TESIS DOCTORAL DEPARTAMENTO DE FÍSICA APLICADA UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA ______________________________________

Contribución al Estudio del Comportamiento de Silicio Poroso Nanoestructurado en Fluidos Corporales Simulados para el Desarrollo de Nuevos Materiales Biocompatibles y Biodegradables Directores: Dra. Eugenia Matveeva Dr. Jorge Curiel-Esparza Presentada por: Ester L. Pastor

Valencia, Febrero de 2008

Agradecimientos Quiero expresar mi agradecimiento, en primer lugar, a mis directores, Jorge Curiel-Esparza y Eugenia Matveeva, no sólo por el interés y esfuerzo que han puesto en este trabajo, también por el aprecio que siempre me han demostrado. Además de a Vitali Parkhutik por cuánto me transmitió y sin cuya aportación no hubiera realizado esta investigación. Agradezco a los profesores Jarno Salonen y Vesa-Pekka Lehto la hospitalidad con que me recibieron en el Laboratorio de Física Industrial de la Facultad de Ciencias Físicas de Turku durante mis estancias en el 2006 y en el 2007. En este sentido, extiendo mi agradecimiento a otros miembros de dicho departamento por su amistad y colaboración. También a José Ángel Ayúcar, Técnico de Microscopía del Instituto de Tecnología de Nanofotónica de Valencia, así como a Gonzalo Salvador, Técnico de Laboratorio de la UPV, su ayuda en la toma de imágenes SEM y en la preparación de los portamuestras. Además de a mis compañeros del Grupo de Materiales y Tecnologías de Microfabricación por su compañía y las múltiples conversaciones –científicas o no – a lo largo de estos años. Por último, quiero expresar mi mayor agradecimiento a mi familia y amigos, sin cuyo apoyo no habría llegado nunca hasta aquí.

Valencia, 12 de Febrero 2008.

Índice Introducción y objetivos del estudio

1-6

1. Estado actual de conocimiento en el campo de materiales nanoestructurados biocompatibles

7-56

1.1. Introducción

9-10

1.2. Definiciones

10-13

1.3. Clasificación y aplicaciones

13-30

1.3.1. Administración de fármacos

14-19

1.3.2. Reparación y/o reemplazo de tejidos

19-27

1.3.3. Dispositivos implantables para detección y/o tratamiento

27-30

1.4. Fluidos biológicos simulados

31-37

1.5. Silicio poroso nanoestructurado

37-46

1.5.1. Descubrimiento

37-39

1.5.2. Obtención

39-46

1.5.2.1. Formación por corriente anódica

38-44

1.5.2.2. Formación por stain-etching

44-45

1.5.2.3. Formación por fotosíntesis

45

1.5.3. Morfología y estructura

46-49

1.5.4. Química de superficie del silicio poroso

49-55

1.5.4.1. Oxidación

50-52

1.5.4.2. Derivatización

52-55

2. Métodos experimentales

57-84

2.1. Introducción

57-84

2.2. Materiales

59

2.3. Preparación de muestras y cálculos oportunos

60-62

2.4. Tratamientos de derivatización

62-67

2.4.1. Oxidación electroquímica

67-68

2.4.2. Oxidación térmica

68

2.4.3. Tratamiento térmico con acetileno

69

2.5. Preparación del fluido biológico simulado (SBF)

70-73

2.6. Métodos de visualización de la estructura y morfología

73-76

2.6.1. Microscopía óptica

73

2.6.2. Microscopía electrónica de barrido

73-75

2.6.3. Microscopía de fuerza atómica

75-76

2.7. Análisis químico superficial

76-80

2.7.1. Reflectancia total atenuada

77-79

2.7.2. Reflectancia difusa

79-80

2.8. Estructura cristalina 3. Resultados obtenidos

80-84 86-151

3.1. Introducción

88-89

3.2. Silicio poroso sin modificar

89-110

3.2.1. Preparación de las muestras

89-92

3.2.2. Caracterización de la morfología y la composición

92-105

3.2.3. Comportamiento en SBF

105-110

3.3. Silicio poroso modificado por oxidación 3.3.1. Oxidación térmica

110-114 112-114

3.3.1.1. Preparación

112-113

3.3.1.2. Comportamiento en SBF

113-114

3.3.2. Oxidación electroquímica 3.3.2.1. Cinética electroquímica de oxidación y factores que influyen en la misma

115-129 115-117

3.3.2.2. Caracterización de la morfología y la composición

118-125

3.3.2.3. Comportamiento en SBF

125-129

3.4. Silicio poroso modificado por tratamiento térmico con acetileno

129-144

3.4.1. Preparación

129-130

3.4.2. Caracterización de la morfología y la composición

130-133

3.4.3. Comportamiento en SBF

133-134

3.4.4. Oxidación electroquímica de las muestras derivatizadas

135-144

3.4.4.1. Cinética electroquímica de oxidación de silicio poroso derivatizado con acetileno

135-136

3.4.4.2. Caracterización de morfología y composición

136-139

3.4.4.3. Comportamiento en SBF

139-144

3.5. Casos especiales de interacción de silicio poroso con SBF

144-151

3.5.1. Polarización corriente continua

144-150

3.5.2. Polarización corriente alterna

151-152

4. Conclusiones y perspectivas futuras

153-160

Bibliografía

161-175

Resumen En los últimos años el interés hacia el silicio poroso nanoestructurado para el desarrollo de nuevas aplicaciones biomédicas, como pueden ser: biosensores, liberación controlada de fármacos, etc., ha crecido exponencialmente. Los materiales ideales para este tipo de aplicaciones deben ser biocompatibles, biodegradables y biorreabsorbibles dependiendo de su función. El silicio mesoporoso es biodegradable, pero su biocompatibilidad depende de sus propiedades superficiales y de su estructura. Nuestro objeto de estudio ha sido el aumento de la biocompatibilidad del silicio poroso. En particular se ha investigado la interacción “in Vitro” de este material con fluido corporal simulado (FCS), que contiene una composición iónica casi idéntica a la del plasma sanguíneo, con el objetivo de conocer su comportamiento. Posteriormente, se han realizado dos tipos de tratamientos sobre el mismo: de oxidación (Si-O) y de derivatización con acetileno (Si-C), analizando su influencia en el comportamiento del material en FCS. Ambos procesos, ya conocidos en diversas aplicaciones del silicio poroso, han dado lugar a una estabilización en este medio. Además se ha demostrado que la oxidación electroquímica en ácido fosfórico concentrado del silicio poroso con o sin derivatización, incrementa su bioactividad, asegurando la biocompatibilidad. Los resultados han permitido llegar a obtener capas de hasta 5 µm de hidroxiapatito (componente mineral del hueso) sobre la superficie de las muestras, tras un mes de inmersión de las mismas en FCS, lo que es de gran interés en futuras aplicaciones biomédicas que tengan como base este material.

