TESIS DOCTORAL

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE EDUCACIÓN FÍSICA DEPARTAMENTO DE EDUCACIÓN FÍSICA

“EJERCICIO FÍSICO Y RECEPTOR MUSCULAR DE LEPTINA EN HUMANOS SANOS Y OBESOS” “EXERCISE AND MUSCLE LEPTIN RECEPTOR IN HEALTH AND OBESE HUMANS"

Tesis doctoral presentada por: Teresa Fuentes Nieto Tesis doctoral dirigida por:

Los directores

José Antonio López Calbet Carlos Borja Guerra Hernández Alfredo Santana Rodríguez

El doctorando

Las Palmas de Gran Canaria, 2010

Financiación La realización de este trabajo de investigación ha sido posible gracias al disfrute de una beca del “Programa Nacional de Formación de Profesorado Universitario”, concedida por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España. El presente trabajo ha sido financiado por los siguientes proyectos de investigación:

1. “Mecanismos genéticos y moleculares de la resistencia a la leptina en músculo esquelético humano normal y de pacientes obesos con intolerancia a la glucosa” (PI/10/07). Investigador principal: Alfredo Santana Rodríguez. Entidad financiadora: FUNCIS (Fundación Canaria de Investigación y Salud).

2. “Influencia del ejercicio físico regular en la expresión proteica y nivel de fosforilación (activación) de la isoforma larga del receptor de leptina (OB-Rb) en músculo esquelético humano”. Investigador principal: Carlos Borja Guerra Hernández. Entidad financiadora: Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (Proyectos de Investigación en el marco de Programa Propio para el año 2006).

3. “Influencia del ejercicio físico en los mecanismos de señalización de leptina en el músculo esquelético humano” (BFU2006-13784). Investigador

principal:

José

Antonio

López

financiadora: Ministerio de Ciencia e Innovación.

Calbet.

Entidad

Agradecimientos: Son muchas las personas y muchos los agradecimientos. Empezaré por mi familia. Mª del Carmen Nieto (mamá), Fº Javier Fuentes (papá) y mis hermanos: Laura, Beatriz, Lucía y Jaime. Muchas gracias por educarme, confiar siempre en mí, dejarme volar, seguir mis peripecias y amortiguar las caídas del camino. Quisiera en segundo lugar expresar un especial agradecimiento a mis directores de tesis: Sin duda, la “culpa” de esta tesis y del doctorado la tiene José Antonio López Calbet. Gracias por abrirme las puertas de tu laboratorio, poniendo a mi disposición todos los medios que estaban en tu mano. Gracias de todo corazón a Borja Guerra, que ha sabido conjugar como nadie el papel de jefe, tutor, maestro y amigo; sin perder nunca el buen humor. Ha sido un placer y un orgullo trabajar contigo. A Alfredo Santana por su generosidad a la hora de compartir sus infinitos conocimientos, así como los medios a su disposición. Y sobre todo, gracias por estar ahí siempre que te necesito. Mil y una gracias a mis compañeros de laboratorio, por estos años compartiendo pipetas, poyata, risas y cafés: José y sus “postics”, sus “Inspecciones sorpresa” y sus “elige un número… te ha tocado”. Gracias por preocuparte de nosotros como un padre. Safira, fue un placer compartir los primeros años de esta andadura contigo, no sólo como compañera de trabajo sino como amiga. Hugo, gracias por resolver mis interminables dudas y mis constantes “problemillas informáticos” con esa eterna disponibilidad. Amelia, mi compi de congresos, muchas gracias por compartir trabajo, viajes, charlas y hasta paellas familiares conmigo.

