UIVERSIDAD CETROCCIDETAL “LISADRO ALVARADO”

CARACTERIZACIÓ DE PYTHIOSIS GATROITESTIAL CAIA. EERO 2001 – JULIO 2007.

YARITZA SALAS ARAUJO

Tarabana, Octubre 2008

UIVERSIDAD CETROCCIDETAL “LISADRO ALVARADO”

CARACTERIZACIÓ DE PYTHIOSIS GATROITESTIAL CAIA. EERO 2001 – JULIO 2007.

Trabajo presentado para optar al grado de Magíster Scientiarum

Por: YARITZA SALAS ARAUJO

Tarabana, Octubre 2008 ii

CARACTERIZACIÓ DE PYTHIOSIS GATROITESTIAL CAIA. EERO 2001 – JULIO 2007.

Por: YARITZA SALAS ARAUJO

Trabajo de grado aprobado

Prof (a) Victoria Colmenárez Tutora

Prof. José Agustín López

Prof. Ortelio Mosquera

Tarabana, Octubre 2008

iii

IDICE DE COTEIDO Pág. v vi vii viii ix

DEDICATORIA AGRADECIMIETOS IDICE DE TABLAS IDICE DE GRÁFICOS IDICE DE FIGURAS RESUME

xi

ITRODUCCIÓ

1

CAPITULO I MARCO TEÓRICO Pythiosis a) Ciclo de vida b) Formas de presentación de la Pythiosis c) Herramientas diagnósticas d) Epidemiología / Factores de Riesgo.

7 8 14 24

CAPITULO II MARCO METODOLÓGICO a) Tipo de investigación b) Población y muestra c) Métodos e instrumentos de recolección de datos d) Análisis de los datos

29 29 29 30 35

CAPITULO III RESULTADOS Y DISCUSIÓ a) Características Macroscópicas de las lesiones gastrointestinales en Pythiosis canina b) Característicos Microscópicas de las lesiones gastrointestinales en Pythiosis canina c) Descripción estructural y ultraestructural del Pythium insidiosum y las lesiones que produce a través de Microscopia Electrónica de Barrido (MEB) y de Transmisión (MET). d) Factores de Riesgo de Pythiosis Gastrointestinal Canina.

4

37 37 42 51 60

COCLUSIOES RECOMEDACIOES

75 77

BIBLIOGRAFIA AEXOS

78 85

iv

DEDICATORIA A los animales que dan sus vidas a cambio de un pequeño avance en la ciencia.

v

AGRADECIMIETO

A Dios todo poderoso porque siempre camina a mi lado y me permite lograr mis metas. A mi tutora y amiga la Dra. Victoria Colmenárez por guiarme en la consecución de mis objetivos y motivarme cada día en mi superación profesional y personal. A Adelys Antonio Márquez por su apoyo, estímulo, confianza, ejemplo de trabajo y amor por nuestra casa de estudio, de la cual, nos sentimos supremamente orgullosos. A mis padres y hermanos por ser motivo de inspiración en los proyectos de vida que decido emprender y a quienes les debo lo que soy. A mis compañeros y amigos Ana Cecilia Corro, Marlene de Rodríguez, María de los Ángeles Ortiz y Dichson Freitez quienes laboran en el Laboratorio de Diagnóstico del Área de Patología del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza” del DCV por su valiosa colaboración y disposición para el trabajo. Al Prof. Ortelio Mosquera por su generosa, paciente y acertada orientación. A los profesores Juan Luis León, Olivar Castejon y Rosa Cristina Pérez por su oportuna orientación y por abrirme las puertas del Laboratorio de Microscopia Electrónica de Barrido de la Facultad de Ciencias de la Salud del Centro de Investigación y Análisis Docente Asistencial del Núcleo Aragua (CIADANA) de la Universidad de Carabobo. A mis profesores de la Maestría por saber guiarme por el correcto camino.

vi

IDICE DE TABLAS

°

Pág.

1

Guía de observación

35

2

Distribución de Frecuencias de las Variables Sexo, Raza y Talla. Servicio Diagnóstico Anatomopatológico. DCV. 2001-Junio 2007

3

Odds Ratio (OR) según el sexo de los caninos en estudio. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

4

60 64

Odds Ratio (OR) según la Raza en caninos Fenotípicamente Puros y Mestizos. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

5

66

Odds Ratio (OR) de Condición Racial según la Talla de los caninos en estudio. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

6

69

Tasa de infección de infección de Pythiosis Gastrointestinal Canina. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

vii

73

IDICE DE GRÁFICOS

° 1

Pág. Forma de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

2

Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según la Edad. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001– Junio 2007

3

62

Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según el Sexo. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

4

61

64

Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según la Raza en Caninos Fenotípicamente Puros y Mestizos. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001- Junio 2007

5

66

Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según la variedad de Fenotipos Raciales. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

6

67

Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según Raza/Talla. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

7

68

Promedio de Frecuencia de Presentación de Pythiosis Canina según los meses del año. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

8

70

Relación entre la frecuencia de presentación de Pythiosis Canina y la Precipitación Pluvial (mm3). Barquisimeto. Enero 2001 – Junio 2007

viii

71

IDICE DE FIGURAS °

Pág.

1

Pythiosis Gástrica

37

2

Pythiosis Gástrica

38

3

Pythiosis Gástrica

38

4

Pythiosis intestinal

40

5

Pythiosis intestinal

40

6

Pythiosis intestinal. Infarto intestinal

40

7

Pythiosis intestinal. Intususcepción

40

8

Pythiosis atípica

41

9

Pythiosis. Inflamación piogranulomatosa. H&E

42

10 Pythiosis intestinal. Tricrómico, H&E

42

11 Exudado celular en pythiosis. H&E

43

12 Exudado celular en pythiosis. H&E

43

13 Pythiosis gástrica. Infiltrado inflamatorio a mononucleares. H&E

43

14 Pythiosis intestinal. Infiltrado inflamatorio a mononucleares. H&E

44

15 Pythiosis intestinal. Enteritis erosiva y hemorragica. H&E

44

16 Pythiosis intestinal. Reacción granulomatosa. H&E

45

17 Micelio de P. insidiosum. Methenamine de plata de Grocott

46

18 Hifas de P. insidiosum. Methenamine de plata de Grocott

46

19 Hifas de P. Insidiosum. H&E

46

ix

IDICE DE FIGURAS °

Pág.

20 Hifas de P. Insidiosum. H&E

47

21 Hifas de P. Insidiosum. H&E

47

22 Pythiosis gastrointestinal. Arteritis. H&E

47

23 Hifas de P. insidiosum en la pared y luz vascular. Methenamine de

47

plata de Grocott 24 Pythiosis gastrointestinal. Trombosis. H&E

48

25 Pythiosis gastrointestinal. Trombosis. Methenamine de plata de

48

Grocott 26 Hifa de P. Insidiosum. MEB

51

27 Hifa de P. Insidiosum. MEB

52

28 Hifa de P. insidiosum ramificada en ángulo de 90°. MEB

52

29 Hifa de P. Insidiosum. MET

53

30 Hifas de P. Insidiosum. MET

53

31 Hifa de P. Insidiosum, botón de ramificación. MET

54

32 Hifa de P. Insidiosum.

55

Material granular electrón denso en la

superficie. MET 33 Hifa de P. insidiodum y Polimorfonuclear. MET

56

34 Hifa de P. Insidiosum ramificada en ángulo de 90º relacionada con

57

una célula fagocítica. MEB 35 Pythiosis canina. Trombosis. MEB

58

36 Pythiosis canina. Trombo con hifas ramificadas en 90º. MEB

58

x

UIVERSIDAD CETROCCIDETAL “LISADRO ALVARADO” DECAATO DE CIECIAS VETERIARIAS POSTGRADO DE MEDICIA Y CIRUGÍA DE PEQUEÑOS AIMALES CARACTERIZACIÓ DE PYTHIOSIS GATROITESTIAL CAIA. EERO 2001 – JULIO 2007. Autor: Yaritza Salas Araujo Tutor: Victoria Colmenárez RESUME La Pythiosis, es una enfermedad granulomatosa causada por el Oomyceto Pythium insidiosum. Existe una marcada frecuencia de diagnósticos compatible con pythiosis en caninos con diarrea hemorrágica crónica, por ello se planteo como objetivo la caracterización de la pythiosis gastrointestinal a partir de biopsias y necropsias de caninos procesadas en el Servicio Diagnóstico Anatomopatológico del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza”. Periodo 2001 – Julio 2007. Se desarrolló una investigación de campo, de tipo descriptivo y se empleó un diseño retrospectivo, para ello se combino investigación documental y recolección de información a partir de muestras de tejido gastrointestinal de caninos con diagnóstico compatible con pythiosis, se realizó observación macroscópica, histopatológica y ultraestructural de lesiones gastrointestinales. Para la determinación de los factores de riesgo se utilizó estadística descriptiva a través de distribución de frecuencias y correlación de Pearson con el paquete estadístico SPSS 10.0 para Windows, asimismo, se calculó el Odds Ratio y la tasa de infección. Obteniéndose que la pythiosis gastrointestinal se caracteriza macroscópicamente por ser una lesión multinodular, de aspecto tumoral que involucra estómago e intestino. Histopatológicamente presenta gastritis y enteritis piogranulomatosa multifocal extensiva. El Pythium insidiosum conforma micelios constituidos estructural y ultraestructuralmente por hifas largas, pobremente septadas, ramificadas en ángulo de 90°, de 3 a 5 µm de diámetro, rodeada por un material granular electrón denso. De igual forma, se observó que los caninos se infectan principalmente durante la época de lluvia y presentan signos clínicos aproximadamente a los 7 a 10 meses postinfección, con una mayor ocurrencia de la enfermedad en adultos jóvenes con edades comprendidas entre 1 y 2 años sin mostrar predilección por sexo, igualmente, los caninos de raza fenotípicamente pura y de talla grande-mediana tienen más probabilidades de padecer la enfermedad. Se llegó a la conclusión que la pythiosis gastrointestinal canina es una enfermedad emergente que presenta una alta tasa de infección en el Servicio Diagnóstico Anatomopatológico del Decanato de Ciencias Veterinarias de la UCLA. Palabras claves: Pythiosis, gastrointestinal, canina.

xi

ITRODUCCIÓ

La Pythiosis, es una enfermedad granulomatosa crónica que afecta a humanos y a varias especies animales, causada por el Oomyceto Pythium insidiosum (Leal et al. 2001), patógeno presente en regiones de clima tropical, subtropical y templado, ha sido descrita en América, algunos países europeos y en el sureste asiático (Foil, 1996). Este tipo de moho acuático produce zoosporas flageladas, móviles, responsables de la migración y diseminación del agente en el medio ambiente, y es capaz de invadir los tejidos orgánicos del aparato digestivo, el subcutáneo y las arterias (Mendoza et al. 1987). El diagnóstico de esta enfermedad tradicionalmente se ha basado en los signos clínicos, histopatología y aislamiento e identificación del agente a través de sus características morfológicas y reproductivas (Chaffin et al. 1992). En caninos y felinos la forma de presentación de la enfermedad puede ser cutánea o digestiva, esta última es la más común y se manifiesta con vómito, anorexia crónica, pérdida de peso, diarrea, que puede o no ser sanguinolenta y con presencia de masas nodulares a la palpación abdominal (Fischer et al. 1994). Las lesiones gastrointestinales se caracterizan por la formación de grandes masas en la pared del estómago y/o intestino que microscópicamente están conformadas por inflamación granulomatosa y piogranulomatosa, con áreas de necrosis e intenso infiltrado celular a polimorfonucleares eosinófilos, así como, macrófagos, linfocitos y la presencia de hifas (Smith et al. 1989). Además, es importante resaltar que la pythiosis en humanos, se caracteriza por producir cuadros de arteritis y aneurismas carotideos (Wanachiwanawin et al. 1993), lesiones oculares como celulitis orbital y queratitis ulcerativa (Bedenouch et al. 2001).

1

Las características morfológicas estructurales y ultraestructurales de las lesiones presentes en pythiosis, basadas en observaciones realizadas a través de Microscopia Electrónica han sido poco estudiadas, solo se ha reportado la caracterización morfológica del P. insidiosum a partir de cultivo microbiológico obtenido de lesiones cutáneas en bovinos sin haber sido anteriormente reportado a partir de lesiones gastrointestinal en caninos. De igual forma, en Venezuela no se ha llevado a cabo un estudio que permita realizar la caracterización de esta enfermedad en caninos desde el punto de vista anatomopatológico y epidemiológico que arroje datos importantes que puedan ser utilizados como herramienta complementaria en la aplicación de métodos diagnósticos, medidas de prevención y tratamiento de la enfermedad, así como, estudios que aclaren interrogantes en relación al potencial zoonótico de la pythiosis. Basado en lo anteriormente expuesto y teniendo en cuenta que existe una marcada frecuencia de diagnóstico compatible con pythiosis en pacientes con diarrea hemorrágica crónica, es necesario establecer criterios morfológicos estructurales y ultraestructurales de lesiones gastrointestinales de pythiosis canina, así como, determinar los factores de riesgo asociados a esta enfermedad y de esta forma contar con estudios científicos que revelen el comportamiento de la pythiosis canina en Venezuela, que a su vez contribuyan con la implementación y divulgación de medidas de control sanitario para la prevención de la pythiosis tanto en animales como en el hombre. A pesar de que en el país actualmente no se han reportado casos de pythiosis en humanos, no se puede descartar la posibilidad de que se puedan ver afectados, teniendo en cuenta que la pythiosis humana es causada por el mismo agente etiológico responsable de la pythiosis canina, el cual esta presente en el país y representa un riesgo inminente de infección. En tal sentido se plantean los siguientes objetivos:

2

Objetivo General:
Caracterización de la pythiosis gastrointestinal a partir de biopsias y necropsias

de

caninos

procesadas

en

el

Servicio

Diagnóstico

Anatomopatológico del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza”. Periodo 2001 – Julio 2007.

Objetivos Específicos:
Caracterizar macro y microscopicamente las lesiones gastrointestinales compatibles con pythiosis, a partir de biopsias y necropsias de caninos procesadas en el Servicio Diagnóstico Anatomopatológico del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza”.
Describir la estructura y ultraestructura del Pythium insidiosum y las lesiones que produce a través de Microscopia Electrónica de Barrido (MEB) y de Transmisión (MET).
Determinar los factores de riesgo asociados a pythiosis canina tales como edad, raza, sexo, época del año en que ingresaron los casos al laboratorio y la tasa de

infección

de

la enfermedad

en

el

Servicio

Diagnóstico

Anatomopatológico del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza”.

