´ ´ TECNICAS INTELIGENTES EN BIOINFORMATICA Modelizaci´ on de la regulaci´ on g´ enica en procariotas El Oper´ on Lactosa Mario de J. P´ erez Jim´ enez Grupo de investigaci´ on en Computaci´ on Natural Dpto. Ciencias de la Computaci´ on e Inteligencia Artificial Universidad de Sevilla

M´ aster Universitario en L´ ogica, Computaci´ on e Inteligencia Artificial Curso 2013-14

Introducci´ on Cantidad de prote´ınas que produce un gen activo por unidad de tiempo: var´ıa seg´ un las necesidades de la c´elula. El nivel de expresi´ on de los genes variar´ a seg´ un las condiciones ambientales, el nivel de diferenciaci´ on de la c´elula etc. S´ıntesis de prote´ınas: alto coste energ´etico (hay que regular este proceso). La regulaci´ on se puede dar a nivel de la transcripci´ on o de la traducci´ on ? Lo m´ as directo es regular su tasa de transcripci´ on del gen en mol´ eculas de RNAm, por parte de la RNA-polimerasa.

Diferencias importantes entre los sistemas de regulaci´ on de genes: ´nico RNAm (policistr´ onicos). ? En c´ elulas procariotas varios genes pueden ser codificados por un u ? En c´ elulas eucariotas un RNAm s´ olo puede codificar un gen (monocistr´ onicos).

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Sistemas de regulaci´ on

? Positivo: una mol´ecula efectora activa un promotor (no hay que anular ning´ un inhibidor). ? Negativo: un inhibidor (represor) puede evitar la transcripci´ on y, para la transcripci´ on, es necesario inhibir al inhibidor (mediante un inductor); todas las o ´rdenes de regulaci´ on son negativas. Un sistema pueder estar regulado, a la vez, positiva y negativamente.

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Concepto de oper´ on Un oper´ on es un conjunto de genes cuya expresi´ on est´ a regulada por los mismos elementos de control (promotor y operador) y los mismos genes. Elementos que constituyen un oper´ on: I

Los genes estructurales: son los genes cuya expresi´ on est´ a regulada. Los operones bacterianos suelen contener varios genes estructurales (policistr´ onicos). Los operones eucari´ oticos suelen contener un s´ olo gen estructural (monocistr´ onicos).

I

El promotor (P): es un elemento de control, una regi´ on del DNA que es reconocida por la RNA polimerasa para comenzar la transcripci´ on. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales.

I

El operador (O): es otro elemento de control, una regi´ on del DNA con una secuencia que es reconocida por la prote´ına reguladora. Est´ a situado entre la regi´ on promotora y los genes estructurales.

I

El gen regulador: secuencia de DNA que codifica la prote´ına reguladora. Suele estar situado cerca de los

I

Prote´ına reguladora: prote´ına codificada por el gen regulador y suele unirse al operador del operon.

I

Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresi´ on de los genes estructurales.

genes estructurales del oper´ on pero no inmediatamente al lado.

Un oper´ on se transcribe en una s´ ola cadena de RNAm a partir de un u ´nico promotor. 5 / 51

Promotores de un oper´ on

El inicio de la transcripci´ on puede estar regulado por una prote´ına represora. I

Ejemplo: la s´ıntesis del tript´ ofano en la bacteria E. coli. • La prote´ına represora necesita al tript´ ofano para unirse al operador e inhibir el proceso.

Promotores de un oper´ on: I Fuerte: en ausencia del represor, la tasa de uni´ on de la RNA-polimerasa

es muy alta. I D´ ebil: en ausencia del represor, no son capaces de iniciar la transcripci´ on

por s´ı solos de forma efectiva. • Necesitan una prote´ına activadora.

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El Oper´ on Tript´ ofano

Tiene cinco genes estructurales: trpE-trpD-trpC-trpB-trpA (¡en este orden!). I

Las enzimas codificadas por estos cinco genes act´ uan en la ruta metab´ olica de s´ıntesis del tript´ ofano en el mismo orden en el que se encuentran los genes en el cromosoma.

El promotor y el operador est´ an al lado de los genes estructurales I

Primero el promotor y despu´ es el operador.

El gen regulador (trpR) codifica para la prote´ına reguladora. I

Este gen se encuentra en otra regi´ on del cromosoma bacteriano aunque no muy lejos del oper´ on.

Existe un represor: el propio tript´ ofano (correpresor). El inductor del sistema es la lactosa I

El oper´ on lactosa tambi´ en est´ a bajo control positivo, ya que existe otra prote´ına que estimula la transcripci´ on de los genes estructurales.

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Estrutura del Oper´ on Tript´ ofano

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En ausencia del tript´ ofano (o cuando hay muy poco), la prote´ına reguladora no es capaz de unirse al operador de forma que la RNA-polimerasa puede unirse a la regi´ on promotora y se transcriben los genes del oper´ on tript´ ofano.

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En presencia del tript´ ofano, ´este se une a la prote´ına reguladora o represora cambiando su conformaci´ on, de manera que ahora s´ı puede unirse a la regi´ on operadora y como consecuencia la RNA-polimerasa no puede unirse a la regi´ on promotora y no se transcriben los genes del oper´ on tript´ ofano.

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El Oper´ on Lactosa Los genes estructurales del oper´ on lactosa son los siguientes: I

El gen z+: codifica la β-galactosidasa (Lac Z) que cataliza la hidrolisis de la lactosa en glucosa m´ as galactosa.

I

El gen y+: codifica la galact´ osido permeasa (Lac Y) que transporta b-galact´ osidos al interior de la c´ elula bacteriana.

I

El gen a+: codifica la transacetilasa (LacA) que no parece estar relacionada con el metabolismo de la lactosa.

El promotor y el operador est´ an al lado de los genes estructurales I

Primero el promotor y despu´ es el operador.

El gen regulador es el gen i que codifica la prote´ına reguladora (en este caso, represora): LacI compuesta de 300 amino´ acidos. El inductor del sistema es la lactosa (en realidad es la alolactosa, un derivado) I

La alolactosa inhibe la acci´ on de la prote´ına represora: se une a una regi´ on del LacI cambiando su conformaci´ on.

