ORIGINAL

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R e v. Soc. Esp. Dolor 9: 291-300, 2002

Un nuevo modelo de dolor visceral e hiperalgesia referida en el ratón J.M.A. Laird*, L. Martínez-Caro*, E. García-Nicas* y F. Cervero*

L a i rd JMA, Martínez-Caro L, García-Nicas E, Cervero F. A new model of visceral pain and re f e r red hyperal gesia in the mouse. Rev Soc Esp Dolor 2002; 9: 291300.

1.9 + 1 m g . k g -1 s.c.). We conclude that this model re p resents a useful tool both for phenotyping mutant mice and for classical pharmacology since information on visceral pain, re f e r red hyperalgesia and colon inflammation can all obtained from the same animal. © 2001 Elsevier Science B . V. Published by Elsevier Science B.V. All rights re s e r v e d . Key words: Colon. Inflammation. Capsaicin. Mustard oil.

SUMMARY The generation of transgenic mice that lack or overe xp ress genes relevant to pain is becoming increasing common. However, only one visceral pain model, the writhing test, is widely used in mice. Here we describe a novel model, chemical stimulation of the colon, which we have developed in mice. Mice of either sex were injected i.v. with 30 mg.kg-1 Evan’s Blue for subsequent determination of plasma extravasation. For behavioural testing, they were placed on a raised grid and 50 µl of saline, mustard oil (0.25-2.5%) or capsaicin (0.03-0.3%) was administered by inserting a fine cannula into the colon via the anus. Vi s c eral pain-related behaviours (licking abdomen, stre t c h i n g , contractions of abdomen, etc.) were counted for 20 min. B e f o re intracolonic administration, and 20 min after, the f requency of withdrawal responses to the application of von Frey probes to the abdomen was tested. The colon was removed post-mortem and the Evan’s Blue content m e a s u red. Mustard oil and capsaicin administration evoked dose-dependent visceral pain behaviours, re f e r red hyperalgesia (significant increase in responses to von Frey hairs) and colon plasma extravasation. The peak behavioural re sponses were evoked by 0.1% capsaicin and by 1% mustard oil respectively. The nociceptive behavioural re s p o n s e s w e re dose-dependently reversed by morphine (EDS0 =

*Departamento de Fisiología. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares (Madrid) Pain 92 (2001) 335-342 © 2001 Elsevier Science B.V. Published by Elsevier Science B.V. All rights reserved. PII: S0304-3959(01)00275-5 Traducción supervisada por L. M. To r r e s

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RESUMEN La obtención de ratones transgénicos que carecen o exp resan en exceso genes relacionados con el dolor se está haciendo cada vez más frecuente. Ahora bien, en los ratones suele utilizarse un único modelo de dolor visceral, la prueba de re t o rcimiento. Aquí describimos un nuevo modelo, la estimulación química del colon, que hemos desarrollado en el ratón. Ratones de ambos sexos re c i b i e ron una inyección intravenosa de 30mg.kg-1 de Azul de Evans para la posterior determinación de la extravasación plasmática. Para las pruebas de conducta, los ratones se colocaron sob re una rejilla elevada y se les administró 50 µl de suero fisiológico, aceite de mostaza (0,25–2,5%) o capsaicina (0,03–0,3%), introduciendo para ello una fina cánula en el colon a través del ano. Las conductas relacionadas con el dolor visceral (lamerse el abdomen, estirarse, contraer el abdomen, etc.) se contabilizaron durante 20 minutos. Antes de la administración intracolónica y 20 minutos después, se determinó la frecuencia de respuestas de re t r a imiento a la aplicación de filamentos de von Frey al abdomen. El colon se extirpó tras sacrificar a los animales y se midió el contenido de Azul de Evans. La administración de aceite de mostaza y capsaicina provocó conductas de dolor visceral pro p o rcionales a la dosis, hiperalgesia referida (aumento significativo de las respuestas a los filamentos de von Frey) y extravasación plasmática en el colon. Las respuestas máximas de conducta se obtuviero n con capsaicina al 0,1% y aceite de mostaza al 1%, re s p e ctivamente. Las respuestas de conductas relacionadas con el dolor re m i t i e ron de una manera pro p o rcional a la dosis con morfina (DE50 = 1,9 ± 1 mg.kg-1 por vía subcutánea). Nuestra conclusión es que este modelo re p resenta una herramienta útil tanto para establecer el fenotipo de ratones

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J. M. A. LAIRD ET A L .

mutantes como para modelos de farmacología clásica, puesto que en el mismo animal puede obtenerse inform ación sobre dolor visceral, hiperalgesia referida e inflamación del colon. © 2001 Elsevier Science B.V. Publicado por Elsevier Science B.V. Reservados todos los dere c h o s . Palabras clave: Colon. Inflamación. Capsaicina. Aceite de mostaza.

