TOLERVIT-MS: INDUCCIÓ DE TOLERÀNCIA EN ESCLEROSI MÚLTIPLE AMB CÈL·LULES DENDRÍTIQUES TRACTADES AMB VITAMINA D3 I CARREGADES AMB PÈPTIDS DE LA MIELINA Investigadora principal: Dra. Eva M. Martínez-Cáceres LIRAD-Banc de Sang i Teixits de l’HUGTiP Durada: 3 anys

1

1. Resum L’esclerosi múltiple (EM) és una malaltia crònica inflamatòria i desmielinitzant del sistema nerviós central (SNC), que es produeix per l’atac del sistema immunitari a la mielina que recobreix els nervis, amb la qual cosa indueix desmielinització i dany neuronal. Les lesions inflamatòries i desmielinitzants s’acumulen a l’SNC i acaben provocant una discapacitat lenta i progressiva en la majoria dels casos. El 70% dels pacients amb EM pateixen dolor crònic, que varia de moderat a intens. En adults joves l’EM és la causa mes freqüent de discapacitat d’origen no traumàtic. No existeix un tractament curatiu per l’EM. Disposem de tractaments que modifiquen l’evolució natural de l’EM remitent recurrent (EMRR), que són immunomoduladors no antígens específics o immunosupressors. L’objectiu d’aquestes teràpies és disminuir la freqüència dels brots, però no és clar que aconsegueixin reduir la progressió a llarg termini de la malaltia. Aquests tractaments tenen efectes adversos, un cost elevat i no són tan efectius com seria desitjable en un percentatge alt de pacients. Només un tractament etiològic capaç d’interferir en el desenvolupament de la inflamació i de la desmielinització podrà evitar l’aparició de símptomes clínics, inclòs el dolor, i induir una millora significativa en els pacients. L’avenç en el coneixement dels mecanismes d’immunoregulació ha facilitat el desenvolupament de teràpies inductores de tolerància immunològica davant d’antígens propis per al tractament de malalties autoimmunitàries. En aquest context, la utilització de cèl·lules dendrítiques tolerogèniques carregades amb pèptids de la mielina es postula com una alternativa prometedora per al tractament de l’EM. L’objectiu és induir “tolerància immunològica” a la mielina i evitar així l’atac autoimmune al SNC per preservar la resta del sistema immunitari. Ens vam plantejar els objectius concrets següents:

2

OBJECTIUS: Objectiu 1: Disseny i desenvolupament del producte cel·lular tolerogen (cèl·lules dendrítiques tolerògenes o DCtol carregades amb un grup de pèptids de la mielina) a partir de monòcits de sang perifèrica dels pacients.

Objectiu 2: Desenvolupament d’un mètode in vitro per seleccionar pacients candidats al tractament i fer el seguiment dels mateixos. Objectiu 3: disseny i realització d’un assaig clínic fase I/IIa, longitudinal i prospectiu per obtenir resultats de seguretat i una primera “prova de concepte” d’aquesta teràpia. Objectiu 4: Anàlisi del dolor en pacients amb EM.

L’ajut MTV3 07/2410 ens ha permès poder fer els estudis preclínics per al desenvolupament d’aquesta teràpia cel·lular autòloga basada en la utilització de cèl·lules dendrítiques tolerògenes (DCtol) carregades amb un grup seleccionat de pèptids de la mielina i establir les bases per a la realització d’un assaig clínic fase I/IIa basat en l’administració d’aquestes cèl·lules a un grup seleccionat de pacients amb EM remitent recurrent.

2. Resultats 1) Disseny i desenvolupament del producte cel·lular tolerogen 1.1. Selecció dels pèptids Per poder definir una teràpia antígens específica és important comprovar la reactivitat dels limfòcits dels pacients a diferents autoantígens. Es va fer una revisió bibliogràfica sobre els autoantígens candidats en EM, que es va publicar a Grau-López et al., 2009. Es va seleccionar un grup de set pèptids de la mielina com a candidats, pèptids no restringits per l’HLA i capaços de ser reconeguts per limfòcits T de pacients amb EM amb avidesa elevada

3

(descrits per Roland Martin, investigador d’aquest projecte a Bielekova et al., 2004).

