o prolato-esfeiroidales (Figuras 3 y 4), pero que no tienen similitud con los de Passifloraceae, también investigados por nosotros (datos no publicados). Igualmente, en V. cauliflora se obtuvo un polen subprolato (P/E 1.203), diferiendo del prolato esfeiroidal (P/E 1.070) reportado por Badillo (1971). En la Figura 3 son exhibidos respectivamente el polen en vista ecuatorial (3a, c, e, g) y vista polar (3b, d, f, h) de V. cundinamarcensis (VcundEc24 y VcundCol), V. stipulata (VstipEc12) y V. goudotiana (VgoudCol), por MEB. En la Figura 4, la vista ecuatorial (4a, c, e, g) y la polar (4b, d, f, h) de V. cauliflora (VcaulCol), V. sphaerocarpa (VsphaCol), V. crassipetala (VcrasCol) y C. papaya (CpapCol1). Tanto las características especie-específicas, como las similitudes pueden ser observadas, y en adición a los datos de acetólisis y carmín acético, establecerse comparaciones. Así, según las vistas ecuatorial y polar y teniendo en cuenta otros descriptores

palinológicos, se puede agrupar las siete especies y las dos accesiones de V. cundinamarcensis como sigue:

a) En vista ecuatorial Dos grupos, cada uno conteniendo dos subgrupos interrelacionados

Grupo 1 Subgrupo 1a: VcundEc24, VcundCol y VgoudCol; Subgrupo 1b: VsphaCol.

Grupo 2 Subgrupo 2a: Vstip12; Subgrupo 2b: VcaulCol, VcrasCol y CpapCol1.

b) En vista polar

Igualmente los dos grupos presentan cada uno dos subgrupos Grupo 1 Subgrupo 1a: VcundEc24, VstipEc12 y VsphaCol; Subgrupo 1b: VcundCol.

Grupo 2 Subgrupo 2a: V goudCol y VcrasCol; Subgrupo 2b: CpapCol1 y VcaulCol.

Figura 3. Vistas ecuatorial (a,c, e, g) y polar (b, d, f, h) del polen de Caricaceae, en microscopía electrónica de barrido. a-b) V. cundinamarcensis de Ecuador VcundEc24; cd) V. cundinamarcensis de Colombia (VcundCol); e-f) V. stipulata; g-h) V. goudotiana.

Figura 4. Vistas ecuatorial (a,c, e, g) y polar (b, d, f, h) del polen de Caricaceae, en microscopía electrónica de barrido. a-b) V. cauliflora; c-d) V. sphaerocarpa; e-f) V. crassipetala; g-h) C. papaya.

Consideraciones finales El presente trabajo, “Estudios citogenéticos y palinológicos en Caricaceae para su utilización

en

programas

de

mejoramiento”,

complementario

al

proyecto

“Aprovechamiento de los recursos genéticos de las papayas para su mejoramiento y promoción”, tuvo como objetivo realizar la evaluación citogenética de las Caricáceas investigadas en el proyecto, y un tiempo previsto para su realización de diez meses, de agosto del 2002 a mayo del 2003. Dada la importancia de las especies investigadas como opción de cultivo subtropical o fuentes de genes, se sugiere la continuidad de tales estudios, sobre todo como herramienta para basar la formación de híbridos (y la evaluación citogenética paralela a los mismos). Referencias Belling J. 1926. The iron-acetocarmine method of fixing and staining chromosomes. Biol. Bull. 50: 160-162. Badillo V.M. 1971. Monografia de la familia Caricaceae. In: Asociación de Profesores, Maracay, Venezuela, Universidad Central de Venezuela. Badillo V.M. 2000. Carica L. vs. Vasconcella St.-Hil. (Caricaceae) com la rehabilitación de este ultimo. Ernstia 10: 74-79. Badillo V.M. 2001. Nota correctiva Vasconcellea St. Hill., y no Vasconcella (Caricaceae). Ernstia 11: 75-76. Dempsey E. 1993. Traditional analysis of maize pachytene chromosomes. In: Freeling M. and Walbot V. (eds.). The Maize Handbook, New York, Springer-Verlag New York Inc., pp. 432-441. Erdtman G. 1952. Pollen morphology and plant taxonomy. Angiosperms. Estocolmo, Suecia, Almqvist & Wiksell. Erdtman G. 1986. Pollen morphology and plant taxonomy. Angiosperms. An introduction to palynology. Leiden, Netherlands, E.J. Brill. Guerra M.S. 1985. Estrutura e diversificação dos núcleos interfásicos em plantas. In: Aguiar-Perecin M., Martins P. e Bandel G. (eds.). Tópicos de Citogenética e Evolução de Plantas. Ribeirão Preto, São Paulo, Sociedade Brasileira de Genética, pp. 137-153. Heilborn O. 1921. Taxonomical and cytological studies of cultivated Ecuatorial species of Carica. Ark Bot 17: 1-16. Herr Jr J.M. 1971. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in Angioserms. Amer J Bot 58: 785-790. Huziwara Y. 1962. Karyotype analysis in some genera of Compositae. VIII. Further studies on the chromosomes of Aster. Am J Bot 49: 116-119. Jones P.G., Gladkov A. 1999. FloraMap. A computer tool for predicting the

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for

demonstrating

centromeric

Verma R.S., Babu A. 1989. Banding Techniques. 3. In: Manual of Basic Techniques. New York, pp. 45-113. Young B.A., Sherwood R.T., Bashaw E.C. 1979. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot 57: 1668-1972. Zerpa D.M. de. 1980. Comportamiento meiótico de la descendencia híbrida producida al transferir el caracter bisexual de Carica pubescens a Carica stipulata. Rev Fac Agron (Maracay) 11(1-4): 5-47.

