Centro de Estudio de Productos Naturales Facultad de Química Universidad de la Habana

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina TESIS DE DIPLOMA

Autor: Leonardo González Ceballos Tutor: Dr. Daniel García Rivera MSc. Micjel Chávez Morejón

La Habana/Junio de 2015

Dedicatoria

La principal enfermedad del hombre es la curiosidad inquieta de lo que no puede conocer. PASCAL

A mi papá, a mi hermana y en especial a mi mamá: la más valiente de todas A mi nueva familia: Mercedes, Leonide y Daylin

Simbologías y abreviaturas Simbologías y abreviaturas aa

aminoácido

AcOEt

acetato de etilo

anh.

anhidro

Asp

ácido aspártico

Bzl

bencilo

Boc

tert-butoxicarbonilo

Cbz o Z

benzoxicarbonilo

CCD

Cromatografía de capa delgada

CLC

Cromatografía líquida en columna

CHCl3

cloroformo

CDCl3

cloroformo deuterado

CD3OD

metanol tetradeuterado

DCC

diciclohexilcarbodiimida

DCM

diclorometano

DCU

diciclohexilurea

DIC

diisopropilcarbodiimida

dil.

Disolución diluida

DIPEA

diisopropiletilamina

DMSO

dimetilsulfóxido

DMSO-d6

dimetilsulfóxido hexadeuterado

dsln sat.

Disolución saturada

EDC

hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida

ESI-MS

Espectrometría de masas con ionización por electronebulización

Et3N

trietilamina

EtOH

etanol

Fmoc

fluorenil-9-metoxicarbonil

Glu

ácido glutámico

Gly

glicina

HATU

hexafluorofosfato de 1-[bis-(dimetilamino)metiliumil]-1h-1,2,3triazolo[4,5-b]piridine-3-óxido

HAPyU

hexafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3tetrametileneuronio

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Simbologías y abreviaturas HBTU

hexafluorofosfato de 3-[bis(dimetil amino)metiliumil]-3h-benzotriazol -1-óxido

HOAt

1-hidroxi-7-benzotriazol

HOBt

1-hidroxibenzotriazol

HOSu

N-hidroxisuccinimida

HPLC

Cromatografía líquida de alta eficacia

Leu

leucina

MCR

Reacciones multicomponentes

MeOH

metanol

n-Hex

n-hexano

RMN

Resonancia magnética nuclear

RMN-13C

Resonancia magnética nuclear de carbono 13

RMN-1H

Resonancia magnética nuclear protónica

PyBroP

hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio

PyCloP

hexafluorofosfato de clorotripirrolidinofosfonio

PyClU

hexafluorofosfato de 1,1,3,3-bis(tetrametilen)clorouronio

tBu

tert-butil

TFA

ácido trifluoracético

THF

tetrahidrofurano

Ugi-4C

Reacción de Ugi cuatro componentes

Ugi-4CC

Reacción de Ugi cuatro centros, cuatro componentes

Ugi-3C-4C

Reacción de Ugi tres centros, cuatro componentes

Val

valina

VIH

Virus de la Inmunodeficiencia Humana

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

Resumen Resumen Los péptidos son una familia bien amplia de compuestos con características estructurales propias que les permiten realizar variadas funciones en el mundo animal, como por ejemplo: hormonas, enzimas, entre otras. La Surfactina es un producto natural obtenido de la bacteria Bacillus subtilis con un amplio espectro de actividad biológica que lo convierte en uno de los prospectos más fuertes para desarrollar los productos antibióticos de la próxima generación. Se ha demostrado que la Surfactina tiene propiedades antitumorales, antivirales, antifúngicas, anti VIH, bactericida, antimicoplasma y muchas otras debido a su gran poder surfactante sobre todas las membranas celulares gracias a su estructura anfifílica formada por un residuo ciclopeptídico de siete aminoácidos y un residuo de un ácido graso -hidroxilado de entre doce a dieciséis átomos de carbono. Esta gran actividad biológica se ve inutilizable hasta el momento debido al gran poder hemolítico que presenta la Surfactina. Este trabajo está encaminado a mostrar una vía novedosa de síntesis de análogos de la Surfactina en disolución, basada en reacciones multicomponentes tratando de que los análogos sintetizados conserven o mejoren la actividad biológica de dicho producto, aumenten su estabilidad metabólica y disminuyan su hemofilicidad. Para ello se sintetizaron dos heptapéptidos, un octapéptido y un isocianuro lipídico a partir de una amina comercial y ambos fragmentos se condensaron mediante la reacción de Ugi-4C o de Passerini. Este trabajo representa el primer reporte de la utilización de reacciones multicomponentes para la obtención de la Surfactina.

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

Abstract Abstract Peptides are a wide family of compounds with own structural characteristics that allow them to devlop many functions in the animal world, such as hormones, enzymes, and others. Surfactin is a natural product which is produced by bacterium Bacillus subtilis with a broad spectrum of biological activity that convert it in one of the strongest prospects for developing antibiological products of the next generation. It’s have been demonstrated that Surfactin exhibits antibacterial, antiviral, antitumor, antifungal, anti HIV and some others due to its great surfactant power over all kinds of known membrane cells because of its amphipathic structure form by a ciclopeptide of seven amino acids and a residue of a -hidroxi fatty acid with twelve to sixteen carbon atoms. This amazing biological activity of Surfactin is limited until this moment by its hemolytic action. This work wants to show a novel method to synthetize Surfactin analogues in solution by means of multicomponent reactions trying to keep or to increase the biological activity of Surfactin and to rise its metabolic stability and to reduce its hemophilicity. For this reason were synthetized two heptapeptides and one octapeptide, a lipidic isocyanide from a commercial amine and both fragments were condensed through Ugi-4C or Passerini reaction. This work represents the first report of the use of multicomponent reactions to obtain Surfactin.

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Índice Introducción ...................................................................................................................... 1 1. Revisión bibliográfica .................................................................................................. 5 1.1 Estructura y propiedades químicas de la Surfactina ................................................... 5 1.1.1 Interacción Surfactina-membrana............................................................................ 8 1.1.2 Obstáculos y perspectivas en la producción de Surfactina ...................................... 9 1.1.3 Síntesis total de la Surfactina reportada en disolución ............................................ 9 1.1.4 Síntesis total de la Surfactina reportada en fase sólida .......................................... 10 1.2 Estrategias de acoplamiento peptídico en disolución ............................................... 11 1.3 Reacciones multicomponentes ................................................................................. 17 1.3.1 La reacción de Ugi-4C........................................................................................... 17 1.3.2 La reacción de Passerini-3C .................................................................................. 19 1.4 Métodos de ciclación basados en reacciones multicomponentes ............................. 20 2. Parte experimental ...................................................................................................... 23 2.1 Procedimientos generales ......................................................................................... 23 2.1.1 Equipos, materiales y reactivos ............................................................................. 23 2.1.2 Procedimiento general para los acoplamientos peptídicos .................................... 23 2.1.3 Procedimiento general para la eliminación del grupo Boc. ................................... 24 2.1.3.1 Metodología A .................................................................................................... 24 2.1.3.2 Metodología B .................................................................................................... 24 2.1.4 Procedimiento general para la hidrólisis/desprotección del éster metílico............ 24 2.1.5 Procedimiento general para la hidrólisis/desprotección del éster bencílico .......... 24 2.1.6 Procedimiento general para la obtención de los ciclolipopéptidos mediante la reacción de Ugi-4C ......................................................................................................... 25 2.1.7 Procedimiento general para la obtención de los ciclolipopéptidos mediante la reacción de Passerini ...................................................................................................... 25 2.2 Métodos de síntesis................................................................................................... 26 2.2.1 Síntesis de los fragmentos peptídicos .................................................................... 26 2.2.1.1 Síntesis del dipéptido Boc-Leu-D-Leu-OBzl (1) ............................................... 26 2.2.1.2 Síntesis del tripéptido Boc-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-OBzl (2) ............................. 26 2.2.1.3 Síntesis del tetrapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-OBzl (3) ............... 27 2.2.1.4 Síntesis tetrapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-OH (4) ....................... 28 2.2.1.5 Síntesis del dipéptido Boc-D-Leu-Leu-OBzl (5) ............................................... 29 2.2.1.6 Síntesis del tripéptido Boc-Asp(OMe)-D-Leu-Leu-OBzl (6) ............................ 29 2.2.1.7 Síntesis del tetrapéptido Boc-Val-Asp(OMe)-D-Leu-Leu-OBzl (7) .................. 30 Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

Índice 2.2.2 Síntesis de los esqueletos peptídicos ..................................................................... 31 2.2.2.1 Síntesis del octapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-Val-Asp(OMe)-DLeu-Leu-OBzl (8) ........................................................................................................... 31 2.2.2.2 Síntesis del octapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-Val-Asp(OMe)-DLeu-Leu-OH (9).............................................................................................................. 32 2.2.2.3 Síntesis del heptapéptido Boc-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-Val-Asp(OMe)-D-LeuLeu-OBzl (10) ................................................................................................................ 33 2.2.2.4 Síntesis del heptapéptido Boc-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-Val-Asp(OMe)-D-LeuLeu-OH (11) ................................................................................................................... 35 2.2.3 Síntesis del dodecilisocianuro (12) ........................................................................ 36 2.2.4 Síntesis de los ciclolipopéptidos análogos de la Surfactina .................................. 37 2.2.4.1 Síntesis del ciclolipopéptido 13 .......................................................................... 37 2.2.4.2 Síntesis del ciclolipopéptido 14 .......................................................................... 38 2.2.5.4 Síntesis del ciclolipopéptido 15 .......................................................................... 38 2.2.5.3 Síntesis del ciclolipopéptido 16 .......................................................................... 39 3. Discusión de los resultados......................................................................................... 40 3.1 Metodología de trabajo ............................................................................................. 40 3.2 Síntesis de péptidos en disolución ............................................................................ 43 3.2.1 Síntesis y caracterización del tripéptido Boc-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-OBzl (2) .... 45 3.2.2 Síntesis y caracterización del octapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-ValAsp(OMe)-D-Leu-Leu-OBzl (8) .................................................................................... 48 3.3 Síntesis y caracterización de los ciclolipopéptidos análogos de la Surfactina ......... 52 3.3.1 Síntesis de los ciclolipopéptidos 13 y 14 ............................................................... 53 3.3.2 Síntesis del ciclolipopéptido 15 ............................................................................. 56 3.3.3 Síntesis del ciclolipopéptido 16 ............................................................................. 57 3.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana de los ciclolipopéptidos sintetizados. ... 59 Conclusiones................................................................................................................... 61 Recomendaciones ........................................................................................................... 62 Referencias ..................................................................................................................... 63 Anexos...………………………………………………………………………………..68

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Introducción Introducción En la actualidad, la demanda constante de nuevos agentes terapéuticos se ha dirigido hacia el campo de los productos antimicrobianos de origen natural. Estos compuestos son sintetizados por todas las formas de vida y tienen importantes aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. Gracias a estas propiedades los productos naturales y sus derivados son considerados a nivel mundial como una solución potencial para las infecciones causadas por hongos, el tratamiento a las enfermedades que atentan contra la vida y el creciente problema de la resistencia a los antibióticos convencionales debido al empleo desmedido y sin prescripción médica por parte de la población. Los productos naturales presentan un espectro de actividad biológica in vitro muy prometedor y dentro de ellos se destacan los ciclolipopéptidos. La ausencia de residuos C- y N- terminal ionizados y la presencia de un residuo lipídico en su estructura le permiten a estos compuestos traspasar las membranas de un modo más fácil, les confiere una mayor estabilidad a la degradación enzimática y una mayor biodisponibilidad oral. La ciclación, además, reduce considerablemente la flexibilidad conformacional del esqueleto peptídico lo cual facilita la determinación de la estructura biológica tridimensional de los compuestos activos.1 Entre las propiedades más significativas de los ciclolipopéptidos se encuentran: su poder surfactante y antimicrobiano y sus propiedades citotóxicas. Muchos de estos compuestos presentan además actividad antiviral, anticancerígena, antifúngica y han logrado comercializarse como principios activos de algunos antibióticos, este es el caso de la Daptomicina, la Caspofungina, la Micafungina, la Anidulafungina, la Micosubtilina, la Friulimicina y la Surfactina (Figura 1).

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1

Introducción

Daptomicina

Surfactina

Friulimicina

Micosubtilina

Figura 1 Algunos ciclolipopéptidos empleados como fármacos Además de la industria farmacéutica, los ciclolipopéptidos también han encontrado aplicaciones en la industria de los cosméticos, en la producción de alimentos y en la biotecnología gracias a sus propiedades antiarrugas y biosurfactantes.2 A pesar de las propiedades presentadas, el uso de los ciclolipopéptidos como fármacos, específicamente el uso de la Surfactina, se ve muy limitado debido a su pobre biodisponibilidad oral, su baja estabilidad metabólica y su gran poder hemolítico.3 De cara a contrarrestar las limitaciones mencionadas anteriormente se han desarrollado durante las últimas décadas gran variedad de compuestos que mimetizan la estructura de péptidos naturales sin perder la actividad biológica deseada, esto se logra incluyendo Nsustituciones y disminuyendo la hidrólisis de los residuos C- y N- terminales mediante la ciclación.4 La introducción de una sustitución en el átomo de nitrógeno de la amida reduce el número de enlaces por puente de hidrógeno intramoleculares, mejorando la permeabilidad de membranas por difusión pasiva debido a un aumento de la lipofilicidad. Esta modificación también estabiliza a los péptidos frente a la acción de las proteasas, ampliando así su potencial farmacológico. Adicionalmente, se ha observado que la Nalquilación de péptidos (tanto por la presencia de prolina como N-metilación) reduce la diferencia de energía entre la configuración s-cis y s-trans del enlace amida, lo que Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Introducción provoca cambios conformacionales y mayor interconversión comparado con el péptido de partida. Estas características hacen de un péptido N-alquilado un compuesto de partida excelente para el desarrollo de productos líderes en química medicinal. Además la síntesis de análogos cíclicos de péptidos lineales permite constreñir la molécula a un número determinado de conformaciones por enlaces covalentes de partes distantes de sus estructura, disminuyendo el costo entrópico para alcanzar la conformación necesaria para realizar una función biológica determinada. En el caso de la síntesis en el laboratorio, la ciclación se ve favorecida introduciendo en la secuencia peptídica D-aminoácidos. La posibilidad de combinar estructuras cíclicas y N-sustituciones en un esqueleto peptídico representa una interesante propuesta para el diseño de potenciales compuestos terapéuticos. Las reacciones multicomponentes insertadas en los diseños de síntesis de péptidos en disolución o en fase sólida podrían ser una alternativa para obtener estructuras peptídicas que en un futuro fuera necesario ciclar; pues en algunas de estas reacciones, como la reacción de Ugi, se obtiene una N-sustitución que aumenta la flexibilidad del esqueleto peptídico convirtiéndose en una herramienta que favorece la ciclación. Otras ventajas de estas reacciones son la gran eficiencia química y la economía de átomos ya que generan más de 2 enlaces covalentes en un solo paso de síntesis así como su fácil implementación: temperatura ambiente, sin atmósfera inerte, etanol o metanol como disolvente y agua como único producto colateral. Algo muy importante en la estructura de los ciclolipopéptidos lo constituye el residuo lipídico, esta sección le confiere a estos compuestos la capacidad de interactuar con las membranas de un modo más fácil gracias a la lipofilicidad de ambas partes. Esta interacción posibilita la formación de poros en las membranas lo que, junto a otros procesos, conduce a la muerte celular de los microorganismos. Las reacciones de Ugi y Passerini permiten introducir estos residuos en la estructura que se pretende obtener si se emplean isocianuros lipídicos en dichas reacciones. Debido a las características de los ciclolipopéptidos antes mencionadas y a su potencial uso como principios activos de los antibióticos de la próxima generación se plantea como problema científico la necesidad de obtener análogos de la Surfactina que mantengan o mejoren su actividad biológica y disminuyan su poder hemolítico para ser usados como fármacos antimicrobianos. Para dar respuesta a este problema fundamental nos

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Introducción planteamos como hipótesis que mediante el diseño de metodologías de síntesis química basadas en reacciones multicomponentes es posible obtener análogos de la Surfactina que conserven su actividad biológica. Debido a la presencia de modificaciones en el enlace peptídico y en el residuo lipídico introducidas mediante este tipo de reacciones es lógico esperar que la biodisponibilidad de estos análogos sea superior a la del producto natural. Por lo antes planteado el objetivo general de este trabajo es desarrollar una metodología basada en el uso de reacciones multicomponentes para la síntesis de análogos bioactivos de la Surfactina. Este objetivo estará sustentado bajo los siguientes objetivos específicos:  Sintetizar los precursores peptídicos lineales empleando metodologías de síntesis de péptidos en disolución.  Obtener análogos de la Surfactina a partir de la reacción de Ugi-3C4C entre péptidos lineales e isonitrilos lipídicos.  Obtener un análogo de la Surfactina a partir de la reacción de Passerini entre un péptido lineal N-funcionalizado y un isonitrilo lipídico.  Caracterizar los compuestos obtenidos mediante técnicas espectroscópicas (RMN) y espectrometría de masas (ESI-MS).  Evaluar cómo influyen la naturaleza del enlace amida N-sustituido así como el número de residuos lipídicos presentes en la estructura del ciclolipopéptido en la actividad biológica de los análogos sintetizados. Este trabajo tiene como novedad el empleo de las reacciones multicomponentes de Ugi y Passerini por primera vez en la síntesis de análogos de un ciclolipopéptido de origen natural, las cuales nos permiten incorporar el residuo lipídico y ciclar el péptido en un solo paso de reacción.