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Estrutura del Oper´ on Lactosa (I)

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Estrutura del Oper´ on Lactosa (II)

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Control de expresi´ on de genes en el Oper´ on Lactosa

A˜ nadiendo un nuevo sustrato al cultivo se puede inducir la formaci´ on de enzimas capaz de matabolizar este sustrato. • Por ejemplo, en un cultivo de E. coli alimentado por glucosa cuando se transfiere algunas c´ elulas a un medio conteniendo lactosa tiene lugar una serie de eventos reveladores. • En primer lugar, las c´ elulas est´ an quiescentes (no metabolizan lactosa, se ralentizan otras actividades metab´ olicas y la divisi´ on celular se detiene) pero est´ an produciendo tres enzimas: LacY (galact´ osido permeasa) que transporta la lactosa desde el cultivo al interior de la c´ elula a trav´ es de la membrana pl´ asmica, LacZ (β-galactosidasa) que hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa, y LacA (transacetilasa) cuya funci´ on no es conocida a´ un. • Sin embargo, el cultivo empieza a crecer y la lactosa es consumida r´ apidamente

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El Oper´ on Lactosa. Represi´ on

I La prote´ına represora del oper´ on lactosa se llama LacI. I Parte de la mol´ ecula LacI se une al operador impidiendo la uni´ on de la

RNA-polimerasa al promotor. I El inductor del sistema es la alolactosa, un derivado de la lactosa:

represor del represor. I La alolactosa inhibe la acci´ on de la prote´ına represora: se une a una regi´ on del LacI cambiando su conformaci´ on e impidiendo que LacI se una al operador.

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El Oper´ on Lactosa. Activaci´ on I La inhibici´ on del represor LacI es condici´ on necesaria pero no suficiente

para la transcripci´ on de los genes estructurales. I El complejo prote´ınico CRP-cAMP es un activador que propicia la uni´ on

de la RNA-polimerasa al promotor. I La presencia de glucosa en el medio inhibe la s´ıntesis de dicho complejo

prote´ınico: represi´ on catab´ olica. • La mol´ ecula EIIA∼P: ? Ayuda al transporte de la glucosa por el interior de la bacteria (en ese transporte, la glucosa es fosforilada). ? Activa la enzima AC que, a su vez, regula la producci´ on de cAMP. ? Inhibe a la enzima LacY que transporta lactosa al interior de la bacteria. • En medios ricos en glucosa, los niveles de cAMP son bajos. • Para que se transcriban los genes del oper´ on lactosa es necesario niveles alto de cAMP: cuando no hay glucosa en el medio, la mol´ ecula EIIA∼P est´ a libre y se sintetiza cAMP. • Cuando la E. coli crece en un medio sin glucosa pero rica en lactosa, los niveles de cAMP son altos: El cAMP se une al receptor CRP y el complejo prote´ınico CRP-cAMP2 propicia la uni´ on de la RNA-polimerasa al promotor, estimulando la transcripci´ on de los genes estructurales. 16 / 51

Estrutura del Oper´ on Lactosa (III)

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Oper´ on Lactosa en E. coli Mediante la degradaci´ on de la lactosa, las bacterias obtienen energ´ıa. La bacteria E. coli es capaz de seleccionar la fuente de energ´ıa cuando tiene varias a su alcance. • En un medio que contiene glucosa, la E. coli prefiere a ´ esta como fuente de energ´ıa. • Los operones que producen las enzimas necesarias para obtener energ´ıa de otros az´ ucares, est´ an bloqueados.

El Oper´ on lactosa est´ a sujeto simult´ aneamente a un control negativo y a un control positivo: I

Control negativo: la prote´ına reguladora Lac I (producto del gen i) es un represor que impide la expresi´ on de los genes estructurales en ausencia del inductor.

I

Control positivo: existe un complejo prote´ınico (CRP-cAMP2 ) que estimula la transcripci´ on de los genes estructurales.

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Oper´ on Tript´ ofano versus Oper´ on Lactosa

Oper´ on Tript´ ofano: I

La prote´ına represora s´ olo se puede unir al operador cuando previamente est´ a unido al tript´ ofano.

I

El promotor es fuerte ya que la transcripci´ on est´ a regulado por un represor (Lac I), un activador de ´ este (lactosa) y por un represor de ´ este (tript´ ofano).

Oper´ on Lactosa: I

La prote´ına represora s´ olo se puede unir al operador en ausencia de lactosa.

I

on est´ a regulado por un represor (Lac I) y un complejo activador El promotor es d´ ebil ya que la transcripci´ (CRP-cAMP2 ).

I

La presencia de glucosa en el medio inhibe la s´ıntesis del complejo activador.

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En ausencia de la lactosa, la prote´ına represora se encuentra unida al operador e impide la uni´ on de la RNA-polimerasa a la regi´ on promotora y, como consecuencia, no se transcriben los genes estructurales (ahorro energ´etico).

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En presencia de la lactosa, ´esta se une a la prote´ına reguladora que cambia su conformaci´ on y se suelta de la regi´ on operadora dejando que la RNA-polimerasa se una a la regi´ on promotora y se transcriban los genes estructurales.

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Transcripci´ on del Oper´ on Lactosa en E. Coli (I) I Caso 1: Ausencia de glucosa y lactosa. ? Existir´ an muchos complejos CRP-cAMP2 que asistir´ an a la RNA-polimerasa para que se una al promotor del oper´ on pero NO se activar´ a la transcripci´ on ya que el represor Lac I impedir´ a esa uni´ on.

I Caso 2: Presencia de glucosa y ausencia de lactosa. ? Existir´ a un bajo n´ umero de complejos CRP-cAMP2 pero NO se activar´ a la transcripci´ on ya que el represor Lac I impedir´ a esa la uni´ on del complejo al operador.

I Caso 3: Presencia de glucosa y presencia de lactosa. ? Existir´ a un bajo n´ umero de complejos CRP-cAMP2 pero ahora S´I se activar´ a la transcripci´ on ya que el represor Lac I est´ a inhibido por la presencia de la lactosa. Se producir´ a, pues, un nivel bajo de transcripci´ on (en este caso, no se necesita degradar lactosa para obtener energ´ıa).

