SIMPOSIOS SIMPOSIO I: ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE MACROMOLÉCULAS. Moderadores: Dres. A Buschiazzo y S Pantano

Expositores: 10:45-11:05

MD Piñeiro (FMed, UdelaR): ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES DE UNA PEROXIRREDOXINA DE Trypanosoma cruzi

11:05-11:25

F Trajtenberg (UCP, IP) : ESTUDIO ESTRUCTURAL DEL TERMOSENSOR DESK DE Bacillus subtilis

11:25-11:45

V Tórtora (FMed, UdelaR): ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE FORMAS NITRADAS DEL CITOCROMO C

11:45-12:05

H González (FQuím/FMed, UdelaR) ANÁLISIS DE MICROHETEROGENEIDAD ESTRUCTURAL DE POLISACÁRIDO CAPSULAR DE Streptoccocus pneumoniae SEROTIPO 14

12:05-12:25

A Zeida (IP) DESARROLLO DE UN MODELO SIMPLIFICADO PARA SIMULACIÓN DE ADN

11:25-12:45

A Pittini (FQuím, UdelaR): CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE FARMACOS ANTI-CANCERIGENOS DE Pt(IV) Y METABOLITOS PRINCIPALES

Resúmenes simposio I

ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES DE UNA PEROXIRREDOXINA DE Trypanosoma cruzi. 1,2

Piñeyro M. D., 2Arcari T., 3Parodi-Tálice A., 1,2Robello C.

1

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR; 2 Unidad de Biología Molecular, Instituto Pasteur Montevideo; 3 Sección Genética, Facultad de Ciencias, UdelaR Trypanosoma cruzi posee sistemas de defensa antioxidantes diferentes al de sus huéspedes mamíferos, dependientes del tripanotión, exclusivo de kinetoplástidos. Uno de los sistemas de detoxificación de hidroperóxidos depende de la enzima triparredoxina peroxidasa (de la familia de las peroxiredoxinas). Existe un complejo sistema para regenerar a la triparrredoxina peroxidasa basado en las proteínas triparredoxina (TXN) (de la familia de las tiorredoxinas) y tripanotión reductasa y el ditiol tripanotión. En trabajos previos, realizamos la purificación de la triparredoxina peroxidasa citosólica de T. cruzi (c-TcTXNPx). Cristalizamos y resolvimos la estructura de la c-TcTXNPx, en su forma reducida y activa, a una resolución de 2.8Å. La estructura de la enzima muestra que es un anillo compuesto de 5 dímeros. De acuerdo a la estructura, existen dos residuos de cisteína que son esenciales en la catálisis (Cys52 y Cys173). Durante su catálisis la c-TcTXNPx se oxida, siendo reducida por la TXN, siendo esta interacción muy rápida, sin formación real de un complejo ternario. Nos propusimos realizar la caracterización del complejo heterólogo TcTXNPxTbTXN, para estudiar los sitios de interacción entre ambas proteínas. Para ello, utilizamos una TbTXN mutada en la cisteína 43. Expresamos y purificamos las proteínas recombinantes c-TcTXNPx y TbTXNC43S y las cooxidamos con H2O2, purificando el complejo por gel filtración. Realizamos ensayos de cristalización del complejo, obteniendo microcristales. Actualmente hemos comenzado la caracterización del complejo homólogo TXNPx-TXN en T. cruzi.

ESTUDIO ESTRUCTURAL DEL TERMOSENSOR DESK DE BACILLUS SUBTILIS Trajtenberg, F.1 Albanesi, D.2 Martin, M.2 Mansilla, MC.2 Alzari, P.3 de Mendoza, D.2 Buschiazzo, A.1,3 1 Institut Pasteur de Montevideo, Unidad de Cristalografía de Proteínas, Uruguay. 2 Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario, Dep de Microbiología, Argentina. 3 Institut Pasteur, Unité de Biochimie Structurale, Francia Los mecanismos fundamentales por los cuales proteínas sensoras detectan señales externas y transmiten esta información hacia el interior celular, generando la respuesta adaptativa, son poco conocidos a nivel molecular y de gran relevancia biológica. Con el interés de dilucidar estos mecanismos en la transducción biológica de señales, hemos abordado el estudio estructural de la histidina quinasa DesK de Bacillus subtilis. DesK es el componente sensor de un sistema a dos componentes, que controla la respuesta al descenso brusco de la temperatura ambiente. Esta proteína puede alternar entre actividades autoquinasa y fosfatasa, dependiendo de la fluidez de la membrana. En el estado quinasa, activado por el choque frío, cataliza la autofosforilación de la His188, para luego transferir el grupo fosfato al Asp54 de DesR, un factor de transcripción que ejecuta la respuesta (desaturación de fosfolípidos de membrana vía D5-desaturasa). La fluidificación adaptativa de la membrana se correlaciona con la inducción de la actividad fosfatasa de DesK sobre P-DesR, permitiendo apagar esta vía. Para comprender el mecanismo molecular de transmisión de información en DesK, hemos resuelto 7 estructuras cristalográficas de la región citoplasmática completa de DesK, en distintos estados funcionales. Las distintas formas de la proteína fueron atrapadas usando mutantes, fosforilación en pH alcalino y/o complejos con nucleótidos sustrato. La comparación de las distintas estructuras, en combinación con evidencias bioquímicas luego de reconstituir el sistema en liposomas, sugieren un modelo de tres estados funcionales regulados por el dominio sensor de transmembrana. La señal se transmite al interior celular a través de un “coiled-coil” de dos hélices, induciendo rearreglos conformacionales (rotación doblado asimétrico de hélices en el dominio central) capaces de controlar las actividades quinasa/fosfatasa en el curso del ciclo regulatorio.

ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE FORMAS NITRADAS DEL CITOCROMO C Tórtora, V.1,2; Abriata, L.4; Alvarez, D.5; Marín, M.2,3; Cassina, A1,2; Souza, J.M.1,2; Murgida, D.5; Vila, A4; Castro, L.1,2 y Radi, R.1,2. 1

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina; 2Center for Free Radical and Biomedical Research y 3Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay; 4 Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Universidad Nacional de Rosario y 5Instituto de Química Física de las Materiales, Medio Ambiente y Energía, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina. El citocromo c (cyt c) es una proteína mitocondrial que presenta un hemo hexa-coordinado, siendo la M80 la sexta posición de coordinación. También se destacan en su estructura 4 tirosinas altamente conservadas. Al aumentar el pH el cyt c presenta una ruptura del enlace M80-hemo (transición alcalina, pKa=9.2). Además, el cyt c puede ser nitrado tanto por peroxinitrito como por nitrito y H2O2. Análisis espectrales del nitro-cyt c a pH fisiológico muestran una transición alcalina temprana, una ganancia de la actividad peroxidada y una incapacidad para transportar electrones. Se expresaron y purificaron mutantes de Y→F, para estudiar el rol de la nitración en cada tirosina y el mutante M80A, como modelo de cyt c pentacoordinado. Todos los mutantes Y→F son proteínas estables con espectros similares al del cyt c salvaje. El espectro del mutante M80A presentó un corrimiento de 2 nm en la banda de Soret y varias diferencias en la región entre 600-700 nm. Estudios de NMR paramagnética revelaron que todos los mutantes Y→F, así como formas puras de nitro-Y74 o nitro-Y97 tienen una estructura electrónica similar a la del cyt c salvaje a pH fisiológico; sin embargo Y67F presentó una transición alcalina tardía (pKa>10.6), mientras que el nitro-Y74 mostró una transición temprana (pKa=7.2). La estructura electrónica del mutante M80A es distinta y existe en una seria de formas de alto y bajo espin. Ensayos de dicroismo circular no revelaron cambios significativos en la conformación de los nitro-cyt c con respecto al salvaje. Estudios electroquímicos mostraron que el potencias redox de los mutantes Y→F es similar al del salvaje, mientras que el mutante M80A presentó un potencial más negativo. Estos datos apoyan la idea de que la Y67 tiene un rol clave en la ruptura del enlace M80-hemo, mientras que la nitración en la Y74 favorece esta transición.

ANALISIS DE MICROHETEROGENEIDAD ESTRUCTURAL DE POLISACARIDO CAPSULAR DE STREPTOCCOCUS PNEUMONIAE SEROTIPO 14 González, H.; Rodríguez, M.; Fontana, C.; Ferreira, F. Lab. de Carbohidratos y Glicoconjugados de Facultad de Química; Depto. de Desarrollo Biotecnológico de Facultad de Medicina; Instituto de Higiene, Alfredo Navarro 3051, Montevideo. Los exopolisacáridos microbianos, y en particular, los polisacáridos capsulares microbianos (CPS) consisten en geles altamente hidratados formados por heteropolisacáridos con unidades repetitivas, estas a su vez se hallan compuestas principalmente por hexosas o metil pentosas, pero pueden presentar también ácidos urónicos, N-acetil-aminoazúcares y en menor medida aminoazúcares y pentosas en polisacáridos de cianobacterias. Los CPSs se encuentran cubriendo completa o parcialmente las superficies de los microorganismos, formando así una capa más o menos adherente, que lo envuelve haciendo de barrera contra la penetración de macromoléculas e inmunoglobulinas. Este es el caso de Streptococcus pneumoniae el cual es un importante patógeno en humanos tanto a nivel mundial como regional. Parte de dicha patogenicidad radica en la presencia de un CPS que lo recubre protegiéndolo del sistema inmune del huésped. El CPS del serotipo 14 (CPS14) ha sido objeto de exhaustivo estudio y posee una estructura conocida: [4)Glc(β1-6)[Gal(β1-4)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1-]n. Este CPS, neutro y compuesto de unidades repetitivas de un tetrasacárido, ha sido estudiado en nuestro laboratorio hallando cierto nivel de heterogeneidad en su estructura, lo que difiere con lo publicado hasta el momento. Hemos encontrado también en sobrenadantes de cultivos de S.pneumoniae serotipo 14, junto con el CPS14, un segundo polisacárido (CPS14p) con similares motivos estructurales pero de carácter aniónico. En este trabajo se reportan y discuten los resultados obtenidos en el estudio de microheterogeneidad del CPS14 así como también los obtenidos en la caracterización estructural del CPS14p, empleando métodos cromatográficos (SEC-LC y HPLC), métodos espectroscópicos (1H-NMR y DOSY) y métodos químicos (colorimetría y despolimerización por tratamiento con NaNO2).

DESARROLLO DE UN MODELO SIMPLIFICADO PARA SIMULACIÓN DE ADN Zeida A., Dans P. & Pantano S. Institut Pasteur de Montevideo, Calle Mataojo 2020. CP 11400 Montevideo, Uruguay Las simulaciones de dinámica molecular de sistemas con detalle a nivel atómico son una herramienta muy poderosa para predecir propiedades estructurales, dinámicas y termodinámicas de moléculas biológicas. No obstante, el poder computacional actual restringe este análisis a escalas de tiempo de pocas centenas de nanosegundos, que resultan demasiado breves para estudiar importantes procesos biológicos. Conjuntamente, el número de grados de libertad de los sistemas biomoleculares es muy grande, por lo que no es factible la exploración exhaustiva del espacio conformacional de muchas macromoléculas. Para salvar la distancia entre las escalas de tiempo de simulaciones practicables y aquellas de procesos biológicos relevantes, como también para suplir el vacío entre escalas de longitud microscópicas y mesoscópicas de biomoléculas, se han propuesto varios modelos simplificados que a pesar de perder la resolución atómica, mantienen la representación física de las principales interacciones. En estos modelos la energía potencial es expresada en términos de interacciones harmónicas entre centroides representantes de grupos funcionales o residuos en biomoléculas. Mientras que existen adecuadas representaciones de ADN al nivel atómico y continuo, hay una relativa carencia de modelos capaces de describir su comportamiento a escalas mesoscópicas. En esta contribución, presentamos un modelo de ADN a escala mesoscópica, que reduce la complejidad de cada nucleótido a seis sitios de interacción manteniendo una evaluación rigurosa de la electrostática y los efectos de solvatación. Varias propiedades calculadas con nuestro modelo, como la dependencia de la temperatura y fuerza iónica de melting pare distintas secuencias, así como la transición estructural (A→B) resultan en buen acuerdo con información experimental y/o de simulaciones a nivel atómico con un significativo descenso del costo computacional.

CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE FÁRMACOS ANTI-CANCERÍGENOS DE PT(IV) Y METABOLITOS PRINCIPALES. Pittini, A., Coitiño, E.L. Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Instituto de Química Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República. La proposición de compuestos de Pt(IV) como anticancerígenos eficaces, de administración oral y baja toxicidad sistémica, representa una alternativa a otros fármacos que desarrollan resistencia que ha sido intensamente explorada en la última década, resultando en el hallazgo del Satraplatin (JM216, [Pt(IV)(NH3)(NH2C6H11)(OCOC3H7)2Cl2], en vía de aprobación por la FDA para varios tipos de cáncer) y el descarte del Tetraplatin ([Pt(IV)(dach)Cl4], debido efectos secundarios indeseados). El uso de métodos cuánticos para modelar la estructura y propiedades fisicoquímicas de éste y otros tipos de fármacos resulta una estrategia valiosa de apoyo al diseño y pre-selección de buenos candidatos para ensayos biológicos y farmacológicos, que permite la evaluación costo-efectiva in silico de un número amplio de compuestos. Este estudio tiene como doble meta verificar la validez de la aplicación a compuestos de Pt(IV) de una estrategia simplificada de modelado usada con éxito en el screening de compuestos de Pt(II)/Pd(II)1 y caracterizar detalladamente la estructura y propiedades fisicoquímicas de los compuestos Satraplatin, un derivado del mismo, el Tetraplatin y los respectivos metabolitos de Pt(II) que serían responsables finales de su actividad antitumoral. Para ello se modeló la estructura y propiedades de dichos compuestos (cargas atómicas NPA, dureza, potencial químico, electrofilicidad, orbitales de frontera y potenciales electrostáticos mapeados) en fase gaseosa a nivel DFT con el funcional B3LYP y la base 6-31G(d) para los átomos de C, H, O, N y Cl y el pseudopotencial LANL2DZ+base asociada para Pt. El relajamiento debido a la influencia del medio -agua- sobre la función de onda, geometría de los compuestos y propiedades asociadas fue evaluado por cálculos single-point y minimización mediante el modelo del continuo PCM-IEF y cavidades adaptadas a la forma molecular con radios UATM. La naturaleza de los puntos estacionarios fue verificada en cada caso evaluando el Hessiano analítico al nivel correspondiente. 1

Dans, P.D.; Coitiño E.L. J. Chem. Inf. Model. 2009, 49, 1407–1419.

Simposio II: PARASITOLOGIA MOLECULAR Moderadores: Dres C Fernández y M Comini

Expositores:

10:45-11:05

U Koziol (FCien, UdelaR): PROLIFERACIÓN CELULAR DURANTE EL DESARROLLO DE MESOCESTOIDES CORTI (CESTODA)

11:05-11:25

T Basika (FQuím, UdelaR): PROTEÍNAS S100 DE FAGOCITOS EN LA RESPUESTA INFLAMATORIA EN LA HIDATIDOSIS

11:25-11:45

I Corvo (FMed, UdelaR):.EVOLUCIÓN CONVERGENTE DEL SITIO ACTIVO DE LAS CISTEÍNA PROTEASAS DE LA FAMILIA C1A CON ACTIVIDAD COLAGENASA

11:45-12:05

l Pérez-Díaz (FCien, UdelaR):.ANÁLISIS RIBONÓMICO DE LA PROTEÍNA TCRBP19 DE T. CRUZI.

12:05-12:25

ML Chiribao (FMed, UdelaR): ESTUDIO DE LA O-GLICOSILACIÓN EN TRYPANOSOMA CRUZI

12:25-12:45. M Vieites (FQuím, UdelaR): EL ADN COMO PROBABLE BLANCO DE ACCIÓN DE COMPUESTOS DE PALADIO Y PLATINO CON ACTIVIDAD ANTITRYPANOSOMA CRUZI

Resúmenes simposio II PROLIFERACIÓN CELULAR DURANTE EL DESARROLLO DE Mesocestoides corti (CESTODA) Koziol, U., Domínguez, M. F., Costábile, A., Caurla, G.,Kun, A.*, Marín, M., Castillo, E. Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay, * Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos IIBCE. En planarias, la proliferación celular durante el crecimiento, mantenimiento y regeneración tisular es provista por neoblastos (células madres indiferenciadas), y no existe proliferación en células somáticas diferenciadas. Existe evidencia de que ocurre un mecanismo similar en platelmintos parásitos. En este estudio, se estudió la localización y características de las células proliferantes durante el desarrollo in vitro de Mesocestoides corti mediante experimentos de pulso y caza con bromodeoxiuridina, identificación de mitosis tras tratamiento con colchicina, y determinación de la expresión de genes pumilio. Las células proliferantes se encuentran en el parénquima interior, en particular en proximidad con la capa muscular interna. En la larva, son más abundantes en las regiones anteriores (escólex y cuello) disminuyendo su número en las regiones posteriores. Tras proliferar, las células migran al parénquima exterior y tejido sub-tegumentario donde se diferencian. Durante el desarrollo a la forma adulta segmentada se observan en el cuello acumulaciones periódicas de células proliferantes, incluyendo una masa central en cada primordio de segmento (primordio genital). El primordio genital se genera a partir de extensiones dorso-ventrales del anillo de células proliferantes, y al crecer se divide en dos regiones, una región interna compacta no proliferante, y una región externa laxa proliferante. Histológicamente, las células proliferantes tienen características similares a las células germinativas de otros cestodos (núcleo grande con cromatina poco compacta, nucléolo prominente, forma redondeada o con pequeñas extensiones, y alta basofilia debido a la abundancia de ARN ribosomal), y expresan los genes pumilio en forma preferencial. Actualmente, estamos caracterizando la proteína PCNA, un marcador de células en fase S, como un posible marcador exclusivo de células proliferantes en cestodos. El gen fue clonado en Echinococcus granulosus, y se confirmó la utilidad del anticuerpo monoclonal PC10 para reconocer la proteína PCNA en M. corti.

PROTEÍNAS S100 DE FAGOCITOS EN LA RESPUESTA INFLAMATORIA EN LA HIDATIDOSIS Tatiana Basika1, Natalia Muñoz1, Cecilia Casaravilla1, Florencia Irigoín1, Rosario Durán2, Mariana Bonilla1, Gustavo Salinas1, José Pedro Pacheco3, Johaness Roth4 & Alvaro Díaz1 1. Cátedra de Inmunología, DEPBIO, Facultad de Química, UdelaR. 2. UBYPA. Instituto Pasteur Montevideo. 3. Departamento de Patología. Facultad de Veterinaria. UdelaR. 4. Institute of Immunology, University of Münster, Alemania. Las proteínas S100 específicas de fagocitos (S100A8, S100A9 y S100A12) tienen papeles importantes pero mal comprendidos en procesos inflamatorios. La infección por la larva de Echinococcus granulosus (hidatidosis) normalmente cursa con control de la inflamación del hospedero. Sin embargo, esto admite excepciones, de las cuales la más extrema es la infección de bovinos por la cepa más extendida (ovina) del parásito. En este sistema se desarrolla una respuesta granulomatosa, cuyos productos de secreción se suelen encontrar asociados con la pared de la hidátide. A partir de una observación inicial de presencia de S100A8 y S100A9 en hidátides de infecciones experimentales en ratón, quisimos profundizar en la expresión de proteínas de esta familia en respuesta a la hidátide en hospederos naturales, incluyendo el bovino. Encontramos que en extractos de paredes quísticas de infecciones bovinas, una banda proteica dominante corresponde a S100A12. La identificación proteómica fue confirmada por inmunoblot, usando un anticuerpo generado contra la S100A12 bovina, que fue expresada en forma recombinante. En un panel de muestras bovinas, la S100A12 se encontró consistentemente, en abundancias que correlacionaron con el grado de inflamación, determinado histológicamente. Entre las células de la reacción del hospedero, la S100A12 se localizó, por inmunohistoquímica, principalmente en los macrófagos epitelioides que forman la primera capa celular adyacente a la pared quística y, en menor medida, en fibroblastos activados. Los macrófagos epitelioides también mostraron inmunoreactividad para S100A9; sin embargo, ni S100A9 ni S100A8 fueron detectadas a nivel proteómico, sugiriendo que sus niveles de expresión deben ser menores que el de S100A12. Nuestros resultados, en conjunto con publicaciones recientes, sugieren que la S100A12 puede ser altamente expresada por macrófagos epitelioides, tanto en contextos Th1 (sarcoidosis, tuberculosis) como en contextos sesgados hacia Th2 (infección por un helminto). Financiacion: PDT 54/078

EVOLUCIÓN CONVERGENTE DEL SITIO ACTIVO DE LAS CISTEÍNA PROTEASAS DE LA FAMILIA C1A CON ACTIVIDAD COLAGENASA Corvo I, Pi-Denis N, Cancela M, Cappetta M, Tort J. F, Roche, L. Dpto. de Genética, Facultad de Medicina, UDELAR, Montevideo, Uruguay.

Los principales componentes de los productos de excreción/ secreción del género Fasciola son cisteína proteasas de la familia C1A, las cuales están involucradas en la invasión mediante la degradación de tejidos, evasión de la respuesta inmunitaria del hospedero y digestión de nutrientes. La familia multigénica de catepsinas L se ha expandido en los trematodos Fasciola, identificándose 2 grupos de expresión estadio diferencial. Los adultos secretan principalmente catepsinas CL1 y CL2, mientras CL3 es secretada por el estadio juvenil, al inicio del proceso de infección del hospedero mamífero. Nuestros resultados muestran que la enzima CL3 recombinante expresada en levaduras presenta características inusuales para esta familia, mostrando especificidad por el sustrato peptídico Tos-Gly-Pro-Arg-AMC y degradando eficientemente colágeno tipo I. Si bien algunas catepsinas, como la catepsina K de mamíferos, FhCL2 y la zingipaína de plantas pueden también digerir colágeno y sustratos con prolina en P2, sólo CL3 y zingipaína muestran preferencia por estos sustratos sobre aquellos que poseen residuos hidrofóbicos o alifáticos en P2. La estructura del sitio activo que subyace a las diferencias en la especificidad de estas enzimas ha sido ampliamente estudiada mediante cristalografía y mutagénesis dirigida. La comparación estructural y los modelos moleculares nos indican que la selectividad de sustrato observada podría ser debido a las restricciones estéricas impuestas por los residuos aromáticos en los subsitios S2 y S3. Mientras la topología del sitio activo de CL3 es similar a la encontrada en la zingipaína, FhCL2 tiene un bolsillo S2 similar a la catepsina K y FhCL1 tiene el bolsillo más amplio, similar a la catepsina L humana. Estas sustituciones aminoacídicas se produjeron de forma independiente durante la evolución de la familia de catepsinas L, lo que revela la presencia de fuertes presiones evolutivas modelando el sitio activo de estas enzimas. CSIC-UDELAR.

