Universidad Autónoma de Barcelona Departamento de Medicina

Análisis del perfil de péptidos en sangre y orina en pacientes con nefropatía IgA y su asociación con las lesiones histológicas según la clasificación de Oxford

Licenciada Fredzzia Amada Graterol Torres Director de investigación: Profesor Ramón Vicente Antonio Romero González. Trabajo de investigación. Convocatoria de Septiembre Barcelona, 04 de Septiembre de 2012 -1-

Índice

Certificado del director .............................................................. Resumen ................................................................................... Introducción .............................................................................. Material y métodos .................................................................... Población de estudio ............................................................. Criterios de inclusión ............................................................ Parámetros clínicos y bioquímicos........................................... Biopsia renal ........................................................................ Recogida muestra de sangre ................................................. Recogida muestra de orina .................................................... Extracción de péptidos e identificación por MALDI-TOF MS......... Análisis estadístico ............................................................... Resultados ................................................................................. Identificación de péptidos relacionados con la nefropatía IgA en sangre y orina ..................................................................... Asociación entre los péptidos relacionados con la nefropatía IgA y las lesiones histológicas según la clasificación de Oxford ......... Asociación entre péptidos y el doble de la creatinina sérica ........ Asociación entre péptidos y los parámetros clínicos .................. Discusión ................................................................................... Limitaciones del estudio ............................................................ Conclusiones ............................................................................. Bibliografía ................................................................................ Leyendas figuras ....................................................................... Figura 1 .............................................................................. Figura 2 .............................................................................. Figura 3 .............................................................................. Figura 4 .............................................................................. Tablas Tabla 1 ............................................................................... Tabla 2 ............................................................................... Tabla 3 ............................................................................... Tabla 4 ............................................................................... Tabla 5 ...............................................................................

-2-

3 4 6 9 9 9 10 10 11 11 12 13 14 14 15 18 18 20 28 30 31 36 47 48 49 52 38 41 46 50 53

CERTIFICAT

DEL DIRECTOR O CO-DIRECTOR DEL

TREBALL DE RECERCA

Ramón Vicente Antonio Romero González, Professor del Departament de Medicina de la Universitat Autònoma de Barcelona i Cap de servei de Nefrologia del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol,

Fa constar, que el treball titulat “Análisis del perfil de péptidos en sangre y orina en pacientes con nefropatía IgA y su asociación con las lesiones histológicas según la clasificación de Oxford” ha estat realitzat sota la meva direcció pel llicenciat Fredzzia Amada Graterol Torres, trobant-se en condicions de poder ser presentat com a treball d’investigació de 12 crèdits, dins el programa de doctorat en Medicina Interna (curs 2011-2012), a la convocatòria de setembre.

Barcelona, 04 de setembre de dos mil dotze.

-3-

Resumen

Introducción: La nefropatía IgA (NIgA) es la glomerulonefritis primaria más común, con una progresión a la insuficiencia renal de 15-40%. Su diagnóstico se realiza a través de la biopsia renal siendo un método invasivo y no exento de complicaciones.

Objetivo: Encontrar una asociación entre un patrón de péptidos en sangre/orina de pacientes con NIgA y las lesiones histológicas descritas en la biopsia renal según la clasificación de Oxford.

Material y métodos: Estudio prospectivo, que incluye 19 pacientes con diagnóstico de NIgA y 14 sujetos sanos utilizados como controles en el período 2006-2009, excluyendo aquellos que presentaban reacción extracapilar. Se incluyeron datos clínicos y bioquímicos al momento del diagnóstico y a los 24 meses. Las lesiones histológicas fueron evaluadas según la Clasificación de Oxford. El análisis proteómico

fue

magnéticas

y

realizado

mediante

espectrometría

de

la

masas

tecnología

de

(MALDI-TOF

esferas MS).

Se

consideró el doble de la creatinina como variable de mal pronóstico.