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Jesús, mi andaluz preferido del laboratorio, ya sabes que aunque hubiera más lo seguirías siendo. Muchas gracias por ese buen humor, esa sonrisa perenne, los cafés terapéuticos, las bromas fáciles (ya sabes que seguiré cayendo en las mismas) y el buen trabajo en equipo (nadie mejor con quien ordenar sueros). José Guillén, gracias por ese buen ambiente que aportaste durante tu año en el laboratorio. David, gracias por tus “frikadas mañaneras” y tu “café al 10X” (siempre listo para tomar). Lorena, “piba!”, muchas gracias por estar siempre “de buen rollito” y transmitirlo. Rafa, gracias por ofrecerme otro punto de vista de la vida y la ciencia, por regalarme miles de conversaciones de todo tipo y por tu amistad incondicional. Maca, gracias por aportar ese buen hacer diario. Marta y Andrea, gracias por dar ese aire renovado y jovial al laboratorio durante vuestros meses de estancia. A Mila, Vicky, Isabel, Macu, “Julius”, Anselmo, Rosa Delia… y demás personal de la universidad por sus sonrisas diarias a la entrada y salida de la facultad. Muchas gracias a mis compañeros en mis estancias fuera de Las Palmas: A todo el grupo del Dr. José Viña, en Valencia. Por esos tres meses de antioxidantes, ratones, paellas y fallas. A Carmen Gómez, por su profesionalidad, calidez y amistad, que hizo que me sintiera como en casa. No me olvidaré tampoco de mi estancia en la preciosa Copenhague. De la sonrisa Jorn y Jacqueline a la entrada del PANUM, las canciones en Español en el X-lab, las cenas en casa de Rob, los ratos con Clara y Pau y los momentos con mi gente de la Guess House: Alba, Daniela y Barbara. Thank you very much to Rob Boushel. Gracias también a mis amigos ajenos al mundo de la investigación: Muchas gracias a Cristina y a Mónica, mis segovianas, siempre dispuestas a platicar durante horas y horas sobre todo lo que me preocupa, incluso desde la distancia.

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A Jacqueline, a Esther (con coscó incluido), Cesitar, Jorge Running, Rafa Leo, Manolo, Pablo, Victor (y sus victormeleridades) que han sido mi familia durante estos años en Las Palmas. Muchas gracias a mis voleyplayeros de Las Canteras con los que me desahogaba a base de remates: Andrew, Sleeping, Pablo, Jorge, Manolo, Paola… Y a mis padeleros con los que he mantenido la “vidilla” de la competición: Carmen Julia, Felipe, Iván, Marisol, Rubén, María y Aurora… Por último, y no por ello menos importante, querría agradecer a todas las personas que se han prestado a participar en nuestros estudios, así como a La Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, en especial al equipo del Vicerrectorado de Investigación. Sin ellos no podríamos investigar.

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ÍNDICE

Pág.

RESUMEN

15

ABSTRACT

21

ABREVIATURAS

27

INTRODUCCIÓN

31

1. OBESIDAD

33

2. LEPTINA

34

3. RECEPTORES DE LEPTINA

37

4. PRINCIPALES VÍAS DE SEÑALIZACIÓN ACTIVADAS POR LEPTINA

40

Cascada de señalización JAK/STAT

41

Cascada de señalización MAPK (Miogen-Activated Protein Kinase)

44

Vía de señalización de IRS (Insulin Receptor Sustrate) / PI3K (Phospo-Inositide 3-Kinase)

46

AMPK (5’-AMP-Activated Protein Kinase)

49

5. RESISTENCIA A LA LEPTINA

54

6. PRESENTACIÓN DE LOS ARTÍCULOS QUE COMPONEN LA TESIS

57

6.1. Artículo 1 (Guerra et al. 2007)

58

6.2 . Artículo 2 (Guerra et al. 2008)

58

6.3. Artículo 3 (Fuentes et al. 2010)

59

6.4. Artículo 4 (Fuentes et al. 2010b)

59

11

OBJETIVOS

61

RESUMEN DE LA METODOLOGÍA APLICADA

65

1. SUJETOS

67

2. COMPOSICIÓN CORPORAL

67

3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE SANGRE

69

4. BIOPSIAS MUSCULARES

69

5. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS A PARTIR DE BIOPSIAS MUSCULARES

70

6. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS DE HIPOTÁLAMO HUMANO

70

7. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS Y TINCIÓN DE GELES

70

8. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR WESTERN BLOT

71

9. ENSAYOS DE COMPETICIÓN PARA OB-R

73

10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

74

RESUMEN DE LOS RESULTADOS

75

1. RESUMEN DE RESULTADOS DEL ARTÍCULO 1 (Guerra et al. 2007)

77

2. RESUMEN DE RESULTADOS DEL ARTÍCULO 2 (Guerra et al. 2008)

78

3. RESUMEN DE RESULTADOS DEL ARTÍCULO 3 (Fuentes et al. 2010)

79

4. RESUMEN DE RESULTADOS DEL ARTÍCULO 4 (Fuentes et al. 2010b)

12

81

DISCUSIÓN

85

ESTUDIO 1: Receptores de leptina en músculo esquelético humano.