Resum En els últims anys l'interès cap al silici porós nanoestructurat per al desenvolupament de noves aplicacions biomèdiques, com poden ser: biosensors, alliberament controlat de fàrmacs, etc., ha crescut exponencialment. Els materials ideals per a aquest tipus d'aplicacions han de ser biocompatibles, biodegradables i biorreabsorbibles depenent de la seva funció. El silici mesoporós és biodegradable, però la seva biocompatibilitat depèn de les seves propietats superficials i de la seva estructura. El nostre objecte d'estudi ha estat l'augment de la biocompatibilitat del silici porós. En particular s'ha investigat l´interacció “in Vitro” d'aquest material amb fluid corporal simulat (FCS), que conté una composició iònica gairebé idèntica a la del plasma sanguini, amb l'objectiu de conèixer el seu comportament. Posteriorment, s'han realitzat dos tipus de tractaments sobre el mateix: d'oxidació (Si-O) i de derivatització amb acetilè (Si-C), analitzant la seva influència en el comportament del material en FCS. Ambdós processos, ja coneguts en diverses aplicacions del silici porós, han donat lloc a una estabilització en aquest mitjà. A més s'ha demostrat que l'oxidació electroquímica en àcid fosfóric concentrat del silici porós amb o sense derivatització, incrementa la suva bioactivitat ,assegurant la biocompatibilitat. Els resultats han permès arribar a obtenir capes de fins a 5 µm d´hidroxiapatit (component mineral de l'os) sobre la superfície de les mostres, després d'un mes d'immersió de les mateixes en FCS, el que és de gran interès en futures aplicacions biomèdiques que tinguin com base aquest material.

Abstract Porous silicon recently has been suggested for biomedical proposals. These applications require materials that are both biocompatible and biodegradable. Medium and highly porous (above 40%) silicon is known as a biodegradable material and its biocompatibility is highly tunable. The aim of the work is a study of the methods for improving its biocompatibility (up to reaching a bioactivity). As a model positive we investigated “in Vitro” process of deposition of hydroxyapatite (inorganic component of bones) form simulated body fluid SBF. In our study a surface of porous silicon materials was differently modified by gradual electrochemical oxidation (Si-Ox) or by acetylene (Si-C) and response produced in SBF solution was analyzed. The surface modification allowed for obtaining biocompatible dense hydroxyapatite layers up to 5 µm of thickness on the samples surfaces after one month in SBF. The results are of great interest for future biomedical applications of that material.

Introducción y objetivos del estudio ________________________________________________

2

La presente tesis contribuye al estudio del comportamiento de silicio poroso en fluido biológico simulado con el objetivo primordial de lograr la formación de una capa de hidroxiapatito sobre su superficie, lo que garantizaría su biocompatibilidad. En nuestro trabajo hemos enfocado el problema desde el punto de vista de la estabilización de las características del material para conseguir mejorar la bioactividad de materiales basados en silicio poroso. Particularmente hemos estudiado la oxidación del silicio poroso como método de estabilización de sus propiedades superficiales y los efectos de la misma en el comportamiento en FCS. También hemos usado otro proceso de modificación superficial, la derivatización con acetileno. Se han estudiado las variaciones que produce este tratamiento en el material poroso y como afecta la oxidación posterior de la superficie derivatizada a su comportamiento en FCS. El silicio poroso es un material nanoestructurado de fácil y económica fabricación. Debido a sus nanoporos posee propiedades físicas y químicas muy diversas tales como luminiscencia, índice de refracción variable, biodegradación, bioactividad en cierto rango, etc. Esto hace que hoy en día sea objeto de gran cantidad de estudios para aplicaciones que van desde la opto-electrónica hasta la biotecnología y numerosos grupos de investigación punteros en el mundo sitúan sus perspectivas e interés en él. La posibilidad de utilización de silicio poroso nanoestructurado en dispositivos médicos implantables y en diversas aplicaciones biomédicas es increíble y en algunos de los casos puede parecer de ciencia ficción. Se ha propuesto usarlo como interfaz entre sistemas biológicos y electrónicos (microelectrónicos), está siendo investigado para aplicaciones en liberación controlada de fármacos, en ingeniería de tejido como sustituto óseo, biosensores, terapia fotodinámica de cáncer, etc. La profundización en este campo es de gran interés científico y marca las tendencias de desarrollo tecnológico del sector. Entre todas las posibilidades de empleo de este material, que van desde la fotovoltaica a la biotecnología, su uso en biomedicina es uno de los más prometedores. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el silicio no es un elemento especialmente biocompatible. De hecho, el silicio poroso recién preparado se encuentra recubierto por terminaciones superficiales Si-Hx., es decir, es hidrofóbico y por consiguiente no miscible con los medios biológicos basados en agua. Además, la presencia de esos grupos de fácil, espontánea e incontrolada oxidación hace que las propiedades de material cambien con el tiempo. Por eso las aplicaciones comerciales del silicio poroso requieren de tratamientos químicos para la estabilización de sus propiedades superficiales.