I Caso 4: Ausencia de glucosa y presencia abundante de lactosa. ? Existir´ an muchos complejos CRP-cAMP2 que asistir´ an a la RNA-polimerasa para que se una al promotor del oper´ on y S´I se activar´ a la transcripci´ on ya que el represor Lac I est´ a inhibido. Se producir´ a, pues, un nivel alto de transcripci´ on. 23 / 51

Transcripci´ on del Oper´ on Lactosa en E. coli: Modelo basado en sistemas P

En una bacteria E. coli existen dos regiones relevantes: I

La superficie celular de la bacteria que contiene un conjunto de prote´ınas que controlan el movimiento de las mol´ eculas y detectan se˜ nales.

I

El lumen bacteriano o interior acuoso de la bacteria donde una serie de prote´ınas est´ an involucradas en procesos celulares espec´ıficos.

En nuestro modelo vamos a considerar tres membranas I

La primera est´ a etiquetada con s y representa la superficie celular. Los objetos que describen las entidades moleculares asociadas a la membrana piel se localizar´ an en esta regi´ on, as´ı como las reglas que especifican los procesos de selecci´ on de sustancia del entorno y de se˜ nalizaci´ on (receptor-se˜ nal).

I

La segunda est´ a etiquetada con c, est´ a contenida en la membrana s y describe el medio acuoso del interior de la bacteria. Contiene los objetos y cadenas que especifican las prote´ınas y otras entidades moleculares situadas en dicho medio. Las reglas describen las interaccions que tienen lugar dentro de la bacteria.

I

La tercera membrana est´ a etiquetada por e, contiene a la membrana s y describe el medio cultivo. Dependiendo de los recursos de az´ ucares, la E. coli exhibir´ a un comportamiento diferente. En nuestro modelo usaremos esta regi´ on para codificar esos recursos a trav´ es de la multiplicidad de ciertos objetos. La membrana e delimitar´ a la frontera de nuestro sistema.

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Entidades moleculares

Las prote´ınas y enzimas involucradas en la selecci´ on de az´ ucares del medio y en su metabolismo, ser´ an representadas por s´ımbolos de un alfabeto: Oprot . I

Por ejemplo, se puede considerar que las mol´ eculas EIICB y β–galactosidasa son entidades individuales sin estructura interna.

El alfabeto Oprot es el siguiente conjunto: {EIIA,

EIIA∼P,

Lact-LacY,

AC,

β–Galac–Lact,

EIICB,

EIICB–EIIA∼P,

AC–EIIA,

Allolact,

AC–EIIA∼P,

LacI,

EIICB∼P, ATP,

LacI–Alloct,

Gluc,

Gluc∼P,

AC–EIIA∼P–ATP,

CRP,

CRP–cAMP,

EIICB∼P–Gluc,

LacY-EIIA,

CRP–cAMP2 ,

Lact,

β–Galac,

LacY,

Lact,

RNAP}

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Symbol EIICB EIICB∼P EIIA EIIA∼P EIICB–EIIA∼P Gluc Gluc∼P EIICB∼P–Gluc Lact LacY Lact-LacY LacY-EIIA ATP cAMP AC AC–EIIA AC–EIIA∼P AC–EIIA∼P–ATP β–Galac β–Galac–Lact Allolact LacI LacI–Alloct CRP CRP–cAMP CRP–cAMP2 RNAP

Molecule Glucose Transporter Enzyme IICB and its phosphorylated state Glucose Transporter Enzyme IIA and its phosphorylated state Complex transporter enzymes IICB and phophorilated IIA Glucose and its phosphorylated state Complex transporter IICB phosphorylated and glucose Lactose Lactose permease Complex lactose permease and lactose Complex lactose permease and transporter enzyme IIA Adenosine triphosphate and cyclic adenosine monophosphate Adelynate Cyclase ATP and AC complexes with and ATP β–Galactosidase and its complex with lactose Allolactose, the inducer The lac repressor and its complex with allolactose cAMP Receptor Protein, the activator, its complex with cAMP and its dimer RNA polymerase

M´ as tarde se detallar´ an las funciones de estas prote´ınas cuando se analice la especificaci´ on de los procesos celulares en el sistema de regulaci´ on del oper´ on lactosa usando reglas de reescrituras.

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Representaci´ on de genes, RNAm y sitios

I

Los genes que intervienen aparecen en una estructura lineal en donde el orden es esencial (orden en el que los genes son expresados).

I

La estructura lineal de los genes y del RNAm ser´ an especificadas a trav´ es de cadenas.

I

Los sitios relevantes en el oper´ on lactosa y en el RNAm ser´ an representados usando s´ımbolos de los alfabetos Odna y Orna , resp.

I

El alfabeto Odna es el siguiente conjunto: {cap, capCRP−cAMP2 , op, opLacI , lacZs , lacZm , lacZe , lacYs , lacYm , lacYe , lacAs , lacAm , lacAe }

I

El alfabeto Orna es el siguiente conjunto: {Rib, op, lacZs , lacZm , lacZe , lacYs , lacYm , lacYe , lacAs , lacAm , lacAe }

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S´ımbolos que indican los sitios relevantes Symbol cap cap

CRP−cAMP2

op opLacI lacZs lacYs lacAs lacZm lacYm lacAm lacZe lacYe lacAe op lacZs lacZe lacYs lacYe lacAs lacAe lacZm lacYm lacAm

Site Free CAP site where the activator CRP-cAMP2 binds CAP site occupied by the activator CRP-cAMP2 binds Free operator site where the repressor LacI binds Operator site occupied by the repressor LacI binds Sites marking the start point of the lacZ, lacY and lacA gene respectively Sites located in the middle of the lacZ, lacY and lacA gene respectively Sites located in the final point of the lacZ and lacY gene respectively. Site marking the end of gene lacA which coincides with the transcription termination site of the lac operon Site marking the starting point of the mRNA transcript Sites marking the beginning and end of the reading frames in the mRNA for the genes lacZ, lacY and lacA respectively Sites located in the middle of reading frames of lacZ, lacY and lacA gene respectively

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La cadena s3 representa el oper´ on lactosa en E. coli: 30

12

6

z }| { z }| { z }| { h cap. op . lacZs .lacZm . · · · .lacZm .lacZe . lacYs .lacYm . · · · .lacYm .lacYe . lacAs .lacAm . · · · .lacAm .lacAe i La RNA polimerasa ocupa alrededor de 100 nucle´ otidos y, por ello, cada s´ımbolo h lacZi i, h lacYi i y h lacAi i with i = s, m, e, representa una sucesi´ on de 100 nucle´ otidos del correspondiente gen, en lugar de s´ olo uno. Por tanto, tenemos u ´nicamente 30 sitios lacZ, 12 lacY y 6 lacA que representan los 3000, 1200 y 600 nucle´ otidos de los correspondientes genes. El lugar de enlace de CAP y el operador es representado por h cap i y por h op i.

