Tema 2 Conceptos Sobre Receptores Definición (Ehrenpreis et al. Pham.Rev. 21(2): 131 1969) 1. Un receptor es una macromolécula con sitios que tienen propiedades "quimio reconocedoras" para una molécula endógena natural o para una droga específica. 2. La especificidad de los sitios quimio reconocedores de la macromolécula está determinada genéticamente y cumple una función genéticamente determinada. 3. El ligado ("binding") de agonistas, tanto endógenos como fármacos sintéticos, causa un estímulo específico o perturbación en el estado del receptor o su ambiente inmediato (el "estímulo"),o en ambos. Cambio este que inicia una cadena de eventos que llevan a la respuesta. 4. La iniciación de una respuesta por pegado de una droga con un receptor no depende del establecimiento de enlaces covalentes.

Criterios Para Identificar Receptores Aislados. 1. Un receptor putativo debe exhibir una alta especificidad para ligar la droga y esta especificidad debe ser igual a la detectada en el tejido original. 2. Cambios en el estado del receptor putativo inducidos por las drogas u otros agentes deben correlacionar con los efectos de las mismas drogas u agentes sobre el tejido del cual los receptores putativos son originarios. 3. Las cantidades de receptores aisladas deben ser consistentes con las cantidades estimadas como presentes en el tejido original. 4. El receptor putativo debe originarse de regiones de la célula donde se demuestra su existencia in situ. 5. TODOS LOS REQUISITOS SON EL MÍNIMO NECESARIO PARA ACEPTAR EL AISLAMIENTO DE UN RECEPROR.

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Teorías de Acción de Drogas. ¿Por qué esperar que existan receptores? Algunos números mágicos. Un mole es una cierta cantidad de átomos o de moléculas de una misma clase: es el número de Avogadro, 6.022×1023 moléculas/mole. Si consideramos una molécula típica como un fármaco ella pesa unos 200 Da y si 1 mg es la dosis efectiva de esta droga en esa dosis habrá: 10−3⋅g =5⋅10−6 mole −1 200 g⋅mole y con el número de Avogadro: 5⋅10−6 mole⋅6.022⋅1023 moléculas⋅mole−1≈3⋅1018 moléculas se ha estimado (¿?) que un ser humano consta de 31013 células, de modo que la dosis anterior equivale (suponiendo que llega a todas las células): 3⋅1018⋅moléculas =105 moléculas⋅célula−1 13 3⋅10 células igualmente se ha estimado (¿?) que un eritrocito consta de unas 10 10 moléculas. si lo tomamos como una célula tipo nos quedaría: 10 5 moléculas de doga⋅eritrocito−1 moléculas de droga =10−5 10 −1 moléculas de eritrocito 10 moléculas de eritrocito⋅eritrocito de modo que si bien muchas de las suposiciones en el análisis precedente son solo aproximaciones, es obvio que en ellas se requiere un error de 5 órdenes de magnitud para poder presuponer que cada molécula del organismo interactúa con una molécula de droga o que a lo sumo 1 de cada 100,000 moléculas del organismo es candidata a interactuar con una molécula de droga: de ser su receptor. Otro cálculo ilustrativo, pero con menos suposiciones es el hecho que en 1 2 de axón gigante de calamar hay 5105 moléculas de colesterol (8.910-19 moles) y hay entre 50 y 500 receptores de tetrodotoxina (canales de sodio) lo cual lleva a una conclusión similar a

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la anterior con solo considerar el colesterol (no los fosfolípidos, mucopolisacáridos u otras proteínas): 5⋅105 moléculas de colesterol Moléculas de Colesterol =5⋅103 2 Receptores de TTX 10 Receptores de TTX de donde también resulta obvio que no todas las moléculas del nervio interactúan con una molécula de tetrodotoxina. De modo que ambos cálculos sugieren la existencia de sitio específicos para la acción de las drogas en el organismo, sitios que de cumplir las exigentes condiciones indicadas arriba serían los llamados receptores de las drogas. Teorías Sobre Los Modos De La Acción De Las Drogas. Dos grandes teorías se han postulado para explicar el modo por el cual una droga produce su efecto. La primera de ambas fue la teoría de la tasa de ocupación de los receptores propuesta por Parker y Waud. En ella se indica que la acción de las drogas resulta de la energía de activación de la interacción droga receptor que a su vez se propone proporcional a la velocidad con la cual se ocupan los receptores o tasa de ocupación no al número de receptores ocupados. De aquí que como la interacción droga-receptor debe depender de la ley de acción de masas para una droga reversible: [D ][R]⇔[DR] debemos esperar que en equilibrio las concentraciones de reactantes y resultantes den: [D]⋅[R] =K d [DR] donde [D] es la concentración de droga, [R] la de receptor y [DR] la de complejo droga-receptor reversible. Kd es la llamada constante de disociación. Si suponemos que esta reacción sigue una cinética de primer orden para la reacción debemos esperar: d [DR] =k 1⋅[D ]⋅[R]−k −1⋅[DR] dt