3

Los tratamientos más comunes utilizados para estabilizar la superficie de silicio poroso son los de oxidación (Si-O) o derivatización química con formación de enlaces Si-C. En este último caso las posibilidades de utilización del material modificado para aplicaciones biomédicas son muy diversas porque se abre la vía de enlazar con el silicio cualquier tipo de molécula orgánica y formar una monocapa sobre la superficie porosa. Además, la química derivativa de este material es más versátil que la de otros materiales a base de sílice mesoporosa donde de partida siempre se tiene los enlaces Si-O. En cuánto al campo de ingeniería de tejido, el silicio poroso se encuentra dentro del grupo de sustitutos óseos que más se acerca a la condición de ideal para está aplicación. Dadas sus características el silicio poroso es un material de última generación que combina la biocompatibilidad con la reabsorción por los sistemas vivos. Además, siendo semiconductor es apto en aplicaciones con control eléctrico, mientras que otros materiales biodegradables utilizados como sustitutos óseos, normalmente cerámicos o poliméricos, son aislantes y su utilidad en tales dispositivos es limitada. Actualmente la mayoría de las investigaciones de nuevos materiales en el campo de las aplicaciones biomédicas se realizan in Vitro con la utilización de fluido biológico simulado (FCS, o en inglés simulated body fluid, SBF) [1], un medio acelular artificial que trata de imitar el plasma humano. Los ensayos en FCS proporcionan un método sencillo y económico que puede ser usado como indicador de la capacidad del material de interaccionar con los tejidos vivos (bioactividad). Los principales problemas que se presentan a la hora de utilizar nuevos materiales en medios biológicos están relacionados con la pobre biocompatibilidad de los mismos y demandan el conocimiento de sus propiedades superficiales. Esto también afecta al silicio, de ahí nuestro interés en investigar este campo. Sobre la superficie de los materiales bioactivos cuando están inmersos en FCS se produce formación de una capa de hidroxiapatito. La creación de esta capa intermedia entre la superficie del dispositivo y el medio biológico aseguraría su biocompatibilidad. Por este motivo, y desde el descubrimiento en 1995 por L. Canham [2] de la bioactividad del silicio poroso, los intentos para producir una capa de hidroxiapatito sobre superficie de este material han sido constantes [3-9]. A pesar de ello, cabe mencionar que en el caso del material investigado en esta tesis, teniendo en cuenta su gran interés potencial, todavía son pocos los estudios en esta área. Tras el análisis del comportamiento de este material en fluidos corporales simulados, una vez descubiertas las pautas de conducta, las bases científicas

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involucradas en éstas servirán para la creación de nuevos materiales biodegradables y biocompatibles. Es conveniente efectuar primero un reconocimiento general que permita establecer que materiales nanoestructurados se están utilizando en biomedicina y cuáles son sus aplicaciones, así como las perspectivas de desarrollo dentro de este sector. Una vez ubicados en el campo de materiales nanoestructurados biocompatibles, procederemos a un estudio detallado del silicio poroso como biomaterial, concretamente el estado actual de conocimiento, el modo de empleo, las aplicaciones y las investigaciones sobre estabilidad y biocompatibilidad existentes sobre el mismo. El Capítulo 1 está dedicado a esta finalidad desde el punto de vista de materiales nanoestructurados, medios de ensayos in Vitro, silicio poroso como materia nanoestructurado y sus aplicaciones biomédicas, así como una breve descripción de los métodos de estabilización de la superficie del silicio poroso. Para detallar el proceso de preparación de silicio poroso y del fluido biológico simulado (FCS) utilizado para los ensayos in Vitro, las técnicas de derivatización y de estabilización de la superficie de las muestras, el funcionamiento de los equipos de medición y los métodos de caracterización empleados en el Capítulo 2 se describe el procedimiento experimental seguido. El Capítulo 3 presenta los resultados obtenidos en la preparación de las muestras (porosidad, espesor de capa, diámetro de poro,…) así como las propiedades de las mismas tras realizar los tratamientos de derivatización química. También se analizan los cambios producidos tras la inmersión de las muestras en FCS en función de sus condiciones de preparación y los efectos producidos por la polarización catódica en este medio. Para terminar, en el Capítulo 4 se resumen las principales ideas a tener en cuenta en el campo investigado, describiendo las contribuciones aportadas por nuestro trabajo, las perspectivas futuras y diversas posibilidades de realización de investigaciones para profundizar aún más en este estudio. Esperamos que los resultados obtenidos en nuestras investigaciones ayuden a conseguir el máximo beneficio en el empleo de materiales basados en silicio poroso nanoestructurado en sus diversas aplicaciones biomédicas.

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CAPÍTULO 1 Estado actual de conocimiento en el campo de materiales nanoestructurados biocompatibles ____________________________________________________

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8

1.1 Introducción Actualmente los materiales nanoestructurados biocompatibles se usan en campos que hasta hace poco eran considerados como de ciencia ficción: nuevas formas de administrar medicamentos más directas y eficaces, desarrollo de nuevos materiales para injertos, materiales inteligentes capaces de responder a estímulos dentro del cuerpo, etc. Durante los últimos 5 años ha habido un aumento muy significativo de la actividad comercial en este campo. Por ejemplo, la empresa Nanosys creada en el 2001 que trabaja con semiconductores nanoestructurados en distintos campos, incluido el de la biodetección, cuenta ya con más de 300 patentes. El mercado actualmente ofrece gran variedad de productos nanoestructurados con aplicaciones en medicina y biología. Fácilmente se encuentran más de 100 compañías dedicadas a la producción de estos materiales para dichas aplicaciones. Entre otras se puede nombrar Biosante, Nanotemplate Engineering, Biocrystal, Nutrelase, Orthovita, PSivida, etc. Cabe destacar que la mayoría de estas empresas son salidas tecnológicas (Spin-Out) de Centros de Investigación y Universidades. En el caso particular del silicio poroso, material con el que se ha trabajado en esta tesis, posee un conjunto de propiedades (semiconductor, gran versatilidad química, facilidad de fabricación, etc.) que hacen que sea un excelente candidato en potencia para determinadas aplicaciones: biosensor, contenedor de fármacos para su administración más eficaz o soporte reabsorbible en ingeniería de tejido. De hecho hoy en día existen multinacionales que trabajan en diferentes campos y que mantienen patentes en innovación biomédica utilizando este material como base. Por ejemplo, Siemens Ag ha patentado un biochip a base de silicio poroso (EP1451289-A2), Robert Bosch GMBH ha patentado un sistema para inmovilizar células a base también del mencionado material (DE10247189-A1). Existen diversas empresas como son pSimedica Ltd, QinetiQ Ltd, Infineon Technology GMBH, u otras, que lo utilizan como material base para su gama principal de productos. Las marcas Vitrasert®, Retisert® tratamientos para enfermedades oculares y de cáncer ya están comercializadas y tienen también este material base, otros productos en los que se utiliza silicio poroso con diversos tratamientos químicos como Brachisyl y Mifrepristone están en fase de ensayos clínicos [1]. Se considera que determinados campos de la medicina pueden ser objeto de una auténtica revolución con la utilización de materiales nanoestructurados, especialmente áreas como reparación de tejidos, control de la evolución de las enfermedades, defensa y mejora de los sistemas biológicos humanos, diagnóstico,