3

CAPITULO I

MARCO TEÓRICO

La pythiosis es una enfermedad granulomatosa crónica, producida por el Pithium insidiosum, afecta más comúnmente la piel y el tracto gastrointestinal de algunas especies animales como caninos, equinos, bovinos, felinos y también al humano (Foil, 1996). El primer reporte de esta enfermedad fue probablemente realizado en equinos por Smith y Drouin, denominada por muchos años Pycomicete, y conocido en general como bursatii, dermatitis granular, hyphomicosis destruens equina o cáncer de los pantanos (De Cock et al. 1987), según las bases morfológicas en cultivo el agente etiológico fue llamado Hyphomices destruens, considerado en ese entonces como un zigomiceto (Voss et al. 1981). Según estudios sobre la clasificación de los hongos, basados en sistemas filogenéticos y moleculares el agente etiológico de la pythiosis es un organismo acuático el cual pertenece al Reino Stramenopila Clase Oomycetes, Orden Pythiales, familia Pythiaceae, Génereo Pythium y Especie Pythium insidiosum (Leal, 1999; Trindade et al. 2001), conocido como patógeno de mamíferos a pesar de que este género y especie se caracteriza por ser patógeno de plantas. Los organismos Oomycetes se caracterizan por la producción de zoosporas biflageladas durante la reproducción asexual, reproducción sexual por oogamia, pared celular compuesta de β-glucanos, celulosa e hidroxipolina, tallo diploide, mitocondrias con cresta tubular y características moleculares y bioquímicas propias como ruta alternativa para síntesis de lisina (Moore-Ladercker, 1996).

4

La clase Oomycetes posee 120 especie más, la mayoría son patógenos de plantas y causan daño a su vez en la agricultura. Algunas especies han sido estudiadas para su empleo como control biológico de hongos y larvas de mosquitos, conociéndose solo al P. insidiosum como patógeno de mamíferos y plantas (Alexopoulos et al., 1996). Los miembros de la Clase Oomycetes son filogenéticamente distintos a los del reino Fungí y se relacionan más con las algas que con los hongos (Kwon-Chung, 1994), la principal diferencia entre los oomicetos y los hongos es la pared y membrana celular, la quintina que compone la pared celular de los hongos esta generalmente

ausente

en

la

pared

de

los

oomicetos

quienes

presentan

predominantemente celulosa y β-glucanos (Hedrix, 1964), otra diferencia relevante es que los oomicetos no sintetizan el ergosterol sino que lo toman del medio ambiente, este esteroide es importante en la producción de estructuras sexuales in vitro más no es necesario para el crecimiento de las hifas vegetativas (Grooters, 2003). Los esteroides estimulan el crecimiento, la reproducción, aumentan la resistencia a altas temperaturas y afectan la permeabilidad de las membranas celulares (Plaats-Niterink, 1981). La reproducción en los Oomycetes puede ser sexuada o asexuada. El tipo de reproducción observada en especies de Pythium en medios húmedos es asexuada, la cual a manera general se inicia cuando un esporangio encuentra un medio favorable, las membranas exo y endospóricas se rompen por gelificación y emiten un tubo germinativo que crece continuamente hasta formar las hifas que se entrecruzan formando un tramado o micelio. De este micelio se forman hifas diferenciadas, cada uno de las cuales va a dar origen a un esporangióforo o tubo que sostiene el esporangio, éste una vez que a alcanzado su longitud definitiva se ensancha en su ápice para constituir el esporangio, en éste se acumula la mayor parte del protoplasma y núcleos, cada núcleo se divide varias veces y cada uno de ellos junto con una porción del protoplasma se rodea de una membrana para así producir múltiples 5

zoosporas, una vez maduro el esporangio se rompe y libera las zoosporas las cuales en el medio favorable reinician el ciclo asexuado. La diseminación de las zoosporas o micelios se da a través del aire, agua, insectos, pájaros, etc. (Quisqueya-Pérez, 2006). Muchas especies se caracterizan por ser de reproducción asexual, entre ellos, numerosos géneros de Pythium, sin embargo, la diferenciación entre estos géneros y otros se ha basado en la producción de estructuras reproductivas sexuales, desafortunadamente, algunos aislados de P. insidiosum ocasionalmente producen estructuras reproductivas sexuales in vitro por lo que esta identificación morfológica no es viable (Grooters, 2003). En cultivo microbiológico el micelio de Pythium spp. es incoloro, a veces brillante, de vez en cuando ligeramente lila amarillento o grisáceo. En conjunto numerosos filamentos o hifas constituyen el micelio, sus hifas son hialinas, de 5-7µm de diámetro, son no septadas aunque pueden aparecer micelios de hifas maduras septadas sobre todo en regiones huecas o delimitando órganos reproductivos. En hifas jóvenes puede verse claramente como fluye el protoplasma. Producto del ensanchamiento del ápice de las hifas se desarrollan los esporangios, los cuales son esféricos y de pared delgada (Plaats-Niterink, 1981). Los esporangios producidos en cultivos acuáticos son una parte terminal de una hifa parcialmente septada o de segmento completo y se observa en forma de vesícula en el ápice de la hifa, son globosas o subglobosas de 20 a 60 µm de diámetro (De Cock et al. 1987). Internamente contiene las zoosporas que son liberadas al medio para su propagación, se caracterizan por ser móviles, semejantes a un fríjol y lateralmente presentan dos flagelos. Pasado algún tiempo las zoosporas pierden la movilidad al entrar en contacto con plantas o tejido animal para enquistarse y luego dar lugar a un tubo germinativo (Plaats-Niterink, 1981). A partir de técnicas de inmunodifusión y anticuerpos fluorescentes, Mendoza et al. (1987) demostraron que el P. insidiosum aislado de casos de pythiosis en 6

caninos, caballos y humanos son idénticos antigenicamente y diferentes al Pythium spp. no patógeno aislados de las plantas y de la tierra. De igual forma, más tarde Mendoza y Marín (1989) a través de inmunodifusión observaron seis bandas en común entre el antígeno del P. destruens y P. insidiosum aislado de humanos y animales con pythiosis por lo que concluyeron que el agente etiológico de la pythiosis es una sola especie, el P. insidiosum. Existen variantes geográficas del P. insidiosum, demostradas por resultados aportados por Schurko et al. (2003) quienes a través de la secuenciación de ADN, establecieron las relaciones filogenéticas entre 23 casos donde se aisló P. insidiosum, los cuales fueron divididos según su ubicación geográfica en tres clases distintas, la clase I aislada del Norte, Centro y Sur América, en la clase II incluyeron los aislados de Asia y Australia, mientras que en la clase III se ubicaron los aislados de Tailandia y EE.UU.

Ciclo de Vida Mendoza et al. 1993 postuló que el ciclo del P. insidiosum se basa en la colonización de diversas plantas acuáticas que sirven de substrato para el desarrollo y reproducción del organismo mientras origina los zoosporangios. Las zoosporas libres en el agua necesitan temperaturas de 30 a 40°C, se mueven hasta encontrar otra planta o animal, en el que se enquista y emiten el tubo germinativo, mientras crean un nuevo micelio y el ciclo se halla completado. A través de observaciones realizadas con Microscopia Electrónica de Barrido (Mendoza et al. 1993), se determinó que el proceso de formación del esporangio se caracterizó por la presencia de una vesícula de pared compacta y turgente ubicada en uno de los extremos de las hifas. Asimismo, notaron como el protoplasma dentro de la vesícula se diferencia en zoosporas para constituir el esporangio cuyas paredes cuando alcanzan la madurez se convierten en membranas frágiles, comienzan a 7

debilitarse y sufren progresivas hendiduras que permiten a través de ellas evidenciar los flagelos de las zoosporas y posterior liberación de las mismas, las cuales, fueron observadas alrededor del esporangio roto y a veces sobre las superficies de restos de hojas de plantas. Por otra parte, la base de unión del esporangio a la hifa pierde turgencia lo que ocasionalmente puede originar desprendimiento de la misma. Posterior a su liberación las zoosporas se enquistan sobre la superficie de tejido animal o vegetal, se dirigen con movimientos giratorios sobre su propio eje hacia su blanco donde dejan de moverse, pierden sus flagelos, se tornan esféricas, producen y se rodean de un material amorfo que actúa como una sustancia que facilita la adhesión de las zoosporas a la superficie del hospedador, dicha sustancia no fue observada en las muestras desprovistas de tejido, es así como de esta forma demostraron que tanto el pelo como los tejidos animales y vegetales son quimiotácticos para el P. insidiosum. De igual forma observaron a partir del lugar ocupado anteriormente por los dos flagelos una proyección engrosada que en la mayoría de los casos condujo a la formación de un tubo germinativo que servirá para penetrar los tejidos y desarrollar las hifas que invaden dentro y fuera de las células. En cuanto a la forma de contagio se conoce poco pero se presume que para la forma cutánea los animales adquieren el microorganismo al pararse en agua dulce, caliente y estancada que contiene las zoosporas recién liberadas y en la forma digestiva al ingerirlas, también se maneja la posibilidad de que este microorganismo prolifere en acúmulos temporales de agua o incluso césped húmedo (Foil, 1996).

Formas de presentación de la pythiosis La patogenia de esta enfermedad no ha sido completamente dilucidada, se ha asociado a individuos inmunosuprimidos, basado en el reporte de invasión de colon en gatos por P. insidiosum secundario a inmunosupresión por panleucopenia felina (Fox et al. 1978). De igual forma, Mendoza et al. (1996) consideraron al P. insidiosum como un oportunista clásico por causar infección en individuos con un 8

sistema inmune comprometido o posterior al trauma del tejido como ocurre en las heridas de piel, que se comportan como un factor predisponente para la infección de éste patógeno al ofrecer un tejido necrótico que favorece el desarrollo de los micelios de Pythium. Sin embargo, estudios posteriores realizados por Thomas y Lewis (1998) lograron inducir la enfermedad tanto en ratones saludables y ratones tratados con cortisona luego de la inyección de zoosporas de P. insidiosum, es por ello que lo consideraron como un verdadero patógeno, no un patógeno oportunista. Esta enfermedad en animales consta de dos formas de presentación, la primera y más común en equinos es la Pythiosis cutánea (Foil et al. 1984; Purcell et al. 1994; Grooters et al. 2002a; Liljebjelke et al. 2002; Santuario et al. 2006), la cual también afecta a caninos (Thomas y Lewis 1998). La segunda forma de presentación y más común en caninos es la Pythiosis gastrointestinal donde se ve afectado estómago e intestino (Foil, 1996). También se han diagnosticados casos en los que se ve comprometida la región bucofaríngea (Santuario et al., 2006 y Foil, 1996) donde el principal signo que se manifiesta es una hipersalivación.

Pythiosis gastrointestinal. En Venezuela, la pythiosis canina ha sido reportada en su forma gastrointestinal, por Mendoza et al. (2005). Se presenta comúnmente con disturbios digestivos como vómito, anorexia crónica, pérdida de peso, diarrea (Fischer et al. 1994), y la presencia de masas nodulares a la palpación abdominal (Foil et al. 1984). La disfagia, diarrea y vómito son reportados como signos característicos de pythiosis canina en los casos de animales que presentan grandes masas abdominales palpables (Helman y Oliver, 1999). Capodacgua (2004) concluyó que existe una marcada frecuencia de diagnósticos compatible con pythiosis en pacientes que cursen con diarrea hemorrágica crónica de más de tres semanas de evolución, eosinófilia marcada y que presenten alteración de aspecto tumoral a la palpación abdominal.

9

Las lesiones gastrointestinales se caracterizan por la formación de grandes masas en la pared del estómago y/o intestino, pueden comprometer de 5 a 25 centímetros de longitud del intestino el cual presenta engrosamiento difuso e irregular de la pared (Foil et al. 1984). El examen clínico, estudios radiográficos y quirúrgicos evidenciaron una masa periforme, redondeada o tubular infiltrativa, ubicada de predilección en el intestino delgado y la válvula ileocecal (Capodacgua, 2004). Por otra parte, Graham et al. (2000) realizaron estudio de ultrasonografia a 9 perros con pythiosis gastrointestinal y observaron en todos ellos engrosamiento de la pared gastrointestinal que involucraba estómago, duodeno, yeyuno y colon con áreas de obliteración. Asimismo, Pavletic et al. (1982) describen engrosamiento de la pared intestinal y/o gástrica, del mesenterio y/o omento y ulceración de la mucosa, presencia de numerosos nódulos de variado tamaño en la pared del intestino grueso que disminuyen o atenúan la luz intestinal, necrosis e infarto principalmente en el yeyuno distal que puede involucrar la mitad del yeyuno, aproximadamente 40 cms y se puede acompañar de ruptura localizada de la pared antimesentérica. La raíz del mesenterio se observa dura, engrosada, como una masa que rodea yeyuno distal e ileon, adherido a otras partes del mesenterio. El área que rodea los vasos sanguíneos mesentéricos puede observarse endurecida, engrosada por masas nodulares, cuya expansión causa una progresiva compresión resultando en isquemia e infarto. Los signos sistémicos progresan a medida que la obstrucción, el infarto y la perforación intestinal se hacen presentes (Foil, 1996). Los linfonódulos regionales se observan aumentados de volumen, puede ocurrir invasión del páncreas y signos de obstrucción biliar (Graham et al. 2000, Pavletic et al. 1982). De igual forma en la Pythiosis intestinal en gatos se describen

10

grandes masas extraluminales que involucran íleo y mesenterio con linfoadenopatia mesentérica adyacente (Rakich et al. 2005). El tratamiento más idóneo y eficaz para la Pythiosis gastrointestinal es la resección quirúrgica de la zona afectada con su respectiva anastomosis y el éxito de la misma dependerá del diagnóstico temprano que indicará la extensión de la lesión. O’Neil et al (1984). Se han descrito terapias farmacológicas basadas en los resultados de pruebas in vitro donde se ha mostrado que P. insidiosum es sensible al miconazol, ketoconazol, y fluconazol, pero resistente a la amphotericina B (Sekhon et al., 1992). La inmunoterapia fue probada mediante el uso de una vacuna en estudios realizados en caballos y perros (Mendoza et al 2003) con el control y resolución de la patología en un 72 % y 33 % respectivamente. Por su parte, Randall y Tomas (1998) realizaron un ensayo similar donde los resultados consistieron en un 53 % de resolución de la forma cutánea en equinos y ningún éxito en caninos, la razón de esta carencia de éxito es desconocida, se presume que es debido a que la mayor parte de casos de pythiosis canina son de evolución crónica.