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Reglas que describen el transporte de glucosa La recepci´ on de glucosa desde el entorno comienza con el reclutamiento de la prote´ına EIIA∼P del citoplasma a trav´ es de al prote´ına transmemmbrana EIICB (regla r1 ). Este proceso es reversible: EIIA∼P puede ser enviada al citoplasma (regla r2 ). c1

r1 : EIICB [ EIIA∼P ]c →EIICB–EIIA∼P [ ]c , c1 = 0.235 molec −1 sec −1 r2 : EIICB–EIIA∼P [

c2

]c → EIICB [ EIIA∼P ]c , c2 = 2 × 10−4 sec −1

Una vez que la prote´ına EIIA∼P ha sido reclutada, puede interactuar produciendo la fosforilizaci´ on de EIICB en la superficie celular y enviar EIIA al citoplasma (regla r3 ). r3 : EIICB–EIIA∼P [

c3

]c → EIICB∼P [ EIIA ]c , c3 = 0.0706 sec −1

Una vez que la prote´ına EIICB∼P est´ a presente en la superficie celular la glucosa comienza a ser transportada al interior de la c´ elula enlazando con EIICB∼P (regla r4 ). Ahora bien, esta interacci´ on es reversible (regla r5 ). Por otra parte, la glucosa puede ser transportada al interior de la bacteria y enviada al citoplasma (regla r6 ). En este proceso, la glucosa es fosforilada, Gluc∼P. c4

r4 : Gluc [ EIICB∼P ]s → [ EIICB∼P–Gluc ]s , c4 = 6.96 × 10−3 molec −1 sec −1 c18

r5 : [ EIICB∼P–Gluc ]s → Gluc [ EIICB∼P ]s , c5 = 1.04 × 10−2 sec −1 c6

r6 : EIICB∼P–Gluc [ ]c → EIICB [ Gluc∼P ]c , c6 = 0.128 sec −1

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Reglas que describen el transporte de lactosa El transporte de la lactosa en el interior de la bacteria se especifica por el mismo tipo de reglas que con la glucosa, si bien ahora el transporte es m´ as simple ya que no implica transferencia de un grupo fosforilo. La entrada de la lactosa al interior de la bacteria necesita la presencia de LacY en la superficie celular. Aunque LacY es sintetizada en el citoplasma, ella se mueve a la superficie celular (regla r7 ). c7

r7 : [ LacY ]c → LacY [ ]c , c7 = 0.02sec −1 La recepci´ on de la lactosa, Lact, presente en el entorno se lleva a cabo en dos pasos. En el priemro, la lactosa enlaza con la permeasa (regla r8 ) y, entonces, la permeasa es transportada y enviada al citoplasma (regla r9 ). c8

r8 : Lact [ LacY ]s → [ Lact-LacY ]s , c8 = 5.12 × 10−3 molec −1 sec −1 c9

r9 : Lact-LacY [ ]c → LacY [ Lact ]c , c9 = 5.12 × 10−3 sec −1 La recepci´ on de la lactosa es inhibida por EIIA que enlaza a LacY produciendo el complejo LacY-EIIA (regla r10 ). La lactosa no puede enlazar a este complejo sobre la superficie celular bloqueando el transporte de la lactosa por el interior de la c´ elula. El complejo LacY-EIIA se puede disociar en sus componentes (regla r11 ). c10

r10 : LacY [ EIIA ]c → LacY-EIIA [ ]c , c10 = 10−4 molec −1 sec −1 c11

r11 : LacY-EIIA [ ]c → LacY [ EIIA ]c c11 = 10−3 sec −1 Estas interacciones moleculares son importantes en la represi´ on catab´ olica: un alto n´ umero de EIIA no fosforilada en el citoplasma es consecuencia de la presencia de glucosa en el entorno. Durante su transporte, la glucosa es fosforilada con un grupo fosforilo que es transferido desde EIIA∼P a EIIBC y, finalmente, a la glucosa. Por tanto, en presencia de glucosa, EIIA∼P es consumida en el citoplasma y EIIA se produce en alto n´ umero, lo que inhibe la permeasa LacY y la recepci´ on de lactosa.

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Reglas que describen la actividad de la β–Galactosidasa

La β–galactosidasa escinde la lactosa en glucosa y galactosa. La producci´ on de la glucosa a partir de la lactosa no es crucial en la regulaci´ on de la expresi´ on de los genes en el opero´ on lactosa. La producci´ on de la alolactosa es un paso importante en la regulaci´ on ya que act´ ua como inductor.

• La alolactosa se obtiene de la interacci´ on entre la β–galactosidasa y la lactosa. • Es una enzima que en primer lugar forma un complejo con la lactosa (regla r12 ) y despu´ es interact´ ua con ´ el para producir alolactosa (regla r13 ). c12

r12 : [ β–Galac + Lact ]c → [ β–Galac–Lact ]c , c12 = 3.92 × 10−4 molec −1 sec −1 c13

r13 : [ β–Galac–Lact ]c → [ β–Galac + Allolact ]c , c13 = 3.92 × 10−4 molec −1 sec −1 La β–Galactosidasa se degrada en el citoplasma a trav´ es de la maquinaria celular (regla r14 ). c14

r14 : [ β–Galac ]c → [

]c , c14 = 1.93 × 10−4 sec −1

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Reglas que describen la actividad de la Alolactosa