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Revisión bibliográfica 1. Revisión bibliográfica Uno de los principales representantes de la familia de los ciclolipopéptidos aniónicos es la Surfactina. Esta molécula se extrajo por primera vez del cultivo de la bacteria Bacillus subtillis y lleva su nombre debido a su excepcional poder biosurfactante. La Surfactina se descubrió en 1968 por Arima y col.5 y su estructura molecular se definió en 1969 por Kakinuma y col. 6 Se sabe que la Surfactina posee una gran anfifilicidad y una fuerte tendencia a la autoagregación, es debido a estas características que la Surfactina muestra excepcionales propiedades superficiales, interfaciales y de membrana, lo que conduce a un gran número de promisorias aplicaciones de gran impacto en el cuidado de la salud y en la biotecnología. Estas propiedades convierten a la Surfactina en un fuerte candidato para ser usado como fármaco en la resolución de variados problemas en el campo de la medicina7, la industria8, 9 y en la protección del medio ambiente.10 1.1 Estructura y propiedades químicas de la Surfactina La Surfactina (MW = 1036 Da), es un ciclolipopéptido anfipático que está constituido por la secuencia heptapeptídica –Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu– enlazada a un ácido graso -hidroxilado cuya cadena carbonada varía su longitud desde 12 hasta 16 átomos de carbono para formar una lactona y donde el carbono 3 de la cadena del ácido graso posee la configuración R. Los residuos de los aminoácidos hidrofóbicos (L- y D- leucinas y valina) se encuentran en las posiciones 2, 3, 4, 6 y 7; mientras que los residuos hidrofílicos (ácidos glutámico y aspártico) se encuentran en las posiciones 1 y 5 respectivamente. Estos residuos introducen dos cargas negativas en la molécula lo que permite una interacción mucho más específica con las bacterias del tipo Gram-positivas (Figura 2). En las células de los microorganismos que producen Surfactina existen varias estructuras isomórficas de esta molécula, algunas con la secuencia peptídica alterada y otras con variaciones en la cadena lipídica. Estas diferencias no solo dependen de las cepas de la bacteria que se usaron para su producción sino también de las condiciones de cultivo.11, 12, 13

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Revisión bibliográfica

Figura 2 Estructura primaria de la Surfactina La estructura tridimensional de la Surfactina (Figura 3) se determinó mediante la técnica de 1H-RMN de alta resolución combinada con técnicas de imaginología. A un lado de la molécula, los residuos 2 y 6 están de frente, siendo vecinos de los residuos de ácido glutámico 1, y de ácido aspártico 5. Del otro lado, el residuo 4 se encuentra al frente de la conexión con la cadena lipídica, un gran dominio hidrofóbico. Este dominio también contiene las cadenas laterales de los residuos 3 y 7, los cuales contribuyen en una menor medida a la extensión del mismo, así como a la naturaleza anfifílica y a las fuertes propiedades surfactantes de la Surfactina.

Figura 3 Estructura tridimensional de la Surfactina (azul=Glu; anaranjado=Leu; morado=Val; rojo=Asp y blanco=residuo lipídico)

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Revisión bibliográfica La forma en que la Surfactina se dispone en disolución y la conformación que esta adopta en las condiciones de agregación, justifican sus propiedades fisicoquímicas y su actividad biológica. La Surfactina adopta varios giros  formando una hoja  con características de silla de montar, esta conformación es probablemente la responsable del amplio espectro de actividades biológicas exhibidas por la Surfactina incluso a bajas concentraciones. El giro  se puede formar a través de un enlace de hidrógeno intramolecular, mientras que la formación de la hoja  depende de la formación de un enlace por puente de hidrógeno intermolecular. 14 ,

15 , 16

Los dos residuos cargados negativamente están

dispuestos al mismo lado de la hoja  y forman una "pinza" confiriéndole una cabeza polar opuesta a los dominios hidrofóbicos. Por debajo de la concentración crítica de micela (CMC), la cadena lipídica se extiende libremente en la disolución, pero aun así participa fuertemente en las interacciones hidrofóbicas de las estructuras supramoleculares tales como: las micelas lipídicas o los oligómeros presentes en la interfase aire/agua. 17 La Surfactina disminuye la tensión superficial del agua desde 72 mN·m-1 hasta 27 mN·m-1 a concentraciones de tan solo 10 mol/L.18 La concentración crítica de micela de la Surfactina varía dependiendo de los métodos y de las condiciones experimentales empleadas, pero oscila entre 7,5 y 20 mol/L. 19 Este valor es dos órdenes de magnitud menor que el de la mayoría de los detergentes. Como consecuencia, el consumo de Surfactina en aplicaciones prácticas puede ser menor en varios órdenes cuando se compara con los surfactantes químicos. La Surfactina tiene una habilidad especial para auto agregarse y formar micelas; a su vez, estas micelas tienden a formar grandes agregados. Las micelas de la Surfactina no poseen tamaños semejantes debido a las diferentes configuraciones que existen y al tipo de contraión presente en el medio: se forman grandes micelas si en el medio hay contraiones divalentes mientras que las micelas son pequeñas si los contraiones son monovalentes.20, 21

También se conoce que el número de agregación es mucho más pequeño que el de los

surfactantes convencionales. La estructura de las micelas es del tipo núcleo-capa (del inglés core-shell), con la cadena lipídica y los residuos hidrofóbicos formando el núcleo de las micelas. 22 Sin embargo, se han encontrado micelas con estructuras esféricas, elipsoidales y/o cilíndricas las cuales pueden contener hasta 170 moléculas de Surfactina (figura 4).16, 18

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Revisión bibliográfica

Figura 4 Micrografía de transmisión electrónica (TEM) de una disolución 0,3 mM de Surfactina en una disolución con buffer fosfato de pH=7,4 También se ha reportado la importancia de la Surfactina en la estimulación y activación de la función biológica que regula la formación de biopelículas alrededor de la bacteria que la sintetiza para su protección contra los agentes externos.23 1.1.1 Interacción Surfactina-membrana El reconocimiento de la interacción entre la Surfactina y la membrana es un prerrequisito esencial para entender su actividad biológica. Las moléculas anfifílicas de la Surfactina desestabilizan la membrana y perturban su integridad.24 Desde que esta observación se realizó, muchos estudios se han centrado en la descripción de la bicapa Surfactinamembrana para documentar esta complejidad excepcional. El mecanismo hipotético de interacción de la Surfactina con la estructura de la membrana exhibe un complejo patrón de efectos, tales como la inserción en la bicapa lipídica, quelatación de cationes mono- y divalentes, modificación de la permeabilidad de la membrana a través de la formación de poros o solubilización de la membrana a través de un mecanismo como el de los detergentes.25 La Surfactina penetra en la membrana lipídica a través de interacciones hidrofóbicas, influenciadas por el ordenamiento de las cadenas hidrocarbonadas y el grosor de la membrana. Después de esta colisión, el ciclopéptido adopta cambios conformacionales para facilitar el proceso de interacción. 26 Una vez incorporada la Surfactina a la membrana, ocurre la deshidratación de las cabezas polares de los fosfolípidos,

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Revisión bibliográfica perturbándose así el empaquetamiento lipídico local y comprometiéndose fuertemente la estabilidad de la bicapa,27 es decir, sus propiedades como barrera.28 Un paso clave en la desestabilización de la membrana es la dimerización de la Surfactina en la bicapa. Estas fluctuaciones estructurales pueden explicar muy bien el modo primario de acción antibiótica y el resto de las propiedades biológicas de este ciclolipopéptido.29 Entre las potenciales aplicaciones biomédicas de la Surfactina a las que hacemos referencia se encuentran antibactericida, antiinflamatoria, antifúngico, antimicoplasma, antiviral, antitumoral, trombolítica y antiparasitaria. 1.1.2 Obstáculos y perspectivas en la producción de Surfactina De forma general, los biosurfactantes obtenidos a partir del cultivo de microorganismos poseen más ventajas que sus análogos químicos, gracias a su mayor diversidad estructural, biodegradabilidad, biocompatibilidad, estabilidad en un variado rango de pH y menor toxicidad. Sin embargo, estos compuestos no han sido ampliamente usados debido a sus altos costos de producción causados fundamentalmente por los bajos rendimientos en su obtención. Limitaciones semejantes dificultan la explotación de las potenciales aplicaciones de la Surfactina en la medicina y en la industria, así como en la protección del medio ambiente. Numerosos estudios se han realizado para optimizar los rendimientos de producción de la Surfactina,30 y se han obtenido grandes resultados si al medio de cultivo se adicionan pequeñas cantidades de sales de hierro.31 Sin embargo, la Surfactina también necesita ajustarse a otros requerimientos adicionales, tales como un conocimiento detallado del mecanismo de interacción con los receptores celulares y los posibles efectos citotóxicos sobre los macroorganismos tratados. Los logros alcanzados por la ingeniería genética y la bioquímica en la producción de análogos de la Surfactina con propiedades modificadas representan una posible solución para el futuro. 1.1.3 Síntesis total de la Surfactina reportada en disolución En enero de 1996 se presentó por primera vez la síntesis en disolución de la surfactina y de algunos análogos. Esta síntesis fue llevada a cabo por Nagai S. y col y se implementó en 16 pasos de reacción.32 Se empleó al grupo tert-Boc para proteger los grupos -amino, el cual se eliminó más tarde con ácido trifluoracético (TFA) anhidro. Los grupos carboxílicos de las cadenas laterales de los aminoácidos Glu y Asp se protegieron en forma de ésteres bencílicos, los cuales se eliminaron mediante hidrogenólisis después de Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Revisión bibliográfica formarse el anillo de lactona. Cada fragmento peptídico protegido se preparó paso a paso, usando ésteres activos, fundamentalmente ésteres N-succinimida. Cada residuo Cterminal del fragmento se protegió con éster bencílico o con Troc-hidrazida, el cual se convirtió en hidrazida previo al paso de condensación mediante el método de la azida (Esquema 1). Este fue el único método empleado para crecer al péptido. Para evitar la racemización, la reacción de ciclación entre el grupo amino del ácido glutámico y el grupo carboxilo del ácido graso hidroxilado se llevó a cabo empleando el método de la activación con éster N-succinimida en un medio bien diluido donde el disolvente empleado fue piridina.

Esquema 1 Metodología de síntesis de la Surfactina reportada en disolución 1.1.4 Síntesis total de la Surfactina reportada en fase sólida En septiembre de 2005 Jean Wallach y colaboradores reportaron por primera vez la síntesis de la Surfactina así como de cuatro análogos en fase sólida. 33 Su objetivo principal fue sintetizar la Surfactina y cuatro análogos más, sustituyendo el gran número de pasos de la síntesis en disolución y la necesidad de purificar cada intermediario, por un método mucho más rápido. La síntesis se desarrolló empleando el método Fmoc, la resina usada fue la Sasrina y la ciclación se llevó a cabo a alta dilución. Los cuatro análogos sintetizados siguiendo la metodología empleada fueron [D-Leu2]-, [Asn5]-, Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Revisión bibliográfica [Nle2, 4, 7]- y [Asp4, Leu5]-Surfactina, en cada análogo se mantuvo invariable el resto de la estructura de la Surfactina (Esquema 2). Estas sustituciones permitieron realizar estudios de relación estructura–actividad variando la secuencia peptídica y el largo de la cadena hidrocarbonada. Los autores también observaron que el paso final de ciclación depende fuertemente de la secuencia peptídica, probablemente debido a que las nuevas conformaciones difieren significativamente de la estructura nativa de la Surfactina.

Esquema 2 Metodología de síntesis de la Surfactina en fase sólida 1.2 Estrategias de acoplamiento peptídico en disolución Un dipéptido es preparado mediante la reacción entre dos aminoácidos, pero para realizar un acoplamiento correcto es necesario que cada aminoácido tenga libre uno de sus dos grupos funcionales (el grupo amino de uno y el carboxilo del otro) pues de no ser así se producirían cuatro productos o una polimerización descontrolada y la separación de los mismos sería muy trabajosa lo que significaría pérdidas excesivas en la purificación por columna o la necesidad de usar temprano un HPLC. Para solucionar este problema, en el mercado se venden los aminoácidos protegidos por uno de sus extremos (o podemos Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Revisión bibliográfica protegerlos nosotros mismos en el laboratorio), para ello se modifica al grupo amino o al grupo carboxilo con funciones químicas que no permiten la participación de dicho grupo en el acoplamiento peptídico (Esquema 3). Estas funciones o grupos protectores pueden permanecer en el esqueleto peptídico por innumerables pasos o ser eliminados fácilmente una vez terminada la reacción de acoplamiento.

Esquema 3 Acoplamiento peptídico Los grupos protectores del grupo amino más utilizados son los carbamatos, como el fluorenil-9-metoxicarbonilo (Fmoc), el t-butoxicarbonilo (Boc) o el benciloxicarbonilo (Z o Cbz). Estos grupos pueden ser eliminados con facilidad de forma ortogonal (se puede desproteger uno sin que el otro se altere) cuando no son necesarios. Los ácidos carboxílicos se protegen comúnmente en forma de ésteres (de metilo, de bencilo o de tertbutilo). 34 En las tablas 1 y 2 se muestran los grupos protectores anteriormente mencionados así como las condiciones necesarias para la protección y para la desprotección de los grupos amino y carboxilo. Tabla 1. Grupos protectores del extremo N- más usados en la síntesis de péptidos Grupos protectores de la función amino tipo carbamato Condiciones de Condiciones de Nombre Simbolo fórmula protección desprotección Piperidina; DBU; Fluorenil-9Fmoc-Cl; Fmoc 2-aminoetanol; metoxicarbonilo Fmoc-OSu morfolina; NH3 (liq) TFA; tertBoc-N3/base; Boc TFA/CH2Cl2; butoxicarbonilo Boc2O/NaOH HCl/dioxano Benciloxi carbonilo

Z o Cbz

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

BnOCOCl/base; BnOCOOC6H4p-NO2

H2/Pd; HBr/AcOH; Na/NH3 (liq)

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Revisión bibliográfica Tabla 2. Grupos protectores del extremo C- más usados en la síntesis de péptidos Grupos protectores de la función carboxilo tipo éster Metilo

Me

MeOH/SOCl2; MeOH/ácido

Bencilo

Bzl

BnOH/ácido

tert-butilo

tBu

Isobuteno/ácido

Hidrolisis alcalina o enzimática H2/Pd; HBr/AcOH; hidrólisis alcalina; HF (liq) TFA; HCl/AcOH; BF3OEt2/AcOH; HBr/AcOH

Para la síntesis de péptidos en disolución existen dos vías fundamentales, la síntesis lineal o la síntesis empleando bloques moleculares, síntesis por fragmentos o síntesis convergente. La síntesis lineal consiste en crecer el péptido por el extremo N- (para evitar la racemización del carbono quiral que poseen estas estructuras, excepto en el aminoácido glicina); de este modo se comienza sintetizando un dipéptido, se desprotege dicho extremo N-, se realiza otro acoplamiento, se desprotege y otro acoplamiento, y así sucesivamente. Este método tiene como limitaciones que luego de un tercer acoplamiento el tetrapéptido obtenido se encuentra muy impuro por lo que se requiere de una purificación intermedia. Debido a estas purificaciones intermedias a medida que la cadena peptídica crece los rendimientos en las síntesis disminuyen siendo muy poco útil desde el punto de vista sintético emplear este método para obtener péptidos de gran tamaño en el laboratorio, la mejor alternativa en estos casos es la síntesis en fase sólida. La síntesis empleando bloques moleculares se basa en la obtención de péptidos de pequeño tamaño (dipéptidos o tripéptidos) mediante síntesis lineal y luego mediante un acoplamiento peptídico unir estos fragmentos posibilitando un crecimiento peptídico más rápido y permitiendo obtener al producto deseado con una mayor pureza. El aspecto más importante en la síntesis de péptidos es, sin dudas, la formación del enlace amida.