ANEXO 9 Ficha de Colecta y Evaluación de Especies de la Familia Caricaceae

FICHA DE COLECTA Y EVALUACIÓN DE ESPECIES DE LA FAMILIA CARICACEAE Especies consideradas para desarrollar la siguiente lista de descriptores:

1. Vasconcellea cundinamarcensis 2. Vasconcellea goudotiana 3. Vasconcellea cauliflora 4. Vasconcellea crassipetala 5. Vasconcellea sphaerocarpa 6 Vasconcellea x heibornii cv. ‘babaco’ 7. Vasconcellea x heibornii var. chrysopetala 8. Vasconcellea stipulata 9. Carica papaya Fecha de colecta:

(dd/mm/aa) .

ACCESIÓN

.

FICHA No.

.

NOMBRES DE COLECTORES

. . .

1. TAXONOMÍA FAMILIA

.

GÉNERO

.

ESPECIE

.

SUBESPECIE

.

VARIEDAD

.

NOMBRE COMÚN

.

NOMBRE LOCAL

.

2. GEOGRAFÍA LOCALIDAD DE LA COLECTA

.

MUNICIPIO DE LA COLECTA

.

DEPARTAMENTO O ESTADO

.

PAÍS

.

LATITUD

.

LONGITUD

.

ALTITUD (msnm)

.

1

3. DATOS DE COLECCIÓN IN SITU 3.1 TIPO DE MATERIAL 1. Vegetativo

2. Semillas

3. Ambos

4. Cultivo de tejidos

3.2 FUENTE DE COLECCIÓN 1. Silvestre

2. Tienda

3. Mercado de pueblo

4. Instituto

5. Granjas

6. Solares

7. Mercado comercial

8. Otros

3.3 STATUS DE LA MUESTRA 1. Silvestre

2. Línea propagada

5. Cultivar primitivo

6. Otro

3. Cultivar avanzado

4. Maleza

.

3.4 NÚMERO DE PLANTAS MUESTREADAS: 3.5 DISTRIBUCIÓN 3. Limitada

7. Ampliamente distribuida

3.6 EROSIÓN GENÉTICA 0. No hay erosión

3. Lenta

5. Intermedia

7. Rápida

Para su determinación se tendrá en cuenta las variedades que crecían hace unos 10-15 años comparadas con las que crecen en la actualidad, considerando la información suministrada por los habitantes de la zona 3.7 GEOFORMA DEL SITIO DE COLECCIÓN 1. Plana

2. Cima

3. Escarpada

4. Cima redondeada

5. Pendiente escarpada

6. Pendiente media

7. Terraza

8. Pendiente ligera

9. Depresión abierta

10. Depresión cerrada

11. Otra

3.8 TIPO DEL SITIO 1. Campo

2. Borde de camino

3. Borde de arroyo

4. Pantano

5. Playa

6. Desierto

7. Pastizal

8. Bosque caducifolio

9. Bosque perennifolio

10. Selva tropical

11. Selva tropical media

12. Selva tropical alta

13. Jardín

14. Huerto familiar

15. Otro

3.9 TIPO DE SUELO 1. Arcilloso

2. Arcillo limoso

3. Limoso

4. Franco

5. Areno limoso

6. Arenoso

7. Materia orgánica

3.10 INSOLACIÓN 1. Soleado

2. Medio sombreado

3. Sombreado

4. Otro

3.11 PRECIPITACIÓN ANUAL MEDIA: mm

2

4. USOS DE LA PLANTA 4.1 USOS DE LAS HOJAS 1. Verdura

.

2. Medicinal

.

3. Ambas

.

4. Otro

4.2 USOS DEL FRUTO 1. Verdura

2. Postre

3. Aromatizante

4. Preparación alimentos

5. Medicinal

6. Producción de látex

7. Combinaciones

8. Jugo

9. Otro

4.3 USOS DE LA SEMILLA 1. Medicinal

.

2. Producción aceite

3. Productos farmacéuticos

4. Otro

5. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA PLANTA Y DEL TALLO (Para C. papaya, una primera parte de la caracterización se realiza cuando se abre la primera flor. La caracterización se completa cuando madura el primer fruto.) 5.1 TIPO DE ÁRBOL 1. Hembra

.

2. Hermafrodita

5.2 EDAD DEL ÁRBOL:

.

3. Macho

.

5.3 HÁBITO DE CRECIMIENTO 1. Tallo único

.

2. Tallo ramificado

3. Tallos múltiples desde la base

5.4 CICLO BIOLÓGICO 1. Anual

.

