TEMA 6 Polimorfismos genéticos humanos. Su importancia en farmacología y toxicología. Asociación con cáncer. Bases Bioquímicas de la Toxicología Clínica Ramiro Jover

Los medicamentos son metabolizados (biotransformados) en nuestro organismo

El hígado es el órgano más importante en la metabolización

1

Metabolismo de medicamentos en el hígado

Los FÁRMACOS llegan al hígado por la vena porta

HEPATOCITOS

Los METABOLITOS salen por la vena cava inferior o por la bilis

Los medicamentos se metabolizan en los hepatocitos METABOLITOS ESTABLES

FARMACO

2

FASE I

XENOBIOTICOS

ELIMINACION

FASE II

Metabolismo de Fármacos - Fase I y Fase II Xenobiótico

Fase I

Metabolito

Fase II

Hidroxilación Epoxidación Desalquilación Desaminación S- y N-oxidación

+ polar + reactivo

Glucuronidación Glucosilación Metilación Acetilación Conjugación con Sulfato Conjugación con GSH Conjugación con AAs

CYP & MEH

Citotoxicidad DETOXIFICACION

3

Metabolismo de fármacos - Fase I y Fase II 5 4

6

3

NH

NH

NH Cl

Cl

Cl

Cl

Conj. Sulfato

3' 4'

Cl

Cl

CYP - 2C9 5'

COOH

COOH

COOH

OH

-O

O S

O

O

Metabolización del diclofenac (ruta principal)

Metabolismo de xenobióticos - bioactivación Estimación del número de xenobióticos • Pesticidas 1500 • Medicamentos 6000 • Aditivos de alimentos - con valor nutricional 2500 - conservantes 3000 • Productos industriales 50000

Xenobiotic

M

Detoxification

Elimination

P450 Bioactivation

Cytotoxicity Genotoxicity

“Up to 80% of all human cancers are thought to arise from exposure to environmental agents” (Doll & Peto, 1981)

4

XENOBIOTIC BIOTRANSFORMATION Reactive metabolite

Stable metabolite

GSH CONJUGATION DEPLETION

Detoxification

Redox cycling Oxidative stress

Lipid peroxidation

Alteration of Ca2+ homeostasis

Covalent binding

Metabolic alterations

ELIMINATION

APOPTOSIS NECROSIS

IMMUNE RESPONSE & GENOTOXICITY

5

Metabolismo de xenobióticos - bioactivación Estimación del número de xenobióticos • Pesticidas 1500 • Medicamentos 6000 • Aditivos de alimentos - con valor nutricional 2500 - conservantes 3000 • Productos industriales 50000

M

Xenobiotic

Detoxification

Elimination

P450 Bioactivation

“Up to 80% of all human cancers are thought to arise from exposure to environmental agents” (Doll & Peto, 1981)

Cytotoxicity Genotoxicity

Funciones del citocromo P450 (CYP) en el metabolismo

Fármacos

Hormonas esteroides Ácidos grasos

Bioactivación. Carcinogénesis química. Xenobióticos

CYP

Vitaminas Liposolubles AyD Sales biliares

6

Citocromo P450 (CYP) - Componentes del sistema NADPH

eCitoplasma

e-

Citocromo P450 reductasa

Fe

FMN FAD

Citocromo b5

P450

Retículo endoplásmico

RH + O2 + NADPH+ H+

ROH + H2O + NADP+

CYPs - Isoenzimas y nomenclatura

Familias > 40%

1

Subfamilias 1A1 1B1 > 55% 1A2

2

3

4

3A4 3A5 3A7 4A9

5

7

8

11

17

19

21

24 27

21A2 4B1

4A11

4F2 4F3

11A1

11B1 11B2

2A6 2B6 2C8 2D6 2E1 2F1 2C9 2C18 2C19

7

CYPs - Abundancia relativa y especificidad Diclofenac Tolbutamide S-Warfarin Phenytoin

SUBSTRATOS Coumarin Fadrozole

2A6

Mephenytoin Diazepam

2C8- 9

3A4- 5

1A2

Sulphaphenazole

Ketoconazole

Furafylline

2C19

INHIBIDORES

Nifedipine Erythromycin Phenacetin Bufuralol Cyclosporine Caffeine Sparteine Chlorzoxazone Cortisol Theophylline Debrisoquine Alcohols

2D6

2E1

Quinidine

¿Tenemos todos el mismo patrón isoenzimático de CYPs?