ANÁLISIS RIBONÓMICO DE LA PROTEÍNA TcRBP19 DE T. cruzi PÉREZ-DÍAZ, L.1, CURTO, M.1, PROBST, C.2, KRIEGER, M. A.2, GOLDENBERG, S.2, DALLAGIOVANNA, B.2, GARAT, B.1 1

Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay; 2Instituto Carlos Chagas, Curitiba 81350-010, Brazil Trypanosoma cruzi es el parásito causante de la enfermedad de Chagas que afecta a miles de personas en América Latina. Su ciclo de vida transcurre entre dos huéspedes e involucra al menos cuatro estadíos diferentes. La regulación de la expresión génica en tripanosomátidos presenta desviaciones de los paradigmas de eucariotas superiores. Los genes se organizan en policistrones, no existiendo promotores canónicos para la transcripción de genes de proteínas. No se han reportado eventos de regulación a nivel de inicio de la transcripción para proteínas, por lo que los principales mecanismos de regulación se dan a nivel postranscripcional. En este aspecto, las proteínas de unión al ARN cobran gran importancia, ya que poseen un rol principal en los eventos de procesamiento, función y degradación del ARNm. Anteriormente, hemos caracterizado una proteína de unión al ARN en T. cruzi con un RRM, TcRBP19, que posee ortólogos sólo en TriTryps, lo que sugiere una función única en estos parásitos. TcRBP19 es una proteína de baja expresión detectada principalmente en el estadío amastigota con un patrón difuso en el citoplasma. Parásitos epimastigotas sobreexpresando TcRBP19 no muestran alteraciones fenotípicas pero tienen disminuida su capacidad de desarrollar metaciclogénesis. Además, se observa una disminución en la tasa de infección en células VERO con estos parásitos transfectantes. En este trabajo, nos hemos enfocado en la identificación de los ARNm asociados a TcRBP19 mediante técnicas de GST pull down e hibridación en microarreglos de ADN. Los ARN seleccionados comparten la presencia de elementos en sus 3´UTR que han sido reportados como desestabilizantes, por lo que nos hemos planteado la determinación de la interacción de los mismos con factores en trans. Mediante ensayos en geles de retardo y crosslinking hemos comprobado que TcRBP19 interacciona con las 3´UTR de algunos de los mensajeros seleccionados.

ESTUDIO DE LA O-GLICOSILACION EN TRYPANOSOMA CRUZI Chiribao M.L, Parodi-Talice A., Osinaga E., Robello C. Departamento de Bioquímica. Facultad de Medicina UdelaR.Unidad de Biologìa Molecular. Institut Pasteur de Montevideo Trypanosoma cruzi es un parásito flagelado capaz de infectar una gran variedad de células de mamíferos. Durante su ciclo vital, T. cruzi presenta varias formas las cuales se alternan entre el insecto vector y el hospedero mamífero. Todas estas formas del parásito presentan una cubierta glicoproteica muy densa, los mayores componentes de la superficie del parásito han sido identificados como moléculas ancladas a glicosilfosfatidilinositol (GPI), ricas en residuos de Ser y Thr las cuales sirven como esqueleto para la adición de O-glicanos por medio de enzimas GlcNAc transferasas. Esta característica permite su clasificación en moléculas tipo mucina por su analogía con las mucinas de mamíferos. También se localizó en este parásito al antígeno tumor asociado sialil-6GalNAc-OSer/Thr. Ya que las glicoproteínas se encuentran principalmente en la superficie es posible que cumplan un rol en la invasión y/o en la adhesión del parásito al hospedero. Con el fin de poder conocer a fondo el mecanismo de O-glicosilación en este parásito, nos propusimos como objetivos, el clonado, expresión y caracterización de una GlcNAc transferasa de T. cruzi, así como la identificación de sus sustratos. Identificamos en el genoma del parásito un gen con alta homología con GlcNAc transferasas de otros organismos. Demostramos su expresión en epimastigotas, y detectamos transcriptos maduros. Para poder estudiar la expresión proteica generamos anticuerpos policlonales de conejo. Por otro lado realizamos estudios funcionale s sobreexpresando la proteína en el parásito. También se comenzó el estudio de las glicoproteínas sialil-Tn presentes en epimastigotas de forma de poder identificarlas y estudiarlas como posibles sustratos para esta enzima.

El ADN COMO PROBABLE BLANCO DE ACCIÓN DE COMPUESTOS DE PALADIO Y PLATINO CON ACTIVIDAD ANTI-Trypanosoma cruzi Vieites, M.,a Luane, F.,b Terenzi, H.,b Otero, L.,a Prieto, M. J.,c Garat, B.,d Moreno, V.,e Gambino, D.a a

Cátedra de Química Inorgánica, DEC, Facultad de Química, Universidad de la República, Uruguay b Centro de Biologia Molecular Estrutural, Departamento de Bioquímica, Universidad Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brasil c Departament de Microbiología, Universitat de Barcelona, Barcelona, España d Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay e Departament de Química Inorgànica, Universitat de Barcelona, Barcelona, España En la búsqueda de agentes terapéuticos para combatir la enfermedad de Chagas, nuestro grupo ha desarrollado complejos metálicos de ligandos bioactivos frente a T. cruzi, que pudieran actuar a nivel del blanco propio del ligando y, también, a nivel del ADN, blanco de muchos fármacos metálicos. En ese marco, hemos desarrollado complejos de paladio y platino, [MCl2L] y [M(L-H)2], siendo L tiosemicarbazonas derivadas de 5-nitrofurano y 5nitrofurilacroleína, que resultaron activos in vitro frente a T. cruzi. Aún cuando su mecanismo de acción tripanocida se relaciona fundamentalmente con la generación de estrés oxidativo, previamente demostramos por técnicas de electroforesis en gel que el ADN constituye un segundo blanco. En este trabajo se compara el mecanismo de interacción con ADN de los complejos isoestructurales de Pd y Pt utilizando medidas de viscosidad del ADN, técnicas de microscopía de fuerza atómica (AFM) y dicroísmo circular (DC). Los complejos [PtCl2L] incrementan la viscosidad del ADN, resultado que sugiere un comportamiento intercalante clásico a través del ligando. En cambio, los complejos análogos [PdCl2L] disminuyen la viscosidad, sugiriendo su unión covalente a través del metal. Dada la labilidad del Pd(II), estos compuestos podrían sufrir sustitución rápida de los ligandos cloruro para luego interactuar covalentemente con el ADN. Los complejos [M(L-H)2] producen un aumento leve de viscosidad e interactuarían a través del ligando. Los estudios de DC también demuestran un comportamiento dependiente del metal. Los complejos [PdCl2L] producen disminución de la intensidad y corrimiento de las bandas del ADN. La intensidad de estos cambios varia con la naturaleza del ligando, evidenciando una afinidad diferencial. En cambio, los complejos [PtCl2L] provocan un aumento de la intensidad de las bandas que evidencia un proceso de intercalación. Los estudios de AFM muestran efectos dosis-dependientes en el ADN (superenrrollamiento, entrecruzamiento, kinks), observándose efectos más rápidamente para los complejos de Pd.

Simposio III: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS Moderadores: Dres P Zunino, P Aguilar y J Cristina 10:45-11:05

B González (FQuím, UdelaR): LEVADURAS PROVENIENTES DE LA ANTÁRTIDA COMO CONTROLADORES BIOLÓGICOS DE P. expansum, EN MANZANA

11:05-11:25

C Martínez-Rosales (FCien, UdelaR): EXPRESION DE PROTEINAS ACTIVAS A BAJA TEMPERATURA.

11:25-11:45

MA Olivera (IP): EISOSOMAS Y COMPARTIMENTALIZACIÓN SEÑALIZACIÓN POR MEDIO DE KINASAS

11:45-12:05

A Sanabria (FQuím, UdelaR): AVANCES EN LA CARACTERIZACIÓN DE LA INTERACCIÓN RALSTONIA SOLANACEARUM - SOLANUM TUBEROSUM

12:05-12:25

MJ Benítez (FCien, UdelaR).ANÁLISIS DE CUASIESPECIES EN CEPAS URUGUAYAS DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD INFECCIOSA DE LA BURSA

11:25-12:45

R Recarey (FCien, UdelaR): EVIDENCIA DE DIVERSIFICACION DE DENV3 GENOTIPO III EN LA REGIÓN SUDAMERICANA

DE

LA

Resúmenes simposio III LEVADURAS PROVENIENTES DE LA ANTÁRTIDA COMO CONTROLADORES BIOLÓGICOS DE P. expansum, EN MANZANA González, B1; Garmendia, G.1; Bentancur, O2; Vero,S.1 1 Facultad de Química. 2 Facultad de Agronomía Universidad de la República En Uruguay el cultivo del manzano es el más importante dentro de los frutales de hoja caduca. Los frutos pueden ser almacenados por 6-8 meses en cámaras frigoríficas a temperaturas entre 0–1ºC. Las podredumbres ocasionadas por hongos constituyen una causa importante de las pérdidas poscosecha, especialmente las ocasionadas por especies de Penicillium y Botrytis cinerea. Los fungicidas constituyen la principal medida de protección. Sin embargo, se ha demostrado que el control biológico resulta una medida eficaz para controlar estas podredumbres. En este trabajo se estudió la capacidad biocontroladora de levaduras psicrótrofas aisladas de 20 muestras de suelo provenientes de la base Artigas de la Antártida. A partir de enriquecimientos en jugo de manzana a 8ºC, se aislaron nueve cepas de las cuales cinco protegieron significativamente en más de 80%, heridas de manzana inoculadas con P. expansum. Las cepas seleccionadas se identificaron en forma polifásica. Para la identificación molecular se amplificaron las regiones D1/D2 e ITS1-ITS2. El análisis de las secuencias mostró un 99% de similitud con secuencias correspondientes a las especies Cryptococus terricola, Cryptococus gastricus. Rhodotorula micilaginosa, Rhodotorula laryngis Leucosporidium scottii Para la identificación fenotípica, según clave de Kurtzman y Fell, se realizaron auxanogramas de C y N. Las cepas se caracterizaron determinando rango y temperatura óptima de crecimiento, destacándose la ausencia de crecimiento a 37ºC, lo cual incrementa su potencial como biocontrolador, por ser incapaces de colonizar el cuerpo humano. Se determinó la capacidad de colonización de heridas de manzana mediante la determinación del número de antagonistas viables a lo largo del tiempo y se detectó la producción de sideróforos por parte de las cepas mediante el ensayo en medio CAS.

EXPRESION DE PROTEINAS ACTIVAS A BAJA TEMPERATURA Martínez-Rosales, Cecilia y Castro-Sowinski, Susana1,2. Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, UdelaR y Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE. . En el marco del estudio de la expresión de proteínas activas a bajas temperaturas, se aislaron 15 microorganismos tolerantes a frío capaces de producir exo-proteasas cuando crecen a 4 ºC. Estos aislamientos, obtenidos de las inmediaciones de la Base Antártica General Artigas (Isla Rey Jorge), se identificaron como Pseudomonas, Janthinobacterium o Flavobacterium. Todos los aislamientos producen exo-proteasas exclusivamente a bajas temperaturas, pero con un amplio rango de termo-actividad y termoestabilidad (ensayada entre 4 y 30 ºC). Los zimogramas, realizados en presencia y ausencia de PMSF (inhibidor de serin-proteasas) mostraron que del conjunto de 15 aislamientos, dos Pseudomonas y un Flavobacterium producen exo-serin-proteasas. Los ensayos de PCR, utilizando cebadores para subtilisinas (las serin-proteasas de mayor uso) produjeron fragmentos de amplificación del tamaño esperado para los 3 aislamientos, mientras que para el resto de los mismos no se detectó ningún producto de amplificación. Actualmente estos fragmentos de amplificación están siendo secuenciados en el servicio de Macrogen, Korea. Paralelamente, se está realizando una mutagénesis al azar de una Pseudomonas productoras de serin-proteasas, utilizando el transposón miniTn5, para la selección de mutantes incapaces de producir exo-proteasas. Las regiones flanqueantes a la mutación se mapearán por PCR inverso, para la identificación del gen y del promotor responsable de tu transcripción. Esta propuesta es la primera etapa en el estudio de los mecanismos involucrados en la expresión génica a bajas temperaturas, actualmente focalizado al estudio del inicio de la transcripción.