INTRODUCCIÓN El dolor visceral es el tipo de dolor más frecuente producido por las enfermedades y uno de los motivos más habituales de consulta médica. No obstante, la mayor parte de lo que sabemos sobre los mecanismos del dolor se deriva de estudios de dolor somático, más que visceral. Ahora bien, cuanto más sabemos sobre los mecanismos responsables de las sensaciones somáticas y viscerales, más nos damos cuenta de que estos dos procesos, aunque tienen muchas características en común, presentan también importantes diferencias (Cervero y Laird, 1999). Por ejemplo, el dolor visceral se caracteriza por reflejarse en la pared corporal. En la zona del dolor referido, los pacientes se quejan también de sensibilidad dolorosa, lo que se conoce como hiperalgesia visceral referida (Giamberdino, 1999; 2000). En parte, la escasez de estudios experimentales del dolor visceral se debe a la mayor dificultad para acceder a los tejidos viscerales comparado con otras estructurales superficiales como la piel. La mayor parte de los modelos animales que existen del dolor visceral son técnicamente complejos, requieren cirugía o entubación a través de una víscera hueca, o no son exclusivamente viscerales (para una revisión, véase Ness y Gebhart, 1990; Giamberdino, 1999). Por ejemplo, la prueba de constricción o retorcimiento abdominal es sencilla, requiriendo únicamente la inyección intraperitoneal de algógenos. Este procedimiento provoca una conducta característica de estiramiento abdominal (estiramiento del torso acompañado de hiperextensión de las extremidades inferiores y arqueado cóncavo de la espalda). La prueba puede considerarse exclusivamente visceral cuando se utilizan sustancias que producen fuertes contracciones de la musculatura lisa visceral (como acetilcolina o suero fisiológico hipertónico). Pero, en estos casos, la respuesta dura muy poco (< 3 min) y, por tanto, tiene una relevancia clínica limitada.

R e v. Soc. Esp. del Dolor, Vol. 9, N.º 5, Junio-Julio 2002

Cuando se utilizan irritantes para producir inflamación y obtener así una respuesta más larga, la prueba se convierte en un modelo visceral y somático mixto, porque el peritoneo, que es una estructura parcialmente somática, se ve también afectado. Por otra parte, las dificultades técnicas de los modelos que precisan cirugía o implantación de dispositivos de estimulación son especialmente grandes en los ratones, unos animales que se utilizan cada vez más como sujetos en estudios genéticos y moleculares del d o l o r. Nuestro objetivo era crear un modelo conductual sencillo y exclusivamente visceral que fuera adecuado para utilizarse en el ratón y que nos permitiera examinar tanto el dolor visceral como la hiperalgesia referida en la pared corporal; es decir, un equivalente visceral de la prueba de la formalina en la pata. A q u í describimos un modelo de estimulación química del colon en el que puede medirse fácilmente en el mismo animal la conducta espontánea producida por el d o l o r, la hiperalgesia referida y la reacción inflamatoria visceral. El menor número de animales requerido y el periodo relativamente corto de supervivencia tras la estimulación visceral (< 30 minutos) tiene ventajas éticas evidentes. Hemos comprobado que este modelo es práctico para la farmacología clásica y para establecer fenotipos conductuales de ratones modificados genéticamente (Laird y cols., 2000a). Algunos de estos datos se han publicado ya en forma resumida (Laird y cols., 2000b).

M É TO D O S Se utilizaron ratones NMRI (US Navy Medical Re s e a rch Institute) adultos de ambos sexos, con un peso corporal de entre 20 y 30 gramos, procedentes de una colonia de la Reserva de Animales de la Universidad de Alcalá. La colonia se estableció con animales de cría procedentes de Harlan. Los ratones fueron manipulados por los investigadores y habituados al lugar del experimento durante 30 minutos el día antes de realizar la prueba, y durante otros 30 minutos justo antes de iniciar la prueba. Los animales se utilizaron sólo para realizar un procedimiento, y al término de la prueba, fueron sacrificados de manera humanitaria por dislocación cervical. El experimento se realizó conforme a las leyes comunitarias y nacionales que rigen los experimentos animales. Los experimentos se realizaron ocultando las concentraciones de las soluciones utilizadas, pero resultó imposible impedir que los investigadores identificaran las sustancias del ensayo, debido al fuerte olor desprendido 20

