Soluciones y Bioseguridad Integrantes: Ayala Schimpf, Alan Benitez, Florencia Delgado, Pryscilha Lisowiec Sonclaire, Leandro Rivas, Ricardo Sebastián Roldán, Franco Rosas, Rocío

Asignatura: Genética Molecular

Profesores: Carina Argüelles Roberto Vogler

2015 FCEQyN – UNaM

Trabajo Práctico n° 1: Soluciones y bioseguridad OBJETIVO: El presente trabajo práctico tiene como objetivo principal ejercitar a los alumnos en la preparación de drogas de uso frecuente en el laboratorio de Genética/Biología Molecular y como objetivo secundario que reconozcan las normas de bioseguridad que deben respetarse en el laboratorio. PARTE I: PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Para repasar: Las soluciones pueden representar mezclas homogéneas o heterogéneas. En una solución líquida, el líquido que representa el mayor volumen se reconoce como solvente. Si el solvente es agua, entonces la solución es denominada solución acuosa. Los componentes minoritarios son llamados solutos. Dado que todos los organismos vivos están compuestos principalmente de agua, el estudio de la química de la vida, involucra el estudio de la química de soluciones acuosas. De esta manera, la preparación de soluciones acuosas representa una parte esencial de la biología celular y molecular. Concepto de Concentración: Definir ¿Qué es concentración? ¿Cuáles son las diferentes formas posibles en las que puede ser expresada o descripta una concentración? La concentración es la proporción o relación que hay entre la cantidad de soluto y la cantidad de solvente que hay en una disolución. Se puede expresar son forma física o química, siendo las físicas porcentaje masa-masa (%m/m), porcentaje volumen-volumen (%v/v) y porcentaje masa-volumen (%m-v). Y entre las químicas molalidad, molaridad y normalidad.

CUIDADO! Un molar (1M) de solución contiene un mol de soluto por litro de solución Un milimolar (1mM) de solución contiene un 0.001 mol de soluto por litro de solución Un micromolar (1µM) de solución contiene un 0.000001 mol de soluto por litro de solución Un mol (1 mol) de cualquier sustancia es igual a 6,022 ×1023 mol−1 (número de Avogadro) unidades básicas (RECORDAR: la unidad básica de un elemento son los

átomos. individuales, y la unidad básica de un compuesto son las moléculas individuales). Así, el PM de una sustancia nos indica cuántos gramos pesa un mol de esa sustancia. POR EJEMPLO: El PM del permanganato de potasio (KMnO4) es de 158,04 g/mol. Entonces si tenemos 154,04 g de KMnO4 en un litro de solución la concentración será de 0.975 molar.

IMPORTANTE: “gramo”, “mg”, “litros”, “mol” y “milimol” son todos ejemplos de, unidad de cantidad. Por otro lado “g/L”, “mg/mL”, “milimoles por litro”, “micromolar” y “molar” son TODOS ejemplos de unidades de concentración. Entonces, siempre que sea necesario indicar la cantidad de una sustancia o la concentración de una solución ASEGURARSE QUE SE UTILIZA LA UNIDAD APROPIADA. PRESTAR ATENCIÓN!: la abreviatura para mol (unidad de cantidad) es “m” y la abreviatura para molar (unidad de concentración) es “M”.

¿Por qué necesitamos preparar soluciones con concentraciones específicas de solutos?

Cuando preparamos soluciones en el laboratorio, controlar la concentración de los solutos en la solución es un aspecto crítico. Cuando se falla en el control cuidadoso de la concentración de los solutos en la solución puede causar por ejemplo la muerte de células en un cultivo celular o que las mismas crezcan de manera anormal. De igual forma, la concentración inadecuada de los solutos en solución que contienen biomoléculas puede causar que las biomoléculas se desnaturalicen o se agreguen, volviéndolas de esta forma inactivas!!! . Por otro lado, la concentración de los solutos puede asimismo afectar la velocidad y tipos de reacciones químicas que pueden tener lugar en una solución.

A. Disolver Solutos en un solvente. Este método se utiliza cuando…se requiere una concentración de soluto en solución menor que la solución madre.

