TÉCNICAS PARA LA CARACTERIZACIÓN DE LINFOCITOS Y RESPUESTA EFECTORA La caracterización de los linfocitos y otras células implicadas en respuesta inmunitaria requiere de la separación e identificación de las subpoblaciones celulares separadas. -Los linfocitos pueden aislarse a partir de sangre, de médula, órganos linfoides, epitelios o sitios donde se haya producido una reacción inflamatoria: Los linfocitos se pueden separar de sangre periférica tratada con heparina medinte un gradiente de Ficoll (mezcla de polímeros de carbohidratos) y metrizamida. (Figura 2.22). La centrifugación de la sangre diluida depositada sobre el “Ficoll-Hypaque” permite la separación de los eritrocitos, polimorfonucleares y granulocitos (que van al fondo) de las células mononucleares de sangre periférica (PBLs) que incluyen linfocitos y algunos monocitos que quedan en la interfase. En animales de experimentación y ocasionalmente en humanos se pueden separar linfocitos a partir de otras locacalizaciones (bazo, timo, médula osea, ganglios linfáticos, tejido linfoide asociado a mucosas). Sin embargo, normalmente el estudio de las poblaciones de linfocitos se hace en sangre periférica. -Obtención de poblaciones de linfocitos con especificidades homogeneas: El estudio de la función efectora de células T depende en buena medida de contar con poblaciones monoclonales de células T (especificidad única). Esto se puede alcanzar de varias formas: 1-Como en el caso de los hibridomas B, células T específicas para un ag pueden fusionarse con líneas celulares derivadas de linfomas de células T para generar híbridos T. Estos híbridos son excelentes herramientas para el análisis de la especificidad, sin embargo no se pueden utilizar para el estudio de la proliferación de células T en respuesta a un ag específico puesto que están continuamente dividiendo. Por esta razón, el estudio de las funciones efectoras de células T requiere de la utilización de clones de células T. Son clones de células T derivadas de una sola célula con especificidad única, a partir de cultivos heterogéneos denominados líneas de células T, cuyo crecimiento depende de la reestimulación por ag periodica así como de la adición de factores de crecimiento (Figura 2.31). La obtención de los clones de células T se obtiene mediante clonación por el método de dilución límite. Cuando se lleva a cabo esta dilución límite de una mezcla heterogénea de células T, algunos pocillos no recibirán ninguna célula T específica de un ag determinado, otras una otras 2 etc. Las células T en los pocillos son activadas con APCs, ag y factores de crecimiento. Después de varios días en cultivo (necesarios para su crecimiento y diferenciación) las células de cada pocillo son testadas en cuanto a su respuesta frente al ag (producción de citoquinas , función efectora etc). -Marcadores de diferenciación: Marcador: cualquier característica funcional o estructural que permite definir un tipo o población de células e incluso separarlas físicamente de las demás. El desarrollo de anticuerpos monoclonales y tecnologías, como la citometría de flujo, que permite una detección rápida de las células reconocidas por esos anticuerpos monoclonales, ha permitido el conocimiento de un gran número de ags. de superficie celular que son útiles como marcadores de diferenciación. Algunos de estos antígenos son exclusivos de