UN NUEVO MODELO DE DOLOR V I S C E R A L E HIPERALGESIA R E F E R I D A EN EL RATÓN

por el aceite de mostaza. Los análisis estadísticos de los datos sobre conductas se realizaron utilizando tests de Friedman con tests de Dunn a posteriori o A N O VA bidireccional con tests de Tukey a posterio r i , según fuera apropiado. Los datos sobre extravasación plasmática se analizaron mediante A N O VA u n idireccional y tests de Tukey a posteriori. Los tests a p o s t e r i o r i se realizaron sólo en el caso de observar efectos significativos. El nivel de significancia estadística se estableció en p < 0,05. Los animales fueron anestesiados brevemente con halotano (4% en O 2 al 100%), tras lo cual se les inyectó por vía intravenosa en el plexo retroorbital 50 mg/kg (< 100 µl de volumen) de Azul de Evans (Sigma, disuelto en suero fisiológico) para poder cuantificar posteriormente la extravasación plasmática en el colon. Una vez recuperados de la anestesia, los animales fueron devueltos a sus jaulas 18 horas antes de la prueba de conducta.

Conductas en respuesta a la estimulación química del colon Las sustancias químicas utilizadas fueron suero fisiológico, capsaicina (Tocris: 0,03, 0,1 ó 0,3% p/vol disuelto en 10% de etanol), Tween 80 al 10% y suero fisiológico al 80%) y aceite de mostaza (Aldrich; 0,25, 1 ó 2,5% vol/vol disuelto en etanol al 70%). Cada concentración se probó en un grupo de 5-6 ratones. Se aplicó petrolato (vaselina) en la zona perianal para evitar la estimulación de áreas somáticas por contacto con las sustancias químicas irritantes. A continuación se administró 0,05 ml de la solución introduciendo una delgada cánula con el extremo redondeado (diámetro externo = 0,61 mm; 4 cm de l a rgo) en el colon a través del ano. El animal se colocó sobre una rejilla metálica elevada (con aperturas de 6 x 6 mm), debajo de una caja de plástico transparente ventilada (18 x 13 x 15 cm). Se observó directamente la conducta espontánea del animal durante 20 min y, en algunas ocasiones, se grabó también en vídeo. La grabación en vídeo permitió que otros observadores distintos repitieran posteriormente el análisis, para garantizar la coherencia entre observadores y experimentos. Las posturas definidas como conductas relacionadas con el dolor fueron: a) lamerse el abdomen; b) estirar el abdomen; c) apretar el abdomen inferior contra el suelo; y d) retracción abdominal. Se registró la latencia de la primera de estas conductas, así como el número y el tipo de conductas exhibidas. 21

293

Efecto de la morfina en las conductas exhibidas en respuesta a la administración intracolónica de aceite de mostaza Cuatro grupos de ratones (n = 6 por grupo) recibieron tratamiento previo con morfina (morfina HCl, Ministerio de Salud Español) en dosis de 1, 3 ó 10 m g . k g-1 por vía subcutánea o con suero fisiológico como excipiente 1 hora antes de la instilación intracolónica de aceite de mostaza al 2,5%. Estos experimentos fueron realizados por investigadores que desconocían el tratamiento farmacológico que los ratones recibían.

Respuestas a la estimulación mecánica del abdomen Antes de la administración intracolónica (basal) y 20 minutos después, se examinó la frecuencia de la respuesta de retraimiento a la aplicación de filamentos de von Frey en el abdomen, como prueba de la hiperalgesia referida. Se aplicaron cinco filamentos con fuerzas de 1, 4, 8, 16 y 32 mN, 10 veces cada uno de ellos en orden creciente de fuerza, y se registró el número y la intensidad de las respuestas. Las fuerzas ejercidas por los filamentos de von Frey se comprobaron antes de la prueba utilizando un micromanipulador para hacerlos avanzar hacia una balanza sensible. El filamento se aplicó durante 1-2 segundos, con un intervalo entre estímulos de 5-10 segundos. Se tuvo cuidado de no estimular el mismo punto dos veces seguidas, para evitar efectos “acumulativos” o desensibilización. Asimismo, se evitó la estimulación en la zona de los genitales externos y se concentró en la parte inferior y media del abdomen, puesto que esta región había proporcionado los datos más reproducibles en los estudios piloto. Se consideró como respuesta de retraimiento cualquiera de las siguientes conductas al aplicar un filamento: a) retracción brusca del abdomen; b) lamido o rascado inmediato de la zona de aplicación del filamento; y c) salto. En el grupo de los seis ratones a los que se administró capsaicina al 0,1%, las respuestas a la estimulación mecánica de la cola y las patas traseras se determinaron también antes y 20 minutos después de la administración intracolónica. Se consideró la superficie ventral del tercio proximal de la cola y la superficie plantar de las dos patas traseras. Estas respuestas se examinaron con filamentos de von Frey tal como se describía antes para el abdomen, con la excepción de que se consideró como respuesta positiva