EISOSOMAS Y COMPARTIMENTALIZACIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN POR MEDIO DE KINASAS Olivera, M.A. & Aguilar, P.S. Institut Pasteur Montevideo Los mecanismos de compartimentalización subcelular son centrales en la regulación de variados procesos de la biología celular eucariota. En Saccharomyces cerevisiae, al igual que en mamíferos, la composición de la membrana plasmática es muy heterogénea, estando organizada en dominios. Los Eisosomas son complejos multiproteicos asociados a la membrana plasmática de levaduras, que organizan dominios de membrana y marcan sitios de endocitosis. Dos de las proteínas que están relacionadas con la regulación de procesos asociados a los eisosomas son las quinasas Pkh1 y Pkh2, homólogas a la quinasa humana PDK1. Actualmente se sabe que estas quinasas fosforilan quinasas implicadas en diversas cascadas de señalización y que son necesarias para la sobrevida celular, el mantenimiento de la integridad de la pared celular, la ocurrencia de eventos endocíticos y el ensamblaje de los eisosomas. Sin embargo, las bases moleculares del reclutamiento a la membrana plasmática o de su especificidad de sustrato, son inciertas. En este trabajo nos propusimos explorar los aspectos anteriores desde una perspectiva celular y molecular. En particular, mostramos que Pkh1 y Pkh2 presentan una localización subcelular claramente diferente, a pesar de tener dominios catalíticos extremadamente conservados, con sustratos y funciones solapadas. Utilizando microscopía confocal hemos observado que Pkh1 presenta una distribución principalmente citoplasmática, mientras que Pkh2 se asocia de forma altamente dinámica a los Eisosomas. Mediante análisis bioinformáticos detallados hemos evidenciado la presencia de dominios exclusivos en Pkh2, probablemente involucrados en la interacción proteína-proteína y proteína-lípido. La presencia de dichos dominios en Pkh2, y no en Pkh1, podría explicar su asociación diferencial a Eisosomas. Así, la compartimentalización podría estar determinando la accesibilidad a diferentes sustratos, lo cual indicaría una división parcial de tareas entre ambas quinasas.

AVANCES EN LA CARACTERIZACIÓN DE LA INTERACCIÓN solanacearum- Solanum tuberosum. Sanabria A.

(1)

Ralstonia

, Burdman S.(2), Pianzzola M.J.(1)

1. Cátedra de Micobiología, Departamento de Biociencias, Facultad de Química, UdelaR 2. Department of Plant Pathology and Microbiology, The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment. Hebrew University of Jerusalem La murchera, ocasionada por Ralstonia solanacearum, es una enfermedad de importancia mundial que afecta al cultivo de papa y genera pérdidas económicas y nutricionales de gran magnitud. En Uruguay, la encuesta papera realizada en otoño de 2008 (DIEA – MGAP) indica que los daños por murchera en esa zafra significaron la pérdida de 323 toneladas de papa. Grupos de investigación en todo el mundo enfocan sus esfuerzos en revelar cuáles son los factores de virulencia de R. solanacearum y en dilucidar sus mecanismos de acción, con el fin de perfeccionar las estrategias de control. Si bien se han hecho importantes avances mediante diversos estudios in vitro, los microorganismos coexisten en sistemas complejos y establecen interacciones dinámicas con sus hospederos, que son difíciles de reproducir en el laboratorio. Recientemente han surgido nuevas estrategias que buscan identificar genes del patógeno activados en el hospedero y que no se expresan bajo las condiciones de crecimiento de laboratorio. Dentro de este grupo se encuentra RIVET (Resolvase In Vivo Expression Technology), que actúa como una trampa de promotores bacterianos que se expresan durante la infección in vivo. Nosotros procuramos aplicar esta estrategia para identificar genes de R. solanacearum r3 bv2 que se expresan durante la infección de la papa (Solanum tuberosum). El primer paso requiere la construcción de una cepa mutante de R. solanacearum por inserción del cassette res (res-Kmr-sacB-res) en un gen que no afecte su virulencia. A partir de un estudio bibliográfico minucioso hemos seleccionado genes candidatos para ser mutados y hemos iniciado el proceso de construcción del mutante. También hemos escogido algunos promotores de genes de R. solanacearum cuyo patrón de expresión in planta e in vitro son conocidos, para emplearlos como controles por generación de fusiones con los genes tnpR-uidA sin promotor.

ANÁLISIS DE CUASIESPECIES EN CEPAS URUGUAYAS DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD INFECCIOSA DE LA BURSA María José Benítez, Leticia Maya, Gonzalo Tomás, Federica Bialade, Diego Hernández, Ruben Pérez & Martín Hernández. Sección Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias, Universidad de la República La enfermedad infecciosa de la bursa (IBD) es una afección severa y altamente contagiosa que produce inmunodepresión en pollos de corta edad. Es causada por el virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (IBDV) (Birnaviridae; Avibirnavirus), cuyo genoma está compuesto por dos segmentos de RNA doble cadena. En el mundo circulan tres cepas de IBDV: clásicas, variantes e hipervirulentas, siendo estas últimas las que presentan mayor patogenicidad. Debido a tiempos cortos de replicación y a altas tasas de mutación, los virus RNA se organizan típicamente en cuasiespecies. Este tipo de organización, consiste en poblaciones replicantes altamente diversas, dinámicas y complejas, confiriéndole una importante capacidad adaptativa a los virus que la integran. Hasta el momento no se han realizado estudios para determinar la existencia de cuasiespecies en brotes de campo de IBDV, de manera que su investigación puede proporcionar información relevante acerca de los mecanismos y tendencias evolutivas de este virus. En el presente trabajo se describe la investigación desarrollada para determinar la presencia de cuasiespecies en un brote de campo uruguayo de IBDV hipervirulento. Así mismo se presenta información que puede ser de utilidad para entender la epidemiología de IBDV a nivel local y regional. Para realizar esta investigación se analizaron las secuencias de amplicones clonados de una muestra de IBDV previamente caracterizada como hipervirulenta. Los amplicones correspondieron a fragmentos genómicos que codifican para las proteínas VP5 (no estructural) y VP2 (estructural). Se secuenciaron automáticamente un total de 20 clones de cada fragmento y posteriormente se analizaron mediante programas bioinformáticos. El análisis de las secuencias obtenidas revela la presencia de cambios nucleotidicos reiterativos en las dos regiones que fueron estudiadas. Nuestros resultados revelan que IBDV podría encontrarse organizado en un sistema de cuasiespecies, sustentando la realización de estudios más profundos para confirmar y analizar esta organización.

EVIDENCIA DE DIVERSIFICACION DE DENV3 GENOTIPO III EN LA REGIÓN SUDAMERICANA. Recarey R., De Mora D., Fajardo A., D’ Andrea L., Alvarez M., Regato M., Colina R., Cristina J. Laboratorio de Virología Molecular, Facultad de Ciencias, Centro de Investigaciones Nucleares. Montevideo Uruguay. Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta Perez. Guayaquil. Ecuador. Dengue es la más importante enfermedad viral transmitida por mosquitos en el mundo. El virus Dengue pertenece al género Flavivirus, es un virus RNA simple hebra de polaridad positiva, con envuelta, su genoma de 11kb con un único ORF sintetiza una poliproteína. Comprende 4 serotípos (DEN1-DENV4); DENV3 comprende 4 genotípos. En Sri Lanka en 1989 surge el genotipo III del DENV3 asociado a Dengue Hemorrágico (DHF), el que se dispersa rápidamente, llegando al Caribe en 1998/99, y a Sudamérica en el 2000. La proteína de envoltura (E) que se halla bajo selección purificadora, es la responsable de la unión a los receptores celulares y posee los épitopes para los anticuerpos neutralizantes, se trata de un homodímero con 3 dominios (ED1-ED3). Con la finalidad de comprender la diversificación del genotipo III de DENV3 en Sudamérica, secuencias del gen E y su proteína fueron analizadas. El estudio filogenético del gen E mediante CLUSTALW determino la existencia de 6 clados dentro del genotipo III de DENV3. Una vez traducida la proteína codificada por el gen E varios cambios aminoacídicos fueron encontrados, las sustituciones en las posiciones 301 y 383 se hallan en todas las cepas; la asparaguina en la posición 388 ha sido asociada a DHF, el cambio en la posición 329 aparece únicamente en las cepas de Perú Ecuador y Venezuela. La mayoría de estos cambios se producen en el dominio ED3 o en aminoácidos expuestos a la superficie viral lo que permitiría a estas cepas escapar a los anticuerpos neutralizantes explicando en parte su importante patogenicidad.

Simposio IV: PEQUEÑOS RNA REGULADORES EN BIOLOGÍA Moderadores: Dres A Cayota y J Tort Salón de Actos –Instituto Pasteur 15:45-16:05

A Cayota (IP/FMed): BIOLOGÍA DE PEQUEÑOS ARN Y SU RELEVANCIA EN BIOMEDICINA.

16:05-16:25

JP Tosar (UGF, IP): PROPIEDADES ESTRUCTURALES Y BIOLÓGICAS DE PROTEINAS ARGONAUTA

16:25- 16:45 M Comini (IP): INTERFERENCIA DE ARN Y MECANISMOS RELACIONADOS EN PROTOZOARIOS: LOS TRIPANOSOMÁTIDOS 16:45-17:05

O Borsani (FAgro, UdelaR): SILENCIAMIENTO GÉNICO MEDIADO POR PEQUEÑOS RNA EN PLANTAS

17:05-17:25

J Tort (FMed, UdelaR) ARN PEQUEÑOS EN HELMINTOS: NUEVAS HERRAMIENTAS E INTERROGANTES

17:25-17:45

A Pena (IP): HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS Y PREDICCIÓN DE mRNA BLANCOS DE microRNAs

17:45- 18:15 E Vigorito (I Babraham, UK): USO DE OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS PARA BLOQUEAR LA ACTIVIDAD DE MICRO ARNs IN VIVO

Resúmenes simposio IV BIOLOGÍA DE PEQUEÑOS ARN Y SU RELEVANCIA EN BIOMEDICINA Cayota, A. Unidad de Genómica Funcional. Institut Pasteur de Departamento de Medicina, Facultad de Medicina (UdelaR)

Montevideo,

y

En la última década una familia creciente de pequeños ARN (sRNA) han sido reconocidos como actores relevantes en diversas formas de regulación de la expresión génica e integridad del genoma. En base a su biogénesis y mecanismos de acción esta población de sRNA son clasificados en 3 subfamilias principales: microRNAs (miRNAs), small-interfering RNAs (siRNAs) y Piwi-interacting RNAs (piRNAs) cuyo tamaño es de 20 a 32 nt aproximadamente. Los microRNAs se han revelado como moduladores esenciales de vías celulares involucradas en la regulación del ciclo celular, proliferación, diferenciación y apoptosis. Una amplia serie de evidencias experimentales ha demostrado que los miRNAs juegan un rol central en la carcinogénesis llevando a importantes avances en la comprensión de la biología del cáncer y aportando nuevas oportunidades para su control terapéutico.

PROPIEDADES ESTRUCTURALES Y BIOLÓGICAS DE PROTEÍNAS ARGONAUTA Tosar, J.P1.; García-Silva, M.R.1; Serra, E.2; Pantano, S.3; Bonilla, B1; Robello, C.4; Cayota, A1,5. 1

Unidad de Genómica Funcional. Institut Pasteur de Montevideo Instituto de Biología Celular y Molecular de Rosario. UNR, Argentina 3 Laboratorio de Simulaciones Biomoleculares. Institut Pasteur de Montevideo 4 Unidad de Biología Molecular. Institut Pasteur de Montevideo 5 Departamento de Medicina, Facultad de Medicina (UdelaR) 2

Las proteínas de la familia Argonauta/Piwi participan en las vías efectoras de los mecanismos de regulación de la expresión génica que involucran pequeños ARNs. Desde un punto de vista estructural presentan un dominio N-terminal variable y un dominio PAZ, MID y PIWI. Forman complejos ribonucleoproteicos que median la interacción entre los pequeños ARNs y sus blancos. A modo de ejemplo, la actividad catalítica característica de los complejos de silenciamiento inducidos por ARN se debe a la actividad ribonucleasa que presentan algunas proteínas Argonauta. Otros miembros de la familia son capaces de regular la traducción de mensajeros blanco uniéndose directamente a sus extremos 5’, impidiendo el ensamblaje o la progresión de los ribosomas, reclutando enzimas que alteran la estabilidad de los mensajeros y/o dirigiendo los mismos a los cuerpos de procesamiento citoplasmáticos. Otras proteínas Argonauta/Piwi participan en el silenciamiento a nivel transcripcional, regulando la formación de heterocromatina. Esta diversidad funcional se debe al extenso grado de duplicación génica que las proteínas Argonauta/Piwi han tenido a lo largo de la evolución. Por ejemplo, el genoma humano codifica para 8 proteínas Argonauta/Piwi, mientras que el nematodo C. elegans posee un total de 26. Desde un punto de vista filogenético, las mismas pueden clasificarse en las subfamilias Argonauta y Piwi. Si bien los animales poseen representantes de ambas subfamilias, algunos linajes han perdido todas sus proteínas Argonauta o todas sus proteínas Piwi. Notablemente, algunos pocos organismos eucariotas parecen haber perdido la totalidad de sus genes Argonauta/Piwi. Entre dichos organismos excepcionales se encuentran Trypanosoma cruzi y Leishmania major. Dichos protozoarios poseen, sin embargo, una proteína que codifica para un dominio PIWI. El final de esta charla abordará la problemática de dichas proteínas, que parecerían ser representantes de una nueva subfamilia de proteínas Argonauta/Piwi, de función aún desconocida.