Cloroformo/Alcohol isoamílico 24:1 Calcular la cantidad de cloroformo y alcohol isoamílico que será necesario para preparar una solución final de 350 ml. 25 ml de solución ---------------------- 24 ml de cloroformo 350 ml de solución --------------------- x ml de cloroformo

25 ml de solución ---------------------- 1 ml de isoamílico 350 ml de solución --------------------- x ml de isoamílico

En un total de 25 ml de solución tengo 24 ml de cloroformo y 1ml de alcohol isoamílico, entonces para preparar 350 ml de solución se necesitan 14 ml de alcohol isoamílico y 336 ml de cloroformo.

1. 0.5 M EDTA PH 8.0 (disódico) Se preparará 1 litro de esta solución.

1 M --------------------- 292.24 g/l 0,5M ------------------- x g/l

Se necesitan 146.12 g de EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético – sal disodica) para preparar un litro de la solución 0.5 M EDTA.

2. Preparar 160 ml de BrEt (10mg/ml) 1ml Sn --------------------- 10 mg So 160 ml Sn ------------------- x mg So

Para preparar 160 ml de BrEt a una concentración de 10 mg/ml se necesitan 1600 mg de soluto. Colorante ADN.

3. Un becario desea preparar 80 mL de una solución de 1.0 M de TRIS/HCl PH 7,5 ¿Cuánto TRIS deberá pesar para preparar esta solución? 1000 ml Sn --------------------- 121,14g So 80 ml Sn ------------------- x g So

Deberá pesar 9.69 gramos de TRIS/HCL.

El becario pesó correctamente la cantidad de TRIS, luego lo colocó en un beaker, midió 80 mL de H20 destilada con en un cilindro graduado, adicionó el H2Od al beaker, y luego mezcló bien la solución con la ayuda de un agitador y el “stir bar” o buzo hasta que toda el TRIS se disolvió. ¿Qué fue lo que hizo mal el becario? Lo incorrecto fue que agregó el volumen total de 80 mL., cuando lo ideal sería agregar un volumen menor en principio hasta tanto se disolviera el soluto (ya que no contempló el volumen que este ocupaba) y después llevar a volumen final 80 mL.

Si el volumen final de la solución que el preparó fue 95 mL, ¿cuál sería la molaridad real de la solución?

121,14g………….1M ……….1000mL 11,51g…… ….. 1M…………...95 mL 9,69g……………..X= 0,842 M La molaridad real obtenida es de 0,842 M.

4. SDS 10% p/v (Dodecil Sulfato de Sodio) ¿Qué cantidad de droga deberá pesar para preparar 350 ml?

100 ml --------------------- 10 g 350 ml ---------------------- x g

La cantidad de droga que se necesitará pesar será de 35 gramos.

5. TBE 10X Si para preparar 1 litro de esta solución de Tris, Borato, EDTA necesito disolver 108 g de Tris, 55 g de ácido bórico y 7,44 g de EDTA en 600 ml de agua destilada. Y luego ajustar a volumen y conservar a temperatura ambiente. ¿A qué concentración se deben encontrar cada una de las tres drogas en la solución? Las concentraciones respectivas son: TRIS 55 g/l, borato 108 g/l y EDTA 7,44 g/l.

6. SUSTANCIA LIOFILIZADA Se cuenta con 45,2 nmol de una sustancia X (liofilizada). Se necesita preparar con ella una solución stock de [100 μM] ¿Qué volumen de agua destilada se deberá agregar al liofilizado?

1 nm_____________ 0,001 µm 45,2 nm__________x= 0,0452 µm Se necesita una solución stock de 100 µm, de donde tenemos que: 100 µm __________1 L 0,0452 µm________ x= 0,000452 L (equivalente a 0,452 ml)

El volumen necesario de agua destilada que se deberá agregar es de 0,452 ml.

B. Diluir una solución stock existente utilizando la técnica de dilución paralela

Cuando se preparan soluciones es normalmente más fácil diluir una solución stock. Se desea preparar 50 mL de 0,15 M de Cl2Ca a partir de una solución stock de 2.0 M. Para diluir la solución stock es necesario calcular el volumen inicial de la solución de concentración

2

M.

para

lo

cual

se

calcula:

Despejando Vi

Estos 3,75 ml son extraídos de la solución stock. A estos 3,75 ml se le agrega agua destilada hasta alcanzar un volumen de 50 ml.