1

un determinado linaje celular y otros se expresan en un determinado estadio de diferenciación y sirven para saber el estado de madurez de un determinada célula. Estas moléculas han sido incluidas en un sistema de nomenclatura conocido como “CD” (Se conocen más de 120 CDs diferentes). La distribución de las subpoblaciones linfocitarias en sangre períferica humana en base a la expresión de determinados marcadores puede caracterizarse de esta forma (Figura 2.23). La herramienta más poderosa para la caracterización de poblaciones celulares heterogéneas es sin duda la citometría de flujo -Citometría de Flujo: Es una técnica analítica que permite la caracterización multiparamétrica e individualizada de una población heterogénea de células. Permite no solo la cuantificación de diversos parámetros de la célula, sino que lo hace en poco tiempo (en minutos se pueden analizar miles de células) e incluso se pueden separar fisicamente las poblaciones elegidas por el operario. Componentes básicos de un citómmetro: (Figura) -Sistema hidraúlico: rodea la suspensión celular en flujo, con una vaina externa, formada por un fluido libre de partículas, que mueve la muestra a velocidad constante y controlada. Produce el enfoque hidrodinámico de la muestra: la suspensión de células se inyecta en un embudo en el que sea su vez se inyecta una corriente de tampón a diferente presión. La diferencia de presioenes crea un efecto hidrodinámico que hace que el tampón envuelva la suspensión de células y consiga que las células de la suspensión se alineen una a una verticalmente. -Sistema de iluminación: La fuente de luz es una haz de laser (normalmente de argon) que incide sobre la corriente de células alineadas. -Sistema óptico: Enfoca la iluminación de las partículas de la muestra de tal forma que cuando el laser no incide sobre una célula no se registra ninguna señal por el aprato. Sin embargo, cuando el laser incide sobre una célula, está prodece una dispersión de luz en todos los ángulos. -Sistema electrónico: La luz dispersada es recogida y amplificada por fotodetectores (fotomultiplicadores) situados en la misma dirección de incidencia del laser y en 90º con respecto al ángulo de incidencia. Estas señales, recogidas en forma de pulsos son registradas y almacenadas por un ordenador. ¿Qué parámetros se pueden medir? La cantidad de luz dispersada en la misma dirección del laser y con la misma longitud de onda del haz incidente es proporcional al volumen de la célula y por tanto esta medida nos permite cuantificar el tamaño de las células. (Figura) La luz dispersada por las células en un angulo de 90º (Figura) con una longitud de onda igual a la del laser de excitación también es proporcional al volumen de la célula pero también es afectada por la topografía de la célula (rugosidades, relación nucleo:citoplasma, homogeneidad del citoplasma-presencia y tamaño de vacuolas etc). Este parámetro se denomina complejidad. Por ejemplo: linfoctios y neutrófilos con tamaño similar tendrían diferentes señales de “light scatter” (complejidad) (90º). Pero además de estos parámetros, si las células van marcadas con un fluorocromo (por ejemplo un anticuerpo conjugado con un fluorocromo específico para un marcador de superficie CD de la célula), el haz de laser excita el fluocromo y se produce una emisión de fluorescencia (diferente longitud de onda a la luz incidente y dependiente del fluorocromo utilizado) que es proporcional a la cantidad de fluocromo y por tanto a la cantidad de marcador que se esté investigando. Por tanto, la luz recogida

2

en 90º con una longitud de onda superior a la de excitación permite la cuantificación de las señales procedentes de los fluorocromos. Teniendo en cuenta que existe un elevado número de fluorocromos que se excitan en un rango de longitudes de onda parecido y que emiten en un rango muy diferente de longitudes de onda (Tabla), es posible llevar a cabo el marcaje simultaneo de diferentes marcadores celulares diferentes mediante la utilización de anticuerpos conjugados a diferentes fluorocromos. El citómetro, mediante una combinación de espejos y filtros (Figura) es capaz de separar las señales de emisión de cada uno de los fluorocromos y registrar y cuantificar por tanto la presencia del marcador celular respectivo. Análisis de los resultados: El software del equipo permite llevar a cabo un análisis posterior de las señales registradas. Se puede llevar a cabo un análisis mono o multiparamétrico, puesto que conocemos todos los parámetros que hemos analizado (volumen, complejidad y cada una de las fluorescencias analizadas de todas y cada una de las células de la población). Se obtienen así diagramas mono o multiparamétricos (Enseñar gráficas) y en cualquier caso el equipo nos informa de la la cuantificación de cada una de las señales así como del porcentaje exacto de la población heterogenénea con determinadas carcterísticas (si es + o – para un determinado parámetro). Pero además, determinados tipos de citómetros de flujo nos permiten llevar a cabo la separación física de las poblaciones analizadas (FACS-citómetros separadoreslo vemos ahora). -Separación de poblaciones celulares: 1-FACS: Determinados citómetros con capacidad de separación son capaces de cargar positiva o negativamente las gotas que contienen células individuales generadas en el flujo hidrodinámico con determinadas características (presencia de CD4 por ejemplo o presencia simultanea de varios parametros CD3, CD44, tamaño). Estás gotas, al pasar por un condensador son separadas en función de la carga (hacia el polo + o -) y recogidas en placas multipocillo o frascos de cultivo. Aunque el FACS es la técnica de elección para una separación con elevado grado de pureza, cuando se trata de separar linfocitos de forma rápida y una pureza elevada se pueden utilizar métodos mecanicos de separación. En muchas ocasiones se utilizan estos métodos como pasos previos al FACS. 2-Separación magnética: Consiste en la utilización de bolas magnéticas conjugadas con anticuerpos monoclonales que reconocen CDs espec´ficos de las células a separar. Las células se incuban con estas bolas y se hacen pasar por una columna que contiene material que atrae las bolas magéticas en presencia de un campo magnético. Las células que unieron el Ac (las que se quieren separar) son retenidas en la columna cuando se amplica este campo magnético mientras que aquellas que no expresan el CD no se retienen. La retirada posterior del campo magnético permite la elución y recogida de las células de interés. (Figura) 3-Panning: unión de Acs específcos de CD a superficies plásticas; incubación de las células en las placas; lavado de las placas; Las células que expresan el CD que quiero detectar son retenidas en las placas. 4-Eliminación de las células no deseadas con anticuerpo más complemento.