Variabilidad interindividual : Causas succinil Co-A + glicina ALA sintetasa

Gen-CYP

ácido d-aminolevulínico ALA deshidratasa

mRNA

porfobilinógeno PBG desaminasa Porfirias Co++, Pb++

POLIMORFISMOS Inductores químicos Señales inflamatorias Hormonas Dieta, etc.

Citocromo P450 apoproteína

protoporfirina IX

Fe

Ferroquelatasa

HEMO

CYP

Inhibidores

8

Variabilidad interindividual: consecuencias Efecto tóxico

2D CYP

6

LENTO

Efecto terapéutico

2D6 CYP

NORMAL

Fallo terapéutico

CYP

2D6

RAPIDO

9

Variabilidad interindividual : Consecuencias Benzo-a pyrene

Benzo-apyrene

B-a -pepoxide

GSTM1

CYP1A1

M CYP1A1 +++ activo

GSTM1 null genotype

Benzo-a -pyreneSG

Benzo-apyrene-SG

El benzo-a-pireno se elimina

El benzo-a-pireno se convierte en un epóxido reactivo que no se elimina

POLIMORFISMO Genetic variations (difference in DNA sequence) occurring in more than 1% of a population. The term defines monogenetic traits that exist in the normal population in at least two phenotypes, for example the ABO blood groups. In the context of pharmacology, genetic polymorphism of drug metabolising enzymes gives rise to distinct subgroups in the population that differ in their ability to perform a certain drug biotransformation.

10

POLIMORFISMOÆ Variación genética Æ Cambio en la secuencia del DNA Æ Mutaciones

Las mutaciones, o variaciones en la expresión de los genes, pueden ocurrir con relativa facilidad en las distintas fases del flujo de información genética (replicación-transcripción-traducción) Causas Factores endógenos: Errores en la maquinaria molecular. Factores ambientales: Radiaciones ultravioleta, alteraciones químicas producidas por sustancias tóxicas, etc. Tipos de mutaciones puntuales : Sustitución: Adición (Inserción) Deleción

- Silenciosas - De cambio de sentido - Sin sentido - Desplazamiento de la pauta de lectura

El código genético

11

Mutaciones del DNA. Puntuales

Silenciosas

De cambio de sentido

Sin sentido

Mutaciones del DNA. Delección, adición y cambio en la pauta de lectura

12

Mutaciones del DNA. Alteración en corte y empalme (splicing)

Introducción de mutaciones puntuales por acción de sulfonato de etilmentano (EMS), un agente mutagénico de uso común.

Sustitución G Æ A

13

POLIMORFISMOS FENOTIPACIÓN Y GENOTIPACIÓN

MÉTODOS de FENOTIPACIÓN

• Medida directa de la actividad en tejido (biopsia hepática). • Métodos ex vivo. Medida de actividad en cultivo de linfocitos. • Métodos in vivo. Medida de un metabolito, relación metabólica (Sustrato / Producto), o velocidad de eliminación, de un fármaco modelo: CYP1A2 Æ Cafeína (?) CYP2C9 Æ Tolbutamida, warfarina CYP2C19ÆS-mefenitoina, omeprazol CYP2D6 Æ Dextrometorfan CYP2E1 Æ Cloroxazona

14

Fenotipo polimórfico: Hidroxilación de debrisoquina Debrisoquine

CYP

4-Hydroxydebrisoquine

Genotipación. Detección de mutaciones puntuales. RFLP

15

RFLP (Southern blot analysis)

Genotipación. Single-strand conformation polymorphism (SSCP)

16

Citocromos P450 polimórficos con relevancia en el metabolismo de xenobióticos

CYPs humanos implicados en el metabolismo de carcinógenos

17

CYPs humanos implicados en el metabolismo de carcinógenos

CYP1A1

Hidrocarburos aromáticos policíclicos (benzo(a)pireno & dimetilbenzantraceno)