INTERFERENCIA DE ARN EN PROTOZOARIOS: LOS TRIPANOSOMÁTIDOS Comini, M. Laboratorio de Biología Redox de los Tripanosomas, Institut Pasteur de Montevideo. La interferencia de ARN (iARN) se puede definir desde un punto de vista experimental clásico como el mecanismo por el cual el ARN de doble cadena induce la degradación específica de transcriptos celulares homólogos. Las evidencias acumuladas en las últimas dos décadas indican que se trata de un proceso celular conservado en la mayoría de los organismos de la escala evolutiva cuyo rol fisiológico estaría ligado a la regulación de la expresión génica y a la protección contra “parásitos” genómicos como los elementos transponibles (transposones) y los virus. Hoy en día, el fenómeno de iARN se ha convertido en una poderosa herramienta de genética molecular que, manipulada adecuadamente, permite el análisis funcional de genes. En lo que respecta a los protozoarios, el fenómeno de iARN fue reportado por primera vez en Trypanosoma brucei. Trabajos posteriores demostraron que la maquinaria molecular responsable de iARN se haya presente en un subconjunto de protistas unicelulares (por ej. Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii y Giardia spp.) pero no en otros (por ej. T. cruzi, Leishmania major, Plasmodium spp. y Criptosporidium spp.). La tecnología del iARN ha contribuido a incrementar de manera rápida y sustancial nuestro conocimiento sobre la biología de varios parásitos protozoarios de gran relevancia para el área de la salud humana y animal. Esta charla abordará en una primera instancia los aspectos básicos del fenómeno de iARN en los protozoarios, para luego hacer foco sobre su empleo en el estudio y la validación de blancos terapéuticos en T. brucei destacando las ventajas y desventajas de los sistemas de generación de iARN disponibles.

Silenciamiento génico mediado por pequeños RNA en plantas Borsani, O. Laboratorio de Bioquímica, Dep. de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, UdelaR. El silenciamiento génico mediado por RNA fue inicialmente descubierto en plantas transgénicas, fenómeno al que se denominó co-supresión o silenciamiento post-transcripcional. Sin embrago, no fue hasta hace unos años que los pequeños RNA interferentes (siRNAs) y los micro RNAs (miRNAs) aparecieron como importantes reguladores de la expresión génica de eucariotas. En plantas están involucrados en una variedad de fenómenos que son esenciales para la estabilidad del genoma, el desarrollo y las respuestas adaptativas a estrés biótico y abiótico. El origen y el modo de acción de estas moléculas es diverso lo que lleva a pensar que el control de la expresión génica mediados por pequeños RNA en plantas se realiza a varios niveles. Un aspecto intrigante del silenciamiento génico por pequeños RNA en plantas es que éste puede ser inducido localmente y propagarse a otras células a través de una señal móvil. Por otra parte la acumulación de siRNA y miRNA endógenos inducida por estímulos ambientales parece tener un papel fundamental en la plasticidad de las respuestas de las plantas a un ambiente cambiante y esto abre nuevas perspectivas para el estudio del rol de estás moléculas en las respuesta a estrés biótico y abiótico.

ARN pequeños en helmintos: nuevas herramientas e interrogantes Tort, J.F. Departamento de Genética, Facultad de Medicina, UdelaR El descubrimiento de la interferencia de ARN en hongos, nematodos y plantas abrió el camino al conocimiento de un espectro diverso de ARN pequeños reguladores que sigue creciendo. El estudio de este fenómeno se ha dado sobre todo en organismos modelo, siendo el avance en otras especies mas limitado. El desarrollo alcanzado en el nemátodo modelo Caenorhabditis elegans y la planaria Schmidtea mediterranea, alentaron a transferir la interferencia de ARN a helmintos parásitos, como forma de estudiar la función génica en organismos donde no existe información genómica. Sin embargo, los logros han sido menores a las expectativas. En los nemátodos parásitos se encontraron respuestas muy diversas en distintos organismos, mientras que en los platelmintos, solamente se ha demostrado la interferencia en los tremátodos Schistosoma mansoni, S. japonicum y Fasciola hepatica. Más allá de la interferencia, la existencia de miRNA ha sido claramente demostrada en C. elegans y S. mediterranea, y recién comienza a estudiarse en helmintos parásitos. Algunos resultados sorprendentes de estudios de interferencia en nematodos y trematodos apuntan a que otros mecanismos que involucran ARN pequeños pueden estar actuando en estos organismos.

Herramientas bioinformáticas y predicción de mRNA blancos de microRNAs Pena, A. Instituto Pasteur de Montevideo. Los microRNAs pertenecen al grupo de pequeños RNA no codificantes que intervienen en la regulación de la expresión génica.Reconocen sitios de unión complementarios en los extremos 3´UTR de los transcriptos blanco pudiendo causar la inhibición de la traducción y/o la degradación rápida del transcripto. Hoy en día existen diferentes métodos de predicción de sitios blanco de miRNAs, principalmente se basan en la búsqueda de complementariedad y/o evaluación desde el punto de vista termodinámico de los dúplex miRNA-ARNm blanco. A pesar de su enorme relevancia biológica, las reglas de reconocimiento específico y la regulación de genes blanco por miRNAs, no están completamente esclarecidas. Entre las principales dificultades para predecir los genes blanco in silico encontramos el pequeño tamaño de los miRNAs y las dificultades de los algoritmos de minimización de energía libre, la carencia de una precisa identificación y determinación de los 3’UTRs, así como la generación de un número considerable de “falsos positivos” por los algoritmos actuales.

USO DE OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS PARA BLOQUEAR LA ACTIVIDAD DE MICRO ARNs IN VIVO Vigorito, E. Laboratory of Lymphoctye Signalling and Development, Babraham Institute, CB22 3AT, Cambridge, Reino Unido. El descubrimiento de que los microARNs (miARNs) son agentes causales tanto en el desarrollo como la progresión de cánceres ha despertado interés en su uso como blancos terapéuticos. Los oligonucleótidos sintéticos antisentido que bloquean ARN específicos son herramientas promisorias para inhibir la expresión de microARNs in vivo, y por lo tanto con potencial para ser usados en la clínica. Los ácidos nucleicos con esqueleto peptídico (PNA) son análogos de ADN sin carga neta y con alta estabilidad con respecto a degradación enzimática. En esta presentación resumiré nuestros resultados sobre el uso de PNAs para bloquear la función de microARNs in vivo en ratones.

Simposio V: FUNCIONALIDAD DE PROTEÍNAS Moderadores: Dres A Denicola y O Pristch

Expositores: 15:45 – 16:10 M Hugo (FMed, UdelaR): UTILIZANDO LA FLUORESCENCIA INTRÍNSECA EN ESTUDIOS FUNCIONALES DE PROTEÍNAS: EL EJEMPLO DE LA PEROXIRREDOXINA DE UNA CISTEÍNA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 16:10 – 16:35 M Bonilla (FQuím, UdelaR): LA TIORREDOXINA-GLUTATIÓN REDUCTASA: UN PAQUETE ENZIMÁTICO EN EL CENTRO DEL METABOLISMO REDOX DE PLATELMINTOS 16:35 – 17:00 R Durán (UBYPA, IP): REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUTAMATO POR SER/THR QUINASAS EN MICOBACTERIAS 17:00 – 17:25 M Fló (FQuím, UdelaR): DIVERSIDAD FUNCIONAL DE UNA FAMILIA DE INHIBIDORES KUNITZ 17:25 – 17:50 G Obal (UBP, IP): CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA Y ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA DE CÁPSIDE DEL VIRUS DE LA LEUCEMIA BOVINA 17:50 – 18:15 F Zolessi (FCien, Udelar): UNA ISOFORMA DE MARCKS ESPECÍFICA DE NEUROBLASTOS: ESTUDIO DE LA REGIÓN FOSFORILADA POR CDK5

Resúmenes simposio IV UTILIZANDO LA FLUORESCENCIA INTRÍNSECA EN ESTUDIOS FUNCIONALES DE PROTEÍNAS: EL EJEMPLO DE LA PEROXIRREDOXINA DE UNA CISTEÍNA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Martín Hugo1, 2, Rafael Radi1, 2 y Madia Trujillo1, 2 1

Departamento de Bioquímica y 2Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales Libres, Facultad de Medicina La fluorescencia de proteínas ha sido ampliamente utilizada para el desarrollo de estudios tanto estructurales como funcionales en proteínas. Muchas proteínas fluorescen por excitación de residuos de triptófano (Trp) presentes en su secuencia aminoacídica. Tanto el espectro de emisión como el rendimiento cuántico proporcionan información acerca del entorno de dichos residuos y en consecuencia, de la conformación proteica. En nuestro grupo hemos utilizado los cambios de fluorescencia de Trp durante procesos de oxidación-reducción de proteínas para su caracterización funcional, particularmente en estudios cinéticos y mecanísticos. La alquilhidroperóxido reducasa E de Mycobacterium tuberculosis (MtAhpE), es un peroxirredoxina (Prx) de una cisteína y forma parte de la potente batería antioxidante de este exitoso patógeno. Las peroxirredoxinas son enzimas antioxidantes dependientes de grupos tiol (Prx-SH) capaces de reducir peróxido de hidrógeno, peroxinitrito y peróxidos orgánicos, formando ácido sulfénico (Prx-SOH): Prx-SH + ROOH Prx-SOH + ROH La oxidación de la MtAhpE durante su ciclo catalítico causa una importante disminución de la fluorescencia de Trp, producto de la inactivación o “quenching” de la misma. Esta enzima contiene tres residuos de Trp, uno de ellos particularmente cercano al sitio activo (Trp80). Tomando ventaja de esta propiedad, hemos podido determinar las constantes de velocidad de segundo orden para la reacción de la enzima con sustratos oxidantes formados durante la activación macrofágica tales como peróxido de hidrógeno y peroxinitrito. Asimismo, hemos calculado los valores de pKa del tiol y sulfénico en la enzima reducida y oxidada, respectivamente. Mediante estudios de mutagénesis sitio dirigida en los tres residios de Trp, logramos identificar al Trp80 como principal responsable de los cambios de fluorescencia observados. Finalmente, proponemos al anión sulfenato (R-SO-) como inactivador de la fluorescencia de este residuo.

LA TIORREDOXINA-GLUTATIÓN REDUCTASA: UN PAQUETE ENZIMÁTICO EN EL CENTRO DEL METABOLISMO REDOX DE PLATELMINTOS Bonilla, M1; Denicola, A2; Salinas, G1 1

Cátedra de Inmunología, UdelaR, Uruguay; Biológica, UdelaR, Montevideo, Uruguay.