1.2. Generació del producte cel·lular: DC-VIT-MS

L’obtenció del producte se subdivideix en dues parts: (1) generació de les DC a partir de monòcits de sang perifèrica i (2) maduració de les DC generades. L’obtenció dels monòcits del grup control es va fer a partir de mostres de capa leucocitària procedents del Banc de Sang i Teixits (BST), i els dels pacients a partir de mostres de sang perifèrica (estudis a petita escala) o leucofèresi (estudis a escala clínica). No es van observar diferències en l’eficiència de diferenciació a DC entre mostres de pacients o controls. La separació dels monòcits es va fer per elutriació o per columnes magnètiques. Es va dur a terme un estudi comparatiu de diferents agents inductors de maduració de les DC: còctel de citocines o CC (que conté TNF-a, IL-1b i prostaglandina E2), l’agonista del TLR-4 MPLA (monophosphoryl lipid A) de grau clínic, i la combinació de tots dos (CC+MPLA). Les (CC)-DCtol van mostrar el potencial més gran de supressió de proliferació de limfòcits T in vitro. A més, només aquestes cèl·lules van mostrar estabilitat funcional, ja que no van induir un increment de la proliferació dels limfòcits T després d’estimulació amb LPS, per la qual cosa es pot concloure que el millor estímul de maduració per a l’obtenció de cèl·lules tolerògenes era el còctel de citocines, resultats publicats a Raïch-Regué et al., 2012a. 1.3. Elecció de l’agent tolerogen Com a agent tolerogen per les DC, encara que en primera instància es va plantejar la utilització de VIP (pèptid intestinal vasoactiu), atès que se n’havia demostrat l’efectivitat en el model animal d’EM (encefalitis autoimmune experimental o EAE). No obstant això, estudis amb cèl·lules humanes no van donar els resultats esperats, per la qual cosa vam analitzar altres agents tolerògens (dexametasona, rapamicina i vitamina D3), tots

4

ells de grau clínic. Es va comparar l’efecte de cadascun d’ells sobre la viabilitat, l’eficiència de diferenciació, el fenotip (mesurat per l’expressió de CD83, CD86, HLA-DR), la secreció de citocines (IL-10, IL12p70, IL-23) i l’estabilitat del fenotip tolerogen després d’una estimulació ulterior amb LPS. Es va analitzar també la capacitat de les diferents DCtol d’estimular limfòcits T i el fenotip dels mateixos, i a partir d’aquests es va seleccionar la vitamina D3 (VitD3) com a agent tolerogen per a l’obtenció del nostre producte cel·lular. Aquests resultats es van publicar a Naranjo-Gómez et al., 2011. A partir d’aquest treball, estem fent una anàlisi del perfil transcriptòmic de les DCtol generades amb diferents agents tolerògens (rapamicina, dexametasona, VitD3) comparat amb DC madures i DC immadures, amb la finalitat de poder definir biomarcadors de tolerogenicitat. 1.4. Anàlisi de la funcionalitat i efecte in vitro de les DCtol-VitD3 carregades amb pèptids de la mielina, sobre els limfòcits T dels pacients A continuació vam analitzar la producció de citocines per les DCtol-VitD3 tant de pacients amb EM com de controls. Es va observar que produeixen nivells d’IL-10 més elevats i nivells d’IL-12p70 més baixos que les DC madures, la qual cosa suggereix un perfil antiinflamatori d’aquestes cèl·lules. De la mateixa manera, en cultius alògens es va demostrar una capacitat disminuïda de les DCtol d’induir proliferació comparades amb les DC madures. Els sobrenedants d’aquests cocultius presentaven nivells significativament mes baixos de TNF-a, IL-6 i IFN-g que aquells amb DC madures. Aquests resultats van ser similars en pacients i controls, per la qual cosa es descarta una funcionalitat més baixa de les DCtol dels pacients amb EM. Mitjançant assajos de competició peptídica vam demostrar que els pèptids de la mielina s’uneixen a les molècules d’HLA de classe II de les cèl·lules dendrítiques. Vam dur a terme estudis funcionals d’inhibició de la proliferació de cultius cel·lulars enriquits en limfòcits T específics enfront del grup de pèptids de la

5

mielina, en mostres de pacients amb EM, i vam observar una disminució de la proliferació d’aquells limfòcits T cultivats amb DCtol+pèptids comparats amb aquells cultivats amb DC madures+pèptids (figura 1A) i una reducció important de citocines proinflamatòries (IL-17, IFN-g i IL-6) en el sobrenedant. Es van recuperar aquests limfòcits T i després de 72 hores en repòs es van reestimular amb PBMC autòlogues irradiades+pèptids, i es va detectar una hiporesposta d’aquells limfòcits que havien estat prèviament en contacte amb DCtol+pèptids (figura 1B)

Figura 1. DCtol carregades amb pèptids de la mielina indueixen hiporesposta de cèl·lules T autòlogues de pacients amb EM. (A) El gràfic mostra la mitjana + SD (de 21 rèpliques) de la proliferació específica als pèptids de la mielina de tres pacients amb EM-RR. Cèl·lules T específiques generades per estimulació seqüencial amb els pèptids, van ser cocultivades amb DC madures sense pèptid (DCmad), amb pèptids (DCmad+p) o amb cèl·lules tolerògenes+pèptids (DCtol+p), a ràtio 1:20 durant sis dies. Es va determinar la proliferació per incorporació de (3H)-timidina (cpm) les últimes 16 hores. (B) Les cèl·lules T (LT) dels cultius descrits a A, després de 72 hores de repòs es van reestimular (ràtio 1:10) amb PBMC autòlogues irradiades carregades amb la barreja de pèptids. La proliferació es va determinar a les 72 hores per incorporació de (3H)-timidina. Les barres representen la mitjana+SD de tres rèpliques de cadascun dels pacients (**p