CYP1A2

Nitrosaminas, aminas heterocíclicas

CYP2A6

Nitrosaminas, aflatoxina B1

CYP2D6

NNK (nitrosamina derivado en humo tabaco)

CYP2E1

Benzeno, tetracloruro de carbono, cloruro de vinilo

CYP3A4/5

Aflatoxina B1, benzo(a)pireno, 6-aminocriseno

Polimorfismo del CYP2D6 Polimorfismo de la debrisoquina / esparteina El 7% de la población presenta un metabolismo deficiente Herencia autosomal recesiva Influye en la metabolización de mas de 25 fármacos de uso común: β-bloqueantes, antiarrítmicos, antidepresivos tricíclicos, antipsicóticos, analgésicos, antihistamínicos, etc

Number of people

Debrisoquine

CYP2D6

4-Hydroxydebrisoquine

Extensive metabolizers

Poor metabolizers

Debrisoquine / 4-hydroxydebrisoquine

18

Polimorfismo del CYP2D6 CYP2D6 allele

Detrimental mutation

2D6-A A

A2637 deleted

2D6-B B

Consequence

Frequency in Caucasian 5-10

G1934 Æ A

Reading frame disruption Defect splicing

2D6-D D

Gene deletion

No-enzyme

10-15

2D6-E E

A3023 Æ C

1-5

2D6-T T

T1795 deleted

His324Æ Pro nonfunctional prot. Reading frame disruption

70-80

5-10

Polimorfismo del CYP2D6

Cys

N

2D6-wt wt

signal anchor

C (497) SRS1 SRS2 SRS3 SRS4

N

2D6-T T

2D6-E E

SRS5

SRS6

C (152) SRS1

Pro (324) Cys

N

C (497) SRS1 SRS2 SRS3 SRS4

SRS5

SRS6

19

Polimorfismo del CYP2D6 y cáncer de pulmón

NNK (4- (metilnitrosamina)- 1- (3 - piridil)- 1- butanona) Nitrosamina identificada en el humo del tabaco (Crespi et al. 1991) Es activada (bioactivada) por CYP2D6 Menos aductos DNA - nitrosamina en metabolizadores pobres 2D6 Metabolizador pobre Æ fenotipo protector Nicotina es sustrato del CYP2D6. Nicotina Æ cotinina Mas nicotina en el plasma de metabolizadores pobres 2D6 Menos necesidad (mayor duración efecto) Æ menos cigarrillos Æ Menos riesgo de cancer Metabolizador pobre Æ fenotipo protector

Ah

R

p9 Hs

0

Hs p9

0

AhR Arnt

AhR

P

AhR

TCDD

Arnt

Polimorfismos del CYP1A1 y del receptor AhR

P Cytochrome Endoplasmic P450 1A1 Reticulum

Enhancer

Promoter

TFIIX TBP

TATA

mRNA

Nuclear RNA

20

Polimorfismo del CYP1A1

CYP1A1

Polimorfismo del CYP1A1: Estudios fenotípicos Actividad: hidroxilación de hidrocarburos aromáticos (benzo(a)pireno Æ 3-hidroxi-benzo(a)pireno) Tejido: linfocitos periféricos inducidos con -3

MCo TCDD

En estudios poblacionales la actividad CYP1A1 muestra una distribución trimodal Æ Fenotipos: Baja, media y alta actividad / inducibilidad

Asociación fenotipos 1A1 con carcinoma bronquial Æ Alta actividad % Controles: 10.9 % Pacientes: 30.6

Baja actividad 42.2 5.0

21

Polimorfismo del CYP1A1: Estudios genotípicos Ile / Val(462) polymorphic site

Exon 1

2

3 4 5

6

7

MspI polymorphic site

AA-MspI polymorphic site

Alelos

Genotipo

Fenotipo

Controles

Cáncer pulmón

m2 MspI +

m2/m2

Alta Inducción

10.6

22.9

Val 462

Val/Val

Alta Actividad

4.7

12.5

Enzimas de Fase II implicadas en carcinógenesis GSTs NATs Sulfotransferasas Otras enzimas implicadas en el metabolismo de carcinógenos Alcohol deshidrogenasa