La Alolactosa es una se˜ nal de la presencia de lactosa en el entorno. Act´ ua como inductor del sistema de regulaci´ on de genes del oper´ on lactosa mediante la inhibici´ on del represor, LacI, con una interacci´ on directa (regla r15 ). Un cambio de conformaci´ on se induce en el represor cuando la alolactosa se enlaza a ´ el, impidiendo su enlace con el operador del sistema. La alolactosa se degrada tambi´ en en el citoplasma (regla r16 ). c15

r15 : [ LacI + Allolact ]c → [ LacI-Allolact ]c , c15 = 0.01molec −1 sec −1 c16

r16 : [ Allolact ]c → [ ]c , c16 = 5.58 × 10−5 sec −1

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Reglas que describen la actividad de la Adenylate Cyclasa La Adenylate Cyclase (AC) regula la producci´ on de las mol´ eculas de cAMP, cuyo n´ umero es inversamente proporcional al n´ umero de mol´ eculas de glucosa en el entorno. Para la s´ıntesis de cAMP, la AC recluta del citoplasma a la fosforilada EIIA∼P (regla r17 ). Esta interacci´ on es reversible (regla r18 ). c17

r17 : AC [ EIIA∼P ]c → AC–EIIA∼P [ ]c , c17 = 2.35 × 10−5 molec −1 sec −1 c18

r18 : AC–EIIA∼P [ ]c → AC [ EIIA∼P ]c , c18 = 0.01sec −1 El complejo AC–EIIA∼P recluta ATP del citoplasma (regla r19 ) y lo transforma en cAMP que es enviado al citoplasma (regla r20 ). c19

r19 : AC–EIIA∼P [ ATP ]c → AC∼P–EIIA∼P–ATP [ ]c , c19 = 2.35 × 10−3 molec −1 sec −1 c20

r20 : AC–EIIA∼P–ATP [ ]c → AC∼P–EIIA∼P [ cAMP ]c , c20 = 0.02sec −1 Como hemos indicado, el n´ umero de mol´ eculas no fosforiladas de EIIA es un indicador de la presencia de glucosa en el entorno. Como parte del mecanismo de represi´ on catab´ olica, EIIA inhibe la producci´ on de cAMP mediante el enlace con AC en la membrana celular (reglas r21 y r22 ). Esto inhibe la activaci´ on del oper´ on lactosa mediante la represi´ on de la actividad del AC y, por tanto, de la producci´ on de cAMP y el activador CRP-cAMP2 . c21

r21 : AC [ EIIA ]c → AC–EIIA [ ]c c21 = 2.35 × 10−3 molec −1 sec −1 c22

r22 : AC–EIIA [ ]c → AC [ EIIA ]c , c22 = 0.02sec −1

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Reglas que describen la formaci´ on del activador CRP-cAMP2

La prote´ına CRP no puede enlazar con el promotor a menos que interact´ ue con cAMP para producir el complejo CRP-cAMP que, a su vez, formar´ a un d´ımero CRP-cAMP2 (regla r23 y r24 ). Este d´ımero es capaz de enlazar con el promotor e incrementar la tasa de transcripci´ on de los genes codificados en el oper´ on lactosa. c23

r23 : [ CRP + cAMP ]c → [ CRP-cAMP ]c , c23 = 5 × 10−3 molec −1 sec −1 c24

r24 : [ CRP-cAMP + CRP-cAMP ]c → [ CRP-cAMP2 ]c , c24 = 5 × 10−3 molec −1 sec −1

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Reglas que describen la activaci´ on y represi´ on del oper´ on lactosa

La tasa de transcripci´ on del oper´ on lactosa viene determinada por el estado del lac operon switch. Este switch lo integra el CAP site, hcapi, donde enlaza el activador y el operador, hopi, en donde enlaza el represor. El switch tiene cuatro posibles configuraciones que dependen de la ocupaci´ on del CAP site y del operator: hcap.opi, hcap.opLacI i, hcapCRP−cAMP2 .opi y hcapCRP−cAMP2 .opLacI i. Estas configuraciones se alcanzan mediante enlaces y disociaci´ on de las reglas de factores de transcripci´ on. En ausencia de lactosa el represor LacI se activar´ a y enlazar´ a con el operador inhibiendo la transcripci´ on del oper´ on lactosa (regla r25 ). No obstante, ocasionalmente LacI se cae del operador permitiendo la producci´ on basal de prote´ınas (regla r26 ). c25

r25 : [ LacI + h op i ]c → [ h opLacI i ]c , c25 = 0.2molec −1 sec −1 c26

r26 : [ h opLacI i ]c → [ LacI + h op i ]c , c26 = 5sec −1 En ausencia de glucosa existe un gran n´ umero de mol´ eculas cAMP que producir´ an un elevado n´ umero de activadores, CRP-cAMP2 . El activador enlaza reversiblemente con el CAP site h cap i (reglas r27 y r28 ). c27

r27 : [ CRP-cAMP2 + h cap i ]c → [ h capCRP−cAMP2 i ]c , c27 = 0.01molec −1 sec −1 c28

r28 : [ h capCRP−cAMP2 i ]c → [ CRP-cAMP2 + h cap i ]c , c28 = 5sec −1

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Reglas que describen el comienzo de la transcripci´ on en el oper´ on lactosa

El primer paso en la transcripci´ on del oper´ on lactosa consiste en el enlace de la RNA polimerasa (RNAP) al lac operon switch. La afinidad entre el lac operon switch y la RNAP depende de la configuraci´ on del. • Por una parte, cuando el CAP site est´ a libre, h cap i, la RNAP rara vez enlaza con el lac operon switch produciendo una tasa de transcripci´ on basal (rule r29 ). • Por otra parte, cuando el activador CRP-cAMP2 ocupa el CAP site, h capCRP−cAMP2 i, se produce un incremento en la tasa de transcripci´ on de aproximadamente 40m veces (regla r30 ). c29

r29 : [ RNAP + h cap i ]c → [ h cap.RNAP i ]c , c29 = 5 × 10−4 molec −1 sec −1 c30

r30 : [ RNAP + h capCRP−cAMP2 i ]c → [ h capCRP−cAMP2 . RNAP i ]c , c30 = 0.02molec −1 sec −1 La RNAP inicia la transcripci´ on produciendo los nucle´ otidos complementarios del sitio del operador h op i (regla r31 ). El sitio h op i marca el comienzo de la transcripci´ on de un mRNA. Obs´ ervese que tras la aplicaci´ on de la regla r31 la subcadena h op i queda libre y, entonces, otra RNAP puede comenzar la transcripci´ on incluso antes de que la primera RNAP acabe de transcribir el oper´ on. Por tanto, estamos simulando la transcripci´ on por diferentes polimerasas como un proceso concurrente. c31

