SIP 20082569 Estudio de la antigenicidad de proteínas estructurales del fago Tbilisi de Brucella Dra. Rosa Ma. Ahidé López Merino, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

RESUMEN Los fagos de Brucella se han encontrado compartiendo el habitat con las bacterias, por lo que han sido aislados de muestras de sangre, leche, heces y otras. A la fecha no se han descrito las proteínas que constituyen los brucellafagos así como su presencia en los hospederos. Con la finalidad de estudiar las proteínas que constituyen al brucellafago Tbilisi y determinar si son antigénicas para el humano. En este proyecto se propuso ensayar y estandarizar técnicas de fraccionamiento para separar las proteínas del fago Tbilisi y efectuar su análisis integral. Como se mencionó, Corbel y Thomas en 1980 demostraron que algunos fagos de Brucella eran capaces de inducir anticuerpos al inocularlos a conejos, además que desde el punto de vista antigénico eran muy semejantes entre si. Por lo anterior se propuso llevar a cabo un estudio encaminado a determinar la antigenicidad de las proteínas estructurales

del

fago

Tbilisi.

Al

mismo

tiempo

los

resultados

aportarían

conocimiento acerca de la proteómica del brucellafago , hasta ahora poco estudiada ANTECEDENTES La brucelosis o fiebre de Malta es una zoonósis de distribución mundialy es una de las más importantes en el país. En humanos la incidencia de la brucelosis esta directamente relacionada con la densidad de rebaños de vacas, cabras y ovejas, del grado de la endemia, del nivel socioeconómico y los hábitos alimenticios. Afecta también a otras especies de animales domésticos y silvestres. Causa pérdidas económicas cuantiosas en la industria pecuaria.

Las brucelas se

encuentran en gran número en la leche y productos del aborto de animales infectados por ello se infectan veterinarios, granjeros y otros que están en contacto con estos productos, a través del consumo de leche y derivados contaminados se infecta gran cantidad de consumidores. Es una enfermedad multisistémica en el humano con clínica poco específica. Los signos clínicos en general son fiebre 1

sudoración, cefalea, fatiga, y daño a órganos del sistema retículo endotelial, como artritis, síntomas neurológicos, orquitis, meningitis y endocarditis, pudiendo incluso llevar a la muerte del individuo (López Merino 2004). La brucelosis humana es una enfermedad que cursa con accesos febriles intermitentes, puede presentarse de manera aguda, crónica y subclínica. La enfermedad, en México, principalmente se adquiere por el consumo de lácteos contaminados con Brucella, en menor frecuencia mediante la infección a partir de los aerosoles de esta bacteria generados en los ambientes en donde se encuentra (materia abortiva, suelo, cultivos masivos). (López Merino 2004). Brucella consta de especies terrestres y marinas, con preferencia clara hacía su hospedero, entre las primeras se tienen a B. abortus que infecta bovinos, B. melitensis a caprinos y ovinos, B. suis a cerdos, B. canis a cánidos, B. ovis a ovinos y B. neotomae a roedores. Aún no se han dilucidado las bases genéticas que regulan la preferencia de Brucella por ciertos hospederos (Godfroid 2005). Los brucellafagos son un grupo altamente específico de fagos que infectan bacterias del género Brucella; pertenecen a la familia Podoviridae, se ha reportado que no contienen fibras caudales, ni collar. Su material genético consta de DNA de doble cadena lineal de aproximadamente 38 Kb en todos ellos. Los fagos de Brucella han sido clasificados en siete grupos, cada uno de ellos presenta uno o varios hospederos preferenciales, sin embargo todos son similares en cuanto a sus perfiles de restricción (Douglas 1976; Morris 1973; Rigby 1988). Los brucellafagos aislados hasta el momento, muestran carácter lítico, sin embargo, no se descarta el estado de pseudolisogenia o estado acarreador de fago. El brucellafago Tblisi (Tb), aislado en la URSS, por su estabilidad y especificidad hacia cepas lisas de B. abortus y algunas de B. neotomae, ha sido considerado el brucellafago de referencia. Se ha empleado en la tipificación de cepas de Brucella en muchos laboratorios del mundo. (Rigby 1988) En el caso de los brucellafagos, no se conoce con certeza que moléculas codificadas en cuales genes participan en la infección fágica, solo se ha especulado acerca de las moléculas que participan en la infección (Brussow & Hendrix 2002, Corbel & Phillip. 1972).