Se puede pensar que la reacción entre el grupo amino (nucleófilo) de un

aminoácido y el grupo carboxilo (electrófilo) del otro origina la correspondiente amida fácilmente, pero la verdad no ocurre así, sino que solamente se forma la sal de amonio. Para lograr generar el enlace peptídico es preciso aumentar la electrofilicidad del grupo Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Revisión bibliográfica carboxilo y convertir el grupo hidroxilo del ácido carboxílico en un mejor grupo saliente, esto se logra mediante un proceso de activación. De esta forma el ataque del grupo amino del otro aminoácido será más fácil. El proceso de activación se puede realizar previo al acoplamiento o se puede realizar “in situ”. Este último método es el más usado por sus grandes ventajas y los reactivos involucrados pueden ser: carbodiimidas, sales de fosfonio o sales de uronio/aminio (Figura 5). PyBroP: X=Br...

PyClU:

Y=PF6  PyCloP:

Y=PF6 …

X=Cl...

HAPyU: X=OAt

Y=PF6  sales de fosfonio

X=Cl…...

Y= PF6 … carbodiimidas

sales de uronio/aminio

Figura 5 Grupos activantes del grupo carboxilo. El método tradicional para activar grupos carboxilos es el de las carbodiimidas (Figura 6).

Los

representantes

más

ampliamente

usados

de

esta

familia

son

la

dicilohexilcarbodiimida (DCC) y la diisopropilcarbodiimida (DIC), aunque la DCC es la más usada ya que es más soluble en los disolventes empleados para la síntesis de péptidos y además su subproducto (diciclohexilurea) precipita del medio de reacción por lo que es fácilmente separable. También se está comenzando a emplear la 1-etil-3-(3´dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), este representante es soluble en agua, por lo que su exceso y subproducto pueden ser separados de la fase orgánica lavando a esta con porciones de agua. Esta carbodiimida se puede emplear en los acoplamientos en disolución acuosa.

DCC

DIC

EDC

Figura 6 Carbodiimidas comúnmente usadas La activación del grupo carboxilo empleando carbodiimidas transcurre por un mecanismo complicado, en el que intervienen una gran cantidad de intermediarios y además es dependiente del disolvente empleado en la reacción (Esquema 4). Se admite que el primer Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Revisión bibliográfica paso es la protonación de la carbodiimida. El par iónico formado entre esta y el carboxilato genera una O-acilurea. Justamente la formación del par iónico intermedio explica por qué la activación del ácido carboxílico transcurre de forma más lenta en presencia de bases. La O-acilurea formada es muy reactiva, debido a su gran poder acilante, y puede ser atacada por el grupo amino del correspondiente aminoácido, por otra molécula del ácido y también intramolecularmente con formación de oxazolonas. La urea formada puede atacar también a la O-acilurea dando lugar a una N-acilurea que puede permanecer sin ser afectada durante la reacción (son mucho menos reactivas), siendo esta la causa principal de la disminución del rendimiento. La formación de estos compuestos indeseados se puede evitar manteniendo la reacción a bajas temperaturas y/o usando un disolvente apolar en el cual son poco solubles. Excepto las N-acilureas, todos los intermediarios formados pueden ser atacados por el nucleófilo (grupo amino del otro aminoácido), en el orden siguiente de reactividad: anhídrido simétrico > O-acilisourea > 2-alcoxy-5(4H)-oxazolonas. Asimismo, se ha observado que cuando se lleva a cabo la activación de ácidos carboxílicos con carbodiimidas en disolventes de baja constante dieléctrica como CHCl3 o CH2Cl2, la formación de la O-acilisourea es más rápida que con disolventes más polares como la DMF.

Esquema 4 Mecanismo del acoplamiento peptídico empleando carbodiimidas Cuando el ácido carboxílico es un dipéptido o un α-aminoácido con un grupo Ncarboxamido (grupo protector, ej. benzoil, acetilo o carbamato), la O-acilisourea puede sufrir una ciclación intramolecular para dar lugar a la 5(4H)-oxazolona mencionada anteriormente. Esta ciclación se observa con mayor facilidad en el primer caso, debido a Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Revisión bibliográfica la mayor nucleofilia del grupo carbonilo de las amidas respecto al de los carbamatos (C). Estos intermediarios pueden sufrir la sustracción del protón alfa con el medio básico y dar lugar a reacciones de racemización (Esquema 5). El grado de racemización dependerá entonces de las velocidades de formación y aminólisis de la oxazolona, cuyo predominio estará determinado fundamentalmente por la relación entre la nucleofilicidad y la basicidad del componente amino.

Esquema 5 Mecanismos de racemización durante el acoplamiento peptídico A) Enolización básica (Act: activante.), B) Formación de oxazolona en dipéptidos C) Formación de oxazolona en amino ácidos protegidos como carbamatos Uno de los métodos para evitar la racemización vía oxazolonas es la utilización de los aminoácidos Gly y Pro o Ala y Arg. Cuando se utilizan otros aminoácidos la racemización es suprimida adicionando a la reacción un derivado de la hidroxilamina, denominados agentes supresores de racemización (HOBt, HOAt, HOSu o HOOBt). Estos nucleófilos reaccionan con la O-acilurea y forman intermediarios acilados tipo éster menos reactivos y por lo tanto, impiden que ocurran reacciones colaterales (reordenamientos, formación de oxazolonas y la deshidratación de asparagina y/o glutamina), ciclaciones y la formación de anhídridos simétricos. Los supresores más comunes son oximas Nsustituidas con grupos electroaceptores que refuerzan el efecto alfa presente entre el nitrógeno y el hidroxilo, lo que las convierte en un excelente nucleófilo y a la vez un buen grupo saliente (Figura 7).

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Revisión bibliográfica

HOBt

HOAt

HOSu

HOOBt

Figura 7 Agentes supresores de racemización más comunes Actualmente existen compuestos que contienen tanto a la carbodiimida como al agente supresor de racemización; estos compuestos se denominan “sales onio”. Entre estos reactivos, las sales de uronio, fosfonio e imonio basadas en HOBt y HOAt han probado ser muy eficientes (Figura 8).35 La utilización de estas moléculas aún es poca ya que son muy costosas y hay muchos procedimientos de síntesis donde se alcanzan muy buenos rendimientos sin la utilización de esta nueva clase de agentes acoplantes.

Figura 8 Agentes acoplantes modernos (tipo sal de uronio) 1.3 Reacciones multicomponentes 1.3.1 La reacción de Ugi-4C La versión más simple de esta reacción multicomponente es la condensación de un aldehído o cetona, una amina primaria, un ácido carboxílico y un isonitrilo para formar un dipéptido N-sustituido (Esquema 6).36

Esquema 6 Reacción de Ugi-4C La reacción transcurre a través de una secuencia de pasos elementales reversibles que culmina con la oxidación irreversible del carbono divalente a tetravalente. Primeramente

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Revisión bibliográfica se forma la correspondiente base de Schiff, seguida de activación mediante protonación por el ácido carboxílico y adición doble de los iones iminio y carboxilato al isonitrilo para dar lugar al -aducto. El paso final es el reordenamiento de Mumm, que se puede considerar como una transacilación intramolecular del nitrógeno de la amina, seguido de la conversión tautomérica de la hidroxilamina en amida (Esquema 7). A pesar de que el orden de adición no se ha determinado, se conoce que la protonación de la imina favorece la adición al isonitrilo debido al aumento de la electrofilicidad del enlace C=N, además de propiciar la desprotonación del carboxilato para generar la especie nucleofílica.

Esquema 7 Mecanismo propuesto para la reacción de Ugi-4C Debido a su carácter iónico, esta reacción se desarrolla mejor si se emplean disolventes polares próticos como el metanol, el etanol, etc. Se ha comprobado además que se obtienen mejores rendimientos si se genera la imina por agitación de la amina y el aldehído en MeOH durante 2h. Debido a que la reacción produce un nuevo centro estereogénico y la misma no es estereoselectiva, el empleo de un compuesto carbonílico proquiral conlleva la formación de mezclas de estereoisómeros, por lo que en muchos casos se emplean paraformaldehído o acetona como compuestos carbonílicos.37 La reacción de Ugi-4C es una alternativa para sintetizar estructuras peptídicas precursoras de compuestos cíclicos pues la N-sustitución aumenta la flexibilidad del esqueleto peptídico convirtiéndose en una herramienta que favorece la ciclación. Otras ventajas de esta reacción como método de ciclación son la gran eficiencia química y economía de átomos (genera 4 enlaces covalentes en un solo paso de síntesis), así como su fácil implementación: temperatura ambiente, sin atmósfera inerte, etanol o metanol como disolvente y agua como único producto colateral.

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Revisión bibliográfica 1.3.2 La reacción de Passerini-3C Esta reacción es también una reacción multicomponente en la que están involucrados tres componentes: un isocianuro, un aldehído o una cetona y un ácido carboxílico para originar una -aciloxiamida (Esquema 8).38, 39, 40 Al emplear la reacción de Ugi como método de ciclación el producto que se obtiene es una lactama mientras que si se emplea la reacción de Passerini el producto cíclico que se obtiene es una lactona.

Esquema 8 Reacción de Passerini-3C La reacción de Passerini es la primera reacción multicomponente basada en un isocianuro y en la actualidad es uno de los pilares de la química combinatoria.41 Existen dos hipótesis para el mecanismo de esta reacción, uno iónico y otro concertado. El mecanismo iónico ocurre en disolventes polares tales como el metanol o el agua. El primer paso es la protonación del grupo carbonilo, después se produce una adición nucleofílica del isocianuro al carbono carbonílico para dar el ion nitrilo 3. Luego se adiciona el carboxilato para dar el intermediario 4. En este intermediario ocurre una transacilación o tautomerización para formar el producto final de la reacción 5 (Esquema 9).

Esquema 9 Mecanismo iónico de la reacción de Passerini

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Revisión bibliográfica El mecanismo concertado transcurre en disolventes no polares y a altos valores de concentración de los reaccionantes. Al inicio se forma un estado de transición producto de una reacción trimolecular donde se suceden una serie de adiciones nucleofílicas. En este estado de transición los átomos involucrados forman un anillo de cinco miembros; posteriormente se origina el intermediario 2. A continuación este intermediario sufre una tautomerización para dar el producto de interés 3, la -aciloxiamida.40 Desde el punto de vista cinético este mecanismo es fácilmente identificable ya que la velocidad de la reacción depende de la concentración de los tres componentes (Esquema 10).

Esquema 10 Mecanismo concertado de la reacción de Passerini Recientemente se desarrolló un catalizador para reacciones de Passerini asimétricas.42 Asimismo se ha investigado que las reacciones de Passerini en solventes polares ocurren más rápido pues los productos al no ser solubles precipitan y por tanto el equilibrio se mantiene constantemente desplazado hacia su formación. Además se han modificado los grupos funcionales que intervienen en la reacción, tal es el caso de la reacción PasseriniDömling donde el ácido carboxílico fue sustituido por un ácido tiocarboxílico para dar como producto final un derivado del tiazol.43 1.4 Métodos de ciclación basados en reacciones multicomponentes Las reacciones multicomponentes han sido empleadas en metodologías de ciclación de diversos tipos de esqueletos químicos. En el caso de los esqueletos peptídicos se tiene que en 1979, Amadeo Failli y col. reportaron por primera vez la ciclación de péptidos empleando la reacción de Ugi-4C.44 Los autores concluyeron en que solo a partir de un hexapéptido se podía lograr la ciclación sin peligro de dimerización. Sin embargo en 2008 Wessjohann y col. lograron sintetizar ciclopeptoides análogos de ciclopentapéptidos tipos RGD.45 El trabajo reportado consistió en crecer un péptido NSíntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Revisión bibliográfica alquilado a través de dos reacciones de Ugi-4C consecutivas mientras que se usaba una tercera para ciclar. En necesario aclarar que la estructura que se creció poseía las funciones amino y ácido (extremos N- y C- del peptoide) por lo que solo se adicionó paraformaldehído y un isocianuro comercial. Además, en 2010 Yudin y colaboradores reportaron la síntesis de esqueletos peptídicos mediante una variante de la reacción de Ugi-4C.46 Igualmente se emplearon los extremos N- y C- del péptido como dos de los componentes de la reacción, en presencia de tertbutilisonitrilo. El compuesto carbonílico en este caso fue un aminoaldehído anfótero, el cual conlleva a la formación de un producto distinto al esperado en la reacción de Ugi convencional. El detalle más importante es que este tipo de proceso provoca una relación diasteromérica elevada, lo que constituye uno de los pocos reportes de una reacción de Ugi asimétrica. Por último, en 2013 se reportó la síntesis de ciclotetrapéptidos a partir de tetrapéptidos lineales empleando la reacción de Ugi-3C4C. Para la ciclación se emplearon como grupos amino y carboxilo tanto los grupos funcionales de los extremos de los péptidos como los de las cadenas laterales de los aminoácidos presentes en la secuencia de estos.47 Otra forma de utilizar las reacciones multicomponentes en la ciclación de esqueletos químicos lo constituyen las MiBs o Macrociclación múltiple multicomponente basada en bloques bifuncionalizados desarrollado por Rivera y col. en el 2005.48 Este procedimiento tiene como base la ejecución simultánea de dos reacciones multicomponentes consecutivas para lograr el ensamblaje de dos esqueletos macrocíclicos bifuncionalizados en un único paso de reacción (Esquema 11).49

Esquema 11 Esquema simplificado de la metodología MiBs Con el objetivo de evitar la polimerización se llevan a cabo dos tareas esenciales: la primera es desarrollar la reacción a alta dilución y la segunda es adicionar los reactivos

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Revisión bibliográfica de forma lenta. Debido a que cada esqueleto es bifuncional, se pueden establecer 6 combinaciones diferentes: diácido/diamina, diácido/diisonitrilo, diamina/diisonitrilo, diamina/dialdehído, diácido/dialdehído, y diisonitrilo/dialdehído. El tipo de sustrato bifuncionalizado puede ser variable por lo que se pueden encontrar sustratos esteroidales, aromáticos, poliéteres, amino ácidos, etc) que se incorporan a la cavidad macrocíclica buscando semejanza con algún producto natural de interés.50 Al emplear péptidos como sustratos bifuncionales se puede obtener un diácido o una diamina y ambos pueden ser originados por los grupos extremos del péptido o por las cadenas laterales que este posea. Las dos combinaciones más exploradas son: diácido/diisonitrilo y diamina/diisonitrilo. De esta forma, los macrociclos resultantes presentan esqueletos peptídicos típicos de compuestos naturales, en los que se mimetizan funciones químicas endo- y exocíclicas, tales como: grupos biaril éter, piperazina, guanidinio, imidazol, y amino-azúcares. Muchas de estas funciones son vitales para alcanzar una apropiada interacción con los receptores proteicos, ya que introducen rigidez conformacional en la cavidad macrocíclica e imponen una pre-organización a las cadenas peptídicas.