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J. M. A. LAIRD ET A L .

exclusivamente un retraimiento brusco de la región estimulada.

Extravasación de plasma en el colon pro v o c a d a p o r estimulación química Al terminar las pruebas de conducta, los animales fueron sacrificados y la sección terminal del colon se extirpó para determinar el contenido de Azul de Evans. El tejido se desecó a 60 ºC durante 24 horas. El tejido desecado se pesó, se impregnó de formamida y se mantuvo a 60º C durante 24 horas para extraer el Azul de Evans. Seguidamente se retiró el tejido y se midió la absorbancia con un espectrofotómetro (λ = 620 nm). La concentración de Azul de Evans se calculó a partir de una curva de absorbancia de referencia obtenida mediante regresión de las mediciones de cinco muestras de concentraciones conocidas.

RESULTADOS Conducta espontánea provocada por l a administración intracolónica

R e v. Soc. Esp. del Dolor, Vol. 9, N.º 5, Junio-Julio 2002

A. Número de conductas

100 80

*

*

*

60 40 20 0 Suero fisiológico

400

0,03% 0,1% 0,3% Capsaicina

0,25% 1% 2,5% Aceite de mostaza

B. Latencia de la primera conducta

300

200 100 50 *

0

La administración intracolónica de suero fisiológico fue seguida de la aparición de un pequeño número de conductas de lamido del abdomen (Fig. 1) que pudieron diferenciarse claramente de la actividad normal de acicalamiento y que, por tanto, se consideraron conductas relacionadas con el dolor. La administración intracolónica de aceite de mostaza o capsaicina provocó una mayor respuesta espontánea en todas las concentraciones estudiadas (Fig. 1). La respuesta consistió en una serie de conductas diferenciadas que duraron entre 1 y 10 segundos y en las que se observó por lo menos algo de lo siguiente: lamido del abdomen en ausencia de otras conductas de acicalamiento, estiramiento de todo el cuerpo, presión del abdomen contra el suelo, o contracción de la pared abdominal adoptando una postura “arqueada” durante 1-2 segundos (retracciones abdominales). Las primeras 3 conductas fueron similares a las que ya se han descrito con detalle en la rata tras la implantación de un cálculo uretral experimental (Giamberdino y cols., 1995). El número de conductas provocadas por la inyección de capsaicina o aceite de mostaza fue proporcional a la concentración, observándose un mayor número de episodios de conducta con las concentraciones más altas. No obstante, hubo también evidencias de un efecto tope con las concentraciones más altas probadas (Fig. 1). El aceite de

*

Suero fisiológico

0,03%

0,1% Capsaicina

0,3%

*

*

* 0,25%

1%

2,5%

Aceite de mostaza

Fig. 1—Reacciones conductuales (lamido del abdomen, estiramiento, retracción abdominal) a la instilación intracolónica de suero fisiológico, aceite de mostaza y capsaicina. (A) Número de conductas observadas en los 20 minutos siguientes a la administración. (B) Latencia hasta la primera conducta. Los datos se expresan como media ± EEM. *Indica grupos con diferencias significativas frente a los ratones tratados con suero fisiológico (p < 0,05).

mostaza al 2,5% provocó menos conductas en un plazo de 20 minutos que la concentración del 1%, aunque la diferencia no fue significativa (Fig. 1). Nosotros observamos que los animales tratados con las concentraciones más altas de aceite de mostaza o capsaicina pasaban una mayor parte del tiempo “paralizados” entre sucesivas conductas relacionadas con el dolor, mientras que con concentraciones más bajas, los ratones pasaban más tiempo acicalándose o moviéndose. La latencia de la respuesta a la administración de suero fisiológico fue mayor de 60 segundos en todos los ratones del experimento. Por el con22