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Los brucellafagos comparten entre sí características como su forma, tamaño del

virus,

tamaño

de

su

genoma

y

patrones

de

restricción

enzimática.

Aparentemente, forman un grupo de fagos muy conservado quizás con mínimas variaciones a lo largo de su existencia (Segondy y col. 1988). La morfología de los brucellafagos ha sido empleada como una característica importante en su clasificación. Sin embargo, algunos autores han sugerido un método alternativo de clasificación basado en la similitud de las proteínas fágicas. (Rowhwer & Edwards, 2002) Por otro lado, las proteínas estructurales, como la cápside, tienen la cualidad de inducir la formación de anticuerpos en los hospederos inoculados (Corbel & Thomas, 1980 y Ackerman 2003). Los fagos de Brucella se han encontrado compartiendo su habitat con las bacterias, y han sido aislados de muestras de sangre, leche, heces y otras. A la fecha no se han descrito las proteínas que constituyen los brucellafagos y puesto que están presentes en los hospederos, se puede especular que las proteínas fágicas serían antígenos potenciales que podrían inducir la síntesis de anticuerpos en los animales que infectan, como fue demostrado previamente en el modelo ratón Corbel & Thomas,1980). En este contexto, la identificación y caracterización de las proteínas presentes en los fagos resultaría interesante para diversos fines. Los brucellafagos pertenecen a la familia Podoviridae, y están constituidos de una proteína principal denominada cápside, así mismo contendrían proteínas de la cauda, conectoras y otras como un disco en donde se unirían las fibras de la cola. Con la finalidad de estudiar las proteínas que constituyen al brucellafago Tbilisi y determinar si son antigénicas para el humano, en este proyecto se propuso emplear técnicas de fraccionamiento para separar las proteínas y efectuar su análisis posterior. Como ya se mencionó Corbel y Thomas en 1980 demostraron que algunos fagos de Brucella eran capaces de inducir anticuerpos al inocularlos a conejos, además que desde el punto de vista antigénico eran muy semejantes entre si. Por lo anterior se propuso llevar a cabo un estudio encaminado a determinar la antigenicidad de las proteínas estructurales

del

fago

Tbilisi.

Al

mismo

tiempo

los

resultados

aportarían

conocimiento acerca de la proteómica del brucellafago , hasta ahora poco estudiada (Rohwer & Edwards, 2002). 3

OBJETIVO Determinar la antigenicidad de las proteínas estructurales del fago Tbilisi que infecta cepas de Brucella MATERIAL Y MÉTODOS Cepas bacterianas.- Para el estudio, se empleó la cepa de referencia Brucella abortus 544, (ATCC 23448) se cultivó en medio Agar Soya Tripticaseína-Extracto de Levadura (TSA-EL) a 37°C durante 48 h bajo una atmósfera de CO2 al 5%. Esta cepa fue empleada para la producción de partículas fágicas. Fago Tbilisi.- Considerado fago de referencia fue obtenido del Instituto Gamaleya, Rusia (Corbel & Morris, 1980) El fago de referencia Tbilisi (Tb) fue propagado a partir de abastos conservados a 70°C en tolueno; el fago Tbilisi fue propagado en 5 ml de caldo soya tripticaseína (TSB) inoculado con Brucella abortus 544 con una multiplicidad de infección (MOI) de 0.1, esta mezcla se incubó a 37 °C durante 48 h con agitación orbital de 140 rpm. Una vez concluido el tiempo de propagación se centrifugó la propagación a 10,000 × g durante 15 min, separando el sobrenadante, el cual fue filtrado a través de una membrana estéril de 0.22 µm de diámetro de poro. Esta propagación fue escalada a un volumen de 50 mL y posteriormente a un volumen de 1 L. Propagación del fago Tbilisi a gran escala.- Se preparó una suspensión bacteriana de B. abortus 544 en un volumen de 15 ml ajustada al tubo 10 del nefelómetro de McFarland. Dicha suspensión se transfirió a un matraz de 2 L con 1500 ml de caldo Triptosa Fosfato Extracto de levadura, al mismo matraz se le adicionaron 15 ml de una suspensión fágica (Tb), conservando una multiplicidad de infección de 0.1 con respecto a las bacterias. Los matraces se incubaron a 37°C por 72 h con agitación orbital a 140 rpm. Luego de la incubación, se procedió a remover remanentes celulares mediante centrifugación a 10,000 x g durante 15 min a 4°C. Después se filtró el sobrenadante a través de una membrana estéril con poros de 0.22 micras. Una vez terminada la incubación de la última propagación, se agregaron 100 µL de RNAsa A 10 mg/mL y 100 µL de DNAsa I 10 mg/mL al matraz, se incubó 1 h a 37°C con la finalidad de eliminar DNA y RNA de la célula hospedera. 4