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Parte experimental 2. Parte experimental 2.1 Procedimientos generales 2.1.1 Equipos, materiales y reactivos Los espectros de RMN 1H y RMN 13C se registraron a 25 °C en un espectrómetro Varian Mercury 400 a 400/ 600 MHz para los desplazamientos protónicos y a 100 MHz para los desplazamientos de

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C respectivamente. Los desplazamientos químicos protónicos se

reportan en ppm, usando tetrametilsilano como referencia interna; los disolventes empleados fueron CDCl3, DMSO-d6 o MeOH-4d. Los desplazamientos de

13

C se

reportan en ppm y están referidos a la señal de los disolventes CDCl3, DMSO-d6 o MeOD-4d cuyos desplazamientos son 77,16; 39,52 y 49,00 ppm respectivamente. Las constantes de acoplamiento (J) se dan en Hz. Los espectros de masa se registraron en un espectrómetro Bruker Apex 70e de resonancia ion ciclotrón a transformada de Fourier (FT-ICR), dotado de una celda InfinityTM con un magneto superconductor de 7,0 T. Todos los espectros de RMN y ESI-MS se registraron en el Instituto de Bioquímica de las Plantas de Halle, Alemania, como parte de un proyecto de colaboración entre dicha institución y el CEPN. Los productos se purificaron por cromatografía de columna con gel de sílice 60 (Riedel de Haën˂230 mesh). El curso de las reacciones se siguió mediante cromatografía de capa delgada (CCD) en cromatoplacas de gel de sílice 60 F254 (Merck 5x2.5 cm y 5x5 cm). Como agente revelador se empleó una disolución de ácido fosfomolíbdico en EtOH al 5%. Los disolventes utilizados para fines cromatográficos se destilaron y/o desecaron según procedimientos reportados. Los reactivos utilizados para las síntesis proceden de las firmas Merck, Fluka, BDH y Panreac, y son de grado analítico. Los mismos se emplearon en los procedimientos de síntesis sin purificación previa. Todos los compuestos se obtuvieron en forma de sólidos amorfos y no fue posible su cristalización. 2.1.2 Procedimiento general para los acoplamientos peptídicos A una disolución que contiene disuelto el compuesto con el extremo carboxílico libre (1,1 mmol, 1,1 equiv.) en CH2Cl2 seco (4 mL) se adiciona EDC (1,2 mmol, 1,2 equiv.) y HOBt (1,2 mmol, 1,2 equiv.) a 00C. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se agrega el compuesto con el grupo amino libre (1,0 mmol, 1,0 equiv.) y la DIPEA (1,2 mmol, 1,2 equiv.). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante toda la noche. El crudo de reacción se diluye con 40 mL Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental de AcOEt, se transfiere a un embudo separador y se lava secuencialmente con una disolución diluida de HCl (1%) (210 mL), una disolución saturada de NaHCO3 (210 mL), agua y salmuera (10 mL). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4 (anh.), se filtra y se concentra a presión reducida. Los detalles para la purificación se brindan en cada caso. 2.1.3 Procedimiento general para la eliminación del grupo Boc. 2.1.3.1 Metodología A El péptido obtenido (1,0 mmol) se disuelve en 4 mL de una mezcla de TFA/CH2Cl2 (1:3, v/v) y la disolución se agita a temperatura ambiente entre 2 y 4 horas hasta que se compruebe la desaparición del producto de partida por CCD. Luego, la disolución se concentra a presión reducida. El exceso de TFA se extrae con pequeñas porciones de CH2Cl2 (5 mL) seguido de concentración a presión reducida. La sal obtenida se usa en el paso siguiente sin purificar y el rendimiento de la desprotección se considera cuantitativo. 2.1.3.2 Metodología B El péptido obtenido (0,1 mmol) se disuelve en una disolución 4M de HCl en dioxano (2 mL) a 0 0C y la mezcla se agita a temperatura ambiente. Después de 30 min se comprueba mediante CCD la desprotección de todo el material de partida. Una vez concluida la reacción, la disolución se concentra a presión reducida. El residuo se lava con dietiléter (5 mL) hasta la formación de cristales. La sal obtenida se usa en el paso siguiente sin purificar y el rendimiento de la desprotección se considera cuantitativo. 2.1.4 Procedimiento general para la hidrólisis/desprotección del éster metílico El péptido obtenido (1.0 mmol) se disuelve en THF/H2O 2:1 (30 mL) y se le adiciona LiOH (3,0 mmol, 3 equiv.) a 0 C. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 3 h y posteriormente se acidifica con una disolución al 10% de NaHSO4 hasta pH 3. La fase acuosa resultante se extrae con AcOEt (330 mL). Las fases orgánicas obtenidas se combinan, se secan sobre Na2SO4 (anh.) y se concentran a presión reducida para obtener el péptido C-desprotegido. Los detalles para la purificación se brindan en cada caso. 2.1.5 Procedimiento general para la hidrólisis/desprotección del éster bencílico El péptido obtenido (1,0 mmol) se disuelve en la menor cantidad de tetrahidrofurano (THF) o metanol (CH3OH) secos. A continuación se adiciona el catalizador de Pd, 10% Pd(OH)2 en carbón activado (10% de la masa de producto a desproteger) a la disolución y la reacción se implementa bajo atmósfera de H2. La reacción se mantiene con una Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental agitación vigorosa toda la noche. El catalizador se elimina mediante una filtración usando Celite y la disolución se seca sobre Na2SO4 (anh.). El producto final se obtiene al eliminar el disolvente mediante presión reducida, se utiliza en el próximo paso de síntesis sin purificación previa y el rendimiento de la desprotección se considera cuantitativo. 2.1.6 Procedimiento general para la obtención de los ciclolipopéptidos mediante la reacción de Ugi-4C A una disolución que contiene el compuesto con el grupo amino libre (0,10 mmol) disuelto en MeOH (10,0 mL) se le adiciona el aldehído (0,15 mmol; 1,5 equiv.) y Et3N (0,12 mmol; 1,2 equiv.); la mezcla se agita a temperatura ambiente toda la noche. A continuación se diluye la disolución en metanol o en n-hexano (5 mL) y se adiciona el isocianuro lipídico (0,12 mmol; 1,2 equiv.) y la reacción se sigue por CCD durante 72 h. Una vez concluida la reacción, esta se concentra a presión reducida y se redisuelve en AcOEt (10 mL). Posteriormente la disolución se trasvasa a un embudo separador y se lava consecutivamente con una disolución de HCl al 5% (210 mL), una disolución saturada de NaHCO3 (210 mL) y con salmuera (10 mL). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4 (anh.), se filtra y se concentra a presión reducida. El producto se emplea en el próximo paso de reacción sin purificación previa. 2.1.7 Procedimiento general para la obtención de los ciclolipopéptidos mediante la reacción de Passerini Se disuelve el péptido con sus residuos C-terminal libre y N-terminal funcionalizado en forma de carbonilo (0,10 mmol; 1 equiv.) en THF seco (10 mL) y se adiciona el isocianuro lipídico (0,12 mmol; 1,2 equiv.). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 72 h y se sigue por CCD. Una vez concluida la reacción, esta se concentra a presión reducida y se redisuelve en AcOEt (10 mL). Posteriormente la disolución se trasvasa a un embudo separador y se lava consecutivamente con agua (210 mL) y con salmuera (10 mL). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4 (anh.), se filtra y se concentra a presión reducida. El producto se emplea en el próximo paso de reacción sin purificación previa.

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Parte experimental 2.2 Métodos de síntesis 2.2.1 Síntesis de los fragmentos peptídicos 2.2.1.1 Síntesis del dipéptido Boc-Leu-D-Leu-OBzl (1)

Se hacen reaccionar Boc leucina (3,23 g, 13,97 mmol) disuelto en CH2Cl2 (51 mL), HOBt (2,06 g, 15,24 mmol), EDC (2,92 g, 15,24 mmol), p-tosilato de D-leucina metil éster (5,00 g, 12,70 mmol) y DIPEA (1,97 g, 15,24 mmol, 2,59 mL) según el procedimiento para el acoplamiento peptídico descrito en el epígrafe 2.1.2 para obtener el dipéptido 1. El producto se emplea en el próximo paso de síntesis sin purificación previa. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,27 (s, 5H, Ar); 6,63 (s, 1H, NH); 5,07 (q, J = 12,3 Hz, 2H, CH2, -OBzl); 4,81 (d, J = 6,8 Hz, 1H, CH); 4,62 – 4,51 (m, 1H, CH); 4,08 (s, 1H, NH); 1,58 (m, 4H); 1,53 – 1,45 (m, 2H); 1,37 (s, 9H, 3CH3, Boc); 0,85 (s, 12H, 4×CH3). RMN-13C (100 MHz, CDCl3) δ 172,77; 172,53; 155,76 (CO); 135,51 (C, Ar); 128,68; 128,47; 128,30 (CH, Ar); 80,28 (C, Boc); 67,11 (CH2, -OBzl); 53,16; 50,89 (CH); 41,41; 41,10 (CH2); 28,37 (3CH3, Boc); 24,92; 24,89 (CH); 23,09; 22,95 (CH3); 21,92 (2CH3). MS (ESI) m/z: 457,2 [M+Na]+; calculada para C24H38N2NaO5: 457,27 2.2.1.2 Síntesis del tripéptido Boc-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-OBzl (2)

El dipéptido 1 crudo (5,22 g, 12 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (27 mL) y se desprotege el residuo N-terminal según el procedimiento para la eliminación del grupo Boc descrito en Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental el epígrafe 2.1.3.1. A continuación se hacen reaccionar Boc-ácido glutámico (metil éster) (3,45 g, 13,20mmol) disuelto en CH2Cl2 (48 mL), HOBt (1,95 g, 14,40 mmol), EDC (2,76 g, 14,40 mmol), el dipéptido 1 con el grupo amino libre (5,38 g, 12,00 mmol) y DIPEA (1,86 g, 14,40 mmol, 2,45 mL) según el procedimiento para el acoplamiento peptídico descrito en el epígrafe 2.1.2 para obtener el tripéptido 2. El producto se purifica mediante cromatografía líquida en columna empleando un gradiente isocrático de n-hexano/AcOEt 2:1, Rf = 0,35. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,31 – 7,20 (m, 5H, Ar); 6,96 (t, J = 8,5 Hz, 1H, NH); 6,73 (s, 1H, NH); 5,50 (s, 1H, NH); 5,05 (dd, J = 27,3; 12,3 Hz, 2H, -OBzl); 4,51 (dd, J = 14,7, 7,4 Hz, 1H, CH); 4,43 (td, J = 8,8, 5,2 Hz, 1H, CH); 4,04 (d, J = 6,2 Hz, 1H, CH); 3,59 (d, J = 2,5 Hz, 3H, -OMe); 2,43 – 2,30 (m, 2H); 2,03 (dt, J = 19,8, 6,2 Hz, 1H); 1,88 (dt, J = 14,3, 7,2 Hz, 1H); 1,70 – 1,49 (m, 6H); 1,35 (s, 9H); 0,87 – 0,79 (m, 12H). RMN-13C (100 MHz, CDCl3) δ 174,01; 172,67; 171,87; 171,75; 156,07 (CO); 135,58 (C, Ar); 128,58; 128,33; 128,18 (CH, Ar); 80,45 (C); 66,92 (CH2, -OBzl); 54,41 (CH3, OMe); 51,96; 51,75; 51,03 (CH); 40,78; 40,56; 30,38 (CH2); 28,34 (3CH3,Boc); 27,24 (CH2); 24,82; 23,86 (CH); 23,08; 22,90; 21,78; 21,71 (CH3). MS (ESI) m/z: 599,9 [M+Na]+; calculada para C30H47N3NaO8: 600,33 2.2.1.3 Síntesis del tetrapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-OBzl (3)

El tripéptido 2 (500 mg, 0,87 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (3 mL) y se desprotege el residuo N-terminal según el procedimiento para la eliminación del grupo Boc descrito en el epígrafe 2.1.3.1. A continuación se hacen reaccionar Boc- alanina (182 mg, 0,96 mmol) disuelto en CH2Cl2 (3,5 mL), HOBt (141 mg, 1,04 mmol), EDC (200 mg, 1,04 mmol), el tripéptido 2 con el grupo amino libre (515 mg, 0,87 mmol) y DIPEA (135 mg, 1,04 mmol, 0,18 mL) según el procedimiento para el acoplamiento peptídico descrito en el epígrafe 2.1.2 para obtener el tetrapéptido 3. El producto se purifica mediante Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental cromatografía líquida en columna empleando un gradiente isocrático de AcOEt/CH2Cl2 3:2, Rf = 0,49. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,25 (s, 5H, Ar); 6,97 (d, J = 6,54 Hz, 2H, 2xNH); 5,05 (q, J = 12,4 Hz, 2H, -OBzl); 4,52 (s, 2H, 2xCH); 4,42 (s, 1H, CH); 3,58 (s, 3H, -OCH3); 3,28 (s, 2H); 2,38 (s, 4H); 1,97 (d, J = 38,8 Hz, 2H); 1,73 – 1,64 (m, 1H); 1,55 (m, 4H); 1,35 (s, 9H, Boc); 1,25 – 1,15 (m, 1H); 0,84 (d, J = 5,9 Hz, 12H, 4CH3). RMN-13C (100 MHz, CDCl3) δ 174,17; 173,06; 172,70; 171,99; 171,22; 156,43 (CO); 135,55 (C, Ar); 128,64; 128,40; 128,19 (CH, Ar); 79,47 (C, Boc); 67,03 (CH2, -OBzl); 53,51 (CH3, -OMe); 52,06; 51,65; 51,05 (CH); 40,80; 40,71; 37,18; 36,27; 30,43 (CH2); 28,52 (3CH3, Boc); 27,36 (CH2); 25,04; 24,94 (CH); 23,04; 22,98; 21,94; 21,71 (CH3). MS (ESI) m/z: 671,2 [M+Na]+; calculada para C33H52N4NaO9: 671,36 2.2.1.4 Síntesis tetrapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-OH (4)

El tetrapéptido 3 (382 mg, 0,59 mmol) se disuelve en metanol (18 mL) y se adiciona el catalizador de Pd/C (38 mg) para desproteger el extremo C- según el procedimiento para la eliminación del grupo bencilo descrito en el epígrafe 2.1.5. De esta forma se obtiene el tetrapéptido 4. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,71 (s, 1H, NH); 7,51 (s, 2H, 2xNH); 4,59 (s, 1H, CH); 4,52 – 4,39 (m, 2H, 2xCH); 3,59 (s, 3H, -OMe); 3,30 (s, 2H); 2,37 (d, J = 6,4 Hz, 4H); 2,08 – 1,85 (m, 2H); 1,69 – 1,56 (m, 5H); 1,36 (s, 9H, Boc); 1,25 – 1,16 (m, 1H); 0,91 – 0,79 (m, 12H, 4CH3). RMN-13C (100 MHz, CDCl3) δ 175,50; 174,24; 172,77; 172,54; 172,03; 156,79 (CO); 79,89 (C, Boc); 53,21 (CH3, -OMe); 52,09; 51,61; 51,20 (CH); 40,63 (2xCH2); 37,17; 36,17; 30,31 (CH2); 28,52 (3CH3, Boc); 27,66(CH2); 25,06; 25,00 (CH); 23,07; 22,90; 22,17; 21,71 (CH3). MS (ESI) m/z: 581,2 [M+Na]+; calculada para C26H46N4NaO9: 581,32 Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental 2.2.1.5 Síntesis del dipéptido Boc-D-Leu-Leu-OBzl (5)