UN NUEVO MODELO DE DOLOR V I S C E R A L E HIPERALGESIA R E F E R I D A EN EL RATÓN

trario, la latencia fue mucho más corta tras la administración de capsaicina o aceite de mostaza, y proporcional a la concentración (Fig. 1). La instilación de las tres concentraciones de capsaicina provocó principalmente el lamido del abdomen (≈ 95% de todas las conductas). Con la concentración más baja de aceite de mostaza (0,25%), también predominó el lamido del abdomen, representando el 76% de todas las conductas, pero con concentraciones más altas se observó un mayor número de retracciones abdominales. El lamido abdominal representó sólo el 53% de las conductas observadas tras la instilación de aceite de mostaza al 2,5%. El estiramiento, la principal conducta observada con la inyección intraperitoneal de irritantes (prueba de “retorcimiento” o constricción abdominal), se observó con mucha menos frecuencia. El estiramiento o presión contra el suelo constituyó menos del 15% de las conductas observadas tras la instilación de aceite de mostaza y menos del 5% de las conductas provocadas por la capsaicina.

Efecto de la morfina en la conducta espontánea p rovocada por la administración intracolónica de aceite de mostaza La morfina redujo de una manera proporcional a la dosis el número de conductas relacionadas con el dolor que se observaron con la administración de aceite de mostaza al 2,5% (Fig. 2). Con una dosis de 10 m g . k g-1, las conductas de respuesta se abolieron por 80

60

40 *

20 *

0 Excipiente

1

3

10

Dosis de morfina (mg.kg-1 por vía subcutánea)

Fig. 2—Efecto del tratamiento con morfina (subcutánea, 1 hora antes del tratamiento) en el número de conductas provocadas por la instilación intracolónica de aceite de mostaza al 2,5%. Los datos se expresan como media ± EEM. *Indica grupos con diferencias significativas frente a los ratones tratados con excipiente (p < 0,05). 23

295

completo en todos los animales estudiados. Este efecto fue estadísticamente significativo en conjunto ( A N O VA para medidas reiteradas; p < 0,05) y un test de Dunn a posteriori demostró una diferencia significativa frente al excipiente después de administrar las dosis de 3 y 10 m g . k g -1. Se ajustó una curva de inhibición de cuatro parámetros a los datos sin procesar utilizando un procedimiento iterativo con un programa informático comercial (Prism, GraphPad Software, San Diego, Estados Unidos) para obtener una dosis inhibitoria 50 (DI50; dosis que produce un 50% de inhibición). El valor obtenido fue de 1,9 ± 1 m g . k g-1.

Respuestas de retraimiento a la estimulación mecánica del abdomen No se observaron diferencias significativas entre los diferentes grupos de ratones en las respuestas de retraimiento a la estimulación con filamentos de von Frey en condiciones basales, de manera que para las representaciones gráficas se agregaron los datos. Ahora bien, se realizaron análisis estadísticos de medidas repetidas (comparando las respuestas antes y después de la instilación intracolónica en cada animal). La administración intracolónica de suero fisiológico no tuvo un efecto significativo en las respuestas comparado con los valores basales (Fig. 3). Los ratones tratados con capsaicina al 0,03% no mostraron ninguna diferencia estadísticamente significativa frente a las respuestas basales cuando se obs e rvon 20 minutos después de la administración intracolónica (Fig. 3). No obstante, tras la administración intracolónica de capsaicina al 0,1 y 0,3%, los ratones mostraron una intensa hiperalgesia mecánica referida en el abdomen, con un claro desplazamiento de la curva estímulo-respuesta hacia la izquierda (Fig. 3). La hiperalgesia provocada por estas dos concentraciones diferentes de capsaicina no fue significativamente diferente en su conjunto, aunque la concentración más alta consiguió una mayor respuesta a los filamentos de von Frey de menor fuerza (Fig. 3). La hiperalgesia referida fue, por tanto, dependiente de la concentración. Los ratones tratados con aceite de mostaza al 0,25 y 1% mostraron también una intensa hiperalgesia mecánica referida en el abdomen (Fig. 3), que fue similar a la observada después del tratamiento con capsaicina. Con la administración de la concentración más alta de aceite de mostaza, tres de los seis ratones estudiados mostraron evidencias de hiperalgesia mecánica referida, y tres no. Los ratones que no desarrollaron hiperalgesia fueron también los que

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J. M. A. LAIRD ET A L .