El sobrenadante fue filtrado utilizando un dispositivo SteriCup de 500 ml (Millipore®), con la finalidad de eliminar todas las bacterias que hubiesen quedado. Purificación del fago Tb (Método de Sambrook modificado 2001). Al filtrado anterior se adicionó Polietilenglicol (PEG) 8,000 sólido hasta alcanzar una concentración final del 10% además de NaCl granulado hasta una concentración de 1M. Las partículas fágicas se precipitaron por acción del PEG. Esta mezcla se mantuvo a 4°C durante 24 horas y pasado este tiempo se centrifugó a 10,000 × g durante 20 minutos, se descartó el sobrenadante. El sedimento, en donde se encontraban concentradas las partículas fágicas, fue resuspendido en 5 mL de Imidazol 10 mM y se realizaron dos extracciones con cloroformo, en cada una de ellas se adicionaron 5 mL de cloroformo, la suspensión se agitó vigorosamente hasta emulsificarla, posteriormente se centrifugó a 11000 × g durante 20 min, se colectó la fase acuosa y se transfirió a un tubo nuevo estéril. Titulación de las suspensiones fágicas.- La suspensión fágica obtenida en cada etapa de la propagación y la purificación fueron tituladas, 100 ul de una suspensión bacteriana de cada cepa propagadora con 100 ul de cada una de las diluciones de la suspensión fágica a titular (10-1 - 10-15) se colocaron en tubos con agar blando fundido. Esta mezcla se vertió en cajas de Petri que ya contenían una capa delgada de agar TSA-EL y se dejó solidificar. Luego de 24 h de incubación a 37°C se contaron las placas líticas. El título de la suspensión correspondió al número de placas contadas, multiplicadas por el inverso de la dilución y multiplicado por el inverso de la alícuota empleada por ml. Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS). La electroforesis se realizó utilizando geles de poliacrilamida al 10, 12.5, 15 y 17.5% en regulador de Tris-HCl 1.5M, pH 8.8, se utilizó la cámara Mini-PROTEAN II (Bio-Rad). Los geles se prepararon con separadores de 1.5mm de grosor y con un gel concentrador al 5% de poliacrilamida en regulador de Tris-HCl 0.5M, pH 6.8, en condiciones desnaturalizantes empleando SDS al 10%. Las partículas fágicas purificadas se resuspendieron en regulador de muestra

(Tris 0.5M pH 6.8, SDS 5

10%, 2-mercaptoetanol 5%, glicerol 20% y azul de bromofenol 0.01%) y se calentaron a ebullición durante 4 minutos. Se cargó una determinada cantidad de cada muestra en función de la concentración de proteína obtenida. Se utilizó un marcador de tamaño molecular SigmaMarker Wide range de Sigma® (miosina, 200 kDa; beta galactosidasa, 116 kDa; fosforilasa b, 97 kDa; albúmina, 66 kDa; glutamato deshidrogenasa, 55 kDa; ovoalbúmina, 45 kDa; gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa, 36 kDa; anhidrasa carbónica, 29 kDa; tripsinogeno, 24 kDa; inhibidor de trispsina, 20 kDa; lactoalbúmina 14.2 kDa; aprotinina 6.5 kDa.) para determinar el peso molecular aparente de las proteínas. El corrimiento electroforético se realizó en un regulador de corrimiento de Trisglicina-SDS pH 8.3. Se utilizó una corriente de 30mA hasta concluir el corrimiento. Concluida la separación electroforética de las proteínas en los geles, se realizó una tinción con azul de Coomassie en los mismos, para observar el perfil de proteínas. Para calcular el peso molecular de las proteínas se utilizó el programa de computo Sigma-Gel® V.1.0.