Aldehido deshidrogenasa

Microsomal epoxido hidrolasa Mieloperoxidasa

NAD(P)H:quinona oxidoreductasa

22

Glutation - S -transferasas GST S (centro electrófilo) + GSH - - ---------- >S - SG • Multifamilia de enzimas citsólicos mayoritariamente hepáticos. • Presente en la mayoría de seres vivos. • Protección contra compuestos nocivos. SUSTRATOS: • Endógenos: Productos del estrés oxidativo Peroxidación lipídica Æ cumene hydroperoxide, 4-hidroxinonenal Oxidación del DNA Æ Propenales básicos de timina y uracilo

• Exógenos: Carcinógenos ambientales HAP bioactivados por P450 ( epóxidos, trans-4-fenil-3-buten-2-ona, benzo(a)pireno-diolepoxido) acroleina (humo tabaco), agentes metilantes (cloruro de metilo) pesticidas, disolventes industriales (oxido de etileno).

Conjugación con glutation y su metabolismo

GSH (γ-Glu -- Cys --Gly)

23

Glutation-S-transferasas humanas

Familias

alpha

mu

GSTM1

Isoenzimas

GSTA1 GSTA2

GSTM2 GSTM3 GSTM4

theta M1*2 (57%) M1*A M1*B GSTT1 M3*1

pi GSTP1 T1*1 T1*2 (20%)

GSTT2

M3*2

GSTM5

Glutation - S -transferasas humanas : Polimorfismos y cáncer

Cutaneous basal cell carcinoma (BCC): UV Æ ROS Æ mutations GSTM1, GSTM3 y GSTT1 conjugan compuestos resultantes del estrés oxidativo inducido por UV. GST se expresa en la epidermis y en la lamina basal de la piel (que incluye las stem cells) Número promedio de BBCs SI NO Skin type 1 2.99 2.12 +GSTM1*2 (null) 4.57 2.00 +GSTM3*1 (AA) 3.57 2.08

24

- acetil- transferasas (NATs) N

Sustrato + Ac-

NAT CoA--------------------> S - acetilado

SUSTRATOS: Endógenos: Aminas aromáticas endógenas como serotonina. Transferencia de grupos acetilo entre arilaminas endógenas (sin Ac-CoA). Son denominadas: Arilamina N-acetiltransferasas Exógenos: Carcinógenos ambientales (Procesos industriales y combustion tabaco o alimentos). Aminas e hidrazinas aromáticas y heterocíclicas.

- acetil- transferasas humanas: variantes alélicas N

NAT1 (7 alelos) Genes

NAT2 (15 alelos)

1*4 1*10 1*14 1*11 1*15

wt Alternat polyA Arg187Gln Val149Ile Arg187Stop

(Ç level) rapid (È affinity) slow (Ç Vmax) rapid (no NAT1) slow

2*4 2*5A 2*6A 2*7A 2*14A

wt Ile114Thr Arg197Gln Gly286Glu Arg64Gln

(È NAT2) slow (È stability) slow (È stability) slow (È stability) slow

25

- acetil- transferasas humanas y cáncer N

Cáncer

Genotipo

Colon: Bell et al. (1995) Controles Enfermos

Rápido

Pulmón: Bouchardy et al. (1998) Controles Enfermos

Lento

Hígado: Agúndez et al. (1996) Controles Enfermos

Lento

NAT1 % (n) OR

NAT2 % (n) OR

29 (112) 1.0 44 (202) 1.9 56 (170) 1.0 66 (148) 1.9 54 (258) 1.0 68 (100) 1.8

ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS. Medidas de asociación.

ODDS de que nazca un niño: nº niños 51 / nº niñas 49 = 1.04 RISK de que nazca un niño: nº niños 51 / (tot 100) = 0.51

ODDS RATIO: ODDS control = 1.04 ODDS india = 1.70 (63/37) OR= 1.70 / 1.04 =1.63 RELATIVE RISK RISK control = 0.51 RISK india = 0.63 (63/100) RR= 0.63 / 0.51 =1.24

26