Se hacen reaccionar Boc-D-leucina (2,75 g, 11,88 mmol) disuelto en CH2Cl2 (43 mL), HOBt (1,75 g, 12,96 mmol), EDC (2,48 g, 12,96 mmol), p-tosilato de L-leucina bencil éster (4,25 g, 10,80 mmol) y DIPEA (1.68 g, 12,96 mmol, 2,21 mL) según el procedimiento para el acoplamiento peptídico descrito en el epígrafe 2.1.2 para obtener el dipéptido 5. El producto se emplea en el próximo paso de síntesis sin purificación previa. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,26 (s, 5H, Ar); 6,65 (s, 1H, NH); 5,07 (q, J = 12,3 Hz, 2H, CH2, -OBzl); 4,84 (s, 1H, CH); 4,56 (s, 1H, CH); 4,08 (s, 1H, NH); 1,66 – 1,45 (m, 6H); 1,36 (s, 9H, 3CH3, Boc); 0,84 (s, 12H, 4CH3). RMN-13C (100 MHz, CDCl3) δ 172,76; 172,53; 155,77 (CO); 135,50 (C, Ar); 128,67; 128,45; 128,28 (CH, Ar); 80,24 (C, Boc); 67,09 (CH2, -OBzl); 53,15; 50,87 (CH); 41,39; 41,08 (CH2); 28,36 (3CH3, Boc); 24,90; 24,88 (CH); 23,07; 22,94; 21,98; 21,90 (CH3). MS (ESI) m/z: 457,2 [M+Na]+; calculada para C24H38N2NaO5: 457,27 2.2.1.6 Síntesis del tripéptido Boc-Asp(OMe)-D-Leu-Leu-OBzl (6)

El dipéptido 5 crudo (4,29 g, 9,87 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (30 mL) y se desprotege el residuo N-terminal según el procedimiento para la eliminación del grupo Boc descrito en el epígrafe 2.1.3.1. A continuación se hacen reaccionar Boc-ácido aspártico (metil éster) (2,68 g, 10,84 mmol) disuelto en CH2Cl2 (40 mL), HOBt (1,60 g, 11,82 mmol), EDC (2,27 g, 11,82 mmol), el dipéptido 5 con el grupo amino libre (4,42 g, 9,85 mmol) Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental y DIPEA (1,53 g, 11,82 mmol, 2,01 mL) según el procedimiento para el acoplamiento peptídico descrito en el epígrafe 2.1.2 para obtener el tripéptido 6. El producto se purifica mediante cromatografía líquida en columna empleando un gradiente isocrático de nhexano/AcOEt 2:1, Rf = 0,32. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,27 (s, 5H, Ar); 6,83 (s, 1H, NH); 6,67 (s, 1H, NH); 5,51 (s, 1H, NH); 5,07 (q, J = 12,3 Hz, 2H, CH2, -OBzl); 4.55 (m, 1H, CH); 4,43 (m, 2H, 2CH); 3,59 (s, 3H, -OMe); 3,08 – 2,98 (m, 1H); 2,69 (dd, J = 17,4, 5,2 Hz, 1H); 1,79 – 1,69 (m, 1H); 1,60 – 1,44 (m, 5H); 1,39 (s, 9H, 3CH3, Boc); 0,84 (m, 12H, 4CH3). RMN-13C (100 MHz, CDCl3) δ 172,95; 172,55; 171,73; 171,07; 155,46 (CO); 135,58 (CH, Ar); 128,61; 128,39; 128,23 (CH, Ar); 81,00 (C, Boc); 66,97 (CH2, -OBzl); 52,17 (CH3, -OMe); 51,83 (CH); 50,98 (2CH); 40,93; 40,25; 36,02 (CH2); 28,31 (3CH3, Boc); 24,87; 24,76 (CH); 23,19; 22,87; 21,84; 21,64 (CH3). MS (ESI) m/z: 586,2 [M+Na]+; calculada para C29H45N3NaO8: 586,31 2.2.1.7 Síntesis del tetrapéptido Boc-Val-Asp(OMe)-D-Leu-Leu-OBzl (7)

El tripéptido 6 (4,0 g, 7,1 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (21,3 mL) y se desprotege el residuo N-terminal según el procedimiento para la eliminación del grupo Boc descrito en el epígrafe 2.1.3.1. A continuación se hacen reaccionar Boc-valina (1,65 g, 7,59 mmol) disuelto en CH2Cl2 (28 mL), HOBt (1,12 g, 8,28 mmol), EDC (1,59 g, 8,28 mmol), el tripéptido 6 con el grupo amino libre (3,99 g, 6,90 mmol) y DIPEA (1,07 g, 8,28 mmol, 1,41 mL) según el procedimiento para el acoplamiento peptídico descrito en el epígrafe 2.1.2 para obtener el tetrapéptido 7. El producto se purifica mediante cromatografía líquida en columna empleando un gradiente isocrático de n-hexano/AcOEt 1:1, Rf = 0,35. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,26 (m, 5H, Ar); 7,04 – 6,89 (m, 2H, 2NH); 5,06 (q, J = 12,4 Hz, 2H, CH2, -OBzl); 4,76 (dt, J = 8,5, 5,2 Hz, 1H, CH); 4,54 (m, 1H, CH), 4,43 (m, 1H, CH); 3,91 (d, J = 5,3 Hz, 1H, CH); 3,61 (s, 3H, OMe); 3,06 (dd, J = 17,3, 4.3 Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental Hz, 1H); 2,68 (dd, J = 17,4, 5,6 Hz, 1H); 2,11 – 2,04 (m, 1H); 1,68 – 1,62 (m, 1H); 1,58 – 1,49 (m, 5H); 1,36 (s, 9H, 3CH3, Boc); 0,89 (m, 3H, CH3); 0,82 (m, 15H, 5CH3). RMN-13C (100 MHz, CDCl3) δ 172,69; 172,45; 171,86; 171,75; 170,59; 156,51 (CO); 135,68 (C, Ar); 128,61; 128,34; 128,14 (CH, Ar); 80,71 (C, Boc); 66,81 (CH2, -OBzl); 60,57 (CH); 52,20 (CH3, -OMe); 52,16; 50,93; 49,44 (CH); 41,10; 40,18; 36,01(CH2); 30,73 (CH); 28,43 (3CH3, Boc); 24,79; 24,75 (CH); 23,27; 22,85; 21,94; 21,48; 19,43; 17,76 (CH3). MS (ESI) m/z: 685,6 [M+Na]+; calculada para C34H54N4NaO9: 685,38 2.2.2 Síntesis de los esqueletos peptídicos 2.2.2.1 Síntesis del octapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-Val-Asp(OMe)-DLeu-Leu-OBzl (8)

El tetrapéptido 7 (1,02 g, 1,54 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (4,6 mL) y se desprotege el residuo N-terminal según el procedimiento para la eliminación del grupo Boc descrito en el epígrafe 2.1.3.1. A continuación se hacen reaccionar el tetrapéptido 4 (312,9 mg, 0,56 mmol) disuelto en CH2Cl2 (2,1 mL), HOBt (82,43 mg, 0,61 mmol), EDC (116,9 mg, 0,61 mmol), el tetrapéptido 7 con el grupo amino libre (345,1 mg, 0,51 mmol) y DIPEA (78,84 mg, 0,61 mmol, 0,10 mL) según el procedimiento para el acoplamiento peptídico descrito en el epígrafe 2.1.2 para obtener el octapéptido 8. El producto crudo se purifica mediante recristalización de la mezcla de disolventes n-hexano/MeOH /CH2Cl2 (6:1:3).

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,27 (dd, J = 10,6, 7,8 Hz, 2H, 2NH); 8,12 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH); 8,05 (d, J = 7,7 Hz, 1H, NH); 7,99 (d, J = 7,6 Hz, 1H, NH); 7,85 (d, J = 8,2 Hz, 2H, 2NH); 7,41 – 7,30 (m, 5H, Ar); 6,68 (s, 1H, NH); 5,11 (s, 2H, CH2, OBzl); 4,63 (dd, J = 13,8, 7,4 Hz, 1H, CH); 4,38 – 4,30 (m, 3H, 3CH); 4,29 – 4,24 (m, 2H, 2CH); 4,11 (dd, J = 14,0, 5,9 Hz, 1H, CH); 3,57 (s, 3H, CH3, -OMe); 3,56 (s, 3H, CH3, -OMe); 3,12 (dd, J = 12,7, 6,3 Hz, 2H); 2,71 (dd, J = 11,5, 7,0 Hz, 2H); 2,31 (dd, J = 16,7, 8,6 Hz, 4H); 2,00 (dt, J = 19,2, 6,1 Hz, 2H); 1,94 – 1,86 (m, 2H); 1,75 (dt, J = 15,6, 8,1 Hz, 2H); 1,56 (dd, J = 9,1, 3,7 Hz, 4H); 1,49 – 1,44 (m, 4H); 1,37 (s, 9H, 3CH3, Boc); 1,19 – 1,11 (m, 1H); 0,89 – 0,77 (m, 30H, 10CH3). RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6) δ 172,83; 172,24; 172,16; 172,10; 171,95; 171,08; 171,01; 170,80; 170,47; 169,81; 155,49 (CO); 135,90 (C, Ar); 128,48; 128,11; 127,86 (CH, Ar); 77,65 (C, Boc); 65,98 (CH2, -OBzl); 57,79; 51,83; 51,62 (CH); 51,56; 51,34 (CH3, -OMe); 51,28; 51,05; 50,37; 49,71 (CH); 41,27; 40,80; 40,65; 36,74; 36,09; 35,58 (CH2); 30,21 (CH); 29,96 (2CH2); 28,25 (3CH3, Boc); 27,12 (CH2); 24,28 (2CH); 24,22; 24,12 (CH); 23,08; 23,05; 22,92; 22,71; 21,67; 21,42; 21,38; 21,27; 19,15; 17,93 (CH3). MS (ESI) m/z: 1126,0 [M+Na]+; calculada para C55H90N8NaO15: 1125,64 2.2.2.2 Síntesis del octapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-Val-Asp(OMe)-DLeu-Leu-OH (9)

El octapéptido 8 (494 mg, 0,45 mmol) se disuelve en THF (13,5 mL), se adiciona el catalizador de Pd/C (49,4 mg) y se desprotege el extremo C- según el procedimiento para

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental la eliminación del grupo bencilo descrito en el epígrafe 2.1.5. De esta forma se obtiene el octapéptido 9. RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,29 – 8,22 (m, 1H, NH); 8,15 – 8,01 (m, 2H, 2NH); 7,81 (dd, J = 16,8, 8,4 Hz, 1H, NH); 7,74 – 7,66 (m, 1H, NH); 6,68 (dd, J = 7,5, 3,4 Hz, 1H, NH); 4,68 – 4,63 (m, 1H, NH); 4,63 – 4,58 (m, J = 7,0 Hz, 1H, NH); 4,37 – 4,30 (m, 2H, 2CH); 4,29 – 4,20 (m, 4H, 4CH); 4,14 (dd, J = 5,5, 3,1 Hz, 1H, CH); 3,57 (s, 3H, CH3, -OMe); 3,56 (s, 3H, CH3, -OMe); 3,51 – 3,49 (m, 2H); 3,12 (d, J = 6,3 Hz, 2H); 2,35 – 2,26 (m, 4H); 2,03 – 1,87 (m, 3H); 1,74 (dd, J = 13,8, 8,0 Hz, 2H); 1,54 (dd, J = 13,2, 6,0 Hz, 5H); 1,49 – 1,43 (m, 4H); 1,37 (s, 9H, 3CH3, Boc); 0,97 (d, J = 5,1 Hz, 1H); 0,91 – 0,76 (m, 30H, 10CH3). RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6) δ 173,92; 172,77; 172,05; 171,54; 171,01; 170,93; 170,68; 170,44; 169,66; 166,98; 155,42 (CO); 77,57 (C, Boc); 57,65 (CH); 51,76; 51,64 (CH3, -OMe); 51,50; 51,30 (2CH); 50,11; 49,66 (CH); 41,31; 40,79; 40,64; 38,10; 36,70; 35,99; 35,53 (CH2); 30,43 (CH); 29,81 (CH2); 28,21 (3CH3, Boc); 27,11 (CH2); 24,24; 24,09; 23,26; 23,06 (CH); 23,03; 22,90; 22,84; 22,41; 21,61; 21,45; 21,31; 21,24; 19,11; 17,91 (CH3). MS (ESI) m/z: 1036,2 [M+Na]+; calculada para C48H84N8NaO15: 1035,60 2.2.2.3 Síntesis del heptapéptido Boc-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-Val-Asp(OMe)-D-LeuLeu-OBzl (10)

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental El tetrapéptido 7 (1,02 g, 1,54 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (4,6 mL) y se desprotege el residuo N-terminal según el procedimiento para la eliminación del grupo Boc descrito en el epígrafe 2.1.3.1. El tripéptido 2 (160 mg, 0,28 mmol) se disuelve en THF (10 mL), se adiciona el catalizador (16 mg) y se desprotege el extremo C- según el procedimiento para la eliminación del grupo bencilo descrito en el epígrafe 2.1.5. A continuación se hacen reaccionar el tripéptido 2 con el grupo carboxilo libre (136,5 mg, 0,28 mmol) disuelto en CH2Cl2 (1,1 mL), HOBt (40,5 mg, 0,3 mmol), EDC (57,5 mg, 0,3 mmol), el tetrapéptido 7 previamente desprotegido con el grupo amino libre (169,2 mg, 0,25 mmol) y DIPEA (38,8 mg, 0,3 mmol, 0,05 mL) según el procedimiento para el acoplamiento peptídico descrito en el epígrafe 2.1.2 para obtener el heptapéptido 10. El producto se purifica mediante cromatografía líquida en columna empleando un gradiente isocrático de CH2Cl2/AcOEt 3:1, Rf = 0,34. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,03 (d, J = 8,0 Hz, 1H, NH); 7,46 (d, J = 8,5 Hz, 1H, NH); 7,32 – 7,26 (m, 5H, Ar); 7,17 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH); 7,00 (d, J = 8,7 Hz, 1H, NH); 6,86 (s, 1H, NH); 5,53 (s, 1H, NH); 5,06 (s, 2H, CH2, -OBzl); 4,94 (td, J = 8,3, 3,6 Hz, 1H, CH); 4,72 – 4,65 (m, 1H, CH); 4,48 – 4,42 (m, 1H, CH); 4,40 – 4,35 (m, 1H, CH); 4,18 – 4,13 (m, 1H, CH); 3,97 (dd, J = 8,2, 4,7 Hz, 1H, CH); 3,84 (dd, J = 6,2, 5,0 Hz, 1H, CH); 3,63 (s, 3H, CH3, -OMe); 3,51 (s, 3H, CH3, -OMe); 3,05 (dd, J = 16,5, 8,1 Hz, 1H); 2,84 (dd, J = 16,5, 3,7 Hz, 1H); 2,61 – 2,53 (m, 2H); 2,44 (dt, J = 16,1, 6,6 Hz, 2H); 1,98 (dd, J = 13,6, 6,6 Hz, 1H); 1,88 (dd, J = 11,3, 4,4 Hz, 1H); 1,85 – 1,77 (m, 2H); 1,66 (dd, J = 2,4, 1,3 Hz, 1H); 1,64 – 1,58 (m, 4H); 1,51 (dd, J = 6,1, 1,6 Hz, 4H); 1,34 (s, 9H, 3CH3, Boc); 0,89 (td, J = 6,5, 3,9 Hz, 12H, 4CH3); 0,83 – 0,78 (m, 18H, 6CH3). RMN-13C (100 MHz, CDCl3) δ 174,26; 174,04; 173,88; 173,84; 172,97; 172,96; 172,35; 171,66; 171,00; 155.83 (CO); 135,04 (C, Ar); 128,82; 128,70; 128,18 (CH, Ar); 80,24 (C, Boc); 67,24 (CH2, -OBzl); 61,91 (CH); 53,42; 53,08 (CH3, -OMe); 52,28; 52,10; 51,76; 50,73; 50,45; 49,15 (CH); 41,90; 40,69; 39,85; 37,31; 35,74; 34,60 (CH2); 30,25 (CH); 29,41 (CH2); 28,43 (3CH3); 28,26; 24,90; 24,83; 24,74 (CH); 24,65; 23,36; 23,27; 23,14; 22,98; 21,98; 21,93; 21,35; 19,62; 18,84 (CH3). MS (ESI) m/z: 1054,8 [M+Na]+; calculada para C52H85N7NaO14: 1054,61

