Objetivo General: Reconocimiento de estructuras subcelulares mediante transfección de proteínas fluorescentes e inmunocitoquímica
Transfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos ó físicos.
Inmunocitoquímica: se emplean anticuerpos para detectar y localizar antígenos específicos en células ó tejidos (Inmunohistoquímica).
GFP-PTP 1B DA VINCULINA
Manipulación de células en cultivo: 1) MEDIO DE CULTIVO
Requerimientos MEDIO DE CULTIVO
Aporte Nutrientes
Composición *glucosa (fuente de C) *aminoácidos (fuente de N) *cofactores enzimáticos *vitaminas *sales *Transferrina *Albumina, *Factores de crec. *Factores de anclaje
SUERO
Estimulo proliferativo y adhesivo
ANTIBIOTICO
*penicilina Prevención de contaminaciones, *estreptomicina selección *gentamicina
SUPLEMENTO
Estimulo especifico
BUFFER
Mantiene el PH
*hormonas *Factores de crec. *Bicarbonato *Indicador: Rojo Fenol
3) ESTERILIDAD 1) Manipulación de células en flujo laminar 2) Exposición de luz UV dentro del gabinete del flujo por 15´ antes de empezar a trabajar 3) Todo el material usado debe estar estéril * por autoclavado (120 C, 1 atm, 20´) en el caso de tips, frascos, eppendorfs, pipetas, etc. * por filtración (poro de 0,2µM) en el caso de medio (antes del agregado de SFB y antibióticos), buffers, agua, etc. 4) Todo los elementos que ingresan al flujo laminar deben ser lavados con etanol 70%
Fijación Preserva la morfología celular y la localización y estructura de los antigenos.
Glutaraldheído
Modo de acción
Por puentes entre grupos aminos de las proteínas
Microscopia electrónica Uso mas frecuente y algunos estudios de fluorescencia
ventajas/ desventajas
*provee la mayor preservación de la estructura fina *es el mas severo de los fijadores *en gral. Altera los epitopes *provoca fluorescencia inespecifica
Paraformaldheído
Metanol/Acetona
Por puentes entre grupos aminos de las proteínas
Por precipitación de proteínas y carbohidratos
Ampliamente usado para estudios de fluorescencia e inmunocitoquímicos
Gran variedad de estudios
*produce menor autofluorescencia que el gluteraldheído *menor cantidad de puentes que el glutaraldheído *penetra mas rápidamente dentro de la célula.
*fijación mas rápida que el aldheído *frecuentemente altera el patrón de localización de antígenos *Fija y permeabiliza * antígenos solubles pueden perderse *contracción de la muestra
Permeabilización Produce poros en las membranas celulares Permite la entrada de los anticuerpos a la célula No es necesario si se quiere detectar antígenos expuestos en la cara exoplásmica de la membrana plasmática o de matriz extracelular Se utilizan generalmente detergentes no iónicos
Tinción con Anticuerpos • Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer y unirse específicamente y con alta afinidad a otras proteínas . • La molécula que induce la producción de anticuerpos y a la éstos se unen se denomina antígeno. • Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.
Anticuerpos Policlonales
Monoclonales
Anticuerpos producidos por diferentes clones de linfocitos
Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos
Mezcla heterogénea de anticuerpos, reconocen distintos epitopes de un mismo antígeno.
Población de anticuerpos homogéneos, reconoce un único epitope del anticuerpo
Anticuerpos policlonales Conejo, cabra, oveja, etc. Purificación de anticuerpos Separar el suero
Anticuerpos monoclonales
• Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por fusión con células de mieloma de ratón. • Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el linfocito B normal parental y es inmortal como el mieloma que le dio origen.
Anticuerpos monoclonales
Fusión Células productoras de anticuerpos
Hibridomas
Producción de anticuerpos monoclonales
Anticuerpos monoclonales • Alta especificidad, reconocen un único epitope. • Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características. • Mayor costo que los sueros policlonales.
César Milstein (Bahía Blanca, 8/10/1927 – Cambridge, 24/3/2002) Premio Nobel de Química 1984
Anticuerpo primario (IgG) •anti-tubulina (producido en conejo) •anti-vinculina
(producido en conejo)
Inmunofluorescencia indirecta Fluoróforo Anticuerpo secundario (anti IgG de conejo) Anticuerpo primario (IgG) •anti-tubulina •anti-vinculina Células fijadas, permeabilizadas y bloqueadas
Inmunofluorescencia indirecta
Microscopio de fluorescencia
Inmunofluorescencia
DIRECTA Anticuerpo marcado con fluoróforo
Ventajas
primario
Acorta tiempos de incubación
INDIRECTA secundario
• Mayor sensibilidad • El anticuerpo secundario puede ser usado para localizar cualquier anticuerpo primario producido en el mismo animal para el cual fue hecho el secundario