100

R e v. Soc. Esp. del Dolor, Vol. 9, N.º 5, Junio-Julio 2002

A. Suero fisiológico

B. Capsaicina

100

75

* *

*

75

* *

* *

•

•

• 50

50

•

*

* *

•

• 25

•

•

•

Basal

0

0,3% 0,1%

•

25

• Suero fisiológico (NS)

(NS) • 0,3% Basal

0 1

4

8

16

32

1

4

Fuerza (mN)

8

16

32

Fuerza (mN)

100

C. Aceite de mostaza

* 75

50

•* *

* •*

•*

*

* •*

•*

25

•

2,5% (NS) 1% 0,25% Basal

0 1

4

8

16

32

Fuerza (mN)

Fig. 3—Respuestas a la estimulación mecánica del abdomen con filamentos de von Frey de cinco intensidades. Los datos se expresan como porcentaje medio de frecuencia de la respuesta (± EEM) antes (basal) y 20 minutos después de la instilación intracolónica de (A) suero fisiológico, (B) tres concentraciones de capsaicina, y (C) tres concentraciones de aceite de mostaza. *Indica respuestas que fueron significativamente diferentes a las basales (p < 0,05).

mostraron una conducta de paralización más marcada, lo que sugiere que esa conducta interfirió con la expresión de la hiperalgesia. En conjunto, este grupo de ratones no mostró diferencias estadísticamente significativas frente a las respuestas basales (Fig. 3).

Zonas del cuerpo con hiperalgesia re f e r i d a En el grupo de ratones a los que se les administró capsaicina al 0,1%, se observaron también las respuestas a la estimulación mecánica de la cola y las patas antes y 20 minutos después de la administración intracolónica. La cola y las patas traseras fueron menos sensibles que el abdomen en condiciones basales (Fig. 4). No obstante, 20 minutos después del tratamiento intracolónico con capsaicina se produjo un marcado aumento de la respuesta en esos dos sitios, de manera que la curva de respuesta a los estímulos se desplazó hacia la izquierda (Fig. 4). La hi-

peralgesia observada en las patas traseras fue estadísticamente significativa, pero sólo con los estímulos más intensos. La hiperalgesia observada en la zona proximal de la cola fue mayor que la observada en las patas traseras, y similar a la observada en el abdomen. No obstante, la prueba de la cola llevó mucho más tiempo que la prueba del abdomen, puesto que se trata de un objetivo mucho más pequeño y que, además, el animal mueve constantemente.

Extravasación de plasma en el colon pro v o c a d a p o r estimulación química Tanto la capsaicina como el aceite de mostaza provocaron una extravasación de plasma en el colon significativamente mayor que la observada con la administración de suero fisiológico. En ambos casos, el grado de extravasación del plasma fue dependiente de la concentración (Fig. 5). 24

UN NUEVO MODELO DE DOLOR V I S C E R A L E HIPERALGESIA R E F E R I D A EN EL RATÓN

100

A. Abdomen

•**

** •

297

** •

** •

100

B. Patas traseras

* •

75 75

* •

50

*•

*•

50 25 25

•

0 1

4

8

16

32

•

0 1

Fuerza (mN)

4

8

16

32

Fuerza (mN)

C. Cola

100

75

• Después de capsaicina

•*

50

Antes de capsaicina

•

25

0

** •

** •

• 1

4

8

16

32

Fuerza (mN)

Fig. 4—Respuestas a la estimulación mecánica de diferentes zonas corporales con filamentos de von Frey de cinco intensidades antes y 20 minutos después de la instilación intracolónica de capsaicina al 0,1%. Los datos se expresan como porcentaje medio de la frecuencia de respuesta (± EEM) de (A) abdomen, (B) superficie plantar de las patas traseras, o (C) superficie ventral de la cola proximal. *Indica respuestas que fueron significativamente diferentes a las basales (p < 0,05).

0,20

A. Capsaicina *

B. Aceite de mostaza *

1,2 1,0

0,15

*

0,8 0,10

0,6

*

*

0,4 0,05

0,2 0,0

0,00 Suero fisiológico

0,03%

0,1% Capsaicina

0,3%

Suero fisiológico

0,25%

1%

2,5%

Aceite de mostaza

Fig. 5—Extravasación de plasma provocada por la estimulación química del colon. (A) Extravasación provocada por tres concentraciones diferentes de capsaicina. (B) Extravasación provocada por tres concentraciones diferentes de aceite de mostaza. Los datos se expresan como contenido medio de Azul de Evans en el tejido (± EEM). *Indica respuestas que fueron significativamente diferentes frente a los animales tratados con suero fisiológico (p < 0,05). 25

298

J. M. A. LAIRD ET A L .

DISCUSIÓN

R e v. Soc. Esp. del Dolor, Vol. 9, N.º 5, Junio-Julio 2002

En el presente estudio, observamos que los dos irritantes químicos utilizados producían una reacción al dolor espontánea y proporcional a la dosis, hiperalgesia referida e inflamación del colon. Estudios previos habían demostrado ya que tanto el aceite de mostaza como la capsaicina excitan y sensibilizan a los nociceptores colónicos (p. ej., Haupt y cols., 1983; Cervero, 1994; Sengupta y cols., 1996; Lynn y B l a c k s h a w, 1999).