Pythiosis cutánea. En caninos la pythiosis cutánea se observa con menor frecuencia y la infección va precedida de traumatismo o abrasión de la piel, se desarrollan exuberantes nódulos de rápido crecimiento, con ulceración y formación de fístulas, los sitios más comunes son las extremidades, cola y perine (Foil, 1998). Las lesiones tempranas se observan como una placa ulcerada o erosiva que recuerda un granuloma por lamido, con la diferencia de ubicación en lugares atípicos de lesiones por lamido y a medida que avanza se torna nodular. (Thomas y Lewis, 1998). Las lesiones por lo general son solitarias y múltiples, suelen ubicarse a lo largo de la extremidades, base de la cola, periné y con menor frecuencia en el rostro (Dyskstra et al. 1999). Las lesiones de piel en algunos casos son nódulos de gran tamaño, de 20 cm. de largo y 7

11

cm. de ancho (Inkrle, 1998), fistulizados, pruriginosos, ulcerados, con contenido sanguinolento y áreas profundas de necrosis. (Foil, et al. 1984). Los equinos son más afectados por la forma cutánea (Liljebjelke et al. 2002). Foil et al. (1984) no observaron en los equinos predilección por raza ni sexo. Las lesiones se caracterizan por ser de crecimiento lento, insidioso, circulares y ulceradas hasta formar grandes granulomas de hasta 50 cm. de diámetro. Se ubican por lo general en la zona inguinal ventral, sitios que están en contacto con las aguas, sin embargo se han reportado en la cara, nariz y cavidad oral (Purcell et al. 1994). En la pythiosis cutánea equina se observan estructuras sólidas llamadas kunkers no reportadas en lesiones de bovinos o caninos y tienen su origen en el acumulo focal de eosinófilos alrededor de las hifas (Miller y Campbell, 1984). La pythiosis cutánea también ha sido reportada en bovinos y se caracteriza por tractos fistulosos, ulcerados, ubicados en los miembros de animales que habitan zonas pantanosas (Santurio et al. 1998). Según las observaciones realizadas en vacas por Miller et al. (1985) las lesiones dermales en la región lumbar y abdomen son fibróticas, contienen múltiples formaciones redondeadas y amarillentas, estas áreas corresponden con los granulomas vistos histológicamente y el color probablemente se deba a la cantidad de neutrófilos, eosinófilos y macrófagos presentes. En Venezuela (Marín et al. 1991) reportaron una enfermedad denominada Granulomatosis Enzootica Bovina que afecta al ganado de carne de las sabanas venezolanas, caracterizada por lesiones en las extremidades y grandes indicios de ser producida por P. insidiosum, sin embargo, esto sólo pudo ser demostrado en estudios posteriores realizados por Pérez et al. (2005) quienes observaron lesiones granulomatosas ulceradas o no, ubicadas en la porción distal del metacarpo o metatarso pudiendo implicar falanges, las lesiones no ulceradas se caracterizan por presentar múltiples tractos fistulosos que drenan un material serosanguinolento, algunos al corte presentan material purulento. Las lesiones ulceradas varían de 12

tamaño (100 mm), redondeadas o alargadas con múltiples zonas de necrosis. En éste estudio las lesiones cutáneas no presentaron las estructuras denominadas Kunkers reportados en equinos.

Pythiosis en humanos En humanos la pythiosis ha sido ampliamente reportada y se han observado tres formas de presentación, la subcutánea, la sistémica vascular y la oftálmica. La principal lesión de pythiosis humana es una oclusión arterial progresiva y crónica, hasta el subsiguiente desarrollo de aneurisma y gangrena, en algunas ocasiones hemorragias arteriales fatales (Thitithanyanont et al. 1998). La lesión oftálmica se inicia con una queratitis y llega a ser exuberante, Murdoch et al. (1997) reportaron una pythiosis ocular en un paciente y la anamnesis reflejo que se infectó en una piscina de agua caliente en una zona templada de Nueva Zelanda.

En el caso de pythiosis humana, casi el 80% del total de los casos globales se han divulgado en Tailandia. La enfermedad también se ha encontrado en otros países, tales como Australia, Nueva Zelanda, los Estados Unidos, Haití, y Malasia (Nongnuch, et al. 2004).

El primer caso en Latinoamérica de pythiosis en humanos fue reportado recientemente en Brasil, en un individuo de 49 años de edad, quien presentó una ulcera tibial de 15 cm. de diámetro, infiltrante y de bordes redondeados, leucocitos en 4200 x mm3, 9% de eosinófilos, con diagnóstico inicial de celulitis bacteriana, sin embargo, el estudio histopatológico reveló una dermatitis granulomatosa supurativa con hifas no septadas vistas con methenamine de plata de Gomori lo que conllevó al diagnóstico inicial de una zigomicosis. Debido a la progresión de la lesión a pesar de tratamiento antifúngico, el paciente fue sometido a una extensiva debridación quirúrgica con amputación del miembro afectado logrando la cura del paciente.

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Finalmente el diagnóstico concluyente de pythiosis se realizó con cultivo microbiológico y ensayos moleculares (Bosco et al. 2005).

Herramientas diagnósticas. El aumento de los casos de pythiosis en áreas donde ésta enfermedad es endémica se debe en parte al conocimiento de su presencia en ellas, difusión de sus características clínicas y epidemiológicas y al desarrollo de nuevas pruebas serológicas para su diagnóstico (Mendoza et al. 1997). Sin embargo, a pesar de que el diagnóstico temprano es esencial para el éxito del tratamiento las herramientas diagnósticas disponibles rutinariamente aún son limitadas. El diagnóstico de pythiosis se ha basado en los aspectos clínicos, histopatológicos, aislamiento e identificación del P. insidiosum a través de sus características de cultivo, recientemente a estos métodos diagnósticos se les han adicionando diferentes técnicas serológicas y de inmunohistoquímica que auxilian y soportan un diagnóstico precoz definitivo (Mendoza et al. 2005). El diagnostico clínico se basa en las características clínicas, edad del animal, perfil hematológico y radiológico, es por ello que Capodagua, (2004) diseñó un protocolo diagnóstico que orienta como diferenciar la Pythiosis gastrointestinal mediante hallazgos encontrados en pacientes con diarrea hemorrágica crónica y cualquier otra alteración de vías digestivas relacionadas principalmente con procesos neoplásicos.

Histopatología. En caninos la forma gastrointestinal debe ser diferenciada de otras patologías. Desde el punto de vista histopatológico se basa principalmente en el infiltrado celular presente en la lesión. Entre los diagnósticos diferenciales se incluyen neoplasias, 14

enteritis eosinofilica, tuberculosis e histoplasmosis. También se requiere de la diferenciación de las hifas del P. insidiosum de otras especies de hifas relacionadas con la clase de Zygomycetos y la morfología de las colonias desde el punto de vista del cultivo microbiológico (Foil, 1996). A manera general el estudio histopatopatológico de las diferentes formas de presentación de la enfermedad digestiva y cutánea, se caracteriza por una inflamación de tipo granulomatoso o piogranulomatoso con áreas de necrosis, intenso infiltrado eosinofílico y presencia de hifas (Smith et al. 1989, Santuario et al. 2006). La Pythiosis gastrointestinal desde el punto de vista histopatológico se caracteriza porque en la mayoría de los casos se conserva la mucosa, en la lámina propia están presentes numerosas células plasmáticas, ocasionalmente eosinófilos y neutrófilos, mientras que en la submucosa y muscular se evidencian discretos granulomas multifocales que coalecen con áreas centrales de necrosis caseosa, eosinófilos, neutrófilos y células gigantes asociados con células epitelioides. Igualmente, se observan hifas ramificadas y ocasionalmente septadas de 4 a 15 micras de diámetro visualizadas fácilmente con coloración especial de Gridley (Pavletic et al. 1982). La inflamación granulomatosa de la pared puede ir acompañada de arteritis (Herman y Oliver, 1999). La zona infartada del intestino presenta una necrosis difusa y numerosas bacterias saprofiticas, vasos sanguíneos congestivos, cambios inflamatorios marcados y difusos en los ganglios yeyunales e inflamación granulomatosa en la serosa. Las áreas de necrosis contienen numerosos neutrófilos y eosinófilos, así como también, hifas ramificadas y tabicadas (Pavletic et al. 1982). Un reporte en gatos reveló que en el intestino, la lesión involucra primariamente la muscular y la serosa y consistía en inflamación granulomatosa eosinofílica con área multifocal de necrosis (Rakich et al. 2005). 15

La histopatología de la pythiosis cutánea reporta una dermatitis granulomatosa multifocal con hifas de P. insidiosum observables con métodos histoquímicos y cultivo del agente (Santurio et al. 1998). Por su parte, Miller et al. (1985) describieron las lesiones microscópicas como pequeños granulomas multifocales rodeados de tejido conectivo denso, en el centro de los granulomas pequeñas y numerosas hifas ocasionalmente septadas, ramificadas, de pared lisa, de 4 a 8 µm de diámetro, algunas hifas fueron vistas aparentemente viables dentro de células gigantes. Muchas hifas circunscritas por una banda de 0,5 a 3 µm de un material granular con mínimas formaciones incrustadas en algunas zonas.

Los hallazgos histológicos de muestras de piel de bovinos de las sabanas de Apure - Venezuela coloreadas con H&E que presentaban pythiosis cutánea consisten en necrosis multifocal, infiltrado de células gigantes, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos y plasmocitos, pocas hifas dentro de algunas células gigantes inmersas en zonas de necrosis y reacción eosinofilica prominente alrededor de hifas conocido como fenómeno de Esplendore Hoeppli. Con el uso de coloraciones argénticas se pudieron evidenciar hifas de 4 a 6 µm de diámetro parcialmente septadas (Pérez et al. 2005).

Cultivo Microbiológico. En busca de establecer las características del cultivo, De Cock et al. (1987) identificaron las colonias de P. insidiosum a través de su aspecto morfológico y las características de las hifas, observaron hifas de color blanco a hialino en agar V8, sabouraud dextrosa o agar de harina de maíz. Por su parte, Grooters et al. (2002) a partir de pequeños fragmentos de tejido fresco, no macerado, distribuidos sobre la superficie del agar V8 e incubados a 37ºC obtuvieron un crecimiento típico a las 12 a 24 horas. Asimismo, evaluaron los efectos del manejo y almacenamiento de la muestra y la técnica de cultivo del P. insidiosum donde determinaron que el éxito del aislamiento de P. insidiosum es alto cuando las muestras de tejidos obtenidas por 16

biopsia son almacenadas y transportadas a temperatura ambiente con la adición de antibióticos (20 µg/ml de estreptomicina y ampicilina 100 µg/ml) entre 1 y 3 días antes de su procesamiento, de lo contrario si el medio de transporte no contiene antibiótico es mejor trasportarla a 4 ºC, lo que sugiere que la inhibición del crecimiento bacteriano que contamina la muestra incrementa las posibilidades del aislamiento del P. insidiosum de los tejidos infectados. Más tarde Grooters et al. (2003) obtuvieron zoosporas producidas a partir del cultivo de P. insidiosum, para ello primero colocaron hojas de grama infectadas con P. insidiosum en solución de sales minerales diluidas al 1% e incubaron cerca de 2 a 4 horas a 37 ºC, con la finalidad de esterilizar dicha muestra vegetal y posteriormente realizar el cultivo en agar agua al 2% incubado a 37 ºC durante 18 a 24 horas hasta obtener finalmente las zoosporas de P. insidiosum.

Pruebas inmunológicas y moleculares.

Otra técnica que puede utilizarse para la confirmación de casos sospechosos de pythiosis es la técnica indirecta de peroxidasa. Brown et al. (1988), inocularon a conejos adultos con antígeno de Pythium para obtener el suero con el anticuerpo primario especifico. El suero de conejo fue diluido en solución búfer fosfato salina (PBSS) a 1:10 y aplicado durante una hora a secciones desparafinadas de tejido de 4 µm provenientes de un caballo con pythiosis, posteriormente fueron lavadas con PBSS e incubadas con el anticuerpo secundario IgG bovino (anti-conejo) marcada con peroxidasa y diluido 1:10 en PBS por 20 minutos posteriormente lavadas con búfer acetato de sodio, finalmente el tejido fue cubierto con solución cromógena por 40 minutos y coloreadas con Hematoxilina de Mayer. De esta manera, observaron que la reacción de inmunopexidasa fue selectiva y coloreó distintamente la pared de las células hifales en las muestras de tejido utilizadas, de igual forma, el citoplasma de las células inflamatorias en el área inmediatamente adyacente a las hifas tuvo un

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incremento en la afinidad por la coloración, mientras que la coloración falló en las secciones de tejidos utilizadas como control negativo.

El diagnóstico serológico convencional en infecciones por P. insidiosum implica el uso de la prueba de inmunodifusión. La prueba, sin embargo, tiene limitada sensibilidad y no detecta algunos casos de la enfermedad probados por cultivo. Sin embargo, a diferencia de esto Miller y Campbell (1982) con la finalidad de diagnosticar y evaluar la respuesta inmune humoral y celular en caballos con pythiosis clínicamente comprobada, desarrollaron la técnica de inmunodifusión en agar gel (ID), fijación de complemento (FC) y un test de hipersensibilidad intradérmica (TI), de los cuales el 100% resulto positivo a ID, el 82% en FC y un 64% a TI, por lo que concluyeron que el test de ID presenta alta sensibilidad y especificidad para la detección de anticuerpos anti P. insidiosum.

La rapidez y la especificidad de la prueba de la inmunodifusión la hicieron una herramienta diagnóstica útil para el serodiagnóstico de las infecciones del P. insidiosum. Es por ello, que Pracharktam et al. (1991) aplicaron dicha técnica en siete sueros de casos de pythiosis humana junto con sueros de pacientes actinomicóticos y de individuos sanos. A pesar de que los títulos obtenidos fueron muy variables (1: 1 a 1: 32) en las siete muestras de suero de los casos de pythiosis, los sueros heterólogos dieron reacciones negativas, por lo que concluyeron a favor de la especificidad de la prueba.

Debido a la creciente presentación de pythiosis en seres humanos y animales, Mendoza et al. (1997) desarrollaron y evaluaron un ensayo inmunoenzimatico (ELISA) utilizando un antígeno soluble de fragmentos hifales del P. insidiosum. El estudio fue realizado con suero de cinco humanos y de ocho animales con pythiosis probada por cultivo e histología. Algunos de estos sueros eran negativos en la prueba de inmunodifusión para pythiosis. Del total de los 13 casos de Pythiosis la prueba de inmunodifusión detectó solamente 8 (61.5%), mientras que el ELISA detectó el 18

100%. Las pruebas de inmunodifusión y ELISA son específicas y dieron resultados negativos o títulos bajos respectivamente, con los sueros de seres humanos y de animales con infecciones fúngicas heterólogas o sin enfermedad evidente. Los resultados indican que el ELISA es una prueba serodiagnóstica confiable para la pythiosis, es tan específica como la prueba de la inmunodifusión pero más sensible. El uso extenso del ELISA proporciona un sensible y específico análisis para la detección de los casos de pythiosis en las áreas donde es endémico, sin importar el tipo y la especie afectada. Además, la prueba puede ser útil para detectar pythiosis en seres humanos y animales en los cuales la prueba actual de inmunodifusión ha fallado. Debido a su sensibilidad, la prueba de ELISA puede también tener valor para diagnosticar las etapas tempranas y crónicas de la enfermedad y para estudios epidemiológicos.

