SSI® DERMATOPHYTE PCR KIT PRUEBA PCR DERMATOFITO

2

Prueba de PCR para la detección de dermatofitos y Trichophyton rubrum Para uso diagnóstico in vitro

Aplicación La prueba de PCR para dermatofitos en uñas ha sido desarrollada para su uso en la detección diagnóstica in vitro de dermatofitos en general (pan-dermatofitos) y, específicamente, Trichophyton rubrum. Descripción La prueba incluye un tampón A y otro B para la preparación de muestras, una PCR ReadyMix (que incluye tampón de carga), un cebador y dos muestras de ADN de control. El cebador contiene dos pares de base dirigidas a la codificación genética de la quitina sintetasa 1 para la detección de dermatofitos en general y ITS2 (espaciador interno de transcriptasa) para la detección de T. rubrum. Todas las bases son oligonucleótidos de secuencia única sintéticos con terminaciones de 5’- y 3’-hidroxil libres. Se añade al cebador plásmido de control interno que funciona como muestra para las bases 3

específicas de T. rubrum. El control 1 consiste en un ADN genómico de dermatofito y el control 2 consiste en un ADN genómico de T. rubrum. El kit contiene los suficientes reactivos para realizar 100 reacciones PCR multiplex. Antecedentes Las infecciones en las uñas están causadas principalmente por T. rubrum y T. mentagrophytes. Tradicionalmente, el tiempo necesario para la identificación de las especies mediante cultivo varia desde 10 y 15 días hasta 3 ó 4 semanas. Este método de diagnóstico basado en PCR 1 puede detectar dermatofitos en general y, específicamente, T. rubrum en 5 horas. A continuación se describen los tamaños de los amplicones para la identificación de un dermatofito en general o un T. rubrum. Gen

chs1 its2 ADN recombinante

Detección

Tamaño del amplicón (pb) Pan-dermatofitos 366 T. rubrum 203 Control interno ~660

4

Materiales necesarios no incluidos Gel de agarosa 2.0 % Marcador de ADN Tubos para la preparación de muetras Procedimiento La preparación de muestras y la configuración PCR deberán realizarse en áreas específicas libres de posibles contaminantes. Preparación del ADN 1. Añada 100 µL de tampón A a la muestra de uña e incube a 95 ºC durante 10 minutos*. 2. Inmediatamente, añada 100 µL de tampón B y mezcle en el vortex. La muestra está lista para realizar la PCR.

* Si la muestra de uña es de gran tamaño, deberá aumentarse la cantidad de tampón A para cubrir la muestra. Aumente el volumen del tampón B en la misma medida.

Configuración de PCR 3. Prepare la master mix (PCR ReadyMix y cebador) acorde a la cantidad de muestras a analizar y dispense 18 µL de la mezcla en cada tubo. Cada tubo debe contener la siguiente cantidad de reactivos:

5

Muestra de uña

Control Control Control positivo Pan-derm. negativo positivo T. rubrum

PCR ReadyMix

10,0 µL

10,0 µL

10,0 µL

10,0 µL

Cebador

8,0 µL

8,0 µL

8,0 µL

8,0 µL

Muestra de uña

2,0 µL

-

-

-

ADN T. rubrum

-

2,0 µL

-

-

ADN Pan-derm.

-

-

2,0 µL

-

Mezcla Tampón*1

-

-

-

2,0 µL

20,0 µL

20,0 µL

20,0 µL

20,0 µL

Total

*1 Mezcla de tampón A y tampón B en una proporción de 1:1.

4. Realice la amplificación de la PCR en el termociclador bajo las siguientes condiciones.

6

Paso

Temp. (ºC)

Tiempo

94

5 min.

Desnaturalización inicial 45 ciclos de: Desnaturalización

94

30 seg.

Hibridación

60

30 seg.

Extensión

72

30 seg.

Extensión final

72

3 min.

5. Coloque 18 µL de cada muestra de PCR amplificada en pocillos independientes en gel de agarosa al 2%. Interpretación de los resultados El gráfico muestra los resultados de PCR en comparación con un DNA Ladder de 100 pb. Una muestra de uña positiva en T. rubrum a menudo ofrece una banda fuerte de 203 pb y una banda más débil o inexistente a 366 pb debido al número de copia relativa superior de its2 en comparación con chs1. Del mismo modo, una muestra de uña positiva, a menudo, ofrece como resultado una banda de control interna débil o inexistente debido a las concentraciones relativas altas de pan-dermatofitos.

7

1

2

3

4

5

6

7

1500 pb Control interno (~660 pb)

600 pb

Pan-dermatofitos (366 pb) T. rubrum (203 pb) 100 pb

Figura 1. Análisis de producto específico de T. rubrum y PCR multiplex de pan-dermatofitos. Pocillo 1: Marcador de tamaño molecular (DNA Ladder de 100 pb); Pocillo 2: ADN genómico de dermatofito (control 1); Pocillo 3: ADN genómico de T. rubrum (control 2); Pocillo 4: Muestra de uña positivo en pan-dermatofitos (débil); Pocillo 5: Muestra de uña positivo en pan-dermatofitos (fuerte); Pocillo 6: Muestra de uña positivo en T. rubrum; Calle 7: Muestra de uña negativo.

Especificidad Se analizaronun total de 118 muestras de uñas en busca de infecciones de pan-dermatofitos o de T. rubrum siguiendo tanto el método de PCR multiplex como los métodos convencionales (microscopía y/o cultivo) 1. Los resultados fueron positivos para pan-dermatofitos en el 42,4 % de las muestras mediante PCR, mientras que el 38,1 % dio positivo con los métodos convencionales. La sensibilidad de la identificación 8

de pan-dermatofitos en muestras de uñas se aumentó en en un 4,3 % mediante el método de PCR multiplex. Además, la prueba mostró que la sensibilidad para la identificación de T. rubrum aumentó en un 18,6 % con el diagnóstico basado en PCR (ver tabla).

Pan-dermatophytes

T. rubrum

Métodos convencionales

38,1 %

22,9 %

PCR

42,4 %

41,5 %

4,3 %

18,6 %

Aumento de sensibilidad

9

Conservación y caducidad Conservar a -20 ºC. La fecha de caducidad del kit está impresa en la etiqueta. Referencias 1. Brillowska-Dabrowska, A., Saunte, D. M. and Arendrup, M. C. 2007. Five-Hour Diagnosis of Dermatophyte Nail Infection with Specific Detection of Trichophyton rubrum. Jour. Clin. Microbiol. 1200-1204.

10

11

SSI Diagnostica Herredsvejen 2 DK-3400 Hillerød Dinamarca

T F @ w

Statens Serum Institut • 1a edición • Mayo 2013 • 89958

+45 4829 9178 +45 4829 9179 [email protected] ssi.dk/ssidiagnostica