El “efecto tope” observado con las concentraciones más altas de los irritantes estudiados, especialmente con el aceite de mostaza, puede deberse a un fenómeno conductual por el cual la expresión activa de conductas relacionadas con el dolor se ve parcialmente oculta por una reacción de paralización. Ta mbién puede deberse a una insensibilización local causada por daños en la mucosa, como se ha descrito para respuestas reflejas a la distensión del colon después de la inflamación de la mucosa (Burton y Gebhart, 1995).

Reacción espontánea al dolor

Hiperalgesia visceral re f e r i d a

La reacción espontánea al dolor observada fue muy diferente, tanto en calidad como en intensidad, a los estiramientos abdominales estereotípicos provocados en la prueba del retorcimiento. En este caso observamos como conductas más frecuentes el lamido del abdomen y retracción abdominal (“arqueamiento”). Otros autores habían referido ya la clara diferencia en el patrón de conducta entre la prueba del retorcimiento y los modelos de dolor abdominal exclusivamente viscerales en ratas y ratones (Lantéri-Minet y cols., 1995; Martínez y cols., 1999). Esta diferencia se refleja también en la distinta presentación clínica de la peritonitis y la inflamación de la mucosa visceral (p. ej., cistitis, colitis) en pacientes humanos (Bonica, 1990), donde sólo la irritación peritoneal produce contracción de la pared abdominal. El lamido del abdomen se ha descrito como una respuesta habitual en prácticamente en todos los modelos de dolor abdominal exclusivamente visceral en ratas, como los modelos de cistitis (McMahon y Abel, 1987; Abelli y cols., 1989; Craft y cols., 1993; Lantéri-Minet y cols., 1995), cálculos uretrales (Giamberardino y cols., 1995), inflamación del útero ( Wesselmann y cols., 1998) y estimulación del colon (Ness y Gebhart, 1988; Miampamba y cols., 1999), y en los escasos estudios publicados en ratones (cistitis, Olivar y Laird, 1999; distensión del colon, Martínez y cols., 1999). No obstante, la retracción abdominal o “arqueamiento” parece asociarse más específicamente a la estimulación dolorosa del colon tanto en ratas como en ratones (Ness y Gebhart, 1988; Miampamba y cols., 1994; Martínez y cols., 1999), aunque se ha descrito también en algunos estudios de ciscitis en ratas (Abelli y cols., 1989; Lantéri-Minet y cols., 1995). Todos los tipos de conducta observados se inhibieron con morfina de una manera proporcional a la dosis, lo que sugiere que están relacionados con el dolor.

La hiperalgesia de la zona somática donde se refleja el dolor visceral es una observación clínica habitual, que se ha cuantificado utilizando estímulos eléctricos y naturales en pacientes con diferentes cuadros de dolor visceral (para una revisión, véase Giamberardino, 1999; 2000; Cervero, 2000). Este fenómeno se ha medido también en modelos animales de dolor visceral. Giamberdino y cols. (1995) han documentado un umbral más bajo a la estimulación eléctrica de los músculos de los flancos en ratas con cálculos uretrales experimentales. La hiperalgesia referida es proporcional a la intensidad de la conducta espontánea visceral relacionada con el dolor que expresan los animales, como nosotros observamos en el presente estudio. Las ratas con cistitis exhiben una mayor respuesta a los estímulos térmicos y mecánicos de la cola y las patas traseras (McMahon y A b e l , 1987; Jaggar y cols., 1999), y las ratas con inflamación del útero son sensibles a la palpación de los músculos de los flancos laterales (Wesselmann y cols., 1998). Nosotros encontramos evidencias de hiperalgesia referida en el abdomen, la cola y, en menor medida, las patas traseras. Estas zonas son los lugares somatotópicamente apropiados para que se refleje el dolor del colon (Bonica, 1990). La hiperalgesia referida representa un desplazamiento de la curva de estímulorespuesta a la izquierda, con un aumento de la respuesta a intensidades de estímulo que provocaron una reacción de retraimiento en condiciones basales (es decir, hiperalgesia), y una nueva respuesta a estímulos que no provocaron reacción alguna antes de la instilación de irritantes (es decir, alodinia). Las mayores respuestas a la estimulación del abdomen podrían representar una hiperalgesia visceral directa debido a la estimulación del colon inflamado por el movimiento del contenido abdominal, más que una verdadera hiperalgesia referida. Sin embarg o , 26