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental 2.2.2.4 Síntesis del heptapéptido Boc-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-Val-Asp(OMe)-D-LeuLeu-OH (11)

El heptapéptido 10 (155 mg, 0,15 mmol) se disuelve en THF (4,5 mL), se adiciona el catalizador de Pd/C (16 mg) y se desprotege el residuo C-terminal según el procedimiento para la eliminación del grupo bencilo descrito en el epígrafe 2.1.5. De esta forma se obtiene el heptapéptido 11. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,99 (d, J = 8,2 Hz, 1H, NH); 7,60 (d, J = 9,0 Hz, 1H, NH); 7,09 (d, J = 7,4 Hz, 1H, NH); 6,81 – 6,70 (m, 2H, 2NH); 6,61 – 6,56 (m, 1H, NH); 5,21 – 5,13 (m, 1H, NH); 4,48 (ddd, J = 17,9, 11,1, 6,5 Hz, 3H, 3CH); 4,11 (dd, J = 15,6, 7,7 Hz, 2H, 2CH); 4,02 (s, 1H, CH); 3,83 (d, J = 5.0 Hz, 1H, CH); 3,70 (s, 3H, CH3, -OMe); 3,65 (s, 3H, CH3, -OMe); 3,18 (dd, J = 15,1, 3,4 Hz, 1H); 2,99 (dd, J = 14,9, 11,8 Hz, 1H); 2,69 – 2,60 (m, 1H); 2,49 (dt, J = 16,2, 6,4 Hz, 1H); 1,91 (dt, J = 14,3, 6,4 Hz, 3H); 1,84 – 1,74 (m, 3H); 1,65 (ddd, J = 17,2, 10,2, 4,5 Hz, 7H); 1,57 – 1,48 (m, 2H); 1,43 (s, 9H, 3CH3, Boc); 1,04 (d, J = 6,1 Hz, 3H, CH3); 0,99 – 0,87 (m, 27H, 9CH3). RMN-13C (100 MHz, CDCl3) δ 173,93 (2CO); 173,58; 173,21 (CO); 172,94 (2CO); 172,21; 171,31; 170,87; 157,70 (CO); 81,11 (C, Boc); 62,39 (CH); 53,57; 53,48 (CH3, OMe); 52,11 (2CH); 51,92; 50,59; 50,42; 49,73 (CH); 41,04; 40,62; 38,35; 37,96; 36,03 (CH2); 29,96 (CH); 29,71 (CH2); 28,46 (3CH3, Boc); 27,58 (CH2); 24,98; 24,90; 24,87; 24,71 (CH); 23,07; 22,86; 22,70; 22,57; 22,32; 22,07; 21,47; 21,32; 19,28; 18,72 (CH3). MS (ESI) m/z: 964,4 [M+Na]+; calculada para C45H79N7NaO14: 964,56

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental 2.2.3 Síntesis del dodecilisocianuro (12)

Se disuelve la dodecilamina (185 mg, 1 mmol) en formiato de etilo (10 mL) y la disolución resultante se agita a reflujo durante 20 horas. A continuación se concentra a presión reducida para obtener la formamida correspondiente. El producto crudo se disuelve en CH2Cl2 seco (5 mL) y la disolución se enfría hasta -60 oC para adicionarle Et3N (2 mL). Posteriormente se adicionaron goteando y bajo atmósfera de nitrógeno 1,5 mL de una disolución de POCl3 en CH2Cl2 (67%, v/v) y la disolución resultante primeramente se agita a -60 oC durante 2 horas y posteriormente se agita 4 horas adicionales a temperatura ambiente. La suspensión generada se vierte en 20 mL de agua fría y la mezcla se extrajo con porciones de CH2Cl2 (2x25 mL). Las fases orgánicas se combinan, se lavan con salmuera y se secan sobre Na2SO4 (anh.). La disolución obtenida se concentra a presión reducida hasta sequedad. El crudo resultante se purifica por cromatografía líquida flash en columna empleando un gradiente de n-hexano/AcOEt 10:1, Rf=0.53 y de esta forma se obtiene el isocianuro lipídico correspondiente en forma de un aceite amarillo pálido. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 3,37 (tt, 2H, J = 1,9; 6,7 Hz, CH2NC); 1,67 (m, 2H, CH2); 1,42 (m, 2H, CH2); 1,26-1,29 (m, 16H, 8CH2); 0,88 (t, 3H, J = 6,9 Hz, CH3). RMN-13C (100 MHz, CDCl3): δ 155,6 (NC); 41,5 (CH2NC); 22,6, 26,3, 28.6, 29,1, 29,2, 29,3, 29,4, 29,5, 31,8 (CH2); 14,0 (CH3). MS (ESI) m/z: 218,1 [M+Na]+; calculada para C13H25NNa: 218,19

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Parte experimental 2.2.4 Síntesis de los ciclolipopéptidos análogos de la Surfactina 2.2.4.1 Síntesis del ciclolipopéptido 13

El heptapéptido 11 (122,5 mg, 0,13 mmol) se disuelve en la disolución 4M de HCl en dioxano (2,6 mL) y se desprotege el residuo N-terminal según el procedimiento para la eliminación del grupo Boc descrito en el epígrafe 2.1.3.2. A continuación se hacen reaccionar el crudo del heptapéptido 11 con los grupos amino (en forma de hidrocloruro) y carboxilo libres disuelto en metanol (13 mL), el isocianuro lipídico 12 (31,3 mg, 0,16 mmol), (CH2O)n (6 mg, 0,20 mmol) y Et3N (0,02 mL, 0,16 mmol) según el procedimiento para la macrociclación mediante la reacción de Ugi descrito en el epígrafe 2.1.6. Posteriormente se trata la reacción y el crudo obtenido se disuelve en una mezcla de THF/H2O 2:1 (2,6 mL), se adiciona LiOH (18,7 mg, 0,78 mmol) y se desprotegen los residuos C-terminales de las cadenas laterales según el procedimiento para la eliminación del éster metílico descrito en el epígrafe 2.1.4. De esta forma se obtiene el ciclolipopéptido 13. MS (ESI) m/z: 1043,5 [M+Na]+; calculada para C52H92N8NaO12: 1043,67

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental 2.2.4.2 Síntesis del ciclolipopéptido 14

El octapéptido 9 (152,1 mg, 0,15 mmol) se disuelve en la disolución 4M de HCl en Dioxano (3 mL) y se desprotege el residuo N-terminal según el procedimiento para la eliminación del grupo Boc descrito en el epígrafe 2.1.3.2. A continuación se hacen reaccionar el crudo del octapéptido 9 con los grupos amino (en forma de hidrocloruro) y carboxilo libres disuelto en metanol (15 mL), el isocianuro lipídico 12 (35,2 mg, 0,18 mmol), (CH2O)n (6,9 mg, 0,23 mmol) y Et3N (0,03 mL, 0,18 mmol) según el procedimiento para la macrociclación mediante la reacción de Ugi descrito en el epígrafe 2.1.6. Posteriormente se trata la reacción y el crudo obtenido se disuelve en una mezcla de THF/H2O 2:1 (4,5 mL), se adiciona LiOH (21,6 mg, 0,9 mmol) y se desprotegen los residuos C-terminales de las cadenas laterales según el procedimiento para la eliminación del éster metílico descrito en el epígrafe 2.1.4. De esta forma se obtiene el ciclolipopéptido 14. MS (ESI) m/z: 1115,0 [M+Na]+; calculada para C55H97N9NaO13: 1114,71 2.2.5.4 Síntesis del ciclolipopéptido 15

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Parte experimental Se hacen reaccionar el heptapéptido N-(3-oxopropanoil)-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-ValAsp(OMe)-D-Leu-Leu-OH el cual fue sintetizado previamente en fase sólida con los grupos carbonilo y carboxilo libres (266,1 mg, 0,25 mmol) disuelto en THF (25 mL) y el isocianuro lipídico 12 (58,6 mg, 0,30 mmol) según el procedimiento para la macrociclación mediante la reacción de Passerini descrito en el epígrafe 2.1.7. Posteriormente se trata la reacción y el crudo obtenido se disuelve en THF (7,5 mL), se adiciona el catalizador de Pd/C (29,3 mg) y se desprotegen los dos residuos C-terminales según el procedimiento para la eliminación del grupo bencilo descrito en el epígrafe 2.1.5. De esta forma se obtiene el ciclolipopéptido 15. MS (ESI) m/z: 1102,0 [M+Na]+; calculada para C54H94N8NaO14: 1101,68. 2.2.5.3 Síntesis del ciclolipopéptido 16

Se hacen reaccionar la amina lipídica (56,2 mg, 0,30 mmol) disuelta en MeOH (30 mL), el heptapéptido N-(3-oxopropanoil)-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-Val-Asp(OMe)-D-Leu-LeuOH el cual fue sintetizado previamente en fase sólida con los grupos carbonilo y carboxilo libres (266,1 mg, 0,25 mmol) y el isocianuro lipídico 12 (59,2 mg, 0,30 mmol) en metanol (30 mL) según el procedimiento para la macrociclación mediante la reacción de Ugi descrito en el epígrafe 2.1.6. Posteriormente se trata la reacción y el crudo obtenido se disuelve en THF (7,5 mL), se adiciona el catalizador de Pd/C (10 mg) y se desprotegen los dos residuos C-terminales según el procedimiento para la eliminación del grupo bencilo descrito en el epígrafe 2.1.5. De esta forma se obtiene el ciclolipopéptido 16. MS (ESI) m/z: 1268,9 [M+Na]+; calculada para C66H119N9NaO13: 1268,88

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados 3. Discusión de los resultados 3.1 Metodología de trabajo El presente trabajo constituye el resultado de una investigación encaminada a la síntesis de

análogos

del

ciclolipopéptido

natural

Surfactina

mediante

reacciones

multicomponentes. Se escoge este compuesto de origen natural debido a su gran capacidad de permeabilizar membranas, a su baja toxicidad y al amplio espectro de actividades biológicas que presenta. Además,

se emplearon las reacciones

multicomponentes en la ruta de síntesis de la Surfactina debido a su fácil implementación, su gran economía de átomos y porque estas reacciones posibilitan que en un solo paso de reacción ocurra la macrociclación de la cadena peptídica y, en el caso de la reacción de Ugi-4C, que se produzca la N-sustitución del nuevo enlace amida formado por la cadena lipídica, confiriéndole una estabilidad adicional al ciclolipopéptido obtenido (Esquema 12).

Esquema 12 Reacción de Ugi cuatro componentes Con la síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina se pretende disminuir la ocurrencia de los procesos de degradación de su cadena peptídica a causa de las proteasas y de este modo simplificar una de sus principales deficiencias: su baja biodisponibilidad oral. Un análisis retrosintético de la Surfactina conduce a realizar inicialmente dos desconexiones para separar la parte correspondiente al ácido graso de la parte peptídica (un heptapéptido lineal). Como el método que emplearemos para la síntesis de los péptidos necesarios para este trabajo es el método de síntesis empleando bloques moleculares (discutido en la sección 1.2) es preciso realizar una desconexión adicional en el heptapéptido lineal, la cual generará un tetrapéptido y un tripéptido que desde el punto Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

40

Discusión de los resultados de vista sintético es mucho más lógico que realizar una desconexión que genere un dipéptido y un pentapéptido o que genere un hexapéptido y un aminoácido. La desconexión se realizó en la unión de los aminoácidos Valina y D-Leucina ya que al ser la valina un aminoácido bastante impedido estéricamente se prefiere que este se encuentre formando parte del extremo N- y no del extremo C- del péptido para evitar una reacción de acoplamiento peptídico más lenta lo que trae consigo inevitablemente un aumento del porciento de racemización. Teniendo en cuenta la metodología y los grupos funcionales que deben participar en las reacciones multicomponentes, el ácido graso se puede sustituir por un isocianuro lipídico que posea una cadena lipídica de tamaño semejante. Estas ideas se ejemplifican en el siguiente esquema.

Esquema 13 Análisis retrosintético de la Surfactina (las flechas indican los sitios de desconexión) En el capítulo 1 se hizo mención a la primera vez que se sintetizó la Surfactina en disolución y en fase sólida, pero en ninguno de los casos mencionados ni en recientes búsquedas realizadas en la literatura científica se reportó el empleo de las reacciones multicomponentes en dichas síntesis. Este trabajo propone aplicar este tipo de reacciones en la síntesis de análogos de la Surfactina y para ello presentamos la síntesis de cuatro análogos de este ciclolipopéptido natural. Lo primero que se realizó fue la síntesis de los fragmentos peptídicos, a continuación estos fragmentos se acoplaron y se generaron los Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados esqueletos peptídicos con los cuales se implementó la tercera parte de este trabajo que consistió en la macrociclación mediante las reacciones de Ugi o Passerini de estos esqueletos peptídicos con un isocianuro lipídico para obtener cada análogo deseado. 

La síntesis del primer análogo se llevó a cabo mediante la macrociclación mediante la reacción de Ugi entre el heptapéptido A y el isocianuro lipídico.



Para la síntesis del segundo análogo primeramente se acopló -alanina al tripéptido B, posteriormente el tetrapéptido obtenido se acopló al tetrapéptido C, y por último se realizó la macrociclación mediante la reacción de Ugi entre el octapéptido obtenido y el isocianuro lipídico.



Para obtener el tercer análogo primero se procedió a la N-funcionalización del tripéptido B, a continuación este tripéptido N-funcionalizado se acopló al tetrapéptido C y se obtuvo un heptapéptido N-funcionalizado. Por último se llevó a cabo la macrociclación mediante la reacción de Passerini entre este heptapéptido N-funcionalizado y el isocianuro lipídico.



Para la síntesis del cuarto análogo se realizó la macrociclación mediante la reacción de Ugi entre el heptapéptido N-funcionalizado, el isocianuro lipídico y una amina lipídica con el objetivo de obtener un análogo que tuviera dos cadenas lipídicas en su estructura.

A continuación se presenta el esquema 14, en el cual se muestra la estrategia sintética del trabajo.