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tratamiento y prevención, alivio del dolor y cirugía no invasiva y prevención de la salud. Se espera que el desarrollo de este sector constituya nuevos avances tecnológicos en la medicina que la posicionara en una nueva etapa científica y asistencial. 1.2. Definiciones Para una correcta compresión e interpretación de los estudios realizados en esta tesis es imprescindible introducir y definir previamente conceptos relacionados con las aplicaciones. En un nanomaterial los granos moleculares tienen un tamaño máximo de 100 nm de diámetro y tienen poblaciones granulares menores a decenas de miles de átomos. Los granos de los nanomateriales son entre mil y cien veces más pequeños que los de un material común, y además, dentro del mismo volumen poseen el 0.001 por ciento de átomos. Esto significa un ahorro increíble de materia dentro de cada fragmento de material nanoestructurado y, como consecuencia, permite obtener propiedades y características nuevas, singulares y asombrosas que nunca antes han sido vistas en los materiales comunes. Como materiales nanoestructurados se entienden aquellos nanomateriales que poseen formas o funcionalidades especiales. Por ejemplo, los dendrímeros, que son polímeros ramificados, poseen una estructura geométrica determinada y son utilizados para administración de medicamentos, filtración, o como marcadores químicos. En concreto, el silicio poroso nanoestructurado, posee una morfología o distribución espacial de poros y cristalitos de silicio que resulta en propiedades singulares como luminiscencia, biodegradabilidad, bioactividad. El silicio cristalino macizo no posee estas propiedades que son de gran interés para el desarrollo de aplicaciones biomédicas. El término biocompatibilidad fue introducido por primera vez en el campo de biología y se define como “la habilidad de un implante para llevar a cabo la función requerida sin provocar respuesta específica en el sitio donde es implantado” (Williams 1998). Al considerar el sistema completo (implante – huésped) este término resulta depender de la interacción mutua entre los constituyentes: de cómo el huésped afecte al implante, y viceversa. En caso de biosistemas la respuesta del huésped podría generarse como inflamación, toxicidad, cáncer, etc., es decir, la naturaleza del receptor podría variar considerablemente dependiendo del comportamiento del implante (como por ejemplo su corrosión u otro resultado de biodegradación del material). Por tanto, la biocompatibilidad

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depende de la localización y del tiempo. Un implante puede ser biocompatible para aplicaciones en periodos cortos de tiempo, pero no para periodos largos. O puede tener una respuesta nociva en periodos cortos pero no en largos. La biodegradación puede no tener importancia para aplicaciones en periodos cortos de tiempo, pero puede ser muy importante para periodos largos, por ejemplo, en válvulas del corazón. Cabe subrayar que el término biocompatibilidad fue introducido respecto a los sistemas vivos y tiene esta percepción bastante clara. Sin embargo, en los ensayos con materiales de procedencia no biológica el término de biocompatibilidad ha perdido esta noción y es considerado de modo simplificado. En nuestro caso el término de bioactivo va a significar la habilidad del material (silicio poroso) de recubrirse por la fase de hidroxiapatito (componente mineral del hueso) tras su exposición temporal (de 15 a 30 días) a fluido biológico simulado. Relacionado con esto el término de biodegradación significa la desaparición (disolución) de parte de material (silicio poroso en nuestro caso) durante su exposición al fluido biológico (FCS). Con frecuencia en las investigaciones biomédicas se usan dos términos muy parecidos a los mencionados con significado semejante: Bioactivo (en vez de biocompatible) es un material que puede enlazarse con tejido vivo, un término opuesto es bioinerte. El crecimiento de una capa de hidroxiapatito cuando el material está inmerso en fluido biológico simulado se ha convertido en indicador de la bioactividad del material. No obstante, antes de que un nuevo material pueda ser autorizado para su uso clínico, ha de pasar pruebas biológicas que demuestren su biocompatibilidad (in Vivo). Para ello según la función específica del objeto a implantar y la duración del contacto con el cuerpo humano se realizan diferentes experimentos. En el caso de materiales que van a ser utilizados en implantes de hueso la normativa obliga a efectuar test de citotoxicidad, reactividad intracutánea, genotoxicidad, toxicidad crónica, carcinogenicidad, etc. Existe una base de datos para conocer las pruebas pertinentes que hay que realizar en cada caso [2] (Agencia americana de alimentación y fármacos, FDA, Food and Drug Agency) que es un buen punto de partida en cuestiones relacionadas con biocompatibilidad. Igualmente las normas recomendadas para la evaluación de la seguridad biológica y biocompatibilidad de los biomateriales y equipos médicos se encuentran en la ISO 10993. La FDA en el año 2005 ya aprobó algunos medicamentos que contienen el silicio poroso modificado o tratado convenientemente para lograr su biocompatiblidad como puede ser el tratamiento con Retisert® de enfermedades oculares [3].

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Generalmente, para materiales en contacto con fluidos biológicos las pruebas más importantes son las de calcificación, adsorción de proteínas y las de adhesión de células. En este sentido en el silicio poroso se han efectuado gran cantidad de estudios, existen publicaciones referentes a la calcificación [2-9,13-17], adhesión y cultivo de células [18-21], redes neuronales [22], adsorción de proteínas [23-26] y estudios de biodegradabilidad [27-31], así como de biocompatibilidad in Vivo [32, 33]. Además se han hecho estudios sobre problemas que pueden plantearse a la hora de utilizarlo en seres humanos, como por ejemplo, la esterilización en autoclave [34] y otras técnicas de esterilizado [35], o sobre técnicas de fabricación con el objeto de que no sea perjudicial para la salud [36]. Dentro de los potenciales avances tecnológicos en la medicina, una de las vertientes más prometedoras es la nanomedicina. Su definición podría ser como rama de la nanotecnología con el uso de nanomateriales que permitiría la posibilidad de curar enfermedades desde dentro del cuerpo a nivel celular o molecular. Una simple comparación de tamaños entre nanopartículas creadas por el hombre y presentes en la naturaleza (tablas 1 y 2) da una idea de la importancia del uso de nanopartículas para poder estudiar y trabajar sobre la maquinaria celular. Por ejemplo, las nanopartículas creadas para la administración de fármacos pueden tener tamaños comparables a los de los virus ( 99.5

0.325

KCl

> 99.5

0.225

K2HPO4 3H2O

> 99.0

0.230

MgCl2 6H2O

> 98.0

0.311

1.0M HCl

--------

40 mL

CaCl2

> 95.0

0.293

Na2SO4

> 99.0

0.072

TRIS

> 99.9

6.063

1.0M HCl

--------

Aprox. 0.8mL

Tabla 2. Componentes a adicionar en la preparación de 1L de FCS.