7. En ciertas oportunidades puede ser necesario preparar varias soluciones que posean cada una diferentes concentraciones del mismo soluto. Esto es conocido como dilución paralela serial. Calcular la cantidad de KMnO4 de una solución stock al 0,01 M y la cantidad de H2Od necesaria para hacer 10 mL de cada una de las siguientes soluciones. Concentración Diluida

1,0 MKMnO4

0,6 mM KMnO4

Volumen necesario de la solución stock de KMnO4 al 0,01 M

NO SE PUEDE PREPARAR DEBIDO A QUE LA SOLUCIÓN QUE SE DESEA PREPARAR ES MÁS CONCENTRADA QUE LA SOLUCIÓN STOCK 0.6 ml

Volumen de H2Od requerida

-

9.4 ml

0,4 mM KMnO4

0.4 ml

9.6 ml

0,2 mM KMnO4

0.2 ml

9.8 ml

100 μM KMnO4

0.1 ml

9.9 ml

50 μM KMnO4

0.05 ml

9.95 ml

20 μM KMnO4

0.02 ml

9.98 ml

C. Diluir una solución stock existente utilizando la técnica de dilución seriada

Existen dos situaciones en las que se deben utilizar las diluciones seriadas preferentemente a las diluciones paralelas.

1. Utilizarla cuando se necesitan varias soluciones del mismo soluto y existe un factor de dilución constante.

2. Utilizarla cuando el factor de dilución es tan grande que la cantidad de solución stock necesaria para realizar la dilución en un paso es tan pequeña que es muy difícil medirla adecuadamente.

Se tiene una solución stock de 1,6 M de sucrosa y se necesita preparar soluciones con la siguientes concentraciones de sucrosa: 0,4 M, 0,1 M, 25 mM, y 6,25 M ¿Cuál es el factor de dilución para esta serie?

La solución 6,25M no se puede realizar porque la solución stock es de menor concentración. El factor de dilución para esta serie es 4.

Se desea preparar cuatro soluciones mediante una dilución serial. La concentración de la solución stock es de 2,7 M y el factor de dilución es 3. ¿Cuál será la molaridad de las cuatro soluciones? Las molaridades serían las siguientes: 0.9 M, 0.3 M, 0.1 M y 0.033 M. Se tiene una solución stock de 1,0 M de glicina y se necesitan 5 mL de una solución 0,1 M. ¿Cuál será el factor de dilución necesario para diluir la solución stock?

El factor de dilución necesario es 10.

¿Cómo realizar una dilución seriada?

Ej. Se tiene una solución stock de ClNa 2 M y se desean preparar 15 mL de cada una de las siguientes concentraciones de ClNa: 0,2 M; 20 mM, 2 mM y 0,2 mM. ¿Cómo prepararían estas diluciones utilizando la técnica de la dilución seriada?

Lo primero a realizar es hallar el factor de dilución:

El factor de dilución es de 10.

15 ml. Sn Stock / 15 ml. de H2O dest. en los 4 tubos

Fd.= 1,67 ml

Descarto fd.

2M

0.2M

20mM

2mM

0.2mM

8. PCR Solución Maestra (o Master Mix) Preparar la Master Mix para un volumen final de 25 μl. (2,5x10-5 L.) La solución debe contener 1 mM Cl2Mg, 25 μM de cada dNTP, 1 μM de cada iniciador o primer (dos), 50 mM ClK y 10 mM de Tris/ClH (pH 8). Las concentraciones stock con las que se cuentan son: 

Cl2Mg 2 M Cf= 10-3 mol



dNTP [200 μM]



ClK 1 M Cf=0.05 mol



Tris/HCl (pH 8) 1 M Cf=0.01mol



Primers [10 μM]

Cl2Mg 2 M x Vi = 0,001 M Cl2Mg x 25µl Vi =0,0125µl

dNTP 200 µM x Vi = 25 µM de cada dNTP x 25µl Vi = 3,125µl

ClK 1 M x Vi = 0,05 M ClK x 25µl Vi = 1,25µl

Tris/HCl 1 M x Vi = 0,01 mM de Tris/ClH x 25µl Vi = 0,25µl

Primers 10 µM x Vi = 1 µM primer x 25µl

Vi =2,5µl

Volumen inicial: 

Cl2Mg 2 M: 1.25x10-8 L



dNTP [200 μM]: 3.125x10-6 L



ClK 1 M: 1.25x10-6 L



Tris/HCl (pH 8) 1 M: 2.5x10-7 L



Primers [10 μM]: 2.5x10-6 L 9. Es necesario realizar una reacción de amplificación específica. Para ello se requieren preparar 20 μl de primers por cada reacción a una concentración de 10 pmol/μl = 60 ng/μl. ¿Qué volumen de la solución stock del primer “Cbra_F” que posee una concentración de 100 μM necesitará para realizar 8 reacciones de amplificación? ¿Cuál es la concentración de la dilución preparada del primer “Cbra_F”, expresada en μM?