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados Primera etapa: Síntesis de los fragmentos peptídicos

Segunda etapa: Síntesis de los esqueletos peptídicos

Tercera etapa: Síntesis de los ciclolipopéptidos

Esquema 14 Metodología de trabajo 3.2 Síntesis de péptidos en disolución Como se mencionó en el primer capítulo de este trabajo, la síntesis de los péptidos necesarios para la obtención de la Surfactina se realizó en disolución. De esta forma se sintetizaron un tripéptido, y dos tetrapéptidos, los cuales posteriormente se acoplaron convenientemente para obtener los heptapéptidos y octapéptidos necesarios para la macrociclación mediante las reacciones de Ugi-4C o de Passerini-3C. La síntesis de péptidos consiste de forma general en pasos sucesivos de acoplamiento y desprotección de los grupos funcionales. Escoger la secuencia de síntesis y los grupos protectores que se emplearán es el principal requerimiento para una síntesis de péptidos adecuada. Los grupos amino y carboxilo que no participan en el acoplamiento peptídico deben ser temporalmente protegidos y como, al menos, uno de ellos está involucrado en el posterior enlace peptídico deben ser desprotegidos de forma selectiva. En la síntesis de péptidos en disolución la combinación de grupos protectores más empleada es la Boc/OMe (Boc como grupo protector del amino y OMe como grupo Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados protector del ácido) y en el caso de las cadenas laterales estas se protegen en forma de ésteres bencílicos, pero las condiciones necesarias para la desprotección del éster metílico (hidrólisis básica) pueden propiciar también la desprotección del éster bencílico, mientras que el éster bencílico se puede desproteger mediante hidrogenólisis la cual no afecta al éster metílico. Por las razones antes mencionadas, en nuestro caso la combinación empleada fue la Boc/Bzl (Boc como grupo protector del amino y Bzl como grupo protector del ácido) mientras que los grupos carboxilos presentes en las cadenas laterales de los ácidos glutámico y aspártico, necesarios en nuestras secuencias peptídicas, se protegieron en forma de ésteres metílicos. Como agente activante del grupo carboxilo se empleó la carbodiimida EDC, y como agente supresor de racemización se empleó el 1hidroxibenzotriazol (HOBt). En el acoplamiento peptídico también se emplea diisopropiletilamina (DIPEA) con el objetivo de sustraer el protón que está unido al grupo amino del aminoácido con el residuo N-terminal ya que estos se venden en forma de sal de hidrocloruro, p-tosilato o trifluoracetato y además para generar un ligero medio básico que facilite la disociación del grupo carboxilo ya que este deberá actuar como nucleófilo, en forma de carboxilato, frente a la carbodiimida. Es necesario recordar que el crecimiento de la cadena peptídica debe realizarse desde el extremo C- hacia el N-, de esta forma el péptido con el extremo N- desprotegido se acopla al aminoácido con el grupo carboxilo activado, pues la versión contraria conduce a la racemización del aminoácido con el grupo carboxilo activado debido a la formación de oxazolonas. Esta es una gran desventaja que atenta contra el rendimiento del péptido deseado (en su forma estereoquímicamente pura) ya que origina la formación de diastereoisómeros a medida que se van realizando acoplamientos consecutivos. Otro aspecto a resaltar en este trabajo es la desprotección del grupo amino después de cada acoplamiento y antes de la macrociclación. Como se presentó en el capítulo 2, se utilizaron dos metodologías para eliminar al grupo Boc del residuo N-terminal una que emplea ácido trifluoracético en diclorometano y otra que emplea una disolución 4M de HCl en Dioxano. La necesidad de implementar dos metodologías de desprotección del grupo amino se basa en la repercusión que puedan tener los subproductos de estas en la reacción de Ugi-4C. La desprotección con ácido trifluoracético en diclorometano hace que la amina libre obtenida quede en forma de sal del ácido, es decir en forma de par iónico entre el anión trifluoracetato y el derivado del catión amonio correspondiente al aminoácido desprotegido. Mientras la reacción subsiguiente sea un acoplamiento, el ion Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados trifluoracetato presente no supone ningún problema; pero en el caso de la reacción de Ugi-4C, este anión puede hidrolizarse y generar nuevamente ácido trifluoracético el cual es un ácido orgánico y puede participar en dicha reacción dando productos colaterales que impurifican al macrociclo que se desea obtener. Es por este motivo que las desprotecciones del grupo amino necesarias para las macrociclaciones se realizaron empleando HCl/Dioxano 4M. El rendimiento en ambas desprotecciones es cuantitativo. Por otro lado la desprotección del extremo C- también se realizó de dos formas, en función del grupo protector presente. En el caso de los ésteres metílicos el método empleado es la hidrólisis con LiOH en agua. Los ésteres bencílicos se desprotegieron mediante hidrogenación catalítica empleando primeramente metanol como disolvente, pero tras la primera desprotección se observó una mancha que presumiblemente debe corresponder al producto transesterificado, por ello para las siguientes desprotecciones el disolvente se sustituyó por tetrahidrofurano (THF). Igualmente en este caso el rendimiento de ambas desprotecciones es cuantitativo. En nuestra ruta de síntesis se emplearon dos aminoácidos que no se comercializan comúnmente, estos son el Boc-Asp(OMe)-OH y Boc-Glu(OMe)-OH, ambos se compraron en la firma Bachem, lo más común es que se vendan estos aminoácidos con las cadenas laterales protegidas en forma de ésteres bencílicos. Debido a que los isocianuros lipídicos tampoco son comerciales, o en caso de haberlo su precio es muy alto, el isocianuro empleado también se obtuvo en el laboratorio mediante la formilación con formiato de etilo y posterior deshidratación con POCl3 de la dodecilamina que es mucho más barata. 51 A continuación se discute la síntesis de un tripéptido y la síntesis de un octapéptido a modo de aplicar la metodología previamente explicada. 3.2.1 Síntesis y caracterización del tripéptido Boc-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-OBzl (2) Para la síntesis de este tripéptido se necesitaron dos pasos de acoplamientos y una desprotección (Esquema 15). Primeramente se acopló la D-leucina bencil éster en forma de p-tosilato con la Boc-leucina en presencia de EDC, HOBt y DIPEA. De esta forma se obtuvo el dipéptido Boc-Leu-D-Leu-OBzl (1) con un rendimiento del 97%. A continuación se desprotegió el residuo N-terminal de este intermediario con ácido trifluoracético y diclorometano (1:3 v/v) y se obtuvo el dipéptido H-Leu-D-Leu-OBzl en forma de sal trifluoracética de forma cuantitativa. La eliminación del exceso de ácido Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados trifluoracético se realiza mediante lavados con diclorometano ya que ambos forman una mezcla azeotrópica y esto permite que mediante pasos consecutivos de dilución y concentración a presión reducida se logre eliminar su exceso. El segundo acoplamiento consistió en la reacción entre el dipéptido obtenido y ácido glutámico (con el grupo Boc protegiendo al grupo amino y con el grupo carboxílico de la cadena lateral protegido en forma de éster metílico) en presencia de EDC, HOBt y DIPEA. Así se obtuvo el tripéptido Boc-Glu(OMe)-Leu-D-Leu-OBzl (2) luego de purificar el crudo de reacción mediante cromatografía en columna.

Esquema 15 Síntesis del tripéptido 2 El espectro RMN 1H del tripéptido 2 en CDCl3 se muestra en la figura 9. En la zona más desblindada del espectro se observa una señal que integra 5 protones la cual corresponde a los protones del anillo aromático; aunque el sistema de espines esperable es del tipo AA´BB´C la calidad del espectro no nos permite resolver dichas señales. En 6,96; 6,73 y 5,50 ppm se observan las señales de los protones de las amidas. En 5.05 ppm aparece la señal de los protones del grupo CH2 del bencilo, estos protones al estar cerca de un carbono quiral no son equivalentes, poseen desplazamientos químicos distintos y por lo tanto se observan como un doblete de doblete (resultado de dos dobletes muy cercanos), no como un singlete. En 4,51; 4,43 y 4,04 ppm aparecen tres señales que integran un protón cada una correspondiente a los protones alfa de los tres aminoácidos presentes en el tripéptido. En 3,59 aparece un singlete muy intenso que corresponde a la señal de los protones del metilo que protege al grupo carboxilo de la cadena lateral del ácido glutámico. En la región de 2,43-2,30 ppm se observa la señal del CH2 del ácido glutámico más alejado del carbono alfa, mientras que en 2,03 y en 1,88 aparecen las señales de cada protón del CH2 del ácido glutámico más cercano al carbono alfa, es lógico que aparezca una señal para cada protón ya que el hecho de que este grupo esté enlazado a un carbono quiral hace que ambos protones no sean equivalentes y por lo tanto sus desplazamientos químicos no sean iguales. Entre 1,70 y 1,43 ppm se observa una multiplete que integra Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados seis protones la cual corresponde a los CH y CH2 de cada leucina presente en el tripéptido. En 1,35 ppm se observa la señal más intensa del espectro, la cual integra nueve protones y corresponde a los tres metilos del grupo Boc. Finalmente, en la zona más blindada del espectro, en 0,84 ppm, se observa una señal que integra 12 protones y corresponde a los metilos de las leucinas presentes en el tripéptido.

Figura 9 Espectro RMN 1H del tripéptido 2. Las zonas carentes de señales han sido cortadas. El espectro íntegro aparece en el anexo II El espectro RMN 13C del tripéptido 2 en CDCl3 se muestra en la figura 10. En la zona más desblindada del espectro, entre 175 y 156 ppm, aparecen cinco señales que corresponden a los cinco grupos carbonilos presentes en la estructura del compuesto; de ellos, el más blindado corresponde al que forma parte del grupo Boc. Entre 136 y 128 ppm aparecen las señales de los carbonos sp2 del bencilo, a diferencia del espectro protónico, en este caso si coincide el sistema de espines (AA´BB´CD) con el número de señales. En 80.45 ppm aparece la señal del carbono cuaternario del grupo Boc, mientras que en 66.92 se observa la señal del grupo CH2 del bencilo. En 54,41 ppm se observa la señal del CH3 del éster metílico que protege al grupo carboxilo de la cadena lateral del ácido glutámico y entre 53 y 51 ppm se observan las señales correspondientes a los carbonos alfa de los aminoácidos del tripéptido. Alrededor de 40 ppm se encuentran los dos CH2 que pertenecen a las dos leucinas del tripéptido mientras que en 30,38 ppm y en 27,24 ppm aparecen los dos CH2 de la cadena del ácido glutámico. En 28,34 ppm se observa la señal de los metilos del grupo Boc y finalmente en la zona más desblindada

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Discusión de los resultados del espectro, entre 25 y 21 ppm, se observan las señales de los CH y de los CH3 de las leucinas del tripéptido.

Figura 10 Espectro RMN 13C del tripéptido 2. Las zonas carentes de señales han sido cortadas. El espectro íntegro aparece en el anexo III 3.2.2 Síntesis y caracterización del octapéptido Boc--Ala-Glu(OMe)-Leu-D-LeuVal-Asp(OMe)-D-Leu-Leu-OBzl (8) La síntesis de este octapéptido requirió de siete pasos de acoplamientos y seis desprotecciones y se obtuvo mediante el acoplamiento del tetrapéptido 7 desprotegido por el extremo N- y el tetrapéptido 4 (Esquema 16). Para obtener el tetrapéptido 4 se tomó una porción de la masa obtenida del tripéptido 2 y se desprotegió el extremo N- con la mezcla de TFA/DCM 1:3 v/v con un rendimiento cuantitativo y posteriormente se adicionó -alanina en presencia de EDC, HOBt y DIPEA. De esta forma se obtuvo el tetrapéptido 3 con un rendimiento del 77%. A continuación se desprotegió el residuo C-terminal de este tetrapéptido mediante hidrogenación catalítica empleando como catalizador hidróxido de paladio (II) sobre carbón activado al 10% en masa (Pd/C) y como disolvente MeOH. El tetrapéptido 5 se obtuvo con un rendimiento cuantitativo de este paso final. El tetrapéptido 7 se obtuvo de la siguiente manera. En el primer paso se acopló la leucina bencil éster en forma de p-tosilato con la Boc-D-leucina en presencia de EDC, HOBt y DIPEA. De esta forma se obtuvo el dipéptido Boc-D-Leu-Leu-OBzl (5) con un rendimiento de 93%. A continuación se desprotegió el residuo N-terminal de este intermediario con ácido trifluoracético y diclorometano (1:3 v/v) y se obtuvo el dipéptido Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados H-D-Leu-Leu-OBzl en forma de sal trifluoracética con un rendimiento del 99%. La eliminación del exceso de ácido trifluoracético se realizó mediante lavados con diclorometano. El segundo acoplamiento consistió en la reacción entre el dipéptido obtenido y ácido aspártico (con el grupo Boc protegiendo al grupo amino y con el grupo carboxílico de la cadena lateral protegido en forma de éster metílico) en presencia de EDC, HOBt y DIPEA. Así se obtuvo el tripéptido Boc-Asp(OMe)-D-Leu-Leu-OBzl (6) con un rendimiento del 85% luego de purificarlo por cromatografía en columna empleando un gradiente isocrático de n-hexano/AcOEt 2:1. A continuación se desprotegió el residuo N-terminal de este nuevo intermediario con ácido trifluoracético y diclorometano (1:3 v/v) y se obtuvo el tripéptido H-Asp(OMe)-D-Leu-Leu-OBzl en forma de sal trifluoracética de forma cuantitativa, el exceso de TFA se eliminó igualmente mediante lavados con diclorometano. El tercer acoplamiento se realizó entre el tripéptido obtenido y el aminoácido valina, con el grupo amino protegido en forma de Boc, en presencia de EDC, HOBt y DIPEA. El tetrapéptido Boc-Val-Asp(OMe)-D-Leu-Leu-OBzl (7) se obtuvo con un rendimiento del 82%. El tetrapéptido obtenido se purificó mediante cromatografía en columna empleando un gradiente isocrático de n-hexano/AcOEt 1:1 y se desprotegió de forma cuantitativa su residuo N-terminal con la mezcla TFA/DCM 1:3 v/v. Una vez obtenidos los tetrapéptidos 4 y 7 desprotegidos adecuadamente se procedió a su acoplamiento en presencia de EDC, HOBt y DIPEA. De esta forma se obtuvo el octapéptido 8 con un rendimiento del 93% el cual se purificó mediante recristalización de la mezcla de disolventes n-hexano/MeOH/CH2Cl2 en las proporciones 6:1:3 respectivamente.

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Discusión de los resultados

Esquema 16 Síntesis del octapéptido 11 El espectro RMN 1H del octapéptido 8 en DMSO-d6 se muestra en la figura 11. En la zona más desblindada del espectro se observan claramente las señales de los protones amidas correspondientes a los aminoácidos sustituidos en el carbono alfa, mientras que en 6,68 ppm se observa la señal del protón del NH enlazado al grupo Boc correspondiente a la -alanina. Si se comparan las condiciones experimentales en las que se realizó este espectro con las que se escogieron para realizar el espectro del tripéptido 2 notamos que la única diferencia es el empleo de otro disolvente (cloroformo deuterado para el tripéptido 2 y dimetilsulfóxido deuterado para el octapéptido 8), este cambio hace que los protones que se están discutiendo (amida) estén menos propensos a intercambiarse y que por lo tanto sea posible la detección de la multiplicidad de la señal de cada uno de ellos. Entre 7,41 y 7,30 ppm aparece la señal de los cinco protones del anillo aromático del bencilo. En 5,11 ppm se observa un singlete que corresponde al CH2 del bencilo, en el espectro ampliado del octapéptido 8 se puede observar claramente cómo es que este singlete no es más que el doblete de doblete que aparece en el espectro del tripéptido 2 Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados solo que esta vez las señales han calecido. Entre 4,63 y 4,11 ppm se observan las señales de los siete protones alfa del octapéptido mientras que en 3,57 y 3,56 ppm se observan las señales de los dos CH3 que forman parte de los ésteres metílicos que protegen las cadenas laterales de los ácidos glutámico y aspártico presentes en la estructura de nuestro octapéptido. A continuación, en 3,12 se observa la señal del CH2 de la -alanina que está unido al grupo amino y en 2,71; 2,31 y 2,00 ppm se observan tres señales correspondientes a los tres CH2 enlazados a grupos carbonilos presentes en la estructura. A continuación se encuentra un grupo de cinco señales que corresponden a catorce protones los cuales corresponden a los CH y los CH2 de las cadenas laterales de las Leu y al CH2 enlazado al carbono alfa del ácido glutámico. En 1,37 ppm se observa la señal más intensa del espectro, la cual integra nueve protones y corresponde nuevamente a los tres metilos del grupo Boc y entre 1,19 y 1,11 ppm se observa la señal del CH de la cadena lateral de la valina. Por último, en la zona más blindada del espectro, de 0,89 a 0,77 ppm, se observa una señal que integra 30 protones que corresponde a los metilos de las cadenas laterales de las cuatro leucinas y a los dos metilos de la cadena lateral de la valina presentes en el octapéptido.