Por su parte, Grooters et al. (2002) desarrollaron y evaluaron un ELISA para la detección de los anticuerpos anti-P. insidiosum en suero canino, utilizaron como antígeno un extracto micelial soluble del P. insidiosum, evaluaron el suero de 43 perros con pythiosis, 8 perros con el lagenidiosis, 16 perros con las infecciones fúngicas o algas no oomycoticas, 22 perros con enfermedad gastrointestinal no fúngica y 55 perros sanos. Las medias y rangos para cada uno de los 5 grupos fueron los siguientes: pythiosis (81,7%, 50,6-98,5%), lagenidiosis (17,3%, 11,3-29,2%), otras

infecciones

fúngicas

o

por

algas

(8.2%,

4.7-15.4%),

enfermedad

gastrointestinales no fúngica (6,2%, 3,9-20,7%), y los perros sanos (6,7%, 3,015,2%). Al usar un valor de corte del 40%, la sensibilidad y la especificidad del ELISA eran 100%. Adicionalmente, luego de la terapia quirúrgica en 2 perros se demostró una disminución de las concentraciones del anticuerpo anti-P. insidiosum hasta el rango normal durante dos meses después del tratamiento. Por lo tanto, concluyeron que ELISA es una prueba sensible y específica para el diagnóstico de pythiosis canina, y puede ser una herramienta útil para supervisar la respuesta a la terapia médica o quirúrgica.

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El aislamiento e identificación del P. insidiosum requiere de un largo plazo y retrasa el tratamiento, lo que da lugar a alta morbilidad y mortalidad. Es por ello, que con la finalidad de facilitar el diagnóstico rápido de esta enfermedad Theerapong et al. (2002) desarrollaron un ELISA para la detección de los anticuerpos de IgG contra P. insidiosum con el objeto de ser usada en el diagnóstico y supervisión de la pythiosis humana. Todos los sueros de casos de pythiosis fueron determinados positivos, mientras que los sueros del grupo control resultaron negativos. Mediante el ELISA realizado a muestras seriadas de sueros de pacientes tratados se demostró que los niveles de anticuerpos de P. insidiosum declinaban gradualmente. La prueba de ELISA era altamente sensible (100%) y específica (100%) y era útil para el diagnóstico temprano y para supervisar el tratamiento de Pythiosis.

Las herramientas diagnósticas moleculares y serológicas son útiles para la identificación rápida de pythiosis, por tal motivo Grooters y Gee

(2002) se

plantearon desarrollar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la identificación del P. insidiosum. El DNA genómico fue extraído a partir de 3 cultivos de P. insidiosum, así mismo, se aíslo de Pythium graminicola y de Pythium arrhenomanes. Para la amplificación se utilizaron las plantillas de P. insidiosumespecíficas (PI-1 y PI-2). La especificidad del análisis fue probado con el DNA extraído de los cultivos siguiente: 10 de P. insidiosum y los otros de P. graminicola, P. irregulare, P. arrhenomanes, P. myriotylum, P deliense, P. ranarum, Basidiobolus, Conidiobolus coronatus, Aspergillus terreus, Lagenidium giganteum. La secuenciación del PCR produjo una amplificación de 105 pares de bases en cada uno de los P. insidiosum aislados, pero no amplificó para ninguno de los otros agentes. Los resultados de este estudio sugieren que el PCR es una herramienta útil para la identificación del P. insidiosum.

Mendoza et al. (2005) a partir del una biopsia de intestino de un canino mestizo terrier de 11 meses de edad con diagnóstico Histopatológico compatible con pythiosis realizaron inmunofluorescencia directa y junto con herramientas 20

moleculares (PCR) corroboraron que el patógeno involucrado era el P. insidiosum. Para ello, los cortes histológicos desparafinados fueron cubiertos con una gota de los anticuerpos específicos fluorescentes de P. insidiosum (FA) y analizados bajo el microscopio de fluorescencia. Además, el DNA genómico del P. insidiosum fue extraído y amplificado de tejidos parafinados. Como control usó cortes histológicos de una variedad de micosis, obteniendo en ellos resultados negativos al usar los reactivo del FA. La identidad de los elementos hifales también fue confirmada por PCR y demostraron total igualdad con las secuencias registradas en el banco de genes del P. insidiosum.

En conclusión la histopatología, immunohistoquimica, y las pruebas serológicas son capaces de demostrar que el P. insidiosum es el responsable de la pythiosis. Pérez et al. (2005), a partir de cortes histológicos de tejidos provenientes de bovinos con diagnóstico de pythiosis epizoótica de los bóvidos realizaron inmunofluorescencia, cuyo resultado fue la identificación de hifas ramificadas del P. insidiosum. De igual forma, utilizando la inmunodifusión, ELISA, y western blotting demostraron en los sueros obtenidos de los bóvidos afectados las inmunoglobulinas Anti-P. insidiosum.

Microscopia Electrónica.

El objetivo de la microscopia electrónica consiste en formar imágenes de un objeto diminuto a través del uso de electrones, se puede alcanzar una capacidad de aumento muy superior hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 aumentos de los mejores microscopios ópticos, de igual forma, el uso de electrones en vez de fotones solo permite visualizar una imagen en blanco y negro (Philips Electrón Optics). Un microscopio electrónico funciona con un haz de electrones acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticos. La amplificación de la 21

imagen se produce por un conjunto de lentes magnéticos que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un computador permitiendo la observación y caracterización estructural a ultraestructural de una muestra a través de información morfológica del material analizado. Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos, el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces a partir de muestras muy finas no mayores de un par de miles de ángstroms, observando una imagen ultraestructural del material analizado, a diferencia de éste, el microscopio electrónico de barrido aunque cuenta con una menor capacidad de aumento, permite apreciar con mayor facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que hayan sido pulverizados metálicamente antes de su observación y no se puede ir más allá de la textura externa que se quiera ver (Philips Electrón Optics). Las características morfológicas estructurales y ultraestructurales de pythiosis basadas en observaciones realizadas a través de MEB y MET han sido poco reportadas, solo se ha estudiado en lesiones cutáneas de bovinos y directamente a partir de cultivo microbiológico, sin haber sido anteriormente reportada en lesiones observadas en la pythiosis gastrointestinal canina. Entre estos estudios se encuentran las observaciones de pythiosis cutánea en vacas llevada a cabo por Miller et al. (1985), quienes a través de microscopia electrónica de transmisión revelaron numerosas hifas de pared densa y de apariencia laminar rodeadas de un material granular electrón denso. De igual forma se evidenciaron muchos neutrófilos cerca de las hifas intentando fagocitarlas. Adicionalmente reportaron una interesante característica como lo son las incrustaciones granulares alrededor de las hifas, la cual no han sido reportadas en equinos y caninos. Ultraestructuralmente están compuestas de material granular electrón denso sugestivo de complejos antígeno-anticuerpo. Estas incrustaciones son vagamente semejantes al fenómeno de Esplendore Hoeppli

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asociado a infecciones fúngicas constituido por complejos antígeno-anticuerpo y detritus celulares íntimamente rodeando las hifas. Como fue descrito anteriormente, Mendoza et al. (1993) procesaron para MEB centrifugado de hojas infectadas con P. insidiosum seleccionadas con microscopio de luz por la presencia de numerosos esporangios en diferentes etapas de desarrollo y observaron in vitro la formación de gran cantidad de micelios describiendo detalladamente, en base a las imágenes en tercera dimensión ofrecidas por el MEB, el ciclo de vida del P. insidiosum, así como, los diferentes estadios evolutivos presentes en la reproducción asexual del microorganismo. Por su parte, Grooters (2003) describió con detalle la reproducción asexual in vitro del P. insidiosum observada a través de MEB, donde observó en los estadios tempranos de la zoosporogenesis como filamentos no diferenciados de la hifa vegetativa que se prolongan formando el tubo germinativo, internamente a éste el protoplasma fluye de manera progresiva hasta expandirse y formar una vesícula terminal que contiene internamente las zoosporas, las cuales de forma mecánica se abren paso a través de la pared de la vesícula y son liberadas. Recientemente, Garcia et al. (2007) observaron a partir de un cultivo microbiológico la morfología de las hifas de P. insidiosum a través de MET, la mayoría de hifas presentaron numerosas estructuras cortas, transversales y longitudinales, con una pared celular de varias capas internas que engloba organelas típicas. La pared celular tiene plasmalema lisa asociado a una capa interna gruesa. Dentro del compartimiento citosólico observaron en forma difusa microtubulos relativamente grandes, fue constante una vacuola grande electrón denso (EDBs), vesículas citoplasmáticas transportadas desde el compartimiento citosólico hasta el plasmalema y luego integradas en las capas internas del plasmalema manteniendo su integridad. En algunas de las muestras fueron observados los núcleos rodeados por una membrana que contiene cromatina granular, igualmente evidenciaron varios 23

aparatos de Golgi con numerosas vesículas de Golgi adheridas o integrándose en el plasmalema. El Retículo endoplásmico ocasionalmente fue visto con múltiple ribosomas alrededor y cerca de mitocondrias con cresta tubular. De igual forma, dispersas en las hifas se observaron numerosas y pequeñas vacuolas de un contenido fino granular. En este mismo estudio, Garcia et al. (2007) realizaron un mapa inmunológico sobre la ubicación de los anticuerpos de P. insidiosum en muestras de micelios, a partir del cual concluyeron que las hifas de P. insidiosum poseen múltiples anticuerpos immunodominantes, la mayoría de ellos localizado dentro de la capa interna de la pared celular y en el mismo plasmalema, también expresa antígenos inmunodominantes en el citosol que puede emigrar al plasmilema, a la capa interna de la pared celular e incluso algunos de estos antígenos posiblemente podrían ser transportados fuera del compartimiento hifal.

Epidemiología / Factores de riesgo. La pythiosis es una enfermedad de distribución mundial y se ha observado principalmente en países de climas húmedos, tropicales y subtropicales, ha sido descrita en América, algunos países Europeos y Suroeste Asiático, Oceanía y África (Chaffin et al. 1995. Mendoza et al. 1996). Ha sido reportada en Estados Unidos de América principalmente en los estados fronterizos con el Golfo de México y otros hacia el Norte como Kentucky y Carolina del Norte, Australia, Brasil, Burma, Colombia, Costa Rica, Indonesia, Japón, Nueva guinea, Tailandia (Foil, 1998) y Venezuela (Mendoza et al. 2005; Pérez et al. 2005, Morais et al. 1998). El P. insidiosum a pesar de que sobrevive en el medio ambiente como un saprófito de plantas es considerado patógeno de animales y del hombre, debido su preferencia por las proteínas y su inhabilidad para degradar polisacáridos de las plantas, pues el tejido animal posee mayor abundancia de proteínas en relación a las 24

plantas que son ricas en hidratos de carbono. Esto explica la preferencia de P. insidiosum por los medios de cultivos ricos en proteína y la secreción de proteínas con altos niveles de actividad proteasa (Mendoza et al. 1996). Otro factor importante a considerar es que este microorganismo es exigente en cuanto a la temperatura de incubación en cultivo, la cual, resulta equivalente a los 37 °C de temperatura corporal de los animales y el hombre (Davis et a.l 2006). Para la producción de zoosporas, el P. insidiosum necesita temperaturas de 30 a 40 °C en aguas estancadas, pantanos y estanques (Miller y Campbell, 1982). Es por ello que la mayoría de los casos de pythiosis se observan durante o después de la estación lluviosa (Foil et al. 1996). En el Pantanal Matogrossense, Brasil, la mayoría de los casos de pythiosis en caballos es registrada entre los meses de Febrero y Mayo (verano-otoño), período que corresponde al ápice de lluvias (Leal et al. 2001). Tabosa et al. (1999) reportó en su estudio que la mayoría de los 38 casos de pythiosis observados en Paraíba, Brasil¸ eran registrados en los meses de Julio a Octubre, siete a diez meses después del principio de las lluvias. La pythiosis gastrointestinal y subcutánea ha sido reportada en África en caninos jóvenes, la lesión aparece al inicio de la época de lluvia en ciudades de condiciones climáticas subtropicales a áridas, con dos estaciones al año, una fría y seca de Noviembre a Febrero y otra lluviosa de Junio a Septiembre (Rivierre et al. 2005). En Venezuela, la pythiosis canina ha sido reportada en su forma gastrointestinal, el primer reporte fue realizado por Mendoza et al. (2005) en un canino Terrier de once y medio meses de edad con enteritis piogranulomatosa compatible con pythiosis y cuyo diagnóstico fue comprobado a través de inmunofluorescencia directa y la presencia de anticuerpos contra P. insidiosum.