La figura 5 presenta el montaje experimental utilizado durante la preparación. El baño térmico debe tener una temperatura de 36.5 ºC.

Figura 5. Montaje experimental utilizado en la preparación de FCS.

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Es práctico detallar el procedimiento experimental y como se ha hecho el fluido biológico simulado. Cualquier variación de la técnica de preparación de los fluidos simulados puede alterar el resultado final, por ejemplo pequeños cambios del pH pueden provocar la precipitación teniendo que desechar la disolución. Para evitar esto hemos seguido siempre el procedimiento propuesto en [1] durante la preparación. Aunque el contenido final sea el mismo, el método impide la precipitación durante la preparación, facilitando la realización del trabajo con éxito. El orden de adición de los reactivos ha sido el indicado en la Tabla 2. A partir de las sales: NaCl, NaHCO3, KCl, K2HPO4·3H2O, MgCl2·6H2O, CaCl2 y Na2SO4, se prepara una disolución que contiene concentraciones de iones similares a los del +

-

-

+

plasma de la sangre (Na 142 mM, Cl 148.8 mM, HCO3 0.4452 mM, K 5 mM, 2-

2+

2-

2+

HPO4 1 mM, Mg 1.5 mM, Ca 2.5 mM y SO4 0.5 mM). Hemos mantenido un pH ácido y a la hora de ajustar el pH a 7.4, hemos añadido la cantidad de desolución tampón tris indicada, 6.063 g. Tras esta adición es necesario ajustar el pH final. La disolución debe calentarse hasta 36.5 ºC, si no el pH real de la disolución a esa temperatura, nunca resultará ser menor. Al calentar desde temperatura ambiente a 36.5 ºC va disminuyendo el pH. Una vez alcanzada la temperatura deseada se debe ir añadiendo con agitación HCl 1M. La cantidad de HCl 1M a añadir para llegar a un pH 7.4 depende de la cantidad de cada sal y de la concentración real de HCl, ya que esta puede variar ligeramente, y no ser 1,000 M. Por eso en la tabla se indica que hay que añadir aproximadamente 0.8 mL de HCl al final. Una vez preparado el fluido se ha guardado en el frigorífico a 4 ºC en un recipiente esterilizado y hermético hasta su consumo. Es muy importante seguir las siguientes precauciones durante la preparación de estos fluidos: - preparar siempre con agua de alta calidad ultra pura (miliQ). - disolver algunas de las sales por separado antes de mezclarlas para evitar altas concentraciones locales de alguno de sus componentes. En caso contrario pueden hacerse interacciones con otro de los componentes y formarse un precipitado insoluble. - esterilizar térmicamente todo el material a utilizar para evitar el crecimiento de microorganismos durante el tiempo en el que se realizan los estudios. - no volver a meter muestras en la solución cuando estas se sacan del fluido y se secan.

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- no almacenar el fluido simulado nunca durante más de un mes Debemos tener en cuenta que todos los modelos que intentan simular las condiciones que se dan naturalmente en el crecimiento del hueso utilizan disoluciones supersaturadas, por este motivo se deben utilizar recipientes de plástico con superficies lisas y si aparecen grietas en las paredes se puede producir la nucleación de hidroxiapatito dado el grado de saturación, por tanto, en caso de que precipitara en el recipiente habría que reemplazarlo por uno nuevo. Durante los tratamientos con FCS se puede utilizar régimen estático o continuo. En las investigaciones sobre nuevos materiales bioactivos se suele recurrir al régimen estático, ya que resulta más sencillo, por eso en esta tesis hemos trabajado de ese modo. En régimen estático durante los tratamientos de inmersión de las muestras en FCS el volumen de la disolución que se debe utilizar para hacer las medidas de bioactividad [212] en el caso de utilizar materiales densos es el obtenido mediante la ecuación: Vs ¼ Sa=10 Donde: Vs es el volumen de FCS (ml) Sa es el área superficial aparente de la muestra (mm2) En el caso de utilizar materiales porosos el volumen utilizado debe ser mayor que el calculado con esta ecuación (Vs). El fluido ha sido reemplazado a los 15 días por fresco para asegurarnos que se mantenía la concentración de iones y el pH durante el tiempo de exposición al mismo. Es importante remarcar que se ha utilizado en todos los casos 10 mL para un área de muestra tratada de 1 cm2, teniendo en cuenta, además, que la superficie específica del silicio poroso en nuestras muestras puede haber variado entre 200 m2/g (para las muestras tipo p más dopadas) y 600 m2/g (para las muestras con . . resistividad 10-20 Ohm cm y para las tipo n+ de resitividad 0.01-0.02 Ohm cm) Estos datos son importantes para tener una idea de la bioactividad del material, ya que para poder comparar con otros materiales hay que considerar la relación entre el área de la muestra expuesta y el volumen de fluido utilizado.

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Por tanto, las muestras de silicio poroso de 1cm2 de diámetro una vez limpias y secas, tras realizar el tratamiento correspondiente en cada caso, se han colocado en portamuestras de teflón y a continuación se han introducido en vasos transparentes herméticamente cerrados de Nalgene, en 10 mL de FCS, con una temperatura de 36.5 ºC y con un pH de 7.40. Es importante poner el volumen de FCS necesario en el recipiente de plástico y calentar hasta 36.5+/-0.1 ºC. Después de esto hay que introducir la muestra y meter todo en el incubador. En los tratamientos de inmersión de las muestras en fluido biológico simulado la temperatura se ha mantenido constante, a 36.5 ºC, similar a la del cuerpo humano, utilizando un incubador Selecta. Este funciona por convección natural a temperaturas ajustables desde 5 a 80 ºC. El equipo tiene una estabilidad de 0.2 ºC, una resolución de 0.1 ºC, así mismo, dispone de una puerta de vidrio oscuro y capacidad de 38 litros. Los periodos de exposición de las muestras a fluido corporal simulado han ido desde 1 a 40 días con el fin de estudiar las variaciones en la morfología y estructura de la superficie y la evolución en la composición química de las mismas. Las muestras bioactivas deben inducir la precipitación de hidroxiapatito en un máximo de 4 semanas. 2.6. Métodos de visualización de nanoestructuras 2.6.1. Microscopía óptica Hemos utilizado microscopía óptica para tener una idea preliminar de la evolución de las muestras. Es una técnica útil y económica, a la que se tiene acceso en la mayoría de laboratorios. Le hemos acoplado a una cámara y con un programa que permite captar las imágenes y añadir las escalas. La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible El microscopio óptico del que disponemos es de lentes que nos proporcionan hasta x100 aumentos. 2.6.2. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) El microscopio electrónico utiliza electrones para obtener una imagen de un objeto. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. La longitud de onda más corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 Å. La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0,5 Å.