Figura 11 Espectro RMN 1H del octapéptido 8. Las zonas carentes de señales han sido cortadas. El espectro íntegro aparece en el anexo IV El espectro RMN 13C del octapéptido 8 en DMSO-d6 se muestra en la figura 12. En la zona más desblindada del espectro, entre 173 y 155 ppm, aparecen once señales que corresponden a los once grupos carbonilos presentes en la estructura del compuesto; de Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados ellos, el más blindado corresponde igualmente al que forma parte del grupo Boc. Entre 136 y 127 ppm aparecen las señales de los carbonos sp2 del bencilo, al igual que en el caso anterior coincide el sistema de espines (AA´BB´CD) con el número de señales presentes en esta zona del espectro. En 77,65 ppm aparece la señal del carbono cuaternario del grupo Boc, mientras que en 65,98 se observa la señal del CH2 del grupo bencilo. Entre 58 y 49 ppm aparecen las señales de los carbonos alfa de los aminoácidos que contiene el péptido, intercaladas en este intervalo, en 51,56 y 51,34 ppm, se encuentran las señales de los dos CH3 de los ésteres metílicos que protegen al grupo carboxílico de la cadena lateral del ácido glutámico y del ácido aspártico. Entre 42 y 27 ppm se encuentran las señales de los nueve CH2 pertenecientes a las cuatro leucinas, el ácido aspártico, los dos del ácido glutámico y los dos de la -alanina, en este intervalo, además, se encuentra la señal del CH de la valina en 30,21 ppm y la señal de los metilos del grupo Boc en 28,25 ppm. Finalmente en la zona más desblindada del espectro, entre 25 y 17 ppm, se observan las señales de los CH de las leucinas y de los CH3 de las leucinas y de la valina del octapéptido.

Figura 12 Espectro RMN 13C del octapéptido 8. Las zonas carentes de señales han sido cortadas. El espectro íntegro aparece en el anexo V 3.3 Síntesis y caracterización de los ciclolipopéptidos análogos de la Surfactina Sin dudas esta es la etapa más importante y a la vez la más lenta de este trabajo pues las reacciones de macrociclación, sobre todo la macrociclación cabeza-cola de esqueletos peptídicos, es un proceso entrópicamente desfavorecido debido al orden que debe preestablecerse para que ocurra la reacción entre los extremos de la cadena del péptido. Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados Durante este ordenamiento el acercamiento espacial de los residuos N- y C-terminales de la molécula conlleva inevitablemente a un giro del esqueleto peptídico, que provoca, que en la mayoría de los casos sea necesario adoptar una conformación termodinámica y entrópicamente desfavorecida. Debido a que solo un pequeño número del total de confórmeros que pueden coexistir a temperatura ambiente para el péptido en cuestión puede generar el producto deseado, es lógico esperar que los rendimientos de estas reacciones sean bajos; alrededor del 50% se consideran buenos. Debe aclararse que la presencia de dos D-aminoácidos en la estructura de la Surfactina y de los cuatro análogos sintetizados influye de forma positiva en el rendimiento de la macrociclación, es por ello que en todos los casos la concentración del péptido a ciclar fue de 10 mM. La caracterización espectroscópica de los péptidos no es una tarea sencilla. Es muy frecuente encontrar señales que no pueden ser asignadas a menos que se emplee alguna técnica bidimensional. Entre los factores que pueden influir en un espectro más complicado se encuentran: el aumento de la talla del péptido, la presencia de aminoácidos con cadenas laterales ricas en protones alifáticos como la lisina y la ornitina, así como la presencia de varios aminoácidos del mismo tipo en la secuencia peptídica, todos estos factores generan una gran superposición de señales. Debido a estas razones las técnicas por excelencia para caracterizar un péptido son la RMN-2D y las técnicas blandas de ionización de espectrometría de masas, especialmente la técnica ESI-MS en la más recurrida para este propósito. En estos espectros es muy frecuente encontrar los iones moleculares [M+Na]+. 3.3.1 Síntesis de los ciclolipopéptidos 13 y 14 El primer ciclolipopéptido que se obtuvo fue el ciclolipopéptido 13 a través de la macrociclación del heptapéptido 11 con sus extremos N- y C- desprotegidos con el paraformaldehído (para evitar la racemización) y con el isocianuro lipídico 12 (esquema 17). Primeramente se disuelve el heptapéptido 11 en dioxano para desproteger su extremo N siguiendo el procedimiento de remoción del grupo Boc anteriormente descrito. Luego se toma el heptapéptido 11 con sus dos extremos desprotegidos y se disuelve en la menor cantidad de MeOH. A continuación se adicionan el paraformaldehído y la Et3N, esta última en un ligero exceso para generar un ligero medio básico y evitar una posible esterificación del grupo carboxilo. Este paso se mantiene durante toda la noche para preformar la imina. Al día siguiente se adiciona una pequeña cantidad de MeOH o nhexano para diluir la reacción y finalmente se agrega el isocianuro lipídico. Esta reacción Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados se sigue por CCD hasta su máxima extensión. Cuando la reacción concluye, el crudo obtenido se concentra mediante filtración a presión reducida para eliminar la mayor cantidad del exceso de las sustancias más volátiles y luego se redisuelve en AcOEt para realizar posteriormente lavados con HCl (dil.), NaHCO3 (dsln sat.) y con salmuera. A continuación, la fase orgánica recogida de estos lavados, se seca sobre Na2SO4 (anh.) y se concentra a presión reducida. El último paso consiste en la desprotección de los grupos carboxílicos presentes en la estructura mediante la hidrólisis con LiOH y posterior acidulación del medio.

Esquema 17 Síntesis del ciclolipopéptido 13 La obtención del compuesto 13 se comprueba mediante espectrometría de masas empleando la técnica ESI-MS (Figura 13). [M+Na]+

Figura 13 Espectro ESI-MS del ciclolipopéptido 13 Como se puede apreciar, en el espectro se encuentra la señal correspondiente al ion [M+Na]+ (m/z = 1043,5 Da, pico base) que coincide con la masa calculada para el ciclolipopéptido 13.

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Discusión de los resultados De igual manera se obtuvo el ciclolipopéptido 14, la única diferencia en este caso fue el péptido de partida, ya que para obtener este producto se partió del octapéptido 9 (Esquema 18).

Esquema 18 Síntesis del ciclolipopéptido 14 La obtención del compuesto 14 igualmente se comprueba mediante espectrometría de masas empleando la técnica ESI-MS (Figura 14). [M+Na]+

Figura 14 Espectro ESI-MS del ciclolipopéptido 14 En el espectro se puede apreciar claramente la señal correspondiente al ion [M+Na]+ (m/z = 1114,71 Da, pico base) que coincide con la masa calculada para el ciclolipopéptido 14. Las estructuras de los ciclolipopéptidos 13 y 14 son muy similares a la estructura de la Surfactina natural. La diferencia es que en este compuesto la cadena lipídica se encuentra unida al átomo de nitrógeno aportado por el isocianuro, mientras que en la Surfactina natural la cadena lipídica forma parte del residuo del ácido graso hidroxilado en la posición . Esta N- sustitución puede influir de forma positiva en la estabilidad del análogo obtenido si esta se compara con la de la Surfactina natural.

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Discusión de los resultados 3.3.2 Síntesis del ciclolipopéptido 15 La idea de obtener un análogo de la Surfactina que solo se diferenciara en la cadena lipídica al tiempo que la parte cíclica fuera exactamente la misma es el objetivo principal de obtener un análogo mediante la reacción de Passerini, el cual se generó a partir de la macrociclación entre un heptapéptido sintetizado en fase sólida en nuestro grupo de trabajo y el isocianuro lipídico 12, ambos disueltos en THF. El heptapéptido empleado para la síntesis de este análogo posee la misma secuencia de aminoácidos de los esqueletos peptídicos empleados en la síntesis de los análogos 13 y 14 solo que en su extremo N- se encuentra funcionalizado con ácido 3-oxopropanoico. El empleo de un heptapéptido N-(3-oxopropanoil)-funcionalizado con los grupos carboxílicos de las cadenas laterales de los aminoácidos Glu y Asp protegidos en forma de ésteres bencílicos previamente sintetizado en fase sólida se debe a dos razones fundamentales: la primera es, como se mencionó anteriormente, que permite obtener un análogo con la parte cíclica idéntica a la de la Surfactina, y la segunda es que la desprotección de estos grupos carboxílicos mediante hidrogenación catalítica en presencia de catalizador de Pd/C no implica la escisión de la lactona previamente generada en la macrociclación de Passerini de haberse empleado el heptapéptido 11 obtenido en este trabajo N-funcionalizado con el ácido 3-oxopropanoico. El esquema 19 ilustra lo anteriormente expuesto.

Esquema 19 Apertura del análogo de Passerini durante la desprotección de las cadenas laterales de los ácidos glutámico y aspártico con LiOH.

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Discusión de los resultados Por las razones explicadas y basándonos en el esquema 17, la obtención del análogo de la Surfactina mediante la reacción de Passerini ocurrió de la siguiente manera: primero la reacción de Passerini entre el heptapéptido N-funcionalizado y el isocianuro lipídico 12 disueltos en THF durante 72 horas y posterior al tratamiento de la reacción, la desprotección de las cadenas laterales de los ácidos glutámico y aspártico mediante hidrogenación catalítica también en THF (Esquema 20).

Esquema 20 Síntesis del ciclolipopéptido 15 La obtención del compuesto 15 se comprueba mediante espectrometría de masas empleando la técnica ESI-MS (Figura 15). [M+Na]+

Figura 15 Espectro ESI-MS del ciclolipopéptido 15 En el espectro se puede apreciar claramente la señal correspondiente al ion [M+Na]+ (m/z = 1102,0 Da, pico base) que coincide con la masa calculada para el ciclolipopéptido 15. 3.3.3 Síntesis del ciclolipopéptido 16 Con el objetivo de evaluar la influencia de la cadena lipídica en la actividad biológica que posee la Surfactina nos propusimos la tarea de obtener un análogo que tuviera en su Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados estructura dos cadenas lipídicas, de esta forma se sintetizó el ciclolipopéptido 16 mediante la reacción de Ugi (Esquema 21). Para su obtención se empleó el heptapéptido N-(3oxopropanoil)-funcionalizado previamente sintetizado en fase sólida disuelto en MeOH con sus componentes ácido y carbonilo, una amina lipídica y además se empleó el isocianuro lipídico 12. La macrociclación ocurrió igualmente mediante la reacción de Ugi y bajo el mismo procedimiento, un día preformando la imina y varios días siguiendo la reacción por CCD hasta que esta hubo concluido. A continuación de la macrociclación se desprotegieron las cadenas laterales de los ácidos glutámico y aspártico mediante hidrogenación catalítica en THF.

Esquema 21 Síntesis del ciclolipopéptido 16 La obtención del compuesto 16 se comprobó mediante espectrometría de masas empleando la técnica ESI-MS (Figura 16). [M+Na]+

Figura 16 Espectro ESI-MS del ciclolipopéptido 16 En el espectro se puede apreciar claramente la señal correspondiente al ion [M+Na]+ (m/z = 1268,9 Da, pico base) que coincide con la masa calculada para el ciclolipopéptido 15.

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Discusión de los resultados 3.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana de los ciclolipopéptidos sintetizados. Con el objetivo de evaluar los resultados de este trabajo se procedió a realizarle ensayos de actividad biológica a los análogos sintetizados. El ensayo consistió en tomar cierto volumen de un cultivo de bacterias fluorescentes del tipo gram-negativas y someterlas a cuatro concentraciones diferentes (1, 10, 100, 1000 mol/L) del ciclolipopéptido obtenido. Cada cierto intervalo de tiempo (1, 2, 3, 4, 5, 6 y 24 horas) se tomó una muestra del cultivo y se midió su luminiscencia para cada valor de concentración de forma tal que se realizaron en total 28 mediciones para cada ciclolipopéptido. Esta medida de la luminiscencia del cultivo no es más que una medida indirecta de la cantidad de bacteria que permanece viva en el medio. Posteriormente se realizó el mismo procedimiento, solo que esta vez en lugar de adicionarle al cultivo uno de los ciclolipopéptidos obtenidos se le adicionaron iguales cantidades de Surfactina comercial y del antibiótico Cloranfenicol. Las mediciones de la luminiscencia del cultivo se realizaron de la misma forma. El último paso del ensayo consistió en tabular los datos obtenidos y realizar una comparación entre los valores medidos. Las tres tablas obtenidas se muestran en la siguiente figura, donde el eje Y siempre representa la variación de la luminiscencia de la muestra y el eje X siempre representa el avance del tiempo en horas. Desafortunadamente para nosotros, solo disponemos de los datos recopilados para el análogo 14, aun así procederemos a realizar un análisis muy preliminar de los resultados tabulados. En el gráfico correspondiente al cloranfenicol se observa que durante las primeras cuatro horas la bacteria es resistente al antibiótico pero a partir de las cinco horas la población de la bacteria comienza a disminuir bruscamente hasta que a las seis horas prácticamente se ha eliminado toda la población, para las 24 horas solo queda bacteria en el experimento donde la cantidad adicionada de cloranfenicol fue la menor. El gráfico de la Surfactina comercial muestra de forma general como la bacteria es resistente a todos los valores de concentración durante las primeras cuatro horas. Al cabo de las cinco horas la población de esta disminuye a un 80% y los mejores resultados se obtienen para la mayor concentración, donde incluso a las siete horas la población de la bacteria se hizo muy pequeña. Comparando el gráfico obtenido para nuestro análogo con el de la Surfactina comercial se puede observar claramente que los perfiles de actividad biológica exhibidos por ambos frente a esta bacteria son muy semejantes, incluso los valores medidos a las ocho horas y a las 24 horas muestran mejores resultados para el análogo sintetizado que para la Surfactina comercial. Valorando a priori los resultados obtenidos Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Discusión de los resultados podemos asegurar que al menos este análogo conserva la actividad biológica de la Surfactina comercial, lo cual da cumplimiento al objetivo general de este trabajo.

Figura 17 Valores de luminiscencia obtenidos para cada cultivo, para cada valor de concentración de la molécula activa (Cloranfenicol, Surfactina comercial o análogo 14). El color azul representa el cultivo sometido a la concentración 1mol/L, el color rojo representa la concentración 10 mol/L, el color verde representa la concentración 100 mol/L y el color violeta representa la concentración 1000mol/L.

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Conclusiones Conclusiones  Se sintetizaron los precursores peptídicos necesarios para obtener los análogos de la Surfactina.  Se demostró que la reacción de Ugi-4C es un método eficiente y versátil para sintetizar análogos de ciclopéptidos naturales N-alquilados.  Se logró obtener un análogo de la Surfactina mediante la reacción de Passerini.  Se comprobó la presencia de los cuatro análogos sintetizados mediante el análisis de sus espectros ESI-MS.  Se comprobó mediante ensayos de actividad biológica que el análogo 14 mantiene el mismo perfil de actividad biológica que el de la Surfactina comercial.  Se argumentó la importancia de tener en cuenta a los ciclolipopéptidos, específicamente a la Surfactina, en el diseño de nuevos fármacos con variado campo de acción.

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Recomendaciones Recomendaciones  Purificar mediante HPLC los cuatro análogos sintetizados.  Realizar ensayos que nos permitan documentar el espectro de actividad biológica de los cuatro análogos sintetizados así como sus propiedades hemolíticas.  Realizar estudios de relación estructura-actividad que validen o no la síntesis de análogos truncados de la Surfactina.

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Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Anexos Anexos

Anexo I: Estructura, nombre y códigos de una y de tres letras de los 22 aminoácidos esenciales:

Alanina (Ala) A

Cisteína (Cys) C

Ácido aspártico (Asp) D

Ácido glutámico (Glu) E

Fenilalanina (Phe) F

Glicina (Gly) G

Histidina (His) H

Isoleucina (Ile) I

Lisina (Lys) K

Leucina (Leu) L

Metionina (Met) M

Asparagina (Asn) N

Pirrolisina (Pyr) O

Prolina (Pro) P

Glutamina (Gln) Q

Arginina (Arg) R

Serina (Ser) S

Treonina (Thr) T

Selenocisteína (Sec) U

Valina (Val) V

Triptófano (Trp) W

Tirosina (Thr) Y

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Anexos

Anexo II: Espectro RMN-1H íntegro del tripéptido 2

Anexo III: Espectro RMN-13C íntegro del tripéptido 2

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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Anexos

Anexo IV: Espectro RMN-1H íntegro del octapéptido 8

Anexo V: Espectro RMN-13C íntegro del octapéptido 8

Síntesis multicomponente de análogos de la Surfactina

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