87

ESTUDIO 2: Dimorfismo sexual en los receptores musculares de leptina en humanos, leptina circulante y sensivilidad a la insulina.

89

ESTUDIO 3: Reducción de la expresión de la expresión proteica del receptor muscular de leptina de 170 KDa en sujetos obesos: un potencial mecanismo de resistencia a la leptina.

94

ESTUDIO 4: Señalización muscular en respuesta al ejercicio de esprint en hombres y mujeres.

99

CONCLUSIONES

105

CONCLUSIONS

109

BIBLIOGRAFÍA

113

ANEXO: ARTÍCULOS QUE COMPONEN LA TESIS

135

13

RESUMEN

Resumen

La leptina es una adipocitoquina sintetizada y secretada por el tejido adiposo en proporción directa a la cantidad de masa grasa. La leptina ejerce acciones tanto a nivel del sistema nervioso central (hipotálamo), donde suprime el apetito y aumenta el gasto energético, como a nivel periférico (músculo esquelético), donde estimula la oxidación de grasas. Esta hormona ejerce sus acciones normales tras la interacción con su receptor (OB-R), el cual se encuentra presente en numerosos tejidos, incluido el músculo esquelético. La obesidad humana generalmente, se encuentra asociada a una concentración sérica permanentemente elevada de leptina, lo que conduce a la aparición de resistencia a la leptina. En esta tesis doctoral, se ha investigado la expresión de las diferentes isoformas del receptor de leptina en músculo esquelético humano, el potencial dimorfismo sexual en la expresión del mismo, los mecanismos moleculares mediadores de la resistencia muscular a la leptina asociada a la obesidad y la influencia del ejercicio físico en las vías de señalización activados por la hormona en hombres y mujeres sanos. En el primer estudio de la tesis participaron 14 hombres sanos. La expresión proteica de los receptores de leptina fue determinada en músculo esquelético, tejido adiposo subcutáneo e hipotálamo, utilizando un anticuerpo contra el receptor de leptina humano. Tres bandas con un peso molecular aproximado de 170, 128 y 98 KDa fueron identificadas por Western blot con el anticuerpo dirigido contra OB-R. Las tres bandas fueron identificadas en músculo esquelético, las bandas de 98 y 170 KDa fueron detectadas en hipotálamo y las bandas de 98 y 128 KDa fueron detectadas en el tejido adiposo subcutáneo del muslo. La banda de 128 KDa no fue detectada en cuatro de los sujetos, mientras que en el resto de sujetos su aparición se explica por la presencia de tejido adiposo intermuscular, como demostró el uso de un anticuerpo dirigido contra la perilipina A. No se encontró correlación entre la concentración basal de leptina en sangre y la densidad de la banda de 170 KDa. Concluimos que una isoforma larga del receptor de leptina con un peso molecular cercano a 170 KDa se expresa a nivel proteico en músculo 17

Resumen

esquelético humano. La cantidad de proteína de 170 KDa parece ser independiente de la concentración basal de leptina en sangre. En el segundo trabajo de la tesis se midió la expresión proteica de OB-R, perilipina A, SOCS3 y alfa-tubulina, por Western blot, en las biopsias musculares del vasto lateral del cuádriceps de 34 hombres y 33 mujeres sanos. La concentración basal de insulina en sangre y el HOMA fueron similares en ambos sexos. La concentración basal de leptina en sangre fue 3.4 veces mayor en mujeres que en hombres (P< 0.05), incluso después de tener en cuenta el porcentaje de grasa corporal o de receptor soluble de leptina. La expresión proteica del receptor de leptina fue un 41% (OB-R170, P