2

Unidad de Fisicoquímica

Los parásitos tienen que soportar no sólo los oxidantes generados en forma endógena sino también el estrés oxidativo impuesto por sus hospederos. Los platelmintos parásitos presentan un escenario bioquímico único respecto a estas defensas. Estos parásitos poseen sistemas de la tiorredoxina (Trx) y del glutatión (GSH, forma reducida; GSSG, forma oxidada) ligados en las mitocondrias y el citosol. La selenoenzima conocida como tiorredoxinaglutatión reductasa (TGR) es el vínculo molecular entre ambos sistemas. Esta enzima posee actividades tiorredoxina reductasa (TR), glutatión reductasa (GR) y glutarredoxina (Grx), y es imprescindible para la regeneración de las formas reducidas de la Trx y del glutatión. Su comportamiento inusual proviene de la fusión de un dominio Grx a dominios TR. Previamente, demostramos que la actividad TR de la TGR de Echinococcus granulosus depende exclusivamente de los dominios TR mientras que su actividad GR requiere además del dominio Grx. Observamos además que esta última es inhibida a altas relaciones [GSSG]/[GSH]. Recientemente, mostramos que la TGR también presenta actividad deglutationilasa dependiente de NADPH sobre disulfuros mixtos glutatión-proteína. Tal como para la actividad GR, tanto los dominios TR como el Grx son necesarios para la deglutationilación. Asimismo, empleando mutantes de cisteína a serina en el centro redox CPYC del dominio Grx determinamos que estas actividades dependientes del dominio Grx ocurren ambas a través de un mecanismo monotiólico. Más aún, mostramos que las Trx de Echinococcus granulosus también son capaces de reducir GSSG y deglutationilar el disulfuro mixto glutatión-péptido. A bajas concentraciones de GSSG, la reducción de glutatión mediante esta vía es más lenta que por la vía dependiente del dominio Grx, pero funciona eficientemente a altas concentraciones de GSSG. Así, en este parásito funcionarían dos rutas alternativas de reducción de GSSG y deglutationilación, siendo una de ellas eficiente a altas y otra a bajas relaciones [GSSG]/[GSH].

REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUTAMATO POR Ser/Thr QUINASAS EN MICOBACTERIAS Durán, R1, O'Hare HM, Obal G2, Bellinzoni M4, Wehenkel AM4, Gil M1, Baumgartner J3, Vialaret J3, Johnsson K3, Pritsch O2, Cerveñansky C1, Alzari PM4. 1

Unidad de Bioquímica Analítica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable/Institut Pasteur de Montevideo; 2 Unidad de Biofísica de Proteínas, Institut Pasteur de Montevideo;3Ecole Polytechnique Federale de Lausanne; 4 Unidad de Bioquímica Estructural, Institut Pasteur de Paris. La fosforilación reversible de residuos aminoacídicos de cadena lateral hidroxilada es un mecanismo fundamental en la regulación de la actividad de proteínas, no solo en eucariotas sino también en bacterias. El genoma de Mycobacterium. tuberculosis codifica once quinasas de proteínas en serina y treonina de “tipo eucariota” denominadas PknA a PknL. Previamente hemos demostrado que la actividad de cuatro de estas quinasas de transmembrana está regulada por autofosforilación de residuos específicos. Utilizando aproximaciones proteómicas identificamos un sustrato endógeno de PknB, GarA (Glycogen Accumulation Regulator A). GarA contiene un dominio FHA ("forkhead-associated”) que reconoce específicamente residuos de treonina fosforilados. En este trabajo estudiamos PknG, quinasa citosólica que participa en la fisiología y virulencia de Mycobacterium tuberculosis. PknG es única en su estructura ya que contiene un dominio rubredoxina exclusivo de bacterias caracterizado por la presencia de cuatro cisteínas muy conservadas capaces de coordinar un ion metálico. Estudiamos aspectos básicos de esta enzima en cuanto a su selectividad y a los mecanismos de regulación de su actividad. Evaluamos el efecto de la autofosforilación así como del dominio rubredoxina sobre la actividad catalítica de PknG. El patrón de autofosforilación es distinto al reportado para otras quinasas y no modula la actividad enzimática. Por otro lado, PknG fosforila GarA en un residuo adyacente al fosforilado por PknB. Ambas formas fosforiladas de GarA fueron identificadas in vivo. Demostramos que la autofosforilación de PknG cumple un papel muy relevante en el reclutamiento de GarA, e identificamos el residuo fosforilado involucrado en la interacción de alta afinidad PknG/GarA. El estudio del “interactoma” de GarA nos permitió demostrar que este sustrato regula enzimas claves del metabolismo del glutamato y del ciclo de Krebs, dependiendo de su estado de fosforilación. Por tanto, mediante la fosforilación de GarA, las Ser/Thr quinasas participarían en la regulación del metabolismo intermediario en micobacterias.

DIVERSIDAD FUNCIONAL DE UNA FAMILIA DE INHIBIDORES KUNITZ Fló M1,2, Margenat M1, Pellizza L1, Pérez G1, Durán R3, Salinas G1, Alvarez B2, Fernández C1 1 Cátedra de Inmunología, Facultad de Química, UR, Uruguay. 2 Laboratorio de Enzimología, Facultad de Ciencias, UR, Uruguay. 3 Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable/Instituto Pasteur de Montevideo, Uruguay

Prácticamente no se conocen los mecanismos moleculares que participan en el establecimiento de la larva de E. granulosus en el intestino del perro. Hemos descrito recientemente una familia de proteínas del tipo Kunitz (EgKU1–EgKU-8), identificadas en el transcriptoma de larvas tratadas con pepsina en medio ácido. Como algunos miembros de la familia serían secretados por las larvas, proponemos que estas proteínas pueden interferir con el comienzo de la infección. Además, estudios cinéticos con EgKU-1 y EgKU-8 nativos demuestran la diversidad funcional de estas proteínas. EgKU-8 (Arg en el sitio antiproteasa P1) se comporta como un inhibidor lento de alta afinidad de tripsinas. EgKU-1 (Gln en P1) por su parte, no inhibió ninguna de las proteasas ensayadas y su modelado molecular reveló elementos estructurales presentes en proteínas Kunitz con actividad bloqueadora de canales catiónicos [1]. Caracterizamos otros miembros de la familia usando las correspondientes proteínas recombinantes que confirman y extienden nuestras observaciones previas. La familia incluye tres pares de parálogos: EgKU-1/EgKU-4; EgKU3/EgKU-8; EgKU-6/EgKU-7. EgKU-8 recombinante se comportó como el nativo, EgKU-3 (Leu en P1) actuó como un inhibidor lento de alta afinidad de quimotripsina. Por otro lado, EgKU-4 (Arg en P1), el parálogo cercano de EgKU-1 que conserva los elementos asociados con el bloqueo de canales, inhibió débilmente tripsina. Actualmente, estamos caracterizando EgKU-5, EgKU-6 y EgKU-7 (todos con Arg en P1). Datos preliminares indican que existen diferencias entre ellos en su actividad como inhibidores de tripsina. También estamos poniendo a punto ensayos de patch-clamp para analizar si EgKU-1 y EgKU-4 son, efectivamente, bloqueadores de canales catiónicos. [1] S. González, M. Fló, M. Margenat, R. Durán, G. González-Sapienza, M. Graña, J. Parkinson, R. Maizels, G. Salinas, B. Alvarez, C. Fernández. PLOS ONE 2009 4(9), e7009.

CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA Y ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA DE CÁPSIDE DEL VIRUS DE LA LEUCEMIA BOVINA Obal, G1,. Palacios, F2., Trajtemberg, F3., Buschiazzo, A3 Pritsch, O1. 1.

Unidad de Biofísica de Proteínas, 2. Unidad de Proteínas Recombinantes, 3. Unidad de Cristalografía de Proteínas (Institut Pasteur Montevideo). El virus de la leucemia bovina (VLB), agente causal de la leucosis bovina enzoótica, es un retrovirus perteneciente al género Deltaretrovirus. En la célula infectada, los viriones se ensamblan y brotan inicialmente como partículas inmaduras, formadas por la polimerización de una poliproteína – Gag - que contiene las proteínas estructurales Matriz (MA), Cápside (CA) y Nucleocápside (NC). Posteriormente, la proteasa viral se activa y procesa a Gag generando los dominios MA, CA y NC. Una vez libre, la proteína CA es capaz de auto-ensamblarse, formando una estructura denominada cápside, que encierra al ARN genómico viral. Este proceso es crucial para la propagación del retrovirus, ya que determina la formación de una partícula madura con capacidad infecciosa. Recientemente iniciamos la caracterización biofísica y estructural de CABLV, haciendo particular foco en el proceso de auto-ensamblado. Hemos producido la proteína recombinante en E. coli, y encontramos que existe en solución como monómero, de forma similar a las CA de HTLV-1 y RSV, pero en contraste con CAHIV que existe como dímero. CABLV oligomeriza in vitro formando tubos de longitud variable de manera concentración-dependiente, sugiriendo un proceso dirigido por nucleación. El ensamblado puede ser gatillado por temperatura y sales de fosfato, y procede rápidamente mostrando una distribución bimodal consistente de los bloques de construción (monómero) y especies de alto peso molecular. Actualmente estamos profundizando la caracterización de los determinantes del proceso de autoensamblado y la identificación de especies intermediarias involucradas. En paralelo, realizamos un rastreo de condiciones de cristalización de CABLV, y encontramos pistas prometedoras que estamos optimizando. Una vez tengamos cristales adecuados, procederemos a la elucidación de la estructura 3D mediante difracción de rayos X. Nuestro objetivo amplio es conectar la información que surja de los estudios biofísicos y estructurales para comprender como ocurre la formación la cápside retroviral.

UNA ISOFORMA DE MARCKS ESPECÍFICA DE NEUROBLASTOS: ESTUDIO DE LA REGIÓN FOSFORILADA POR CDK5 Zolessi FR1, Fraga JL2, Obal G3, Tinoco LW2, Pritsch O3, Arruti C1 1- Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República; 2- LADIE-Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, UFRJ, Brasil; 3- Unidad de Biofísica de Proteínas, Institut Pasteur de Montevideo MARCKS es una proteína intrínsecamente desplegada, poco conservada, y cuyas funciones conocidas se restringen a una región central de 25 residuos: el “dominio efector” o ED. El ED, cuya secuencia es extremadamente conservada, interactúa con la membrana plasmática, la actina y la calciocalmodulina, de una manera regulada por PKC. Aunque la función exacta de MARCKS no es clara, es particularmente esencial en el desarrollo del sistema nervioso. Además de este dominio, existe otro altamente conservado, “MH2”, de función desconocida. En esta región, hemos encontrado una fosforilación mediada por Cdk5, y que ocurre exclusivamente en neuronas en diferenciación. Para intentar comprender la posible función de esta modificación posttraduccional de MARCKS, hemos analizado en mayor detalle la interacción con el anticuerpo monoclonal 3C3, que la reconoce específicamente. Mediante estudios de RMN y CD, observamos que un péptido de 20 aminoácidos alrededor de S25 presenta una estructura desplegada, de tipo “random coil”, estando o no fosforilado. La fosforilación, sin embargo, provoca un pequeño cambio conformacional. El anticuerpo interactúa solamente con el péptido fosforilado, sin cambiar su estructura de manera medible por RMN. Por otra parte, espectros de sustitución de 1H por D y análisis TOCSY, muestran que, además de S25, el anticuerpo interactúa fuertemente con K28 y A29, confirmando evidencias previas de que el clivaje de este enlace con tripsina provoca la pérdida de inmunorreactividad. Estudios de interacción molecular mediante SPR muestran nuevamente que el anticuerpo no es capaz de reconocer al péptido no fosforilado en S25, y que los parámetros cinéticos de la interacción son muy similares entre el péptido sintético y la proteína inmunopurificada a partir de sistema nervioso embrionario. En conjunto, los presentes resultados sugieren que la región conservada de MARCKS alrededor de S25 tiene una estructura desplegada en la proteína, tanto en estado fosforilado como no fosforilado.