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Mendoza et al. (1996), han reportado la infección en perros de ambos sexos. Aunque en otros casos publicados predomina la infección en las hembras, de igual forma, la enfermedad al parecer tiene predilección por caninos de raza grande. Aunque algunos reportes se han realizado en perros de talla pequeña de procedencia urbana, sin antecedentes conocidos de acceso a agua estancada lo que ha generado la posibilidad de que el P. insidiosum prolifere en depósitos temporales de agua e incluso en el césped húmedo (Foil, 2000). La mayoría de los casos se presentan después del periodo lluvioso (Foil, 2000). Los caninos mayormente afectados son los de edades comprendidas entre 1 y 4 años (Capodacgua, 2004). Miller (1985) en un estudio de phycomicosis gastrointestinal en 63 perros determinó que 60 de ellos presentaron pythiosis y solo 3 entomophthormicosis, los animales comúnmente afectados con pythiosis eran machos de raza grande con edades promedio de tres años y de mayor incidencia las razas de trabajo en el medio acuático, presentados al veterinario a menudo en los meses de otoño, invierno y comienzos de primavera. Por su parte, en una revisión de casos de Phycomicosis reportadas en caninos Bursanti et al (1975) encontró, en un total de 8 casos, la enfermedad en caninos de 2 , 3 , 4 , 5 , 7 , 9 y 10 años de edad, con predilección por aquellos de 3 años de edad, de raza mediana a grande e indistinta presentación en machos y hembras. Pavlectic et al (1982) en un reporte de 3 casos de phycomicosis de intestino delgado que se desencadenaron con isquemia e infarto donde se logro aislar Pithyum evidenció mayor presentación en caninos machos, mestizos, de raza mediana a grande y de 1 año de edad. Si bien es cierto que la pythiosis afecta animales jóvenes, un hallazgo sorprendente obtuvo Liljebjelke et al (2002) al examinar un cachorro de tan solo 12 semanas de edad quien presentaba vómito, diarrea y anorexia, resultando en pythiosis. Enfermedad que no fue considerada inicialmente como diagnóstico 26

diferencial por la edad del animal y por que provenía de Carolina del Sur donde no se presentan las condiciones ambientales favorables para el desarrollo del agente etiológico de la enfermedad. En cuanto a predisposición etária, sexual y racial de la pythiosis subcutánea, Foil (1984) reportó la enfermedad en 5 casos donde observó que todos los animales eran adultos jóvenes con edades comprendidas entre 1 a 3 años de edad y 4 de ellos de raza grande. Igualmente, Dykstra et al (1999) en la descripción de 15 casos de pythiosis subcutánea reportó mayor predisposición a la enfermedad en animales jóvenes con edad media de 2 años y animales de raza grande mayores a 20 kg de peso corporal. Por otra parte, ha sido sustentada la teoría de que los animales al entrar en contacto con las aguas contaminadas atraen las zoosporas y éstas pueden penetrar en una pequeña lesión. Otros autores sugieren que las zoosporas penetran a través de los folículos pilosos, basado en el hallazgo de zoosporas dentro de los folículos pilosos de bovinos infectados de forma natural (Santurio et al. 1998). Esta última observación puede cuestionar la necesidad de la lesión en la piel para que ocurra la germinación de las zoosporas. Además, para el desarrollo de la enfermedad parecen influir diferencias individuales de susceptibilidad, como aparentemente ocurre en caballos (Trindade et al. 2001). Es importante considerar que probablemente el P. insidiosum logre romper la barrera de protección del tejido a través de la secreción de enzimas, pues ya se ha demostrado la producción de proteínas de 28 y 34 KDa de peso molecular que presentan actividad de proteasa sérica y una metaloproteinasa sérica de 48 KDa. La participación de estas enzimas en la colonización de los tejidos aún no ha sido establecida, sin embargo, resulta muy probable si se toma en cuenta que en muchos otros hongos dichas proteinasas si están implicadas en la invasión de tejidos intactos (Ruchel, 1999). 27

La piel o tejidos traumatizados pueden ser un factor predisponente a la infección por P. insidiosum, sin embargo este podría ser capaz de colonizar tejidos sólidos intactos. Ravisshankar et al. (2001) realizaron un experimento donde se evidencio que un extremo de la hifa solo era capaz de ejercer una presión de 0,3 µNµm-2 mientras que las muestras de tejido subcutáneo y cutáneo de humanos mostraron resistencia a una fuerza de penetración de 24 µN µm-2 y una presión de 30 µN µm-2 fue necesaria para penetrar la piel de un caballo, esto demostró que el P. insidiosum no es capaz de ejercer una presión suficiente para penetrar la piel intacta por este mecanismo. Posteriormente, Money et al. (2004) al analizar el comportamiento mecánico de diversas especies de hongos demostraron que la fuerza física de la hifa sólo es capaz de vencer la resistencia de sus fuentes sólidas de alimentos luego de la digestión sustancial de tejido por parte las enzimas secretadas, y, en algunos casos, favorecido por el daño mecánico previo como por ejemplo las herida de planta y tejidos animal.

28

CAPITULO II METODOLOGIA

A. Tipo de investigación.

El presente estudio desarrolla una investigación de campo, de tipo descriptivo, donde se empleó un diseño retrospectivo. En la primera fase se realizó investigación documental tomando la base de datos de los diagnósticos histopatológicos compatibles con pythiosis disponibles en el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza” del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, desde el año 2001 hasta el año 2005. De igual forma, a partir del mes de Enero del año 2006 hasta Julio del 2007 se continúo con la recolección de información y de las muestras de los caninos con diagnóstico compatible con pythiosis que llegaron al servicio.

B. Población y Muestra.

La población esta referida al total de casos de caninos referidos al Servicio de Diagnóstico Anatomopatológico del Área de Patología del Hospital Veterinario, durante el periodo comprendido entre el mes de Enero del año 2001 hasta Julio del 2007. La muestra consistió en 46 caninos con diagnóstico histopatológico compatible con pythiosis gastrointestinal atendidos en el Área de consulta externa del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza” del DCV-UCLA y en clínicas privadas, principalmente del estado Lara referidos al Servicio.

29

C. Métodos e instrumentos de recolección de datos. C.1.

Caracterización

macroscópica

e

histopatológica

de

lesiones

gastrointestinales compatibles con pythiosis en caninos.

Con la finalidad de llevar a cabo el estudio macroscópico de las lesiones, fueron revisados los informes de biopsias y necropsias que reposan en el Servicio de Diagnóstico de Anatomía Patológica del Decanato de Ciencias Veterinarias, correspondientes al periodo 2001-2005, se seleccionaron y clasificaron, según al número de identificación y el año, todos aquellos casos de biopsias y necropsias compatibles con Pythiosis gastrointestinal canina. A partir del año 2006 hasta Julio del 2007 se continúo realizando el estudio macroscópico de las lesiones de aspecto tumoral ubicadas en estómago e intestino que ingresan al servicio De estos tejidos fijados en formol al 10% buferado se tomaron fragmentos de aproximadamente 1cm3 y se incluyeron en el procesador automático de tejidos (CITADELR 2000), posteriormente se confeccionaron los bloques de parafina y se realizaron los cortes a 5 µ de espesor mediante el uso del micrótomo. Los cortes microscópicos se colocaron en láminas portaobjetos, se desparafinaron en la estufa y se procedió a realizar la coloración con Hematoxilina & Eosina (Thomas, 1995) y con Methenamine de Plata de Grocott. Para el estudio histopatológico, cada corte de tejido se observó en toda su extensión con objetivos de 4X, 10X , 20X y 40X en un microscopio óptico marca Olympus (BX 40) y para realizar el diagnóstico compatible con pythiosis de intestino y/o estómago de los caninos evaluados, se tomó como parámetro la lesión granulomatosa

multifocal extensiva con hifas positivas a la coloración de

methenamine de plata de Grocott. Para obtener el diámetro de las hifas evaluadas

30

bajo aumento de 100 X se utilizó un objetivo micrométrico donde cada unidad es equivalente a 1,5 µm.

C.2. Descripción estructural y ultraestructural de lesiones gastrointestinales de pythiosis canina a través de Microscopia Electrónica de Barrido y de Transmisión.

Las muestras de tejido intestinal positivas a pythiosis por histopatología y cultivo microbiológico fueron procesadas para microscopia electrónica de barrido y de transmisión en el Laboratorio de Microscopia Electrónica de Barrido de la Facultad de Ciencias de la Salud del Centro de Investigación y Análisis Docente Asistencial del Núcleo Aragua (CIADANA) de la Universidad de Carabobo, según técnica descrita por Glauert, (1975) modificada y estandarizada en dicho laboratorio bajo el siguiente procedimiento:

C.2.1. Microscopia Electrónica de Barrido (MEB): 1. Corte del material: El tejido fijado en 2% glutaraldehido – 4% de formaldehído en buffer fosfato, fue cortado en secciones finas de aproximadamente 4x1x1 mm con hojilla de bisturí bajo lupa estereoscópica, posteriormente fue lavado con solución búfer fosfato por 3 veces durante 15 minutos cada uno y luego fue dejado por 10 minutos en agua destilada, este último procedimiento se realizó con la finalidad de eliminar los cristales de fosfato residuales de la solución de búfer fosfato. 2. Fijación secundaria: las secciones de tejido fueron fijadas con solución de tetraóxido de osmio en solución amortiguadora de búfer fosfato a pH 7,4 durante un periodo de 2 horas. Luego fueron lavadas con búfer fosfato 3 31

veces por 15 minutos cada una y finalmente con agua destilada por 10 minutos. 3. Deshidratación: Esta etapa del procedimiento es altamente crítica, pues se debe extraer de la célula y tejido toda el agua contenida en sus compartimientos respetando las características de la misma. Para ello se utilizaron concentraciones crecientes de etanol (70%,85%,95%,100%) durante 15 minutos en dos sesiones para cada alcohol. Seguido por solución fría de etanol : amil acetato en diluciones 3:1; 1:1 y 1:3 durante 15 minutos cada una para luego colocar las muestras en amil acetato a 4 ºC por 15 minutos. 4. Desecación de punto crítico: Los especímenes fueron llevados al desecador y colocados en cestas metálicas, recubiertos internamente con papel de filtro y colocados en la cámara de desecador del punto crítico. A través del desecado por el método de punto crítico con CO2, utilizando un desecador de punto crítico Hitachi HCP-2 (Nissei Sangyo Co, Ltd, Tokio, Japón), donde el dióxido de carbono líquido de la cámara baña el tejido, luego por presión el líquido pasa a gas para que a la temperatura de sublimación del CO2 finalmente sea extraída toda el agua del tejido. 5. Montaje de la muestra: En los porta espécimen de aluminio se colocó plata coloidal en forma de una pasta sobre la cual descansaría la muestra, que fue llevada a la estufa a 42 ºC por 5 minutos con la finalidad de que la plata también evaporara su componente liquido, ya que se encuentra en solución coloidal. 6. Cubrimiento metálico: Las muestras en este paso fueron cubiertas por una fina capa de 100 °A de Platino-Paladio bajo un cobertor iónico IB3 (Eiko, Co; Ltd, Tokio, Japon).

32

Una vez finalizado el cubrimiento metálico las muestras fueron observadas y fotografiadas en toda su extensión utilizando un microscopio electrónico de barrido Hitachi S2300 (Nissei Sangyo Co, Ltd, Tokio, Japon) operando a 10-20kV.

C.2.2. Microscopia Electrónica de Transmisión (MET):

Las muestras de tejido a utilizar para MET, deben estar completamente deshidratadas debido a que la mayoría de los medios de inclusión son insolubles en agua entre ellos la araldita. Los especímenes deshidratados y desecados mediante el método anteriormente descrito para MEB, fueron repicados, e incluidos en araldita siguiendo las técnicas convencionales, hasta obtener cortes en forma de cono de 1 mm con la finalidad de llevar los cortes a ser teñidos con uranilo y citrato de plomo, paso esencial en Microscopia Electrónica (ME) para la obtención de secciones ultrafinas de tejido.

Método de inclusión en Araldita: La mezcla de araldita está compuesta por Araldita M, Endurecedor 96 B (anhídrido

dodecinil

succínico

D.D.S.A),

Aclarador

964

C

(2,4,5-

tridimetilaminometilzenol DMP-30) y el plastizante (Dibutil talato). La mezcla de araldita se preparó calentando los componentes previamente a 60 ºC para disminuir su viscosidad. La Araldita M y el Endurecedor se mezclan en partes iguales (10 ml de cada uno) durante media hora con agitador de vidrio, luego se agregó 10% (1 ml) del Plastizante Dibutil talato y finalmente 5% del acelerador (0,5 ml).

33

Para la confección de los bloques de tejido en araldita los especimenes se colocaron en el extremo con forma de cono de los moldes plásticos para inclusión, los cuales fueron llenados evitando la introducción de burbujas de aire y posteriormente se realizó la polimerización de los bloques de araldita en una estufa a 60 ºC durante 48 horas continuas. Con la finalidad de llevar a cabo la evaluación ultraestructural de las muestras, en el Microscopio Electrónico de transmisión Hitachi H-500 del INIA-Maracay, se realizaron los cortes seriados de 1µ, los cuales se tiñeron con azul de toluidina al 0,5% y se analizaron al microcopio de luz a alta resolución con la finalidad de evidenciar el nivel en el cual se realizarían los cortes finos evaluándose a su vez las características estructurales del tejido. Finalmente en base a estas observaciones se procedió a realizar los cortes finos de 250 A° - 300 A° para la evaluación ultraestructural en el microscopio electrónico de transmisión.

C.3. Determinación de los factores de riesgo y tasa de infección de pythiosis gastrointestinal canina.

Recolección de datos: Para la determinación de los factores de riesgo se procedió a realizar revisión manual de los archivos que reposan el Servicio Diagnostico Anatomopatológico de DCV-UCLA desde el periodo Enero 2001 hasta Julio 2007, a partir del total de protocolos de biopsias y necropsias de caninos, y los datos obtenidos fueron recopilados en una guía de observación donde se tomó en cuenta: el número de protocolo, los datos del animal en relación a edad, sexo y raza, la época del año en que fue recibido el caso, las lesiones macroscópicas y

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microscópicas, así como, el resultado de la coloración especial methenamine de plata (Tabla N°1).

TABLA ° 1.- GUÍA DE OBSERVACIÓ °

EDAD

SEXO

RAZA

ÉPOCA DEL AÑO

Elaboración propia.

LESIO

LESIO

MET

MACROSCOPICA

MICROSCOPICA

(*)

* Methenamine de plata

D. Análisis de los datos.

El análisis de los datos se realizó utilizando estadística descriptiva, a través de distribución de frecuencias y correlación de Pearson, usando el paquete estadístico SPSS 10.0 para Windows. Para establecer asociación entre la enfermedad y los factores sexo y raza se aplicó el Odds Ratio (OR) o razón de desigualdades, la cual, expresa la probabilidad que la pythiosis gastrointestinal se presente o que no se presente en machos vs hembras, así como en individuos fenotípicamente de razas puras vs mestizas o de talla grande vs

talla pequeña. De esta forma revelar el exceso de riesgo en la

pythiosis gastrointestinal canina en relación a dichas variables y el comportamiento de esta enfermedad en la población bajo estudio con la finalidad de obtener un resultado con basamento científico y matemático que represente un dato epidemiológico importante de considerar en el momento del diagnóstico de la enfermedad. 35

El OR se obtuvo según Leon (2004) de la siguiente manera:

Variable X

Enfermos

o enfermos

a

b

c

d

c/d

(hembras/puros/raza grande)

Variable Y

OR = a/b

(machos/mestizos/raza pequeña)

Por otra parte, con la finalidad de obtener la probabilidad matemática de ocurrencia de pythiosis gastrointestinal canina en la población de estudio durante un tiempo definido se procedió al cálculo de la Tasa de infección, considerando a los caninos procesados en el Servicio de Diagnóstico durante el mes de Enero del año 2001 hasta el mes de Julio del año 2007 como el total de animales en estudio y aquellos con diagnóstico compatible de pythiosis gastrointestinal como el número total de animales enfermos. Par tal fin se aplicó la siguiente fórmula:

Tasa de Infección = Total de animales enfermos_ x 100 Total de animales en estudio

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CAPITULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓ

A. Características Macroscópicas de las lesiones gastrointestinales en Pythiosis canina. Al realizar el estudio macroscópico en los pacientes con afección gástrica el órgano se encontró disminuido o aumentado de tamaño, la pared engrosada, de consistencia dura y aspecto escirroso, al corte se observó la presencia de lesiones redondeadas de coloración blanquecina menos densas, de escaso diámetro, que corresponde con múltiples granulomas, la mucosa se mostró aplanada con hemorragias petequiales, pérdida de pliegues gástricos y luz del órgano disminuida (Foto N° 1).