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Los análisis por SEM se han realizado en un microscopio Jeol6400 operando a 10 kV ó cuando se requería menor magnificación a 20 kV. En este equipo la a resolución máxima es de 5 nm. Además se ha utilizado un SEM Hitachi4500 con una resolución de hasta 1 nm y un SEM acoplado a un equipo Raith150 con la misma resolución. Para una mayor caracterización de las muestras se ha utilizado microscopía SEM con la técnica de análisis cuantitativo de la composición por microanálisis de RX. Su uso es interesante para conocer las relaciones Ca/P y así dentificar que fases de los fosfatos tenemos. Las muestras a analizar se colocan sobre un soporte metálico. Las muestras menos dopadas y las oxidadas se tienen que recubrir de una fina capa de oro antes de introducirlas en el microscopio SEM. Mientras que las más dopadas se vieron sin esa película. El recubrimiento de oro puede enmascarar algunas propiedades de la superficie ya que es de 8 a 10 nm. Pero en el caso de muestras poco conductoras es necesario porque si no se produce la acumulación de carga en la muestra y no es posible obtener imágenes claras. Además el SEM que hemos utilizado esta equipado con un detector EDS para hacer microanálisis químico semicuantitativo mediante espectrometría de rayos X de dispersión de energía (longitudes de onda). Los electrones incidentes excitan los átomos de la muestra y provocan la emisión de rayos X cuya longitud de onda (λ) es característica de los elementos presentes en la muestra y cuya intensidad para una determinada longitud de onda es proporcional a la concentración relativa del elemento a esa λ. Normalmente con este equipo se obtiene un análisis cualitativo de los constituyentes mayoritarios y minoritarios de pequeñas áreas (1µm). Sin embargo, en muestras planas y bien pulidas es posible hacer análisis cuantitativos al comparar la intensidad de los rayos X a cualquier λ con la producida en una muestra estándar (patrón) de composición conocida. La precisión de un análisis cuantitativo normalmente es mayor del ± 2% y los límites de detección están alrededor de las 100 ppm en análisis rutinarios, llegando a ser de 10 ppm en circunstancias excepcionales. Para poder analizar los resultados de dispersión de rayos X acoplada a microscopía SEM es interesante conocer las relaciones Ca/P en diferentes fases de los fosfatos por eso hemos recogido los datos de esta relación para las distintas fases de fosfatos en la tabla 3:

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Compuesto

Fórmula

Relación Ca/P

Fosfato dicálcico

CaHPO4

1

Fosfato dicálcico dihidratado

CaHPO4 2H2O

1

Fosfato octacálcico

Ca8H2(PO4)65H2O

1’33

Fosfato tricálcico

β-(Ca3(PO4)2)3

1’50

Hidroxiapatito

Ca5(PO4)3 (OH)

1’67

Apatitas con defectos

Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x (0x>2) donde esta relación es de (10-x)/6 y el fosfato tetracálcico monóxido, Ca4(PO4)2O, donde está relación es

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2. También puede ocurrir que el fósforo y calcio estén formando parte de otros compuestos, ya que en el FCS están presentes gran cantidad de iones, además cabe la posibilidad de formación de algún compuesto con el silicio. Es importante destacar que al aplicar polarización catódica de -5 mA a muestras p++ de OxPSi (10 V) se obtienen también precipitados amorfos sobre la oblea de silicio (figura 53A). Estos contienen principalmente calcio y fosfato, pero además se aprecian claramente los picos del sodio y magnesio, incluso algo de potasio, además estos picos tienen una altura mayor que la del calcio. Esto probablemente indica que la corriente es demasiado grande y se está cambiando el pH muy bruscamente alrededor del electrodo de OxPSi lo que provoca la precipitación de diversas sales. Lo más interesante de este caso (muestras más dopadas que en el caso anterior, con resistividades de 0.0015-0.01 Ohm•cm) es que tras la inmersión en FCS el precipitado formado sobre la oblea en este caso se disuelve con el tiempo y sólo permanecen sobre la oblea restos puntuales de Ca y P.

A

B

Figura 53. A). Imagen de la superficie de OxPSi (preparado con p++) sobre la que se ha aplicado polarización catódica cuando estaba inmersa en FCS. B) Análisis EDS de la superficie mostrada en la imagen A.

Esto indica que dentro de una la variedad de morfologías de silicio poroso que es posible obtener sólo un determinado rango muestra bioactividad. L. Canham estudio en profundidad este campo explicando que hay un rango de muestras mesoporosas con porosidades inferiores a 34% y diámetros de poro de alrededor de 10nm, que es óptimo en el que se produce bioactividad y nosotros hemos

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comprobado que la existencia de un rango óptimo también se da en muestras oxidadas. 3.5.2. Polarización con corriente alterna Hemos visto que si aplicamos corriente alterna sobre el silicio poroso cuando está inmerso en FCS preparado por el método convencional también se deposita hidroxiapatito. La forma del precipitado es de esferas o de agujas según el régimen de corriente aplicado (figura 54).

A

B

Figura 54. Muestras de silicio poroso (porosidad ≈25%, espesor 7 µm) inmersas en 10 ml de FCS A. Tratada en FCS 10 horas con -0.5V de CC + 25 mV de CA con una frecuencia de 100Hz. B. Tratada en FCS 1 hora con 5 mV de CA con una frecuencia de 100 Hz.

Respecto a la polarización podemos concluir que en FCS hemos comprobado que con diversos tratamientos, tanto con corriente continua como con alterna, se puede inducir la deposición de una capa de hidroxiapatito. Si el tratamiento no es el adecuado lo que se produce es la oxidación de la muestra por el aumento de pH provocado tras la evolución de hidrógeno. En algunas ocasiones la relación Ca/P para estas imágenes no llega a alcanzar el valor de 1.67 del hidroxiapatito, podríamos considerar dados los valores que son de alrededor de 1.2 que se trata de hidroxiapatito con defectos. Además se detectan también en ocasiones en menor cantidad los elementos Mg y Na. Los equilibrios que tiene lugar durante la aplicación de carga son muy complejos y dada la variedad de situaciones que se pueden dar, no sólo en cuánto a la corriente

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aplicada también en cuánto a superficie y tratamiento de derivatización de la misma, en este campo aún queda mucho por investigar.