3

Medida de la activación de linfocitos: Medida de proliferación celular: Los linfocitos T cuando reconocen péptidos antigénicos específicos se activan y proliferan antes de diferenciarse en células efectoras para dar lugar a un clón de células con la misma especificidad. Esta respuesta mitógena es acompañada de cambios morfológicos hacia blastos. El grado de activación o proliferación de linfocitos in “vitro” en respuesta a un estímulo se puede evaluar determinando el pocentaje de blastos en cultivo o mediante la medida de incorporación de un análogo de nucleótido radioactivo al DNA que se sintetiza de novo. De cualquier forma el análisis de la proliferación de linfocitos resulta esencial para el estudio de la respuesta celular. Activación por mitógenos policlonales: Ciertas substancias estimulan la proliferación de linfocitos in vitro de forma similar al antígeno pero independientemente de la especicidad de su receptor. A estas substancias se les denomina mitógenos mitógenos policlonales. Al contrario que el ag, que solo induce in vitro la proliferación de aquellos clones específicos, estos mitógenos inducen la proliferación de una mayoría de la población de linfocitos. Sin embargo, existe una adecuada correlación entre la respuesta de linfocitos de un individuo a mitógenos (medida in vitro) y su status inmunológico. Es por ello que estos mitógenos (Tabla 2.26 Janeway) se utilizan in vitro para evaluar la capacidad de proliferación de linfocitos de sangre periférica. Este ensayo se utiliza en clínica para testar la capacidad de los linfocitos de un paciente con sospecha de inmunodeficiencia. Los pacientes con deficiencias inmunitarias se detectan clínicamente por historias clínicas de infecciones recurrentes. Para determinar la competencia del sistema inmune de estos individuos, se somete al paciente a una serie de pruebas (Tabla 2.34 Janeway) entre las que se incluyen la medida in vitro de proliferación celular en respuesta a mitógenos. Activación de linfocitos dependiente de antígeno: Además de medir in vitro la proliferación de linfocitos en respuesta a mitógenos, se puede evaluar de la misma forma la respuesta de linfocitos a antígenoa específicos. Este test se puede utilizar para medir respuestas mediadas por células T después de una inmunización (Figura 2.27 de Janeway). ¿Cómo medir la proliferación celular? -Ensayos de incorporación de timidina tritiada. Las células que proliferan sintetizan DNA. Se incorpora al medio de cultivo un análogo de nucleótido como la timidina tritiada. Este análogo solo se incorpora en células que estén dividiendo puesto que se une a DNA sintetizao de novo. Midiendo la radioactividad en células en presencia y ausencia de señal estimuladora se puede evaluar la proliferación en función de las cuentas radioactivas incorporadas (Figura). Medida de respuesta efectora: La medida de la proliferación celular nos da una idea de la capacidad de las poblaciones de linfocitos de activarse pero no informa sobre la capacidad funciónal de las mismas. Existen sin embargo modos de medir las funciones efectoras: 1-Lisis de la células diana: mediada por células citotóxicas y NKs. Células citotóxicas CD8 son capaces de lisar células que presenten el péptido específcio asociado a su molécula de MHC de clase I. Se puede medir la actividad