100 µM Sn stock primers x Vi = 10 µM primers x 20µl Vi = 2µl se necesitan para un ciclo. Para 8 ciclos se necesitaran 16µl.

La disolución tendrá una concentración de 10 µM.

10. ¿Cómo ajustaría UD. el pH a 5.2, de una solución de Acetato de Potasio 2 M? Se realiza el ajuste del pH con ácido clorhídrico, midiendo el volumen que se agrega de este para posteriormente restárselo al total. (También se puede medir el volumen inicial y restar al volumen total final para saber el volumen agregado de HCl)

PARTE II: BIOSEGURIDAD

1-

Detalle cuáles son los cuidados y normas de bioseguridad (biológica, química y

física) que debe reunir un laboratorio con riesgo biológico. 2-

Detalle la bibliografía consultada

1- Detalle cuáles son los cuidados y normas de bioseguridad (biológica, química y física) que debe reunir un laboratorio con riesgo biológico. Normas generales No fumes, comas o bebas en el laboratorio. Utiliza una bata y tenla siempre bien abrochada, así protegerás tu ropa. Guarda tus prendas de abrigo y los objetos personales en un armario o taquilla y no los dejes nunca sobre la mesa de trabajo. No lleves bufandas, pañuelos largos ni prendas u objetos que dificulten tu movilidad. Procura no andar de un lado para otro sin motivo y, sobre todo, no corras dentro del laboratorio. Si tienes el cabello largo, recógetelo. Dispón sobre la mesa sólo los libros y cuadernos que sean necesarios. Ten siempre tus manos limpias y secas. Si tienes alguna herida, tápala. No pruebes ni ingieras los productos. En caso de producirse un accidente, quemadura o lesión, comunícalo inmediatamente al profesor. Recuerda dónde está situado el botiquín. Mantén el área de trabajo limpia y ordenada. -6Normas para manipular instrumentos y productos Antes de manipular un aparato o montaje eléctrico, desconéctalo de la red eléctrica. No pongas en funcionamiento un circuito eléctrico sin que el profesor haya revisado la instalación. No utilices ninguna herramienta o máquina sin conocer su uso, funcionamiento y normas de seguridad específicas. Maneja con especial cuidado el material frágil, por ejemplo, el vidrio. Informa al profesor del material roto o averiado. Fíjate en los signos de peligrosidad que aparecen en los frascos de los productos químicos. Lávate las manos con jabón después de tocar cualquier producto químico.

Al acabar la práctica, limpia y ordena el material utilizado. Si te salpicas accidentalmente, lava la zona afectada con agua abundante. Si salpicas la mesa, límpiala con agua y sécala después con un paño. Evita el contacto con fuentes de calor. No manipules cerca de ellas sustancias inflamables. Para sujetar el instrumental de vidrio y retirarlo del fuego, utiliza pinzas de madera. Cuando calientes los tubos de ensayo con la ayuda de dichas pinzas, procura darles cierta inclinación. Nunca mires directamente al interior del tubo por su abertura ni dirijas esta hacia algún compañero. Todos los productos inflamables deben almacenarse en un lugar adecuado y separados de los ácidos, las bases y los reactivos oxidantes. Los ácidos y las bases fuertes han de manejarse con mucha precaución, ya que la mayoría son corrosivos y, si caen sobre la piel o la ropa, pueden producir heridas y quemaduras importantes. Si tienes que mezclar algún ácido (por ejemplo, ácido sulfúrico) con agua, añade el ácido sobre el agua, nunca al contrario, pues el ácido «saltaría» y podría provocarte quemaduras en la cara y los ojos. No dejes destapados los frascos ni aspires su contenido. Muchas sustancias líquidas (alcohol, éter, cloroformo, amoníaco...) emiten vapores tóxicos.

3- Bibliografía consultada 

Manual de bioseguridad en el laboratorio. OMS (Organización Mundial de la Salud)

Ginebra, 1983. 

Manual de bioseguridad para técnicos de laboratorio. Lucero N; Coto C. Acata.

Bioquímica Clínica Latinoamericana. Supl Nº2, 1992.