r31 : [ h RNAP.op i ]c → [ h op. op. RNAP i ]c , c31 = 2sec −1

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Reglas que describen la elongaci´ on del mRNA en el oper´ on lactosa Durante las primeras etapas de la elongaci´ on del mRNA, la RNAP se mueve a lo largo del gen lacZ transcribi´ endolo en mRNA. La RNAP comienza transcribiendo los primeros nucle´ otidos del gen lacZ representado por h lacZs i y une los ribonucle´ otidos complementarios especificados por h lacZs i al mRNA, h op i (regla r32 ). La subcadena h lacZs i representa el RBS (ribosome binding site) para este gen. Una vez producido este sitio, una regla de enlace de ribosoma puede ser aplicada y la traducci´ on puede comenzar antes de que finalice la transcripci´ on. Por ello, en nuestra simulaci´ on, los procesos de transcripci´ on y traducci´ on tienen lugar en paralelo. c32

r32 : [ h op. RNAP. lacZs i ]c → [ h lacZs .op.lacZs .RNAP i ]c , c32 = 2sec −1 Durante la transcripci´ on se produce una cadena complementaria de mRNA que es descrita por la producci´ on del ∗ RNA site h lacZm i que se une al mRNA representado por la subcadena h op.w i, w ∈ Orna , mientras el DNA transcrito h lacZm i se queda atr´ as (regla r33 I. c33

r33 : [ h op.w .RNAP.lacZm i ]c → [ h lacZm .op.w .lacZm .RNAP i ]c , c33 = 2sec −1 ∗ Cuando la RNAP alcanza el final del gen LacZ une al sitio h lacZe i a la subcadena h op.w i, w ∈ Orna , que describe el crecimiento del mRNA (regla r34 ). on de la traducci´ on. Luego cuando los ribosomas alcanzan este La cadena h lacZe i representa un sitio de terminaci´ sitio, se disocian dejando la prote´ına codificada por le gen lacZ, β-galactosidasa. c34

r34 : [ h op.w.RNAP.lacZe i ]c → [ h lacZe .op.w.lacZe .RNAP i ]c , c34 = 2sec −1 Las siguientes reglas describen la transcripci´ on de los genes lacY y lacA, de forma similar al caso del gen lacZ. c35

r35 : [ h op.w . RNAP. lacYs i ]c → [ h lacYs .op.w .lacYs .RNAP i ]c , c35 = 2sec −1 c36

r36 : [ h op.w . RNAP. lacYm i ]c → [ h lacYm .op.w .lacYm .RNAP i ]c , c36 = 2sec −1 c37

r37 : [ h op.w . RNAP. lacYe i ]c → [ h lacYe .op.w .lacYe .RNAP i ]c , c37 = 2sec −1 c38

r38 : [ h op.w . RNAP. lacAs i ]c → [ h lacAs .op.w .lacAs .RNAP i ]c , c38 = 2sec −1 c39

r39 : [ h op.w . RNAP. lacAm i ]c → [ h lacAm .op.w .lacAm .RNAP i ]c , c39 = 2sec −1 38 / 51

Regla que describe el final de la transcripci´ on del oper´ on lactosa

La transcripci´ on del oper´ on lactosa finaliza cuando la RNAP alcanza el sitio de terminaci´ on de la transcripci´ on, al final del gen lacA. Este sitio est´ a representado por la cadena h lacAe i. ∗ Cuando la RNAP alcanza este sitio, enlaza los ribonucle´ otidos, h lacAe i al mRNA h op.w . i, w ∈ Orna , y lo disocia del oper´ on, liberando el mRNA (regla r40 ). c40

r40 : [ h op.w .RNAP.lacAe i ]c → [ RNAP + h lacAe i ; h op.w .lacAe i ]c , c40 = 2sec −1

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Reglas que describen el inicio de la traducci´ on

La traducci´ on comienza cuando los ribosomas, Rib, reconoce el RBS de los genes lacZ, lacY y lacA, representados por las cadenas h lacZs i, h lacYs i y h lacAs i (reglas r41 , r42 y r43 ). c41

r41 : [ Rib + h lacZs i ]c → [ h Rib.lacZs i ]c , c41 = 0.16molec −1 sec −1 c42

r42 : [ Rib + h lacYs i ]c → [ h Rib.lacYs i ]c , c42 = 0.16molec −1 sec −1 c43

r43 : [ Rib + h lacAs i ]c → [ h Rib.lacAs i ]c , c43 = 0.16molec −1 sec −1

40 / 51

Reglas que describen la traducci´ on y la disociaci´ on de los ribosomas

Durante la traducci´ on, los ribosomas se mueven a lo largo de los sitios en el mRNA representado por las subcadenas h lacZm i, h lacYm i y h lacAm i (reglas r44 , r45 , r47 , r48 , r50 y r51 ). Cuando los ribosomas alcanzan el lugar de terminaci´ on, lacZe , lacYe or lacAe , se disocian del the mRNA abandonando las prote´ınas β-galactosidase, LacY or LacA (reglas r46 , r49 y r52 ). c44

r44 : [ h Rib.lacZs i ]c → [ h lacZs .Rib i ]c , c44 = 0.3sec −1 c45

r45 : [ h Rib.lacZm i ]c → [ h lacZm .Rib i ]c , c45 = 0.3sec −1 c46

r46 : [ h Rib.lacZe i ]c → [ β−Galac + Rib + h lacZe i ]c , c46 = 0.3sec −1 c47

r47 : [ h Rib.lacYs i ]c → [ h lacYs .Rib i ]c , c47 = 0.3sec −1 c48

r48 : [ h Rib.lacYm i ]c → [ h lacYm .Rib i ]c , c48 = 0.3sec −1 c49

r49 : [ h Rib.lacYe i ]c → [ LacY + Rib + h lacYe i ]c , c49 = 0.3sec −1 c50

r50 : [ h Rib.lacAs i ]c → [ h lacAs .Rib i ]c , c50 = 0.3sec −1 c51

r51 : [ h Rib.lacAm i ]c → [ h lacAm .Rib i ]c , c51 = 0.3sec −1 c52

r52 : [ h Rib.lacAe i ]c → [ LacA + Rib + h lacAe i ]c , c52 = 0.3sec −1

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Reglas que describen la degradaci´ on del mRNA