UN NUEVO MODELO DE DOLOR V I S C E R A L E HIPERALGESIA R E F E R I D A EN EL RATÓN

nosotros creemos que eso no es así por dos razones. En primer lugar, observamos una hiperalgesia mecánica paralela en la cola y las patas traseras cuya estimulación externa no podía afectar al colon. En segundo lugar, la aplicación de estímulos mecánicos a la superficie ventral del abdomen estimula sólo el colon terminal directamente si existe un movimiento considerable de la pared abdominal, puesto que se sitúa en posición dorsal a los intestinos, la vejiga, etc. Los aumentos más marcados de la respuesta se observaron con la aplicación de filamentos de menor fuerza (1, 4 y 8 mN). La aplicación de estos filamentos apenas puede ser detectada por la piel humana y no provoca ningún movimiento de la pared abdominal en el ratón. Por consiguiente, el aumento de la respuesta tiene que deberse a cambios en la respuesta a la estimulación cutánea, más que a la estimulación directa del colon.

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al 0,1% y aceite de mostaza al 1%. Los dos irritantes químicos estudiados provocan reacciones conductuales similares, pero los mecanismos responsables de la reacción inflamatoria del colon difieren y, por tanto, las rutas neurales implicadas pueden ser también diferentes. Esta conclusión se ve reforzada por nuestra observación de que, en ratones sin los genes del receptor NK1, la administración intracolónica de capsaicina no produce ninguna reacción conductual ni hiperalgesia referida, mientras que la respuesta al aceite de mostaza intracolónico es normal (Laird y cols., 2000a). Los métodos aquí descritos podrían utilizarse también con otras sustancias para provoc a r, por ejemplo, inflamación crónica del colon o dolor inflamatorio visceral con una mayor participación del sistema inmune.

AGRADECIMIENTOS Inflamación del colon Aunque la capsaicina y el aceite de mostaza provocaron una hiperalgesia referida similar, las diferencias entre las conductas de respuesta espontánea a la capsaicina y al aceite de mostaza pueden interpretarse como reflejo de un efecto menos intenso de la capsaicina. La capsaicina provocó también una menor reacción inflamatoria. Nosotros habíamos observado ya diferencias en la reacción inflamatoria causada por estas dos sustancias cuando se aplican al colon utilizando los métodos descritos aquí (Laird y cols., 2000a). Habíamos observado que la capsaicina provoca una extravasación de plasma neurogénica pura, que desaparece con la desnervación de la inervación extrínseca del colon. Por el contrario, el aceite de mostaza produce extravasación de plasma tanto en el colon intacto como en el desnervado (Laird y cols., 2000a), lo que sugiere que produce daños directos en la mucosa, como ya se había descrito anteriormente en tejidos viscerales (Hurley y McQueen, 1971; McMahon y Abel, 1987).

Este estudio ha sido financiado con los fondos SAF-970104 y SAF-2000-0199 del CICYT ( M i n i s t erio de Ciencia) y un Contrato Programa de la Comunidad Autónoma de Madrid, España. L.M.-C. y E.G.-N . tienen becas de posgrado concedidas por el FIS, Ministerio de Sanidad (99/9335) y la Comunidad A u t ónoma de Madrid, respectivamente. Queremos expresar nuestro agradecimiento a las Dras. Carolina Roza y Teresa Olivar por su contribución a las primeras etapas de creación de este modelo.

CORRESPONDENCIA: J.M.A. Laird Departamento de Fisiología Universidad de A l c a l á 28871 Alcalá de Henares (Madrid) Telf.: +34-91-885-4595 Fax: +34-91-885-4807 e-mail: jennifer. l a i r d @ u a h . e s

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

Nuestra conclusión es que este modelo constituye una herramienta útil tanto para conocer el fenotipo de ratones mutantes como para estudios de farmacol ogía clásica, puesto que permite obtener en el mismo animal información sobre dolor visceral, hiperalgesia referida e inflamación del colon. Las respuestas conductuales máximas se obtuvieron con capsaicina

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