2. Bienal

.

3. Perenne

5.5 MECANISMO DE REPRODUCCIÓN 1. Vegetativo

.

2. Semilla

.

3. Ambos

5.6 DISTANCIA MEDIA ENTRE LOS NUDOS EN EL ÁRBOL (Cinco medidas de cinco entrenudos sucesivos tomados en la parte suberizada) mm 5.7 COLOR DEL TALLO EN LA PARTE MEDIANA (suberizado) 1. Verdoso a gris claro .

2. Gris marrón .

3. Verde púrpura .

4. Púrpura

5. Otro 5.8 PIGMENTACIÓN DEL TALLO JOVEN (no suberizado) 1. Verde .

2. Verde y púrpura

.

3. Púrpura

.

4. Otro

5.9 VERRUGOSIDAD DEL TALLO 0. Ausente

1. Poca

2. Mucha

5.10 DISTRIBUCION DE LA VERRUGOSIDAD 1. En la base del pecíolo

2.En todo el entrenudo

5.11 ESTĺPULAS 0. Ausente

1. Muy fina (decidua)

2. Conspicua, blanda, pequeña (5mm), acrescente

5. 12 ALTURA DEL ÁRBOL A LA PRIMERA COSECHA: ___________mm (sólo para C. papaya) 3

5.13 NÚMERO DE NUDOS A LA PRIMERA FLOR: _________ (sólo para C. papaya) 5.14 DIÁMETRO DEL ÁRBOL: mm (medir a 10 centímetros del suelo) 6. CARACTERÍSTICAS DE LA HOJA NOTA! Las medidas deberán tomarse en las mismas cinco hojas, totalmente desarrolladas y maduras 6.1 LONGITUD DEL PECÍOLO mm 6.2 DIÁMETRO DEL PECÍOLO (en la parte media) _________mm 6.3 ESTRUCTURA DEL PECÍOLO (en la parte media) 1. Hueco

2. Con médula

3. Macizo

6.4 ESPÍCULAS EN EL PECIOLO (al tacto) 0. Ausente

1. Presente

6.5 COLOR DEL PECÍOLO 1. Verde pálido

.

5. Púrpura

2. Verde

.

3. Verde oscuro

.

4. Verde y púrpura

6. Otro

6.6 ANCHO DE LA HOJA mm 6.7 LONGITUD DE LA NERVADURA CENTRAL (desde la inserción del pecíolo hasta el ápice): mm 6.8 NÚMERO DE ESPINAS EN LA NERVADURA CENTRAL ________ Nota: Las hojas de papayas y papayuelas se consideran divididas en lobos (correspondiendo a una nervadura primaria), lóbulos (correspondiendo a nervaduras secundarias), y lobulillos (correspondiendo a nervaduras terciarias o de rango superior). Estos últimos pueden ser simples puntas a lo largo de un lobo o lóbulo. 6.9 NÚMERO DE LOBOS O NERVADURAS NACIENDO DE LA INSERCIÓN DEL PECÍOLO EN LA LÁMINA _________( en cinco hojas) 6.10 NÚMERO DE LÓBULOS Y LOBULILLOS EN EL LOBO PRINCIPAL (correspondiendo a la nervadura central), ________ (en cinco hojas) 6.11a HENDIDURA ENTRE LOS LOBOS 1. Poco profunda

2. Intermedia

3. Muy profunda

4. Lobos independientes

6.11b DISTANCIA DESDE EL PUNTO DE INSERCIÓN DEL PECÍOLO Y EL SENO DERECHO DEL LOBO CENTRAL __________mm 4

4

LC

3 5

2

6

7 1 8

4

9

D PS

5

6 AH 7

3 2

8

1

9

EJEMPLO DE DESCRIPCION DE UNA HOJA 5.14 LONGITUD DE LA NERVADURA CENTRAL DE LA HOJA MADURA : LC cm 5.15 ANCHO DE UNA HOJA MADURA : AH cm 5.16 FORMA Y DENTACIÓN GENERAL DE LA HOJA 5.17A NÚMERO DE LOBOS O NERVADURAS NACIENDO DE LA INSERCION DEL PECIOLO EN LA LAMINA : 9 5.17B NUMERO DE LOBULOS Y LOBULILLOS EN EL LOBO PRINCIPAL : 9 5.17C HENDIDURA ENTRE LOS LOBOS : 3 5.17D DISTANCIA ENTRE EL PECIOLO Y EL SENO DERECHO DEL LOBO CENTRAL : DPS cm (el segmento DPS aparece a la izquierda de la nervadura central porque la hoja está presentada por el envés) 5.17E. MARGENES FOLIARES : 1 5.22

FORMA GENERAL DEL SENO PROXIMAL DEL PECÍOLO : 4

5

6.12 MÁRGENES FOLIARES 1. Enteros

2. Aserrados

3. Otro (precisar: dentado, crenulado, etc.)

6.13 FORMA DEL ÁPICE DE LA HOJA (Lobo central) 1.Redondeado

2. Obtuso (>90)

3. Agudo

4. Muy agudo (