Simposio VI: NEUROBIOLOGÍA Moderadores: Dres JR Sotelo y S Olivera

Expositores: 15.45 - 16:00

A Toledo (FC-UdelaR): FOSFORILACIÓN DE MARCKS DURANTE LA DIFERENCIACIÓN NEURONAL EN LA RETINA

16:05 - 16:20

M Castelló (NCIC-IIBCE): DESARROLLO POSTNATAL DE UNA RED SENSORIO-MOTORA

16:25 - 16.40

JM Verdes (FVet-UdelaR) CARACTERIZACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE LA DEGENERACIÓN CORTICAL CEREBELOSA OCASIONADA POR INGESTIÓN DE Solanum bonariense EN BOVINOS

16:45 – 17:00

S Olivera (NBCM-IIBCE): PAPEL DE ENFERMEDADES NEUROMETABÓLICAS

17:05 – 17:20

P Cassina (FMed-UdelaR): ALTERACIONES MITOCONDRIALES EN MODELOS DE ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA

17:25 – 17:40

P Lagos (FMed-IIBCE): ROL DE LA HORMONA CONCENTRADORA DE MELANINA (MCH) EN EL SUEÑO REM Y LA DEPRESIÓN

17:45 – 17:55

Presentación oral seleccionada: A Fernández Alvarez (FMed-UdelaR): EL ÓXIDO NÍTRICO (NO) GENERADO POR FIBRAS PROMOTORAS DELGADAS ES EFECTIVO COMO NEUROMODULADOR ANTERÓGRADO

18:00 – 18:15 Observaciones generales

LOS

ASTROCITOS

EN

LAS

CARACTERIZACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE LA DEGENERACIÓN CORTICAL CEREBELOSA OCASIONADA POR INGESTIÓN DE Solanum bonariense EN BOVINOS. Verdes JM1, Battes D1, Calliari A1, 2, Moraña A1, Gutiérrez, F1, Ruiz P1, 2. 1

Área Biofísica, Facultad de Veterinaria, Universidad de la República (UdelaR). 2 Laboratorio de Proteínas y Ácidos Nucleicos, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE), Montevideo, URUGUAY. ([email protected]). El Solanum bonariense L., es un arbusto perenne y autóctono que al ser ingerido por bovinos en pastoreo les ocasiona degeneración cerebelosa, afectando específicamente las células de Purkinje, ocasionando vacuolización del pericario y desplazamiento nuclear, con progresiva muerte neuronal y formación de esferoides axonales y microcavitaciones. El objetivo del presente trabajo fue describir patrones de reactividad contra Calbindina D 28k (Cbd28k), citoesqueleto, ubiquitina, TUNEL (apoptosis) y FluoroJade B (neurodegeneración) en cortes de cerebelos de bovinos intoxicados natural o experimentalmente con Solanum bonariense L. A partir de muestras fijadas en formol al 10% en PBS (pH 7.4) obtenidas de 6 bovinos intoxicados y 2 controles de raza Holando, se obtuvieron secciones transversales, se incluyeron en parafina y fueron cortaron a 5µm montadas en laminas. Sobre ellas se desarrollaron los protocolos de inmunotinción para CbdD28k, Tubulina, Neurofilamentos (NFs), Falloidina (Actina) y Ubiquitina, TUNEL y FluoroJade B. La inmunomarcación para citoesqueleto presentó diferencias de marcación para Tubulina, NFs y Actina. La inmunomarcación contra Ubiquitina, mostró una distribución irregular con áreas puntiformes de mayor intensidad en el pericario. El test de TUNEL fue negativo, mientras que FluoroJade B marcó más intensamente las células de Purkinje afectadas. La Cbd28k mantuvo la marcación en los intoxicados respecto a los cortes del control. Las diferencias observadas en la inmunomarcación contra citoesqueleto y Ubiquitina, sugieren alteraciones de citoesqueleto por posible inhibición de la síntesis proteíca y la alteración de la vía hidrolítica no lisosomal dependiente de ATP indicando bajos niveles de ATP. Además el mantenimiento de la marcación contra Cbd28k indicaría una modulación adecuada de calcio intracelular. La negatividad a TUNEL muestra que la apoptosis no estaría involucrada en esta neurodegeneración y la reactividad de las células de Purkinje al FluoroJade lo muestran como un marcador sensible (aunque inespecífico) para detectar neurodegeneración en esta alteración cerebelosa de bovinos inducida por la ingestión de Solanum bonariense L.

RESÚMENES SIMPOSIO VI EL ÓXIDO NÍTRICO (NO) GENERADO POR FIBRAS PREMOTORAS DELGADAS ES EFECTIVO COMO NEUROMODULADOR ANTERÓGRADO. Fernández Álvarez, A.1; Gómez-Sena, L.2; Fabbiani, M.G.1;Budelli, R.2; Abudara, V.1 1 Laboratorio de Comunicación Celular, Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, UDELAR. 2 Sección Biomatemáticas, Facultad de Ciencias, UDELAR El tamaño y la densidad de las fuentes nitrérgicas están directamente relacionados con la extensión de la difusión del NO, determinante de su capacidad de señalización. En el sistema nervioso central, el NO típicamente liberado desde somas postsinápticos por activación NMDA-dependiente de la NO sintasa neuronal (nNOS), afecta blancos presinápticos retrógrados de menor tamaño. En el núcleo motor del trigémino del cobayo (TMN), el NO se produce en terminales premotoras diminutas y dispersas que expresan nNOS e inervan motoneuronas de gran tamaño. Dichas motoneuronas contienen el receptor de NO, la guanilato-ciclasa soluble (sGC) pero no nNOS. El bajo cociente entre tamaños fuente/blanco y la dispersa disposición de las fuentes nitrérgicas, hacen dudar si el NO endógeno es suficiente para sostener una señalización anterógrada entre las terminales premotoras y las motoneuronas post-sinápticas. En motoneuronas identificadas por marcado retrógrado con CM-DiI y microscopia confocal, evaluamos la actividad de la sGC mediante cuantificación de la inmunofluorescencia para cGMP. La depolarización de múltiples fibras nitrérgicas premotoras con alto potasio aumentó la señal inmunofluorescente para cGMP en dichas motoneuronas. Dicho efecto: a) requirió de la presencia de Ca++ extracelular, activador fisiológico de la nNOS, b) fue imitado por dadores de NO, y c) fue bloqueado por inhibidores de la nNOS, inhibidores de la sGC, y por maniobras que silencian la actividad neuronal o impiden la difusión de NO. Así, el NO liberado presinápticamente durante la activación neuronal alcanza las motoneuronas a concentraciones que activan la sGC. Concluimos que el NO generado por fibras delgadas y dispersas es efectivo como neuromodulador anterógrado a pesar del bajo cociente entre el tamaño de las fuentes y de los blancos y de la baja densidad de las fuentes. Sugerimos que, como con neurotransmisores clásicos, los niveles de Ca++ intraterminal modularían la liberación de NO y entonces su señalización espacial dentro del TMN.

Simposio VII: Biotecnología 1. Moderadores: Dras L Franco Fraguas y M Marín

Expositores: 9:00-9:30

G Cota (ATGen): DESARROLLO DE UN SISTEMA PARA LA DETERMINACIÓN DE CARGA VIRAL PLASMÁTICA DE HIV1 POR PCR EN TIEMPO REAL

9:30-10:00

S Vero (FQuím, UdelaR): BIOTECNOLOGÍA APLICADA AL DESARROLLO DE PRODUCTOS DERIVADOS DE LA MIEL

10:00-10:15

D Senatore (LBGM, IIBCE): BÚSQUEDA, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS EN LA MICROBIOTA INTESTINAL DE TERMITAS NATIVAS

10:15-10:30

P Peraza (INIA): ESTUDIO DE GENEALOGÍA MEDIANTE EL ANÁLISIS DE STR EN OVINOS

10:30-10:45

M Vital (F. Quím, UdelaR): OBTENCIÓN, MARCADO Y ENSAYO DE DISTRIBUCIÓN DE ANEXINA V HUMANA RECOMBINANTE

RESÚMENES SIMPOSIO VII DESARROLLO DE UN SISTEMA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CARGA VIRAL PLASMÁTICA DE HIV-1 POR PCR EN TIEMPO REAL Germán Cota, Jorge De los Santos, Tedesco, Carlos Sanguinetti.

Gonzalo Greif, Andrés Abin, Sofía

Laboratorio ATGen Sistemas Moleculares. La determinación de la Carga Viral Plasmática de HIV (CVP) es un análisis de rutina indicado para el monitoreo de pacientes con HIV que inician o ya se encuentran sometidos a terapia con drogas antirretrovirales. Con esta finalidad distintos métodos basados en la amplificación de ácidos nucléicos han sido desarrollados y optimizados para su utilización en el laboratorio de diagnóstico clínico. Entre ellos la PCR en Tiempo Real ha sido adoptada como técnica de preferencia, debido a su capacidad para generar resultados reproducibles y confiables y la posibilidad de automatización. En este trabajo se presenta el desarrollo de un sistema de cuantificación absoluta de ARN viral por PCR en Tiempo Real orientado al reconocimiento de todos los subtipos de HIV-1. El sistema está basado en la retrotranscripción y PCR acopladas en un único tubo, emplea sondas de hidrólisis e incorpora un control interno de ARN homólogo para la validación del ensayo en cada muestra. Habiendo superado la etapa inicial de desarrollo, el kit comenzó su etapa de validación. Tres lotes de kits prototipo fueron producidos en condiciones GMP para iniciar los ensayos de validación. Los prototipos se utilizaron para analizar un panel de 60 muestras clínicas y 15 muestras provistas por el programa “HIV-Viral Load Survey 2009” del College of American Pathologists (CAP). Su desempeño fue además evaluado frente al 2do. Estándar Internacional de ARN de HIV-1 (OMS) en dilución seriada con plasma negativo. Se presenta un adelanto de los resultados de CVP obtenidos con kits de ATGen sobre el panel de muestras clínicas en comparación con los obtenidos empleando un sistema de PCR equivalente de fabricación extranjera. El desempeño de los kits evaluados frente al Estándar Internacional arrojó resultados altamente consistentes en el intervalo de 5,6-2,3 IU/mL (log10). Así mismo los informes del CAP indicaron que los valores obtenidos se encuentran dentro del rango de aceptación (+/-3 SD) establecido por los más de 200 laboratorios afiliados que utilizan kits de marcas consolidadas.

BÚSQUEDA, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS EN LA MICROBIOTA INTESTINAL DE TERMITAS NATIVAS Senatore, D.; Rodríguez, C.; Peri, A.; Amarelle, V.; Fabiano, E; Noya, F. Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbiana, IIBCE. La producción de bioetanol consiste en la degradación de polisacáridos complejos y la posterior fermentación alcohólica. Las materias primas más utilizadas son el almidón del maíz y la sacarosa de la caña de azúcar. Sin embargo, es la lignocelulosa el polisacárido complejo más abundante, barato y mejor distribuido del mundo. Las termitas junto con los rumiantes son los principales consumidores de lignocelulosa del planeta. Para su degradación dependen de una diversa comunidad microbiana que reside en su intestino y que aloja un conjunto vasto y diverso de enzimas glicolíticas. Para poder estudiar las especies bacterianas no cultivables existentes en la microbiota intestinal de las termitas, en este proyecto se trabaja con metagenómica. Se evisceraron 300 intestinos de termitas nativas Rugitermes sp. y se aisló el ADN metagenómico bacteriano presente en los mismos. Se constuyó una biblioteca metagenómica de 30000 clones mediante el clonado en fósmidos de fragmentos de ADN de aproximadamente 42 Kb. Se realizó el screening de toda la biblioteca para hallar funciones celulasas y hemicelulasas utilizando medios sólidos con sustratos específicos. Se encontraron tres clones con función hemicelulasa y un clon con función celulasa. Actualmente se está verificando la función celulasa y hemicelulasa de dichos clones mediante retransformación. También se verificarán las funciones enzimáticas mediante ensayos bioquímicos. Las enzimas serán clasificadas y comparadas con las secuencias de otras enzimas conocidas con el fin de acotar el organismo de procedencia y eliminar aquellas que ya estén descritas. Una vez identificados los genes de interés se procederá a su expresión y purificación. Paralelamente al abordaje metagenómico se aisló una bacteria identificada como Fulvimonas sp. que posee función celulasa y hemicelulasa. Al igual que para los clones de la biblioteca, dichas funciones serán determinadas mediante ensayos bioquímicos.