Foto N° 1.- Estómago de canino. Pythiosis Gástrica

37

Las lesiones observadas en este estudio concuerdan con varios autores en sus hallazgos macroscópicos de la pythiosis gastrointestinal canina. Helman y Oliver (1999) y Pavletic et al. (1982), describen aumento de volumen localizado en la pared gástrica o intestinal, la cual, se torna firme y muestra numerosos focos de color amarillento a marrón. La mucosa se observa ulcerada y las lesiones se extienden a la superficie de serosa e implican mesenterio y omento. Asimismo, estas observaciones coinciden con Mendoza (1998), quien refiere que las lesiones macroscópicas de la pythiosis gastrointestinal en caninos se caracterizan por la formación de una masa granulomatosa gastrointestinal dura, engrosamiento de la pared y ulceración de la mucosa, las lesiones pueden extenderse a tejidos adyacentes como el páncreas, nódulos linfáticos mesentéricos y útero. En otro de los casos se pudo evidenciar, además del severo engrosamiento de la pared, amplias zonas de necrosis de la mucosa con exudado purulento, pliegues gástricos aplanados y úlceras perforadas responsables de peritonitis fibrinopurulenta (Foto N° 2 y 3).

Foto 3-. Estómago, superficie serosa con Ulcera perforada (flechas). Pythiosis Gástrica.

Foto N° 2. Estómago, superficie de la mucosa. Ganglios mesentéricos (flecha). Pythiosis Gástrica

38

Las lesiones de Pythiosis intestinal se observan comúnmente localizadas en el intestino grueso, iniciándose en válvula ileocecal extendiéndose cranealmente hasta yeyuno, ocasionalmente duodeno y caudalmente involucrando ciego, colon y recto. Las afecciones se caracterizan por aumento de volumen multinodular con engrosamiento y adherencias de las asas intestinales, mesenterio, vasos mesentéricos y nódulos linfoides mesentéricos, lo que ocasiona en muchos casos infartos intestinales (Foto N° 4, 5, 6). Equivalentes consideraciones fueron realizadas por Graham et al. (2000) quienes observaron en pythiosis gastrointestinal el engrosamiento simultáneo con áreas de obliteración de la pared del estómago, duodeno, yeyuno y colon. Asimismo, Capodacgua (2004) describe una masa periforme, redondeada o tubular, infiltrativa, ubicada de predilección en el intestino delgado y la válvula ileocecal. Por su parte Foil (1996) quien además de referir dureza, aumento y adherencias del mesenterio desde la raíz del yeyuno distal e ileon, observó que la lesión involucra los vasos sanguíneos mesentéricos con engrosamiento de sus paredes y progresiva compresión que resulta en isquemia, infarto y la perforación intestinal Al corte se observa necrosis de la mucosa, engrosamiento de la pared con varios grados de estenosis de la luz lo que trae como consecuencia dilatación de la porción anterior a la estenosis u obstrucción completa al paso del contenido intestinal (Foto N° 4). Los nódulos linfoides mesentéricos se muestran aumentados de tamaño, duros al corte, de color blanquecino y con pérdida de la arquitectura (Foto N° 4). Ocasionalmente se pudo observar casos acompañados de intususcepción de asas intestinales (Foto N° 7).

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Foto 4.- Pythiosis intestinal. Engrosamiento de la pared y estenosis.

Foto 6.- Infarto intestinal (flecha). Pythiosis Intestinal

Foto 5.- Pythiosis intestinal. Adherencias entre asas intestinales.

Foto N° 7. Intususcepción. Pythiosis intestinal (flecha).

Foil et al. (1984), describen que la extensión de las lesiones intestinales pueden comprometer de 5 a 25 centímetros de longitud del intestino con engrosamiento difuso e irregular de la pared. Pavletic et al. (1982), encontraron una pared intestinal conformada por numerosos nódulos de tamaño variado que obliteran la luz que involucran aproximadamente 40 cms de longitud acompañado por necrosis e infarto en yeyuno con ruptura localizada de la pared. Asimismo, Helman y Oliver

40

(1999) y Pavletic et al. (1982) observaron nódulos linfáticos mesentéricos adyacentes aumentados de tamaño y consistencia firme. Una de las formas consideradas atípicas por no involucrar estómago o intestino se caracterizó por la presencia de un aumento de volumen adherido a la cabeza del páncreas, de consistencia dura, al corte fibrosa y de apariencia hemangiomatosa y contenido constituido por abundante sangre roja oscura, que a la histopatología resultó compatible con Pythiosis (Foto N° 8 y 9) .

B

A Foto N° 8. Pythiosis atípica. Granuloma en cabeza del páncreas (A). Corte sagital (B)

Helman y Oliver (1999) reportan casos poco comunes en la pythiosis canina que involucraba la región faringea, donde señalan la presencia de una masa faringea firme que se extiende hasta el esófago craneal y la presencia de úlceras en la superficie mucosa de la faringe, la laringe y el esófago. Estas lesiones no fueron observadas en este estudio.

41

B. Característicos Microscópicas de las lesiones gastrointestinales en Pythiosis canina.

En el estudio histológico de las lesiones se observó marcado proceso inflamatorio multifocal extensivo que compromete principalmente la serosa, muscular y submucosa, ocasionalmente se extendió hasta la mucosa del estómago o intestino, caracterizado por múltiples zonas de necrosis e infiltrado celular inflamatorio a mononucleares macrófagos, linfocitos y células gigantes, acompañados de abundantes polimorfonucleares con predominio de neutrófilos seguido por eosinófilos, distribuidos de forma difusa o formando pequeños conglomerados y proliferación de abundante tejido conectivo (fibroplasia) que causa atrofia de estructuras parenquimatosas y producen adherencias a tejidos circundantes conformando

una

extensa

lesión

piogranulomatosa

multifocal

extensiva

(Fotomicrografía N° 9, 10, 11 y 12).

Fotomicrografía N° 9. Inflamación piogranulomatosa, células gigantes (flecha). H&E 60X

42

Fotomicrografía N° 10. Pythiosis intestinal canina. Fibrosis. Tricromico 60X

Fotomicrografía Nº 11 y 12. Exudado celular a macrófagos, linfocitos, plasmocitos, células gigantes (flecha) y escasos polimorfonucleares neutrofilos y eosinofilos. Fibroplasia. H&E 60X La mucosa presenta generalmente necrosis superficial, hiperplasia de células caliciformes e infiltrado inflamatorio a linfocitos y plasmocitos que tienden a formar conglomerados hacia la membrana basal (Fotomicrografía N° 13 y 14). También se pudo observar erosión, ulceración de la mucosa y hemorragia, por debajo de la cual se evidencia la marcada reacción granulomatosa (Fotomicrografía Nº 15). En algunas ocasiones la reacción inflamatoria característica generalmente confinada a la serosa, muscular y submucosa se extendía a la mucosa (Fotomicrografía Nº 16).

Fotomicrografía N° 13. Mucosa gástrica. Infiltrado inflamatorio a mononucleares (flecha). H&E 40X 43

Fotomicrografía N° 14. Mucosa intestinal. Infiltrado inflamatorio a mononucleares (flecha). H&E 40X

Fotomicrografía Nº 15. Mucosa intestinal erosionada y hemorrágica. Reacción inflamatoria granulomatosa en submucosa. H&E. 40X.

44

Fotomicrografía Nº 16. Mucosa intestinal infiltrada por la reacción inflamatoria granulomatosa. H&E. 100X.

Para evidenciar el agente etiológico relacionado al proceso infeccioso se realizó coloración especial de methenamine de plata de Grocott observándose micelios constituidos por numerosas hifas de gran longitud, anchas, aplanadas, de paredes delgadas, dispuestas en forma irregular, pobremente septadas, ramificadas, con aspecto de cinta lo que genera variación en el diámetro en una misma hifa desde 1,5 µm en su porción más delgada hasta 9 µm en su zona más ancha. En cortes transversos presenta centro ópticamente vacío (Fotomicrografía N° 17, 18 y 19). No fueron evidenciadas estructuras morfológicas sugestivas de reproducción sexual como son los esporangios, así como, tampoco se observaron las zoosporas móviles que representan las formas infectantes del Pythium.

45

Fotomicrografía N° 17. Micelio de P. insidiosum. Methenamine de plata. 100X

A

Fotomicrografía N° 18. Hifas de P. insidiosum. Methenamine de plata. 100X

B

C

Fotomicrografía Nº 19. Hifas de P. insidiosum con zonas de diametro entre 1,5 µm (A); 3µm (B) y 9 µm (C). Methenamine de plata. 100X

Iguales características se observaron bajo microscopia óptica de alta resolución en cortes de 1µ con ubicación en forma difusa (Fotomicrografía N° 20 y 21). También se observaron estructuras vasculares con cambios degenerativos, inflamatorios y trombosis (Fotomicrografía N° 22 y 23). En cortes coloreados con methenamine de plata de Grocott se evidenciaron numerosas hifas tanto en la pared de los vasos sanguíneos como inmersas en el trombo (Fotomicrografía N° 24 y 25).

46

Fotomicrografía N° 20. Hifas de P. insidiosum. Corte de 1 µ. 1621

Fotomicrografía N° 21. Hifas de P. insidiosum. Corte de 1 µ. 4900

Fotomicrografía N° 22. Pythiosis Fotomicrografía N° 23. Pythiosis gastrointestinal canina. Arteritis. H&E 60X. gastrointestinal canina. Hifas de P. insidiosum en la pared y luz vascular (flecha). Methenamine de plata de Grocott 60X.

47

a

Fotomicrografía N° 24. Pythiosis gastrointestinal canina. Trombosis. H&E 60X (a).

a

Fotomicrografía N° 25. Pythiosis gastrointestinal canina. Trombosis. Hifas de P. insidiosum el trombo (a). Methenamine de plata de Grocott 60X.

La características histopatológicas descritas en este estudio han sido reportadas por diversos investigadores como la lesión típica observada en la pythiosis canina, tal es el caso de Pavletic et al. (1982) Smith et al. (1989) y Santuario et al. (2006) quienes observaron granulomas multifocales que coalecen con áreas centrales de necrosis caseosa, inflamación granulomatosa o piogranulomatosa en la submucosa y muscular, presencia de eosinófilos, neutrófilos y células gigantes asociados con células epitelioides y presencia de hifas. Igualmente, Mendoza (1998) evidenció una lesión granulomatosa focal que se encuentra ubicada hacia la submucosa y muscular, con la presencia de neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, plasmocitos, células gigantes y epitelioides. Así mismo, la lesión de la mucosa gastrointestinal reportada en este estudio concuerda con Mendoza (1998) quien observó que histopatológicamente la mucosa presenta ulceración, atrofia e hiperplasia de las células epiteliales. En relación a la morfología del patógeno, las observaciones realizadas en este estudio son semejantes a los reportes realizados por Plaats-Niterink (1981) quien señala que en conjunto numerosos filamentos o hifas constituyen el micelio, compuesto por hifas hialinas. De igual forma, es comparable con lo reportado por Quisqueya-Pérez (2006) quien describe que los oomicetos con reproducción asexual, 48

como el Pythium emiten un tubo germinativo que crece continuamente hasta formar las hifas que se entrecruzan formando un tramado o micelio a partir del cual se forman hifas diferenciadas. Por otra parte, fueron observadas hifas pobremente septadas tal como fueron reportadas por Pavletic et al. (1982) y contrario a lo propuesto por Bosco et al. (2005) quienes afirmaron observar con Methenamine de plata de Gomori hifas no septadas. Sin embargo, Quisqueya-Pérez (2006) reporta que a pesar de observar hifas no septadas también concluyo que pueden aparecer micelios de hifas maduras septadas sobre todo en regiones huecas. El diametro en las hifas de P. insidiosum evidenciadas en los diferentes casos evaluados histopatológicamente se encuentra dentro de los valores de referencia para este patógeno reportado por diversos investigadores, entre ellos aquellos que señalan un rango amplio como Pavletic et al. (1982) quienes observaron hifas desde 4 a 15µm y otros como Mendoza (1996) con 2,5 a 8,9 µm, Quisqueya-Pérez (2006) de 5 a 7µm y Pérez et al. (2005) 4 a 6 µm de diámetro. Es importante tener en consideración que la variación en el diámetro de las hifas probablemente esté relacionado con las condiciones del medio ambiente en el cual las hifas se estén desarrollando y la disponibilidad de nutrientes en el tejido infectado, siendo aquellas hifas de mayor diámetro las que se encuentre en medios que favorezcan su metabolismo y nutrición.

La presencia de hifas en la luz de estructuras vasculares causando a su vez lesión de las mismas ha sido reportada ampliamente en la pythiosis vascular en humanos donde ocasiona trombosis con isquemia progresiva y gangrena. La pared vascular presenta arteritis, variable fibrosis y trombosis con organismos hifales en la pared y en el trombo, llegando a producir enfermedad fatal (Imwidthya y Srimuang (1989). De igual forma, Smith et al. (1989) observó necrosis y trombosis de vasos 49

sanguíneos y numerosas hifas alargas, bifurcadas, no septadas vista con Mathenamine de Gomori. Hetmam y Oliver (1999) describieron inflamación granulomatosa o piogranulomatosa de las arterias de la pared gástrica en un canino con pythiosis. Contrario a lo mencionado, Pavletic et al (1983) no observó trombosis, sin embargo, en uno de sus casos reportó lesión degenerativa de la túnica media de una arteria muscular. Por otra parte, en este estudio no fueron evidenciadas las formas infectantes del P. insidiosum lo que apoya lo propuesto por Thomas y Lewis (1998) al considerar bajo el potencial zoonótico de la pythiosis, debido a que aún no ha sido reportada transmisión directa de animal a humano, de humano a animal y de animal a animal, en el caso de los caninos con pythiosis subcutánea que acostumbran a lamerse o morderse las lesiones no se ha observado como consecuencia una pythiosis gastrointestinal debido a que la forma infectante de este microorganismo son las zoospora móviles y en los tejidos afortunadamente no han sido observadas dichas formas evolutivas.