4

citotóxica de una población de linfocitos T. Se incuban las células diana con Na251CrO4. Las células vivas lo toman pero no lo liberan espontaneamente. Se lavan bien las células después del marcaje y se incuban con las células citotóxicas y al cabo de un tiempo se evalua la radioactividad en el sobrenadante, que será directamente proporcional a la actividad citotóxica de las células efectoras. Necesidad de establecer unos ratios de efectoras:dianas: (3:1/6:1/12:1) que dependen de la capacidad citotóxica de la scélulas. (Figura). 2-La funcionalidad de linfocitos T CD4 implica la activación por parte de estas células de macrófagos (en el caso de TH1) o de células B (en el caso de células TH2). Los efectos de las células T sobre macrófagos y LB están mediados, en buena parte, por citoquinas producidas por LT cuando se reconoce especificamente el complejo MHCpéptido. Estas citoquinas son diferentes y se producen en diferente cantidad dependiendo del tipo de célula efectora. Por esta razón, la funcionalidad de células TH se mide normalmente identificando y cuantificando las citoquinas producidas por estas poblaciones (Poner tabla de citoquinas producidas por distintas poblaciones Ts. -Detección y cuantificación de citoquinas: Se puede realizar mediante ELISA o mediante RT-PCR. ELISA: se suele utilizar un ELISA en sandwich en el cual la citoquina se caracteriza por su capacidad de formar un puente entre dos anticuerpos monoclonales que reconocen diferente epítopos de la citoquina. Figura 2.29 Janeway: Se recubre la placa donde se hace el ensayo con anticuerpo anti IL-2 (se incuba la placa con el anticuerpo durante unas horas), se lava bien el exceso de Ac y se añade el fluido sobre el que se quiere cuantificar la citoquina; después de un tiempo de incubación se lava la placa y se añade el 2º anticuerpo acoplado a un sistema enzimático de identificación (métodos colorimétricos) o acoplado a un fluorocromo (se detecta la fluorescencia emitida). RT-PCR: Una segunda opción para cuantificar citoquinas es la valoración de la cantidad de RNA mensajero específico para la citoquina en cuestión. Se utiliza el método de RTPCR. Este método consiste en la obtención de RNAm total a partir de las células que se quieren cuantificar y obtención de cDNA total utilizando transcriptasa reversa. A partir de este cDNA total, se lleva a cabo una reacción de PCR utilizando oligonucleótidos específicos del gen de la citoquina que se quiere cuantificar. La cantidad de DNA amplificado será proporcional a la cantidad de transcrito para esa citoquina. Explicar la reacción de PCR (Figura) 3-Fagocitosis: Se puede evaluar la capacidad fagocítica de macrófagos o neutrófilos “in vitro” de varias formas. En cualquier caso, el ensayo se suele hacer en placas multipocillo, las células fagocíticas se ponen en contacto con el microorganismo (bacterias, hongos..) durante unas ) durante un tiempo, en el medio de cultivo adecuado (p ejemplo RPMI 1640) y al cabo de ese tiempo se evalúa la fagocitosis: 1-Mediante tinción de Giemsa y observación microscópica de los macrófagos. 2-Mediante citometría de flujo: se cuantificar la fagocitosis mediante la cuantificación del “burst oxidativo”-aumento de la concentración de peróxido de hidrógenio y otros radicales de oxígeno. Las células fagocíticas se tiñen con diacetato de diclofluoresceína, que cuando entra en la célula sufre la acción de esterasas celulares. La diclorofluoresceína, en presencia de peróxido de hidrógeno (consecuencia del burst

5

oxidativo) sufre un proceso de oxidación que lo transforma en un compuesto fluorescente. La fluorescencisa es proporcioanl al burst oxidaticvo y por tanto a la fagocitosis. Otra forma de cuantificar fagocitosis es marcar los microorganismos con compuestos fluorescentes y luego cuantificar señal de fluorescencia de los macrófagos en el citómetro.

6