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CAPÍTULO 4 Conclusiones y perspectivas futuras ____________________________________

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Para terminar esta tesis se presenta un resumen de las ideas a tener en cuenta en el campo investigado describiendo las principales contribuciones aportadas por nuestro trabajo, las perspectivas futuras y diversas posibilidades de realización de nuevos estudios en el mismo. En esta memoria además de preparar electroquímicamente muestras de silicio poroso variando las condiciones experimentales (nivel de dopaje, densidad de corriente,…) y caracterizarlas (medir diámetros de poros, espesor y porosidad), hemos estudiado su interacción con fluido biológico simulado. Esta investigación es de gran interés para el desarrollo de nuevos materiales implantables y de nuevas aplicaciones biomédicas en las que se utilice como base este material. Nuestro estudio corrobora que el silicio mesoporoso posee biodegradabilidad, ya que cuando se sumerge en fluido corporal simulado se disuelve. Es sabido [236] que el proceso de disolución en FCS tiene lugar vía hidrólisis, formándose primero óxido de silicio que reacciona con H2O dando ácido ortosilícico (Si(OH)4) que puede ser excretado por los riñones. Además hemos profundizado en los campo de la bioactividad del silicio poroso, confirmando, de acuerdo con resultados ya existentes, que es posible depositar en su superficie hidroxiapatito a partir de los iones presentes en líquido corporal simulado (FCS) convencional, y que, por tanto, estamos ante un material bioactivo. Como había sido descrito por L. Canham, hemos visto que las muestras más porosas (porosidad mayor del 34%) se degradan muy rápidamente (son biodegradables) y en muestras con porosidad de 30% o inferior y diámetros de poro de 7 a 15 nm que han sido inmersas en FCS tras su preparación hemos detectado además de disolución, depósitos puntuales de hidroxiapatito. Nuestros estudios muestran que el proceso de degradación (mediante oxidación en medio acuoso con sales) del silicio poroso depende de su nanoestructura y del nivel de dopaje de las muestras. Cabe destacar que en ningún caso en muestras de silicio frescas (recién preparadas) observamos la formación de una capa uniforme recubriendo la superficie de silicio poroso expuesta al FCS. Como novedad y con el objetivo de aumentar la bioactividad de las muestras, hemos estudiado como diversos tratamientos de derivatización, ya conocidos para otras aplicaciones, influyen sobre la biodegradabilidad y la bioactividad del silicio poroso.

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Hemos contribuido al estudio del proceso de oxidación electroquímica de silicio poroso en ácido fosfórico concentrado aplicando bajas densidades de corriente. Hemos visto la influencia del nivel de dopaje, de la oxidación ambiental de las muestras, de la porosidad y del espesor de la capa de silicio poroso en las curvas de oxidación, U (V) vs. t (s), y combinándo estos datos con resultados de imágenes obtenidas mediante SEM y AFM, además de con análisis de FTIR y DRX de muestras oxidadas, hemos explicado como se produce el proceso de oxidación electroquímica de silicio poroso. Hay que tener en cuenta que la oxidación electroquímica además de cambiar la composición del silicio poroso modifica la morfología de las muestras y disminuye su cristalinidad [237]. Todos estos factores afectan al comportamiento de las muestras en el fluido biológico. Hemos comprobado que la oxidación electroquímica de muestras recién preparadas de silicio poroso aumenta la bioactividad del material y hace que el proceso de biodegradación sea más lento, pero se sigue produciendo disolución de la capa porosa. Esta característica es de gran interés para la utilización del silicio poroso en nuevos biomateriales empleados en ingeniería de tejidos, en particular para la utilización del silicio poroso en materiales destinados a la reparación ósea, ya que con este tratamiento que es fácilmente reproducible y controlable obtenemos un material que se aproxima al que se define como ideal para este tipo de aplicaciones. Por el contrario, el tratamiento de oxidación térmica, aunque también cambia diversas propiedades (el proceso es distinto y las propiedades de las muestras obtenidas también) de las muestras y aumenta la estabilidad del silicio poroso en FCS, no incrementa la bioactividad. Este hecho se puede atribuir a la formación por oxidación electroquímica de grupos silanol y de estructuras más favorables para inducir la precipitación de hidroxiapatito. También hemos realizado carbonación química (enlaces Si-C) del silicio poroso, verificando que este tratamiento modifica su comportamiento en fluido biológico simulado. Las muestras derivatizadas por tratamiento térmico (500 ºC) con acetileno son mucho más estables que las que están sin tratar. Incluso muestras con alta porosidad (mayor de un 50%) sumergidas en FCS más de un mes se comportan como prácticamente bionertes. Hemos visto a través del análisis SEM de la sección trnasversal que prácticamente el espesor de capas tratadas (THCPSi) prácticamente no varía y que sólo se produce oxidación superficial. Esto úlimo se ha detectado con ayuda del espectro FTIR de las muestras donde se aprecía el pico correspondiente al modo de vibración del Si-O-Si a alrededor de 1100 cm-1.