ESTUDIO DE GENEALOGÍA MEDIANTE EL ANÁLISIS DE STR EN OVINOS Peraza, P 1; Kelly, L1, 2; Ungerfeld, R

2

*1 Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria – Unidad de Biotecnología Animal - Las Brujas *2 UdelaR – Facultad de Veterinaria Los análisis de paternidad son una herramienta potencial para el productor agropecuario al permitir identificar animales de manera precisa e inequívoca dentro de un rebaño y obtener así su genealogía. Dentro de la Unidad de Biotecnología Animal del Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria se realizó un análisis de paternidad, en este caso en la raza ovina Corriedale del Uruguay, mediante la utilización de marcadores moleculares, como lo son los microsatélites (STR). Estos, permiten realizar una observación de su variabilidad polimórfica dentro de una majada y obtener su parentesco. El test consta de una primera etapa en la que se amplifican los STR mediante una reacción de PCR. Estos se amplifican tanto de manera individual como en forma de multiplex (se amplifican varios loci en una misma reacción) formando distintos paneles. Los paneles dependen del rango de amplificación y del fluorocromo utilizado en cada microsatélite. En el presente trabajo, 10 STR fueron analizados para una población de 154 ovinos incluyendo 6 posibles padres y 148 corderos. Los STR fueron elegidos dentro de los recomendados por la International Society of Animal Genetics (I.S.A.G.). Además de obtener los resultados de Heterocigocidad (H), Frecuencias Alélicas (FA), el Contenido de Información Polimórfica (PIC), el LOD Score y las Probabilidades de Exclusión (PE) fue posible determinar para 126 corderos su progenitor. Este tipo de estudios son de gran utilidad para el apoyo de los programas de mejora genética, donde la correcta identificación del parentesco es fundamental. Asimismo, combinados con otros trabajos de investigación, son de gran utilidad en estudios de regiones a nivel genómico brindando información acerca de distintas características.

OBTENCIÓN, MARCADO Y ENSAYO DE DISTRIBUCIÓN DE ANEXINA V HUMANA RECOMBINANTE Vital M1, Savio E2., Martínez E2., Reyes L2., Terán M2., Esperón P1. 1

Cátedra de Biología Molecular. Facultad de Química. Montevideo. Uruguay Cátedra de Radioquímica. Facultad de Química. Montevideo. Uruguay.

2

La anexina V, proteína soluble ampliamente distribuida en diferentes especies, tejidos y tipos celulares se une en forma dependiente de Ca+2 a constituyentes negativamente cargados de membranas celulares. Su alta afinidad por la fosfatidilserina de membranas en células apoptóticas permite el diagnóstico precoz de este proceso y hace a esta molécula atractiva para diagnosticar daños cerebrales hipóxicos-isquémicos, realizar screening no invasivos en pacientes transplantados o determinar el éxito de un tratamiento oncológico. El cDNA de la anexina V fue obtenido por técnica de RT-PCR a partir de ARN total de placenta humana. Por técnicas de clonado se obtuvo una construcción en pET22b(+) conteniendo el gen de la anexina V. Este sistema de expresión produce una proteína con seis histidinas en el extremo carboxiterminal lo que facilita su purificación y posterior radiomarcado. Se obtuvo con éxito una proteína de 35-36kD, lográndose un muy adecuado ajuste de las condiciones de cultivo, inducción y escalado. El rendimiento final de proteína fue de 50mg/L de cultivo, con una pureza 98%. Los resultados del estudio en espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF dieron concordantes con la secuencia aminoacídica esperada. La anexina V recombinante fue radiomarcada mediante incubación con el complejo [99mTc(H2O)3(CO)3]+, por sustitución de aguas de coordinación por histidinas. El radiofármaco presentó más del 90% de pureza radioquímica. Por estudios in vitro se estudió la estabilidad del complejo y la retención de actividad biológica de la proteína. Los estudios in vivo se realizaron mediante un modelo de apoptosis en ratas Wistar hembras. La mayor captación se dio en hígado, bazo, y pulmones. Estudios histológicos confirmaron el desarrollo de apoptosis en bazo y pulmón. La alta captación en hígado no lo haría apropiado para estudios a nivel abdominal. Este radiofármaco se perfila como un marcador promisorio para la obtención de imágenes centellográficas de apoptosis en estos órganos.

Simposio VIII: INMUNOLOGÍA Moderadores: Dres A Díaz y P Oppezzo

Expositores: 9:00-9:40

E Vigorito (I Babraham, Reino Unido): REGULACION DEL SISTEMA INMUNE POR MICROARN-155.

9:40-10:00

F Palacios (IP): SOBREEXPRESIÓN DE AID ASOCIADA A UN PROCESO ACTIVO DE CAMBIO DE CLASE MARCA A LA SUBPOBLACIÓN PROLIFERANTE EN LA LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA (LCC)

10:00-10:20

A Rial (FMed, UdelaR): IL-17A JUGA UN ROL CENTRAL EN LA PROTECCIÓN A LARGO PLAZO FRENTE A LA INFECCIÓN AGUDA POR STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

10:20-10:40

M Bollatti (UBC, IP): ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO SOBRE CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS

10:40-11: 00 T Freire (I Pasteur, Francia): EL ANTÍGENO TN DIRIGIDO AL RECEPTOR LECTINA TIPO C MGL EN CÉLULAS DENDRÍTICAS DERMALES INDUCE UNA RESPUESTA TH2 Y GENERA ALTOS TÍTULOS DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS

RESÚMENES SIMPOSIO VIII REGULACION DEL SISTEMA INMUNE POR MICRO ARN-155 E Vigorito Laboratory of Lymphoctye Signalling and Development, Babraham Institute, CB22 3AT, Cambridge, Reino Unido. Los microARNs representan una nueva clase de genes reguladores, importantes para una gran variedad de procesos celulares. En el sistema immune, un microARN en particular, el miARN-155, es inducido rápidamente en respuesta a la estimulación de celulas mieloides o linfoides. Además, miARN-155 es expresado en altos niveles en enfermedades hematológicas malignas, y cuando se sobreexpresa en ratón da lugar a la expansión anormal de celulas mieloides y linfocitos B. El elucidar la regulación de la expresión de los miARNs, las funciones celulares por ellos controladas, y sus blancos moleculares directos, es esencial para entender tanto su papel en la fisiología del sistema immune como en el cáncer. Para estudiar la funcion del miARN155 in vivo, creamos y analizamos el fenotipo de ratones deficientes en el gen miARN-155. En esta presentacion resumiré lo que hemos aprendido respecto a la regulación del sistema inmune adaptativo por dicho microARN.

Sobreexpresión de AID asociada a un proceso activo de Cambio de Clase marca a la subpoblación proliferante en la Leucemia Linfoide Cronica (LLC) Palacios F.1;Moreno P.1; Morande P.2; Abreu C.1; Correa A.1; Porro V.1; Landoni A.I.3; Gabus R.3; Bianchi S.1 y Oppezzo P.1. 1 Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay. 2 Academia Nacional de medicina, Buenos Aires, Argentina 3 Servicio de Hematología, Hospital Maciel, Montevideo, Uruguay. Los procesos de Hipermutación Somática (HS) y de Cambio de Clase (CC) en el linfocito B son llevados a cabo por la enzima citidine deaminasa (AID), capaz de mutar específicamente el ADN luego de que el linfocito B es activado por el antígeno. La sobreexpresión de esta enzima lleva a un proceso de mutación inespecífica que se relaciona con ciertos desordenes linfoproliferativos. En la LLC nuestro grupo describió que la sobreexpresión de AID estaba relacionada a una subpoblación de células tumorales en un activo proceso de CC pero solo en aquellos pacientes que no presentaban HS. Como en LLC la falta de HS esta asociada a un mal pronóstico, en este trabajo nos propusimos determinar si la subpoblación de células B tumorales con CC activo constituye población proliferante. Para ello, se seleccionaron pacientes con expresión constitutiva de AID y CC activa. Se separaron las poblaciones de células B tumorales IgM e IgG. Se evaluó la expresión de las quimioquinas (CCL3, CCL4) y proteínas de adhesión (CD49) relacionadas con la progresión tumoral, así como la expresión de moléculas antiapoptóticas (BCL-2), de proliferación (Ki-67, c-myc) y de inhibición de entrada al ciclo celular (p27) en ambas poblaciones. Los resultados muestran que la expresión de los marcadores de proliferación y progresión de la enfermedad es significativamente mayor en la sub-población con alta expresión de AID y CC comparado con su contrapartida de células leucémicas IgM. Finalmente mostramos que la alta expresión de AID está restringida a las células tumorales que están llevando a cabo el proceso de CI y que la presencia de esta subpoblación estaría asociada a una evolución desfavorable en la LLC La presencia de esta subpoblación proliferante en la LLC deja abierta muchas preguntas sobre el origen y la evolución de la enfermedad, planteando además nuevos desafíos en el área terapéutica.

IL-17A JUEGA UN ROL CENTRAL EN LA PROTECCIÓN A LARGO PLAZO FRENTE A LA INFECCIÓN AGUDA POR STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Rial A., Marques J.M., Muñoz N. y Chabalgoity A. Laboratorio de Investigación en Vacunas, Departamento Biotecnológico, Facultad de Medicina, Universidad de la República, URUGUAY

Desarrollo

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es un patógeno humano de muy alta relevancia, siendo uno de los principales agentes etiológicos de la neumonía adquirida en la comunidad. Provoca infecciones invasivas y no invasivas, principalmente en niños menores de 2 años y en adultos mayores. En un modelo murino de nuemonía aguda utilizando un aislado clínico de neumococo serotipo 1 hemos visto que una infección subletal induce protección a corto y largo plazo frente a un desafío letal homólogo, resultando en un 100% de sobrevida. El análisis del perfil transcripcional de pulmón entero mostró una marcada sobre expresión de genes relacionados con IL-17A e IFNadministrado 7 días o 2 meses luego de la infección subletal. Nuestros resultados sugieren que la producción temprana de anticuerpos IgG específicos para el polisacárido capsular y un aumento en el reclutamiento de neutrófilos hacia los pulmones estarían involucrados en la protección a corto plazo. Sin embargo, en el caso del modelo a 2 meses, la protección a largo plazo es estrictamente dependiente de IL-17A, dado que los ratones deficientes en IL-17ª (IL17a KO) no sobreviven al desafío letal. Sin embargo, los ratones salvajes al igual que los KO mostraron niveles similares de IgGs específicas y de infiltración neutrofílica hacia los pulmones. Por otro lado, pudimos demostrar la generación de un pool de células T de memoria con perfiles Th1 y Th17, detectables tanto a nivel de pulmón como a nivel de bazo, en los animales protegidos. En conjunto, estos resultados nos permiten empezar a definir vías, principalmente relacionadas a IL-17, que estarían involucradas en la protección contra la infección neumocóccica aguda y que podrían ser relevantes para definir nuevas estrategias de intervención contra este importante patógeno.

ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE BACTERIAS DEL ACIDO LÁCTICO SOBRE CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS Tiscornia I.1, Racedo S.2, Hernández A.3 y Bollati-Fogolín M.1 1) Unidad de Biología Celular, Institut Pasteur de Montevideo, Montevideo, Uruguay; 2) CIDCA-Facultad de Ciencia Exactas, UNLP, La Plata, Argentina, 3) Facultad de Ciencias, UdelaR, Montevideo, Uruguay. E-mail: [email protected] Ciertas bacterias del ácido láctico (BAL) son consideradas probióticas debido a su capacidad de promover beneficios en la salud del organismo huésped, principalmente a nivel intestinal. Las bases moleculares de estos efectos están parcialmente caracterizadas al presente. Las Células Dendríticas (DC) de mucosas tienen un rol fundamental en el mantenimiento de la homeostasis intestinal y están influenciadas por células epiteliales intestinales y bacterias comensales. El objetivo de este trabajo consistió en analizar los efectos de microorganismos potencialmente probióticos sobre DC humanas. Para ello, cepas de los géneros Lactococcus, Lactobacillus y Streptococcus fueron aisladas de preparados comerciales y DC fueron diferenciadas a partir de monocitos de sangre periférica. Para la generación de DC condicionadas (cDC) se empleó sobrenadante de cultivo de células epiteliales intestinales (HT-29). Se estudiaron los efectos de BAL sobre la activación de DC, cDC (CD86 y HLADR) y la producción de citoquinas pro o anti-inflamatorias (IL-8, IL-10) en condiciones basales o luego de la estimulación con LPS. Asimismo se evaluó la interacción entre DC-BAL. Nuestros resultados demostraron que el condicionamiento de DC induce una respuesta diferente frente a la adición de BAL. Además, se produjo una disminución significativa (p