Resultados: Se encontraron 55 péptidos (13 en suero, 26 en plasma, 16 en orina) que permitieron diferenciar los pacientes de los controles. Existe una asociación significativa entre los péptidos -4-

derivados

de

bradiquinina

uromodulina en

plasma

y

y

alfa-1-antitripsina la

lesión

en

orina,

tubulointersticial

y

y la

glomeruloesclerosis. Además, existe una asociación con una peor función renal, tanto del perfil de péptidos urinarios m/z (1769, 1898, 1913, 1945, 2378, 2491, 2977, 3004, 3389, 3406, 4752) como con el perfil de péptidos en suero/plasma m/z (5337,9289).

Conclusión: El análisis proteómico en sangre y orina permite identificar un perfil de péptidos asociado con las lesiones histológicas en pacientes con NIgA.

-5-

Introducción

La nefropatía IgA es la glomerulonefritis primaria más común en el mundo, siendo una causa importante de insuficiencia renal que conduce a enfermedad renal terminal (ERCT) en el 15-40% de los pacientes después de 20-25 años de seguimiento 1.

Características clínicas tales como el sexo, proteinuria > 1gr/día, aumento de la creatinina sérica y la hipertensión se han asociado con un mal pronóstico

2

. Además, hallazgos anatomopatológicos en el

momento del diagnóstico tales como la glomeruloesclerosis y la lesión tubulointersticial se han descrito también como predictores de mal pronóstico renal 3.

Actualmente el diagnóstico de la nefropatía por IgA se realiza por biopsia renal, basado en criterios patológicos que incluyen la presencia de depósitos de IgA mesangial difusa en el estudio de inmunofluorescencia. La clasificación de Oxford es un reciente método de clasificación histopatológica, que evalúa las variables histológicas utilizando un método cuantitativo relativamente sencillo. Esta nueva evaluación ha demostrado ser más precisa en el análisis de las biopsias de nefropatía IgA 3.

De esta forma el carácter invasivo de la biopsia renal y sus -6-

complicaciones asociadas pueden contraindicar el procedimiento en algunos pacientes, lo que ha llevado a la búsqueda de nuevas alternativas diagnósticas no invasivas.

En la última década, la proteómica se ha aplicado ampliamente en diversos campos de la medicina incluyendo la nefrología, utilizándose para estudiar simultáneamente cientos de proteínas

1,4-8

. La sangre y

la orina son dos de los fluidos biológicos más utilizados en proteómica clínica, ya que pueden obtenerse de forma no invasiva, además que permite identificar marcadores relacionados con la enfermedad glomerular de forma directa

9-19

.

El análisis peptídico es un método de identificación de péptidos diferenciales en auge, que está ganando popularidad en la búsqueda de

posibles

nuevos

glomerulares.

El

biomarcadores

fraccionamiento

20-28

en

mediante

las

enfermedades

esferas

magnéticas

acoplado a la espectrometría de masas MALDI-TOF (MALDI-TOF MS), se ha introducido recientemente como una técnica de identificación de péptidos urinarios, permitiendo un análisis rápido y de alto rendimiento

29-31

.

Por lo tanto, hemos querido utilizar este método para comparar perfiles de péptidos en sangre y orina en pacientes diagnosticados de nefropatía IgA, a través de biopsia renal, con sujetos sanos con la -7-

finalidad de encontrar un perfil de péptidos asociado a las lesiones histológicas encontradas en la biopsia renal según la clasificación de Oxford.

-8-

Material y métodos

Población de estudio Se

ha

realizado

un

estudio

prospectivo,

incluyendo

pacientes

diagnosticados de NIgA entre junio de 2006 y noviembre de 2009 en el Departamento de Nefrología del Hospital Germans Trias i Pujol (Barcelona, España). Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Declaración de Helsinki de 1971, revisada en 2008. Los comités de ética local aprobaron el protocolo de estudio y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para participar.

Criterios de inclusión Para su inclusión, los pacientes debían ser mayores de 18 años, mostrar signos clínicos de enfermedad renal, tales como presencia de proteinuria

con

función

renal

estable

o

diferentes

grados

de

insuficiencia renal, presencia de hematuria, en los que se indicaba una biopsia renal. Sólo se incluyeron pacientes con nefropatía IgA primaria. Los pacientes con glomerulonefritis y reacción extracapilar (presencia de semilunas) fueron excluidos. Los sujetos sanos se utilizaron como controles para establecer un perfil de péptidos normal (Tabla 1).