El mRNA se degrada cuando ciertas enzimas enlazan con el RBS, h lacZs i, strlacYs y h lacAs i, elimin´ andolos a fin de evitar que nuevos ribosomas inicien la traducci´ on (reglas r53 , r54 y r55 ). c53

]c , c53 = 0.2sec −1

c54

]c , c54 = 0.2sec −1

c55

]c , c55 = 0.2sec −1

r53 : [ h lacZs i ]c → [ r54 : [ h lacYs i ]c → [ r55 : [ h lacAs i ]c → [

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Un modelo basado en sistemas P Πlac = (O, {e, s, c}, [ [ [ ]3 ]2 ]1 , M1 , M2 , M3 , Re , Rs , Rc )

(1)

en donde:

I

El alfabeto O contiene los objetos que representan las entidades moleculares, prote´ınas, lugares del DNA y RNA involucrados en el sistema del oper´ on lactosa. O = Oprot ∪ Odna ∪ Orna

I

Las etiquetas {e, s, c} identifican los tipos de compartimentos definidos por la estructura de membranas en Πlac : entorno, superficie celular y citoplasma.

I

Las estructura de membranas consta de tres membranas que definen las tres regiones relevantes en el sistema: la membrana 1 representa el entorno, la membrana 2 representa la superficie celular y la mambrana 3 representa el citoplasma.

I

Los multiconjuntos iniciales M1 , M2 y M3 son parte de los par´ ametros de nuestro sistema de especificaci´ on Πlac . La etiqueta e se asocia a la membrana 1, la etiqueta s se asocia a la membrana 2 y la etiqueta c se asocia a la membrana 3.

I

Los conjuntos de reglas de reescrituras sobre multiconjuntos de objetos y de cadenas, Re , Rs y Rc , est´ an asociados a las regiones relevantes. Estas reglas describen las interacciones moleculares que tienen lugar en los compartimentos especificados. Re = {r4 , r8 } Rs = {r2 , r3 , r5 , r6 , r9 , r11 , r18 , r20 , r22 } Rc = {r1 , r7 , r10 , r12 , r13 , r14 , r15 , r16 , r17 , r19 , r21 , r23 , . . . , r55 }

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Par´ ametros del sistema

Par´ ametros de nuestro sistema de especificaci´ on P(Πlac ): los multiconjuntos iniciales y las constantes estoc´ asticas asociadas a las reglas. P(Πlac ) = (M0 (Πlac ), C(Πlac ))

I

En nuestro caso, las constantes estoc´ asticas tendr´ an unos valores fijos (de un conjunto C ). Se han detrerminado gracias a que el sistema del oper´ on lactosa es el ejemplo can´ onico de regulaci´ on de genes en procariotas.

I

Los multiconjuntos iniciales constituyen los par´ ametros actuales del sistema: especificaremos el n´ umero de objetos y cadenas presentes inicialmente en cada compartimento. Obviamente, diferenetes escenarios ser´ an representados a trav´ es de diferentes multiconjuntos iniciales. Para los multiconjuntos iniciales del sistema (M1 , M2 , M3 ), consideraremos cuatro posibles escenarios iniciales en el entorno {M11 , M12 , M13 , M14 }, y un u ´nico escenario inicial en la superficie celular {M2 } y en el citoplasma {M3 }. • Ausencia de glucosa y de lactosa en el entorno: M11 = (e, λ, λ)

.

• Abundante glucosa y ausencia de lactosa en el entorno: M12 = (e, Gluc300000 , λ)

.

• Ausencia de glucosa y abundancia de lactosa en el entorno: M13 = (e, Lact300000 , λ)

.

• Abundancia de glucosa y de lactosa en el entorno: M14 = (e, Gluc300000 + Lact300000 , λ)

.

44 / 51

Para la superficie celular hay un u ´nico escenario inicial: 2500

M2 = (s, EIICB

+ EIICB ∼ P

15000

+ AC

10000

+ LacY

3000

}, λ)

Para el citoplasma hay un u ´nico escenario inicial: M3 = (c, w3 , s3 ), en donde w3 representa los objetos iniciales w3 = RNAP300 + Rib3000 + EIIA2000 + EIIA ∼ P13000 + ATP1000000 + β − Galac3000 +LacI1500 + CRP10000 y s3 la cadena inicial que representa el oper´ on lactosa: 30

12

6

}| { z }| { z }| { z h cap. op . lacZs .lacZm . · · · .lacZm .lacZe . lacYs .lacYm . · · · .lacYm .lacYe . lacAs .lacAm . · · · .lacAm .lacAe i Estos par´ ametros producen una familia, Flac (Πlac ; (M0 , C )), que consiste de cuatro diferentes sistemas P que corresponden a los distintos escenarios considerados. 1. PSM1 = (Πlac ; (M11 , M2 , M3 ), C ) 2. PSM2 = (Πlac ; (M12 , M2 , M3 ), C ) 3. PSM3 = (Πlac ; (M13 , M2 , M3 ), C ) 4. PSM4 = (Πlac ; (M14 , M2 , M3 ), C )

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An´ alisis de la regulaci´ on de genes en el oper´ on lactosa (I) PSM1 : comportamiento del sistema sin glucosa y sin lactosa en el entorno Cuando la glucosa no est´ a presente en el entorno, EIIA∼P no es consumido y, por ello, se activa AC sobre la superficie celular. Una vez activado el AC se produce un elevado n´ umero de mol´ eculas de cAMP, como muestr la figura siguiente. cAMP enlaza con la prote´ına CRP y produce el complejo CRP-cAMP que por dimerizaci´ on produce el activador CRP-cAMP2 .