RESULTADOS La cuantificación de proteínas se realizó por el método de PIERCE®-BCA, se calculó una concentración de 1.8 mg/mL de proteína con base a la ecuación obtenida posterior a la linearización de la curva obtenida. En la figura 1 se muestra la curva de proteínas empleada para determinar la concentración de proteínas presentes en la suspensión fágica.

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Figura 1 Curva de concentración de proteínas contra absorbencia a 562 nm de acuerdo al método PIERCE ® BCA, la línea azul indica los datos obtenidos, mientras que la línea negra indica la curva linearizada, de igual forma, se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación obtenido.

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La electroforesis de las proteínas fágicas se realizó utilizando geles de poliacrilamida al 15%, concentración con la que se obtuvo la mejor separación de los diferentes componentes proteícos. Posterior a la separación, los geles se tiñeron con azul de Coomassie. En la figura 2 se observa el perfil proteico obtenido, suponemos que la banda mas intensa correspondería a la proteína de la cápside Figura 2. Perfil electroforético de las proteínas estructurales del fago Tbilisi

97 55

66 45

Proteína de la cápside

36 29 24 20 14 6.5

Figura 2 Electroforesis en gel de poliacrilamida mostrando las proteínas estructurales del Brucellafago Tb, en el carril izquierdo se muestra un marcador de peso molecular indicando el peso en kilodalton (kDa) de cada banda, en el carril derecho se muestra el patrón electroforético de las proteínas del fago Tb

Secuenciación de proteínas por LC-MS/MS.Por así convenir al desarrollo del proyecto, se continuó con la secuenciación de las proteínas estructurales del fago Tbilisi. La suspensión fágica concentrada se desnaturalizó corrió en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12.5% y el gel fue teñido con azul de Coomassie y 8

enviado para su secuenciación en el Instituto de Biotecnología (IBT-UNAM) Campus Morelos mediante la técnica de LC-MS/MS. La huella peptídica obtenida para cada una de las proteínas detectadas por LC-MS/MS fueron analizadas con el programa Sequest software de Finnigan (Palo Alto, CA, USA) y el programa Mascot search engine de Matrix Science Ltd. (Boston, MA). Las proteínas hidrolizadas dieron lugar a diferentes péptidos los cuales fueron identificados en el genoma del brucellafago Tb. En la tabla 1 y 2 se muestran algunos de los péptidos generados. Así como algunas de sus características. Tabla 1 Péptidos obtenidos en la secuenciación de la banda con un tamaño entre 45 y 66 kDa Precursor Ion/MW 873.8/1475.6

RT (min) 71.13

818/1634.0

74.40

940/1878.0 997/1992.0

75.43 80.61

1240/2478.0

83.15

1036/2070.0

83.33

718.8/1435.6

84.30

1141/2280.0

88.55

1320/2638.0

92.02

1508/3014.0

99.30

Sequence EIQDIVYNATPLT R …QMPDLVYD EMDGLSAL… ETNGDVSGFTT WDS QAVVLFLT QAVVLDEG ELLNSAVFNWSR GGALTLQLVPLQ G ALSAQAN VWDNRNVLENQ …

Tabla 2 Péptidos obtenidos en la secuenciación de la banda con un tamaño entre 6.5 y 14 kDa Precursor Ion/MW 1344/2686.0