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Por primera vez, hemos comprobado que la oxidación electroquímica de muestras derivatizadas con acetileno (Si-C) permite aumentar su bioactividad [40]. Hasta el momento era conocido que diversos tratamientos de derivatización orgánica (Si-C formados con ácido undecilénico,…) aumentaban la estabilidad del silicio poroso en FCS, pero nunca antes se había estudiado que estas muestras podían ser bioactivas. Nuestras investigaciones han demostrado que la oxidación electroquímica en ácido fosfórico concentrado también mejora la bioactividad del silicio poroso que previamente había sido estabilizado por derivatización térmica en atmosféra de acetileno, asegurando su biocompatibilidad. Los resultados nos han permitido llegar a obtener capas de hasta 5 µm de hidroxiapatito sobre la superficie de las muestras previamente oxidadas (OxTHCPSi) tras un mes de inmersión en FCS. Por tanto, la interacción con el FCS no sólo se produce en el material nanoestructurado fresco. En todas las muestras preparadas (silicio poroso recién anodizado; oxidado térmicamente; oxidado electroquímicamente e hidrocarbonizado oxidado y sin oxidar) se producen cambios de la composición superficial tras la inmersión durante un mes en este medio.Las más inertes son las muestras derivatizadas (TCPSi). Por otro lado, además de modificar las propiedades superficiales hemos querido aprovechar el carácter semiconductor del silicio poroso aplicándole corriente continua y alterna cuando está inmerso en el medio utilizado para los estudios de bioactividad in Vitro, FCS. Nuestro interés al hacerlo ha sido acelerar el proceso de deposición de hidroxiapatito. Los resultados obtenidos indican que tras aplicar este tratamiento en muestras de silicio poroso oxidadas electroquímicamente (OxPSi) con una resistividad de 0.010.02 Ohm*cm se obtiene un precipitado amorfo, que contiene fósforo y calcio en una relación cercana a 2, por lo que probablemente se trate de apatita con defectos. Si lo sumergimos un mes en condiciones similares a las fisiológicas se convierte en hidroxiapatito cristalino. De esta forma obtenemos rápidamente mayor cantidad de precipitado que por el método de simple inmersión. La cantidad de precipitado depende del tiempo de tratamiento. Ya se había comprobado que la polarización anódica era un método útil para este propósito aunque son escasos los estudios en relación a este proceso. Además hemos aplicado corriente alterna en las muestras comprobando que también induce la formación de una capa de hidroxiapatito, proceso nunca había sido estudiado con detalle.

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Aunque aún no están claras las condiciones más favorables para este proceso y que parámetros determinan la morfología del precipitado obtenido, hemos visto que si el tratamiento no es el adecuado lo que se produce es la oxidación de la muestra por el aumento de pH provocado tras la evolución de hidrógeno y no se obtiene hidroxiapatito. Nuestro estudio sugiere que el silicio poroso es un excelente candidato potencial para su utilización como material para andamiaje o en implantes óseos. Hemos realizado una revisión completa del estado actual de investigación en este campo y hemos visto que las propiedades del silicio poroso se aproximan a las de los materiales que se definen como ideales para esta función, materiales reabsorbibles y bioactivos que se van degradando mientras se produce el crecimiento del hueso. Cabe destacar que es necesaria más investigación para buscar las condiciones óptimas de crecimiento de hidroxiapatito en silicio poroso, así como las propiedades óptimas en cada aplicación biomédica. Estamos por tanto al inicio de nuestro camino pero las perspectivas son prometedoras, sin embargo, aún queda mucho por hacer. Dejamos muchas puertas abiertas. Uno de los temas que consideramos de mayor interés es profundizar en el estudio de los procesos que se producen cuando las muestras se sumergen en FCS, además se podría estudiar el efecto de la utilización y preparación de fluidos corporales simulados con mayor concentración que el convencional, ya que está comprobado con otros materiales (poliméricos, titanio,…) que el resultado es acelerar la cinética de deposición de hidroxiapatito. También es importante analizar la influencia de distintos parámetros (pH, temperatura,…). Otra cosa que opinamos resultaría muy interesante para comprender mejor el proceso es probar distintos tipos de silicio (n, n++,…) y electrolitos (HF:CH3CH2OH:H3PO4, HF+ DMF, etc.). Pensamos que otro campo novedoso e interesante puede ser combinar las propiedades del material con la de polímeros biodegradables, como policaprolactona, para crear materiales biodegradables con mejores propiedades mecánicas. Hemos comentado alguna de las posibilidades de investigaciones futuras, como se ha explicado es un campo muy amplio y de gran interés científico y tecnológico. Algunas de estas investigaciones ya se están llevando a cabo por Grupos de investigación de gran prestigio a nivel mundial. Además teniendo en cuenta que se quiere desarrollar un nuevo material implantable que tenga como base silicio poroso, las perspectivas de trabajo

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incluyen que una vez conseguida una capa de hidroxiapatito uniforme este material se pruebe en seres vivos. Debemos aclarar que aunque existen diversos biomateriales que ya están siendo utilizados para este tipo de aplicaciones, en cualquier caso, el desarrollo de nuevos materiales con propiedades óptimas siempre es favorable ya que puede ayudar a disminuir los efectos secundarios y mejorar los tratamientos, así como abaratar los costes de sanidad. No hay que olvidar que no se trata de utilizar un único material para todas las aplicaciones, lo que se pretende es usar el más adecuado en cada caso. Cualquier investigación que permita la creación de nuevos materiales con propiedades mejoradas es útil para el desarrollo de productos implantables. Las áreas de la ciencia y la tecnología donde los semiconductores porosos se aplican se han duplicado, al igual que la participación de empresas industriales interesadas en estos materiales. Sólo en los últimos cinco años han surgido nuevos usos del silicio poroso en biomedicina (en liberación controlable de fármacos, dispositivos microfluídicos, regeneración de tejidos vivos, etc.); explosivos (para utilizar en airbags o micro-reactores de propulsión), energías limpias y renovables (células de combustión, almacenamiento de hidrógeno); como foto-catalizador (los semiconductores porosos generan oxígeno singlete, mucho más activo que el oxígeno normal), entre otras. El material destinado a aplicaciones biomédicas a base de silicio poroso ya no es un artificio científico, la empresa PSi Médica, dirigido por un investigador británico L.Canham, comercializa ya diversos fármacos que contienen el mismo. Esto demuestra que el cuerpo humano no está produciendo rechazos. Los resultados para investigar su utilidad en la regeneración de huesos, en implantes biocompatibles o en biosensores también están siendo muy positivos. El semiconductor, previamente convertido en polvo, se puede aplicar también en forma de cápsulas o inyecciones en los órganos dañados del organismo humano, para la liberación controlada de determinados fármacos. En este campo se está trabajando en varias Universidades y Empresas en todo el mundo (PSi-médica, con el Profesor L. Canham; Universidad de California, Grupo del Profesor Michael Sailor; Universidad de Turku y Helsinki, con el Profesor Jarno Salonen, etc.). Los últimos proyectos y prototipos sobre este material se darán a conocer en el VI Congreso Internacional Porous Semiconductors Science and Technology 2008 que se celebrará en Mallorca del 10 al 14 de Marzo y que está siendo organizado por miembros de esta Universidad.

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Por último, destacar que es necesaria la creación de grupos multidisciplinares (ingenieros electrónicos, médicos, biólogos, físicos, químicos,….) para avanzar en este tipo de investigaciones que pueden suponer una auténtica revolución en la ciencia médica.

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Bibliografía ________________________________________________

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