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β

d [DR] =k ⏞ 1⋅[D]⋅([ RT ]−[ DR])−k −2⋅[DR] dt

[1.2]

si cambiamos una variable como: =k 1⋅[D]⋅[RT ]−[DR]−k −1⋅[ DR] y la derivamos en t se tiene: d d [DR] =−k 1⋅[D ]k −1 ⋅ dt dt de donde: d d [DR] 1 =− ⋅ dt k 1⋅[D ]k −1 dt de modo que la ecuación [1.2] ahora queda: =−

d 1 ⋅ k 1⋅[D ]k −1 dt

d =−k 1⋅[D ]k −1 ⋅dt  T

1

∫ 1 d =−k 1⋅[D]k −1 ∫ dt  0 0

ln T −ln  0=−k 1⋅[D]k −1 ⋅T

[2.2]

0 es  a tiempo T=0 T es  a un tiempo T cualquiera por tanto:  0 =k 1⋅[D]⋅[R T ] (no se ha formado aun ningún complejo droga-receptor)  T =k 1⋅[D ]⋅[RT ]−[DR]−k −1⋅[DR]

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y la ecuación [2.2] queda ahora ln { k 1⋅[ D]⋅[R T ]−[DR]  −k −1⋅[DR]}−lnk 1⋅[ D]⋅[R T ]=−T⋅ k 1⋅[D ]−k −1  ln

[

]

k 1⋅[ D ]⋅[RT ]−[DR]−k −1⋅[DR] =−T⋅ k 1⋅[D ]−k −1  k 1⋅[D ]⋅[RT ]

de donde tomando exponenciales a ambos lados de la igualdad y despejando: [RT ]⋅1−e−T⋅ k ⋅[ D]−k  [DR]=k 1⋅[D ]⋅ k 1⋅[D ]k −1 1

[DR]=

−1

k 1⋅[D ]⋅[RT ] ⋅[ 1−e−T⋅ k ⋅[D ]k k 1⋅[D ]k −1 1

1



]

si expresamos la concentración de complejo [DR] a tiempo T como función del máximo posible: T =

T =

[DR] [RT ]

k 1⋅[ D] ⋅{1−e−T⋅ k ⋅[D ]k  } k 1⋅[ D]k −1 1

−1

con T = ∞ se tiene el valor en equilibrio:

=

k 1⋅[D ] = k 1⋅[D ]k −1

1 1 = k K 1 −1 1 d k 1⋅[ D] [ D]

[3.2]

si partimos directamente de la ley de acción de masas en equilibrio: [D ]⋅[R] =K d [DR]

[4.2]

reemplazando R como se hizo arriba

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[R ]−[DR ] K d =[D]⋅ T [ DR] si suponemos que existe una constante que relaciona la cantidad de complejo droga-receptor y el efecto tal como: −1

y= ⋅[ DR] y max =−1⋅[RT ] la ecuación [3.2] se reescribe como: K d =[D]⋅

y max− y y

de donde: y=

y max K 1 d [D]

[5.2]

si =

y y max

obtenemos algo idéntico a la ecuación [3.2] anterior que, en general con molecularidades tales que n≥1 es: 1

= 1

n

  Kd [D ]

= 1

1 Qd [D ]n

Promedios de Curvas de Relación Dosis Efecto Supongamos [D] varía desde 0.01 hasta 100 en incrementos de 0.01, Qd1 = 1, Qd2 = 3, Qd3 = 1 y n = 1. Con dos funciones definidas como:

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y i [D ]=

1 Q 1 din [D ]

y m

∑ yi [D ] y media [ D]=

1

m

Si se grafican las tres funciones en escala semi logarítmica se obtiene:

Tres curvas tipo Michaelis-Menten y su media aritmética (en negro).

Nótese que el valor de ymedia([D]) es el valor promedio punto por punto de yi([D]). Nótese igualmente que la curva de ymedia(D) (linea negra en la figura) difiere de todas las otras tres en su pendiente en todos los valores de la abscisa, especialmente cuando [D] = Qd. Si calculamos la media de las Qds empleadas en la gráfica anterior tendremos Qd

media

=

1310 =4. 6 3

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(donde la linea sobre el 6 indica que se repite hasta el infinito) con lo cual podemos graficar nuevamente como sigue:

Tres curvas tipo Michaelis-Menten y otra calculada con el promedio de las Qd de esas tres (en negro).

donde se observa que si calculamos la curva con el promedio de las Qds de las otras tres curvas se obtiene otra (linea negra en la figura) que ahora tiene la misma pendiente de las otras tres. Sin embargo por cuanto la media se tomo en un espacio doble lineal y se gráfica en un espacio semi logarítmico la curva pasa a la derecha de dos de las otras, esto resulta algo anti intuitivo si cuando esperamos que la media sea el centro de todas las medidas. Una forma de obtener esto es empleando la media geométrica que para tres medidas es: K media geom. =m K d1⋅K d2⋅K d3

Que permite graficar como sigue:

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Tres curvas tipo Michaelis-Menten y su media geométrica (en negro)

aquí la gráfica empleando la media geométrica es el centro del gráfico y por ello las líneas negra (media geométrica punto a punto) y la roja se solapan completamente. La estadística tanto de la transformación de media lineal a logarítmica como la de la media geométrica son engorrosas. Pero se puede verificar fácilmente que la gráfica hecha usando la mediana en lugar de la media de las Kds sería idéntica a la anterior y la estadística de la mediana está muy bien definida. Esta es una razón más de usar estadística no-paramétrica. ¿Qué consecuencias trae es uso de los promedios (o medianas que da aquí lo mismo) de los puntos experimentales observados en lugar de las Kds de cada experimento?. Para responder esto debemos recordar que la pendiente de una curva es su primera derivada de modo que para la curva dosis respuesta: y=

y max n

 

K 1 d [D ] se tiene en plano semi logarítmico:

{[ 

dy dy =[D ]⋅ =[ D]⋅ d {ln[D ]} d [D ]

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n

y max

K 1 d [ D]

] n

 

K n ⋅ d ⋅ [D ] [D]

}

que cuando Kd = [D] (pendiente en el punto de inflexión de la sigmoidea) se reduce a: y ⋅n dy = max d {ln([ D])}[D]=K 4 d

si n=1 y ymax = 1 entonces dy =0.25 d {ln([ D])}[D]=K d

y también pero en un plano donde la abscisa está como logaritmo decimal y max⋅n dy = ≃0.5756. d {log10 ([D ])}[ D]=K 4⋅log10 ( e) d

Con lo cual queda demostrado que si tomamos las medias de los efectos observados a cada dosis para dibujar o analizar la curva que mejor los fija estaremos estimando mal a n, a ymax o a ambas.

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Estimación Práctica De Los Parámetros Que Definen La Hipérbola Dosis Respuesta De Una Reacción Droga Receptor Reversible De Primer Orden Si partimos de una reacción reversible con cinética de primer orden su cinética de equilibrio se puede graficar como:

Una hipérbola rectangular tipo Michaelis-Menten

Recordemos que: y=

1 1 y max

y max Q 1 dn [D]

Qd n

[D]



=

y max y

Qd 1 1 ⋅ n= y max [D ] y

Que es la llamada nefasta transformación de doble reciproco o ecuación de Linneweaver-Burk

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¡¡¡Es horriblemente mala !!! es una recta ya que tiene forma

Y = AB⋅X sus pésimas1 propiedades para predecir Kd y ymax se deben a que da mucho peso a los puntos con [D] muy bajo que tiene mucho error.

Transformación de Lineweaver-Burk

La transformación de Hill Nuevamente partiendo de: y=

y max Q 1 dn [D]

Dowd, JE and Riggs, DS. 1965. A Comparison Of Estimates Of Michaelis-Menten Kinetics Constants From Various Linear Transformations. J.Biol.Chem. 240: 863-869. 1

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y max y [D] [ D]n n [D ] Qd = y max⋅ y n [ D] Qd =y max⋅ −[D ]n y y −y Qd =[D]n⋅ max y y −y logQd =log [D ]n⋅ max y y −y logQd =log  [D] n log max y y −y log max −log  Qd  =−n⋅log  [ D ] y y −y log max =log  Qd  −n⋅log [D ] Ecuación de Hille y 1

Qd

n

=

{

}

{

{

{ }

}

}

Esta transformación permite estimar n y Kd dado ymax.

Transformación de Hille

Transformación de Eadie-Haldane

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Nuevamente partiendo de: y max Q 1 dn [D] Q y 1 dn = max y [D] y max⋅[ D]n n [D ] Qd = y n [D ] Qd =y max⋅ −[D ]n y y −y Qd =[D]n⋅ max y Qd y max −y y max = = −1 y y [ D]n Q y⋅ dn = ymax − y [D ] Q y max −y⋅ dn = y [D ] y=

y y =y max −K d⋅ n [D ]

Ecuación de Eadie-Haldane

Transformada de Eadie-Haldane

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Si si definimos una función adicional en forma de "first order lag" o función de retardo de primer orden tal como: −

f  x , K =1−e

x K

que graficamos junto con la de Michaelis-Menten así:

Una hipérbola (linea roja) y una función de retardo de 1er orden (linea negra)

Vistas juntas se ven diferentes, pero si esas curvas estuviesen solas o si solo tuviésemos puntos experimentales con alguna incertidumbre, la función de retardo de primer orden pudiese sugerir que los datos vienen de una hipérbola como la de Michaelis-Menten. Todavía mas si representamos ambas curvas con la nefasta transformación de Lineweaver-Burk donde se pueden ver casi idénticas:

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Hipérbola (linea roja) y Función de Retardo de Primer Orden (linea negra) en Gráfico de Lineweaver y Burk

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pero si graficamos la transformación de retardo de primer orden en un plano de Eadie-Haldane veremos clarísimamente que no es una recta y no tendremos ninguna confusión creyendo que se trata de una hipérbola de Michaelis-Menten:

Hipérbola (linea roja) y Función de Retardo de Primer Orden (linea negra) en Gráfico de Eadie-Haldane

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