RT (min) 21.4

1303/2604.0

27.9

1647/3292.0

29.8

Sequence …VQVLAK …DLDQVWLYD … …QANASLPVTLA T… 9

1705/3408.0

31.6

1106/2210.0

26.0

1931/3860.0

34.0

…VAVPNAMLPG … …FDNVLVELVD … …PATFPATV…

Se identificaron las proteínas de la cápside del brucellafago y las del collar además hay otras bandas que no fueron identificadas con los programas con los que se cuenta. Hay que señalar que existe un numero limitado de secuencias de bacteriófagos disponibles en las bases de datos (referencias de bioinformática) por lo que no se ha podido concluir con el análisis, se tendrá que recurrir a otra metodología que no es gratuita. Finalmente por medio del método de inmunotransferencia o Western Blot se determinó que en los pacientes estudiados existen anticuerpos contra la cápside del fago Tbilisi. Este hecho es de gran trascendencia ya que significaría una herramienta alternativa para determinar la existencia de la bacteria en estos individuos. Referencias 1. Ackermann, H.-W. 2003. Bacteriophage observations and evolution. Res. Microbiol. 154: 245-251. 2. Brussow, H. y R. W. Hendrix (2002). Phage genomics: small is beautiful. Cell 108(1): 13-16. 3. Chain, P.S.G., D.J. Comerci & col. (2005). Whole-Genome Analyses of Speciation Events in Pathogenic Brucellae. Infect Immun 73(12): 8353-8361. 4. Corbel, M.J. & J.L. Phillip. 1972. The relationship of Brucella abortus agglutinogenic antigens to the receptor sites for Tbilisi Phage. Res. Vet. Sci. 13, 91-93. 5. Corbel, M.J. & E.L. Thomas. 1980. The Brucellaphages: Their properties characterization and applications. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food. Weybridge. 6. Corbel, M.J. & J.A. Morris. 1980 Investigatio nof the effect o brucella-phage on the course of experimental infection with Brucella abortus. Br. Vet. J. 136: 278-289. 7. Douglas, J. T. & S. S. Elberg (1976). Isolation of Brucella melitensis phage of broad biotype and species specificity. Infect Immun 14(1): 306-308. 8. Dupont, K., F. K. Vogensen y col. (2004). Identification of the receptor binding protein 936-species Lactococcal bacteriophages. Appl Environ Microbiol 70(10): 5818-5824. 9. Godfroid, J., A. Cloeckaert & col. (2005). From the discovery of the Malta fever's agent to the discovery of a marine mammal reservoir, brucellosis has continuously been a re-emerging zoonosis. Vet Res 36: 313-326.

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10.López Merino A. y A. Contreras Rodríguez.2004. Brucella. Capítulo 10, en Microbios en línea. Editores E. Martínez Romero y J. Martínez Romero. Asociación Mexicana de Microbiología A. C. http://www.microbiologia.org.mx/microbiosenlinea/ 11.Morris, J.A., M.J. Corbel & col. (1973). Characterization of three phages lytic for Brucella species. Journal of general Virology (20): 63-73. 12.Nordsröm, K., A. Forsgreen & col. (1974). Prevention of bacteriophage adsorption to Staphylococcus aureus by immunoglobulin G. J Virol 14(2): 203-206. 13.Rigby, C.E., M.L.C. Campos & col. (1988). Properties and partial genetic characterization of Nepean phage and other lytic phages of Brucella species. Can J Vet Res (53): 319-325. 14.Rohwer, F. y R. Edwards (2002). The phage proteomic tree: a genome-based taxonomy for phage. J Bacteriol184(16): 4529-4535. 15.Sambrook, J. y D. W. Russell (2001). Molecular cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, Cold Harbor Spring Press. 16.Segondy, M., A. Allardet-Servent y col. (1988). Common physical map of four Brucella bacteriophage genomes. FEMS Microbiol Lett 56(2): 177-181. 17.Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 76:4350-4354. Referencias bioinformáticas Ncbi Conserved Domains Database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi? InterProScan http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/? SBASEWEB http://hydra.icgeb.trieste.it/servers/protein/sbase/sbase.php?sec=analyse&sub=pre dict INCA INCA: synonymous codon usage analysis and clustering by means of self-organizing map Fran Supek

1*

Kristian Vlahovi ek

2*

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IMPACTO Con base en la secuencia encontrada se puede proponer que las bandas de proteínas encontradas corresponderían a las siguientes proteínas fágicas: - la mas abundante a la proteína de la cápside - por primera vez se han encontrado proteínas que corresponden al collar del virus, este es un hallazgo importante ya que no se había reportado con anterioridad, junto con esto se esperaría que alguna de las bandas obtenidas correspondiera a las fibras caudales, se continuará con el análisis bioinformático de estos péptidos que han sido un hallazgo inesperado y de suma importancia en la proteómica de fagos de Brucella. Cabe mencionar que es el único grupo mexicano que se encuentra abordando estos aspectos de las proteomica de los fagos de Brucella. Además desde el punto de vista inmunológico, es la primera vez que se realiza la búsqueda de anticuerpos anti-proteínas de brucellafagos y se encuentran, la aplicación que puede tener en el diagnóstico deberá ser evaluada, ya que sería un método alternativo al cultivo de la bacteria o al método sexológico.

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