50

C. Descripción estructural y ultraestructural del Pythium insidiosum y las lesiones que produce a través de Microscopia Electrónica de Barrido (MEB) y de Transmisión (MET). En los diferentes cortes observados bajo el microscopio electrónico de barrido y de transmisión se pudo evidenciar tejido necrótico amorfo donde se encuentran inmersas numerosas hifas morfológicamente caracterizadas por tubulares, largas, onduladas, así como, aplanadas, con zonas electrón densas de variada intensidad, poseen un diámetro promedio entre 3 a 5 µm y ramificadas en ángulo de 90° (Fotomicrografía N° 26 a la 31).

Fotomicrografía Nº 26. Hifa de P. Insidiosum larga, ondulada y pared aplanada (flecha). 800 X. MEB.

51

Fotomicrografía Nº 27. Hifas de P. insidiosum. Ramificadas, onduladas y tubulares (flecha). 1000 X. MEB.

Fotomicrografía Nº 28. Hifa de P. Insidiosum ramificada en ángulo de 90º. 800 X (flecha). MEB.

52

Fotomicrografía Nº 29. Hifa de P. Insidiosum alargada, tortuosa y aplanada. 10570 X. MET.

Fotomicrografía Nº 30. Hifas de P. Insidiosum en uno de sus extremos corte transverso (flecha). 14000 X. MET.

53

a

b

Fotomicrografía Nº 31. Hifa de P. Insidiosum, botón de ramificación (flecha a), corte transverso (flecha b). Superficie granular. 35000X. MET

Reporte similar fue realizado por Miller et al. (1985), quienes describieron parte de la morfología de las hifas de P. insidiosum a través de microscopia electrónica de transmisión donde observaron numerosas hifas de pared densa y de apariencia laminar. Estudios análogos con el uso de microscopia de alta resolución a partir de cultivos o en tejidos teñidos con coloraciones argénticas se han reportado los micelios constituidos por numerosas e irregulares hifas ocasionalmente septadas, ramificadas, de pared lisa, de 4 a 8 µm de diámetro (Santurio et al. 1998), hifas prominentes, onduladas, de 4 a 6 µm, con ramificaciones laterales y septums transversos. Así como hifas ramificadas y ocasionalmente septadas de 4 a 15 micras de diámetro (Pavletic et al. 1982). De igual forma, fueron observadas las botones de ramificación o botones terminales por Grooters (2003) quien los reportó en estadios tempranos de la zoosporogenesis como filamentos no diferenciados de la hifa vegetativa que se 54

prolongan lateralmente formando el tubo germinativo que posteriormente dará origen a la formación de una vesícula terminal llamada esporangio.

En otro de los cortes ultrafinos observados por MET se pudo apreciar la pared de las hifas en su superficie externa rodeada por un material granular en forma de incrustaciones, electrón denso, sugestivo de complejos antígeno anticuerpo o material proteico derivado de la desgranulación de neutrófilos (Fotomicrografía N° 32).

Fotomicrografía Nº 32. Hifa de P. Insidiosum, ramificada. Presencia de material granular electrón denso en la superficie. 43000 X. MET

Estas observaciones coinciden con las realizadas por Miller et al. (1985), quienes en lesiones cutáneas de vacas y a través de microscopia electrónica de transmisión revelaron numerosas hifas revestidas externamente por incrustaciones granulares, electrón denso, semejantes al fenómeno de Splendore Hoeppli asociado a infecciones fúngicas constituido por complejos antígeno-anticuerpo y detritus 55

celulares íntimamente rodeando las hifas. Por otra parte, Santurio et al. (1998) también observaron hifas circunscritas por una banda de 0,5 a 3 µm de un material granular con mínimas formaciones incrustadas en algunas zonas. Este reporte representa la primera observación en caninos de dichas incrustaciones electrón denso sugestivo del fenómeno de Splendore Hoeppli, apoyado en las observaciones microscópicas y ultraestructurales descritas en este estudio donde las hifas se evidenciaron inmersas en un material necrótico rodeadas por células inflamatorias. Igualmente, en uno de los cortes histológicos observados con MET se evidenciaron hifas conservadas y relacionadas íntimamente con células inflamatorias a polimorfonucleres neutrófilos (Fotomicrografía N° 33) y bajo MEB éstas células inflamatorias emiten prolongaciones tratando de ingerir los segmentos hifales (Fotomicrografía N° 34).

a n n

n

n

Fotomicrografía Nº 33. Hifa de P. Insidiosum conservadas (flecha a), relacionada con un polimorfonucler (n). 223500X. MET. 56

n

Fotomicrografía Nº 34. Hifa de P. Insidiosum conservadas, ramificada en Angulo de 90º (flecha) relacionada con una célula fagocítica (n). 2000 X. MEB.

De igual forma,

Miller et al (1985) con MET evidenciaron en lesiones

cutáneas de vacas con pythiosis numerosos neutrófilos cerca de las hifas intentando fagocitarlas. Además algunas hifas fueron vistas aparentemente viables dentro de células gigantes (Santurio et al. 1998). El exudado celular inflamatorio que predominantemente rodea íntimamente las hifas de P. insidiosum en éste estudio de lesiones gastrointestinales en caninos con pythiosis se caracterizó por estar constituido por polimorfonucleares neutrófilos y en menor proporción eosinófilos, macrófagos y linfocitos. Semejante a lo que ha sido reportado en bovinos (Pérez et al. 2005). Y a diferencia de lo reportado en equinos donde predominan los eosinófilos, los cuales entre otros factores dan origen a los llamados kunkers vistos hasta ahora solo en equinos y que tienen su origen en el acúmulo focal de eosinófilos alrededor de las hifas (Miller y Campbell, 1984).

57

Así mismo, se pudo observar bajo MEB estructuras vasculares con formación trombótica a partir de la cual sobresalen elementos hifales que se ubican entre ésta y la pared vascular (Fotomicrografía N° 35 y 36).

v

t

Fotomicrografía Nº 35. Trombosis en pythiosis canina. Pared vascular (v) y trombo (t). 200 X. MEB.

v

Fotomicrografía Nº 36. Trombosis con hifas ramificadas en 90º (flecha), ubicadas en la pared vascular (v) y coágulo sanguíneo. 800 X. MEB. 58

Las lesiones vasculares no han sido ampliamente reportadas en la pythiosis gastrointestinal, sin embargo, Herman y Oliver (1999) observaron que la enteritis granulomatosa en la pythiosis canina puede ir acompañada de arteritis y vasculitis necrotizante prominente que contienen hifas gruesas, de aproximadamente 5 a 7 micras en el diámetro, de vez en cuando septadas, irregularmente ramificadas. Por otra parte, se han reportado numerosos casos que cursan con isquemia, necrosis e infarto del segmento intestinal afectado por obstrucción vascular, caracterizado microscópicamente por presentar una necrosis difusa y numerosas bacterias saprófiticas, vasos sanguíneos congestivos, numerosos neutrófilos y eosinófilos, así como también, hifas ramificadas y tabicadas (Pavletic et al. 1982). De igual forma, una de las principales lesiones de pythiosis en humanos ha sido la trombosis, la oclusión arterial progresiva y crónica que incluso termina en el desarrollo de aneurisma con la consecuente hemorragia arterial fatal o en gangrena (Thitithanyanont et al. 1998).

59

D. Factores de Riesgo de Pythiosis Gastrointestinal Canina.

A continuación se muestra la distribución de frecuencia de las variables en estudio a partir de las cuales se obtuvo los factores de riesgo de pythiosis gastrointestinal que presentan los caninos ingresados al Servicio de Diagnóstico Anatomopatológico del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza” del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” durante el periodo comprendido entre Enero de 2001 a Junio de 2007 (Tabla 2).

Tabla ° 2. Distribución de Frecuencias de las Variables Sexo, Raza y Talla. Servicio Diagnóstico Anatomopatológico. DCV. 2001-Junio 2007.

Pythiosis Compatible

Total Año

caninos

2001 2002

141 213

78 105

63 83 108 145

58 68

5 3

0 0

3 3

2 0

136 210

2003

146

64

82

101

45

5

0

4

1

141

2004

226

116

110 152

74

6

1

5

2

219

2005

275

160

115 174

101

9

1

8

2

265

2006

373

189

184 270

103

9

1

8

2

363

2007

219

98

121 130

89

6

0

6

0

213

Total 1593

810

783 1055

538

43

3

37

9

1493

G: gástrica. I: Intestinal

♀

Pythiosis

♂

Puros Mestizos

M – G: Mediana a Grande

60

I

-

G

Talla M-G

Talla Pequeña

negativos

La frecuencia de presentación de la Pythiosis gastrointestinal canina en el servicio Diagnóstico de Anatomía Patológica del DCV-UCLA, durante el periodo Enero 2001-Julio 2007, fue de 6,5% (3 casos) para la Pythiosis gástrica y una mayor presentación de la enfermedad con un 93,5% (43 casos) en su forma de Pythiosis intestinal (gráfico 1)

Gráfico 1. Forma de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

93.5

Porcentaje (%)

100 80 60 40

6.5

20 0 Gástrica

Intestinal

Forma de presentación

1.1 Edad. En relación a la edad, los animales en estudio mostraron una correlación de Pearson negativa, pues a menor edad de los caninos se observó una mayor frecuencia de presentación de pythiosis gastrointestinal canina, con tendencia a mostrar mayor frecuencia en los caninos adultos jóvenes principalmente aquellos de 2 y 1 año de edad (34,8% y 21,7%), seguidos por los caninos de 3 y 4 años (17,4% y 15,2%), y en 61

menor proporción los mayores de 5 años de edad (5 años 6,5%; 7 y 8 años 2,2%). (gráfico 2).

Gráfico 2. Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según la Edad. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

34.8

35

Porcentaje (%)

30 25

21.7

20

17.4 15.2

15 10

6.5 2.2

5

2.2

0 1

2

3

4

5

7

8

Edad (Años)

Los resultados obtenidos coinciden con lo reportado por Dykstra et al (1999) quienes en la descripción de 15 casos de pythiosis subcutánea reportaron mayor predisposición a la enfermedad en animales jóvenes con edad media de 2 años. De igual forma la inclinación del P.insidiosum en afectar caninos jóvenes ha sido demostrada por autores, tales como, Capodaqgua (2004) que concluye a partir de estudios realizados en caninos de Venezuela que la edad de mayor incidencia de esta enfermedad está comprendida entre 1 y 4 años. Rivierre et al. (2005) quienes han reportado la pythiosis gastrointestinal en caninos jóvenes del África. Y Miller (1985),

62

el cual, en un estudio de 60 casos señaló que la pythiosis gastrointestinal afecta comúnmente a animales jóvenes con edad promedio de 3 años. Asimismo, Foil

(1984) en 5 casos observó que todos los animales eran

adultos jóvenes con edades comprendidas entre 1 a 3 años. Y Bursanti et al. (1975) encontraron en 8 casos evaluados que la enfermedad afecta a caninos de diversas edades pero muestra predilección por aquellos de 3 años de edad. Sin embargo, la pythiosis gastrointestinal también ha sido reportada en cachorros de 12 semanas de edad (Liljebjelke et al. 2002) y once y medio meses de vida, siendo este último el primer reporte realizado en Venezuela (Mendoza et al. 2005). Estos hallazgos permiten postular que el P. insidiosun, es un patógeno que además de necesitar ciertas condiciones climatológicas y nutricionales para sobrevivir, tales como, ambientes húmedos, altas temperaturas y sustratos ricos en proteína, requiere de individuos con un sistema inmune poco desarrollado o comprometido para poder invadir los tejidos y causar enfermedad, es por ello que entre los caninos con mayor susceptibilidad están los individuos jóvenes.

1.2 Sexo. Durante

el

período

en

estudio

los

caninos

referidos

al

servicio

anatomopatológico de DCV-UCLA no mostraron una diferencia marcada en cuanto a la frecuencia de presentación entre machos (54,3%) y hebras (45,7%) (gráfico 3), con un OR de 1,1 (tabla 3) lo que indica que el sexo no es una condición predisponente para la pythiosis gastrointestinal canina. De igual forma, al aplicar la correlación de Pearson la variable sexo no está correlacionada (P>0,05) con ninguna de las demás variables en estudio.

63

Gráfico 3. Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según el Sexo. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

Tabla 3. Odds Ratio (OR) según el sexo de los caninos en estudio. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007 Variable

Pythiosis

Pythiosis

Sexo

Compatible

negativo

Machos

25 a

785 b

810

c

d

783

OR = a/b = 1,1

1593

c/d

Hembras

21

Total

46

762

1547

Total

OR

Estos resultados son similares a los encontrados por Mendoza et al (1996) y Dykstra et al., (1999) quienes concluyeron que el P. insidiosum no tiene predilección

64

por el sexo. Y Bursanti et al. (1975) luego de evaluar 8 casos de pythiosis gastrointestinal canina observó indistinta presentación en machos y hembras. Sin embargo, este estudio no concuerda con lo plantedo por algunos trabajos donde se expone que la pythiosis canina muestra predilección por el sexo, entre ellos se encuentra el reporte de Pavlectic et al. (1983) quienes han encontrado mayor presentación de la enfermedad en caninos machos. De igual forma, resulta lo expuesto por Miller (1985) quien señala que los pacientes machos son las más afectadas. Así como, los casos publicados posteriormente por Thomas y Lewis (1998) donde se reportó que los machos están más predispuestos a sufrir esta enfermedad. Creando controversia con Toma y Preston (1990) quienes en su estudio observaron predominio de la enfermedad en las hembras.

1.3. Raza. Con respecto al comportamiento de la enfermedad según la raza, se pudo observar una mayor frecuencia de presentación en los caninos de razas fenotípicamente puras (73,9%) que en los caninos mestizos (26,1%) (gráfico 4), y un OR de 1,5 (tabla 4) lo que significa que esta enfermedad tiene 1,5 veces más probabilidades de afectar animales fenotípicamente puros que aquellos animales mestizos, existiendo entonces predisposición por esta condición racial. Conjuntamente se apreció que existe una gran variedad de razas fenotipicamente puras afectadas por la enfermedad, entre ellas el PittBull (13%) seguida por el Pastor Alemán (8,7%) (gráfico 5). Al mismo tiempo se demostró en la correlación de Pearson que la raza no mostró correlación significativa (P>0,05) con ninguna otra variable en estudio.