120000

100000

cAMP

80000

60000

40000

20000

0 0

100

200

300

400

500

600

time

46 / 51

An´ alisis de la regulaci´ on de genes en el oper´ on lactosa (I) PSM1 : comportamiento del sistema sin glucosa y sin lactosa en el entorno El CAP site ser´ a ocupado por mol´ eculas CRP-cAMP2 que asistir´ an a la RNA polymerase para que enlace con el promotor. No obstante, como no hay lactosa en el entorno, no se producir´ a alolactosa en el citoplasma y, por tanto, el represor estar´ a activo y colapsar´ a el operador. En estas condiciones un estado caracter´ıstico del oper´ on lactosa (representado por una cadena) se obtiene en nuestro simulador. cap-CRP-cAMP 2 RNAP op-LacI lacZ s lacZ m –op Rib –lacZ s –lacZ m RNAP lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m –op Rib –lacZ s –lacZ m –lacZ m –lacZ m –lacZ m –lacZ m –lacZ m–lacZ m –lacZ m RNAP lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ e lacY s lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m lacY e lacA s lacA m lacA m lacA m lacA m lacA e

(2)

Obs´ ervese que el CRP-cAMP2 est´ a en el CAP site asistiendo a la RNAP para enlazar al promotor del oper´ on lactosa. Una vez enlazado, la RNA est´ a lista para la transcripci´ on siempre que el represor libere al operador, si no bloquer´ a el inicio de la transcripci´ on. En resumen, la configuraci´ on del lac operon switch en este escenario, h capCRP-cAMP2 .RNAP.opLacI i, produce un leve incremento en la expresi´ on de genes codificados en el oper´ on lactosa: sin az´ ucar en el entorno la bacteria procede a la producci´ on basal de lactosa. 47 / 51

An´ alisis de la regulaci´ on de genes en el oper´ on lactosa (II) PSM1 : comportamiento del sistema con abundante glucosa y sin lactosa en el entorno Al no haber lactosa en el entorno, no se producir´ a lactosa en el citoplasma y el represor estar´ a activo enlaz´ andose al operador del oper´ on. En estas condiciones la configuraci´ on del switch ser´ a h cap.opLacI i que u ´nicamente permite la transcripci´ on del oper´ on lactosa a muy bajos niveles como puede observarse en el bajo numero de RNAP transcribiendo el oper´ on que aparece en la siguiente figura. 5.0 4.5 4.0

Active RNAP

3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0

100

200

300

400

500

600

time

Al estar presente la glucosa en el entorno hay poca necesidad de metabolizar lactosa. 48 / 51

An´ alisis de la regulaci´ on de genes en el oper´ on lactosa (III) PSM1 : comportamiento del sistema sin glucosa pero con abundante lactosa en el entorno En estas condiciones: • Por una parte, la ausencia de glucosa en el entorno permite que el enzima EIIA∼P interact´ ue con AC para sintetizar un elevado n´ umero de cAMP, lo que producir´ a un alto n´ umero de activadoras CRP-cAMP2 . Por ello, el CAP site ser´ a ocupado propiciando el reclutamiento de RNAP, lo cual potenciar´ a la transcripci´ on. • Por otra parte, puesto que la lactosa es abundante en el entorno ser´ a transportada por LacY, expresada a nivel basal, en el citoplasma. La β-galactosidasa tambi´ en est´ a presente en el citoplasma a nivel basal permitiendo la escisi´ on de la lactosa en galactosa y glucosa, dando lugar a la alolactosa que actuar´ a como inductor enlazando al represor LacI. En la siguiente figura se observa c´ omo los represores activos son inhibidos r´ apidamente cuando la lactosa es abundante. Bajo estas condiciones, el oper´ on lactosa ser´ a, a la vez, inducido (ning´ un represor se unir´ a al operador) y activado (el activador se enlazar´ a al CAP site). Por tanto, la configuraci´ on del switch ser´ a h capCRP-cAMP2 .op i y los genes codificados en el oper´ on se transcribir´ an masivamente, como se deduce del n´ umero de RNAP que est´ an transcribiendo el oper´ on (figura izq.). Esto provocar´ a un incremento en el n´ umero de mol´ eculas de β−galactosidasa y LacY (figura der.).

3000

40

35 2500 30

25 Active RNAP

Active Repressors

2000

1500

20

15 1000 10 500 5

0

0 0

100

200

300

400 time

500

600

700

800

0

100

200

300

400 time

500

600

700

800

49 / 51

An´ alisis de la regulaci´ on de genes en el oper´ on lactosa (IV) PSM1 : comportamiento del sistema con abundante glucosa y abundante lactosa en el entorno La presencia de glucosa produce un bajo n´ umero de activadores y el oper´ on lactosa no ser´ a activado. Por tanto, incluso conla presencia de lactosa, los genes codificados por el oper´ on ser´ an transcritos a muy bajos niveles. Tambi´ en existir´ a poca absorci´ on de lactosa desde el entorno y el LacY ser´ a inhibido. Obs´ ervese en la siguiente figura que el n´ umero de mol´ eculas de glucosa en el entorno decrece mientras que la lactosa permanece casi constante, lo cual indica que pocas mol´ eculas de lactosa son transportadas al interior de la bacteria.

300000 295000 290000

Number of molecules

285000 280000 275000 270000 265000 260000 255000 250000 0

5 10 Glucose Lactose

15

20

25

30

35

40

45

50

time

50 / 51

An´ alisis de la regulaci´ on de genes en el oper´ on lactosa (IV) PSM1 : comportamiento del sistema con abundante glucosa y abundante lactosa en el entorno No obstante, alguna lactosa estr´ a presente ne el citoplasma y producir´ a alolactosa, inhibiendo al represor permitiendo la transcripci´ on a bajos niveles. As´ı pues, en estas condiciones, la configuraci´ on del lac operon switch ser´ a h cap.op i. Luego el oper´ on lactosa ser´ a inducido pero ning´ un activador CRP-cAMP2 se unir´ a al CAP site: no habr´ a transcripci´ on o se producir´ a a bajos niveles como puede verse en la siguiente figura donde el n´ umero de mol´ eculas de galactosidasa y LacY comienza a crecer muy lentamente.

3000

120

2980 100 2960

Cytoplasmic LacY

Galactosidase

80 2940

2920

2900

60

40 2880 20 2860

2840

0 0

100

200

300 time

400

500

600

0

100

200

300

400

500

600

time

En tanto que la bacteria puede metabolizar glucosa, tiene poca necesidad de metabolizar lactosa. No obstante, puesto que la lactosa est´ a presente, la bacteria no ignorar´ a completamente ese az´ ucar adicional. 51 / 51