65

Gráfico 4. Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según la Raza en Caninos Fenotípicamente Puros y Mestizos. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001- Junio 2007

Tabla 4. Odds Ratio (OR) según la Raza en caninos Fenotípicamente Puros y Mestizos. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

Variable

Pythiosis

Pythiosis

Raza/Fenotipo Compatible egativo Puros Mestizos Total

34

a

12

c

46

Total

OR

1021

b

1055

526

d

538

OR = a/b = 1,5

1593

c/d

1547

66

Gráfico 5. Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según la variedad de Fenotipos Raciales. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

En relación con la presentación de la enfermedad en animales fenotipicamente puros o mestizos Foil et al., (1984) concluyen que están más predispuestos los animales puros que los mestizos, entre ellos el Pastor Alemán quien a demostrado ser la raza más predispuesta a sufrir de Pythiosis cutánea. Siendo en este estudio dicha raza la segunda en presentar pythiosis gastrointestinal.

67

Sin embargo, Pavlectic et al. (1983) a pesar de que encontró mayor predisposición a enfermar en aquellos caninos de talla mediana a grande evidenció que los más afectados no eran los de razas puras sino los mestizos. En el mismo orden de idea, Miller (1985) encontraron que los caninos con mayor incidencia eran aquellos de razas de trabajo en el medio acuático. Esto seguramente es debido a su modalidad de vida, en la cual, tienen mayor contacto directo con el ambiente donde habitan las forma infectantes del P. insidiosum reconocido ampliamente como patógeno acuático.

Por otra parte, en este estudio se observó que los animales de raza de talla grande-mediana presentaron mayor número de casos (80,4%) que la raza de talla pequeña (19,4%) (gráfico 6) y un OR de 2,6 (tabla 5) por lo que se concluye que los animales de razas de talla grande-mediana tienen 2,6 veces más probabilidades de enfermar de pythiosis gastrointestinal que aquellos de raza pequeña.

Gráfico 6. Frecuencia de Presentación de Pythiosis Gastrointestinal Canina según Raza/Talla. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

68

Tabla 5. Odds Ratio (OR) de Condición Racial según la Talla de los caninos en estudio. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

Variable

Pythiosis

Raza/Talla Compatible

Pythiosis negativo

Total

OR

MedianasGrandes

37

Pequeñas

9

Total

a

c

46

960

b

997

587

d

596

OR = a/b = 2,6

1593

c/d

1547

En concordancia con este estudio, varios investigadores entre ellos Bursanti et al. (1975), Foil et al. (1984), Miller (1985), Thomas y Lewis (1998) y Mendoza et al. (1996) hacen referencia a que la mayoría de los casos positivos a pythiosis gastrointestinal se observan en animales de razas de talla grande. Adicionalmente, Dykstra et al. (1999) también observó la enfermedad en caninos de raza de talla grande mayores a 20 kg de peso corporal. Si bien es cierto que en este estudio los más afectados son los caninos de talla grande también se encontró la enfermedad en animales de raza pequeña, coincidiendo con Foil (2001) quien reporta que la pythiosis también afecta a caninos de talla pequeña de procedencia urbana. Tal como ocurrió en un canino Terrier de talla mediana (Mendoza et al. 2005). En estos casos no se reportan antecedentes conocidos de acceso a aguas estancadas lo que en busca de una explicación razonable ha generado la posibilidad de que el P. insidiosum prolifere en depósitos temporales de agua e incluso en el césped húmedo como el medio donde los caninos entren en contacto con dicho patógeno.

69

1.4. Época del año. Durante los últimos 10 años, los meses con mayor precipitación, según datos anexos suministrados por el ministerio del ambiente (tabla 6), corresponden con el inicio de las lluvias en el mes de Abril y se mantuvo por los meses de Mayo, Junio y Julio, disminuyendo en los meses de Agosto, Septiembre, Octubre, Noviembre y Diciembre, para entrar en un periodo de mínima precipitación en los meses de Enero, Febrero y Marzo. Al relacionar la presentación promedio mensual de los casos de Pythiosis que fueron referidos al servicio diagnóstico durante el periodo en estudio se pudo observar que se concentraron principalmente durante los meses de Febrero (15,2 casos), Marzo (21,7 casos), Abril (13 casos) y Mayo (13 casos), disminuyendo su presentación para los meses restantes (gráfico 7). Al contrastar los datos de precipitación con la frecuencia promedio de presentación de la Pythiosis canina se evidenció que el mayor número de casos se presentaron en los meses de menor precipitación donde finaliza el periodo seco y durante el inicio del periodo de mayor precipitación superponiéndose a la iniciación del periodo lluvioso (gráfico 8).

Gráfico 7. Promedio de Frecuencia de Presentación de Pythiosis Canina según los meses del año. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007

70

.

Gráfico 8. Relación entre la frecuencia de presentación de Pythiosis Canina y la Precipitación Pluvial (mm3). Barquisimeto. Enero 2001 – Junio 2007

.

12

No.Casos casos

Precip mm3

200

prec.mm3

10 150 8 6

100

4 50 2 0

0

Ene

Feb

Mar

Abr

May

Jun

Jul

Agt

Sept

Oct

Nov

Dic

Meses

La

pythiosis

es

una

enfermedad

infectocontagiosa

geográfica

y

climatológicamente limitada, es por ello que en las regiones con condiciones climáticas favorables para el desarrollo de Pythium la presentación de la enfermedad no es inusual Pier et al. (2000). Se ha establecido que el P. insidiosum necesita altas temperaturas y aguas estancadas para sobrevivir (Miller y Campbell, 1982). En concordancia con los resultados presentados en este estudio según Foil et al. (1996) la mayoría de los casos de pythiosis se observan durante o después de la estación lluviosa. Sin embargo, la mayoría de los reportes asocian la enfermedad con la época de mayor precipitación, entre ellos se encuentra Leal et al. (2001) quienes reportaron que la mayor presentación de casos de pythiosis fue conseguida durante los meses de precipitación más alta. En el mismo orden de ideas, Rivierre et al. (2005) observaron que la lesión en la pythiosis gastrointestinal y subcutánea es evidente al inicio de la época de lluvia en 71

ciudades de condiciones climáticas subtropicales a áridas, con dos estaciones al año, una fría y seca de Noviembre a Febrero y otra lluviosa de Junio a Septiembre. Sin embargo, Foil (2000) observó que en los países de cuatro estaciones bien definidas muchos de los animales enfermos desarrollan la infección durante el otoño en los meses de Marzo, Abril y Mayo pero eran presentados para valoración médica 5 a 6 meses después, entre los meses de Agosto y Diciembre en pleno invierno. Por su parte, Tabosa et al. (1999) reportaron en su estudio que la mayoría de los 38 casos de pythiosis en equinos observados en Paraíba, Brasil, eran registrados siete a diez meses después del principio de las lluvias. Este hallazgo se pudiera explicar debido a la evolución crónica propia de esta enfermedad, donde la presentación de signos clínicos ha sido reportada entre 7 y 10 meses post infección.

Esto último permite concluir que en este estudio el mayor número de caninos con pythiosis reportada probablemente se infectaron durante la época de lluvia y debido al curso crónico de la enfermedad fue solo meses después que presentaron signos clínicos, aproximadamente 7 a 10 meses, coincidiendo en algunos casos con la finalización del periodo seco e inicio del siguiente periodo lluvioso. Igualmente, se debe considerar la hipótesis de que la infección puede darse a partir de pequeños depósitos de agua mantenidos en el ambiente y disponibles para los caninos debido a fallas en el drenaje, humedad de los jardines, en floreros ornamentales, en fin, en lugares donde gracias a la temperatura ambiental de países tropicales como Venezuela pueda sobrevivir el Pythium. Asimismo, es importante asociar la variabilidad del sistema inmune propio de cada animal que en determinados momentos lo hace más susceptible a enfermedades de este orden.

72

1.5 Tasa de infección. La pythiosis es una enfermedad de distribución mundial observada en países de climas húmedos, tropicales y subtropicales (Chaffin et al. 1995). Basado en ello no es inusual su presentación en países como Venezuela donde anteriormente ha sido reportada (Mendoza et al. 2005; Pérez et al. 2005, Marin et al. 1991). En este estudio se evidencio una tasa de infección promedio de pythiosis gastrointestinal canina de 3 por cada 100 caninos (Tabla Nº 7).

Tabla 6. Tasa de infección de infección de Pythiosis Gastrointestinal Canina. Anatomía Patológica. DCV-UCLA. Enero 2001 – Junio 2007.

Total

Tasa de infección

1593

46 1593

Caninos referidos a

Anatomía Patológica

x

100

=

2,9

Casos pythiosis gastrointestinal canina

46

≈3%

Dicha tasa de infección indica que la pythiosis gastrointestinal canina es una enfermedad de alta ocurrencia en el Servicio Diagnóstico Anatomopatológico del Decanato de Ciencias Veterinarias de la UCLA a pesar de ser considerada una enfermedad de aparición relativamente nueva y de numerosos factores que actúan en detrimento sobre el numerador de este índice epidemiológico, entre ellos, se pueden mencionar el desconocimiento de la enfermedad por parte de un gran número de Médicos Veterinarios aunado a las limitadas herramientas diagnósticas sobre pythiosis existentes en Venezuela lo que trae como consecuencia un número no determinado de diagnósticos clínicos errados no referidos para un diagnóstico anatomopatológico.

73

A pesar de que en Venezuela aún no ha sido reportada en humanos se debe tener en cuenta que solo la presencia de esta enfermedad infectocontagiosa es de suma importancia si se considera que el agente etiológico de la pythiosis canina es común para la pythiosis humana (Mendoza et al. 1987), además la habilidad de P. insidiousm para secretar proteasas (Davis et al. 2006), su preferencia por sustratos proteicos y temperaturas de 37 °C lo han convertido en patógeno no solo de animales sino también del hombre (Mendoza et al. 1996), por lo que representa un riesgo de infección para esta especie y de no tomarse las medidas de control pertinentes la población humana continuará potencialmente expuesta. Sin embargo, es importante recordar que a pesar de ser un patógeno capaz de causar infección en el humano el potencial zoonótico de la pythiosis hasta ahora ha sido considerado bajo (Thomas y Lewis 1998).

74

COCLUSIOES




La pythiosis gastrointestinal se caracteriza macroscópicamente por ser una lesión multinodular, de aspecto tumoral que involucra estómago y/o intestino iniciándose en válvula ileocecal con adherencias entre las asas intestinales, mesenterio, vasos mesentéricos y nódulos linfoides, mucosa erosionada a ulcerada, pared engrosada de consistencia escirrosa con formación de múltiples granulomas y estenosis de la luz.




Histopatológicamente la pythiosis gastrointestinal canina se caracteriza por presentar gastritis y enteritis piogranulomatosa multifocal extensiva que involucra la serosa, muscular, submucosa, nódulos linfoides mesentéricos y ocasionalmente mucosa.




El Pythium insidiosum conforma micelios constituido por hifas

largas,

pobremente tabicadas, ubicadas en forma difusa en el tejido, en la pared vascular y en los trombos, varían en diámetro dependiendo de las condiciones del medio ambiente en el cual las hifas se estén desarrollando y la disponibilidad de nutrientes en el tejido infectado.




Estructural y ultraestructuralmente las hifas de Pythium insidiosum se caracterizan por ser largas, onduladas, de pared aplanadas, de 3 a 5 µm de diámetro, ramificadas en ángulo de 90°, externamente rodeada por un material granular electrón denso en forma de incrustaciones sugestivo del fenómeno de Splendore Hoeppli. Y aquellas observadas íntimamente relacionadas con células inflamatorias se caracterizan por mantener su integridad.




La frecuencia de casos compatibles con pythiosis gastrointestinal canina se ha incrementado al pasar de los años, con mayor ocurrencia de pythiosis intestinal en animales adultos jóvenes con edades comprendidas entre 1 y 2 años sin 75

mostrar predilección por sexo, de igual forma, a pesar de afectar a una gran variedad de razas los caninos de raza fenotípicamente pura y de talla grandemediana tienen más probabilidades de padecer la enfermedad.




La pythiosis gastrointestinal canina a pesar de ser una enfermedad de aparición relativamente nueva presenta una alta tasa de infección en el Servicio Diagnóstico Anatomopatológico del Decanato de Ciencias Veterinarias de la UCLA y el mayor número de caninos se infectaron durante la época de lluvia presentando signos clínicos aproximadamente a los 7 a 10 meses postinfección.

76

RECOMEDACIOES

Tomando en consideración los resultados obtenidos en este estudio se considera conveniente continuar con la línea de investigación sobre Pythiosis abarcando el comportamiento clínico de la enfermedad, nuevas variables epidemiológicas, estandarización de herramientas diagnósticas especificas para las cepas de Pythium insidiosum responsable de causar la enfermedad en el país, su ciclo evolutivo, potencial zoonótico, entre otras, con la finalidad de conseguir respuestas a las incógnitas que aun se encuentran sin responder y aportar soluciones a los problemas que esta enfermedad causa tanto en los animales de compañía como en los animales de producción. De esta manera, difundir la información para que se refuercen las medidas de control pertinentes al caso por parte de la comunidad en general principalmente los profesionales de la Medicina Veterinaria como garantes de la salud animal y salud pública.

77

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84

AEXO

Tabla 6. Datos mensuales y anuales de precipitacion (mm). Estación AÑO 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Md

EE .0 .6 .6 1.7 2.5 2.6 2.9 26.6 3.8 34.2 5.4

FEB 1.7 1.0 92.4 13.5 2.4 1.7 31.1 .0 .2 38.4 39.4

MAR .3 1.4 4.2 26.4 8.1 .8 12.6 60.4 74.9 .0 .9

ABR 79.3 75.0 10.6 161.1 33.8 136.5 172.9 3.7 59.1 111.7 5.6

MAY 45.1 35.0 143.7 131.6 138.7 105.4 137.8 119.2 235.1 137.2 72.4

JU 157.9 77.4 92.9 90.8 189.8 91.9 144.8 188.2 123.7 74.7 206.3

OV 40.5 15.7 118.7 39.6 69.4 62.6 56.8 49.0 66.5 .1 30.1

DIC 119.4 30.8 11.3 32.5 16.4 48.7 70.0 2.4 20.7 .0 7.3

2.6 1.7 .8 136.5 105.4 91.9 186.5 51.5 50.4 50.2 62.6 Barquisimeto- Mincom. Serial: 1206. Zona: 11. Estado: Lara. Latitud: 100355. Longitud: 691620. Altitud: 572 M.S..M

48.7

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JUL 72.2 129.2 91.1 78.9 186.5 117.8 27.9 60.0 254.8

AGO 10.0 45.8 28.5 61.9 51.5 72.0 103.7 112.9 40.5 63.4

SEP 59.1 29.2 104.9 99.8 50.4 31.9 76.8 49.7 43.5 57.6

OCT 69.9 67.5 66.5 37.5 19.2 50.2 114.2 18.2 47.1 60.3 59.1