-9-

Parámetros clínicos y bioquímicos Los siguientes datos clínicos se recogieron en el momento del diagnóstico: edad, género, historia de hipertensión, diabetes mellitus o dislipidemia. Datos bioquímicos como: niveles séricos de ácido úrico, albúmina y colesterol, proteinuria, hematuria, presión arterial sistólica y diastólica, fueron recogidos en el momento de la realización de la biopsia renal y a los dos años de seguimiento. De igual forma se registraron durante el estudio el uso de estatinas y de tratamiento antihipertensivo basado en el bloqueo del sistema reninaangiotensina-aldosterona (SRAA).

Biopsia renal Se obtuvo una muestra de biopsia renal percutánea de cada paciente al inicio del estudio, antes del inicio de tratamiento con bloqueadores del

sistema

renina-angiotensina-aldosterona

(BSRAA),

corticoesteroides o cualquier otro tratamiento inmunosupresor. Las biopsias renales fueron procesadas y analizadas de forma rutinaria a través del microscopio óptico, inmunofluorescencia y microscopía electrónica de acuerdo con el procedimiento estándar. En el estudio de microscopia óptica, las muestras fueron procesadas y teñidas con hematoxilina/eosina, ácido periódico de Schiff, plata metenamina, tricrómico de Masson, y rojo Congo.

En el momento de la biopsia, las muestras de biopsias renales eran - 10 -

revisadas por un patólogo y evaluaba las variables histopatológicas de acuerdo con la clasificación de Oxford. Las cuatro variables incluidas dentro de la clasificación de Oxford se describen a continuación:

Score

mesangial:

≤0,5

(M0)

o

>0,5

(M1);

Glomeruloesclerosis segmentaria: ausente (S0) o presente (S1); hipercelularidad endocapilar: ausente (E0) o presente (E1); atrofia tubular/fibrosis intersticial ≤25% (T0), 26 a 50% (T1) o >50% (T2)3.

Recogida muestras de sangre Fueron tomadas muestras de sangre de los pacientes incluidos, en el mismo día en que se realizaba la biopsia renal

29

. Las muestras de

plasma-EDTA y de suero se obtuvieron por centrifugación a 2200 g durante 10 min, alicuotaron

las

para eliminar partículas y restos celulares. muestras

para

evitar

ciclos

de

Se

congelación-

descongelación, siendo posteriormente almacenadas a -80 ° C hasta su uso.

Recogida muestras de orina Fueron tomadas muestras de orina frescas de la primera micción de la mañana el mismo día de la realización de la biopsia renal

29

.

Posteriormente las muestras de orina fueron centrifugadas a 2100 g durante 30 min a 4 ºC para eliminar restos celulares. El sobrenadante fue ajustado a un pH de 6,5 con NH4HCO3 (1M) para minimizar la precipitación de proteínas durante el almacenamiento, y se alicuotó - 11 -

para

evitar

ciclos

de

congelación-descongelación,

posteriormente almacenados a -80 °C hasta su uso

29

siendo

. No se añadió

inhibidores de la proteasa a las muestras y no fue necesaria la normalización de concentración de proteínas en las muestras de orina para el análisis proteómico

30

.

Extracción de los péptidos e identificación por MALDI-TOF MS Los péptidos en plasma y suero (80 mL), y en el sobrenadante de las muestras

de

orina

(110

mL)

se

extrajeron

usando

esferas

magnéticas. El kit de extracción de péptidos utilizado para las muestras de sangre fue el MB-IMAC Cu (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania), que se basa en la afinidad de los péptidos para los iones de cobre inmovilizado en la superficie de las esferas magnéticas; mientras que en el caso de las muestras de orina las esferas utilizadas estaban recubiertas con cadenas alifáticas C18 (Dynabeads ® RP-C18, Invitrogen, Países Bajos). En este caso los péptidos son capturados a través de interacciones hidrófobas.

Las

muestras de plasma, suero y orina fueron procesadas por

duplicado, y cada duplicado fue analizado dos veces en la placa MALDI (AnchorChip 600/384, Bruker Daltonics). Así, se obtuvieron cuatro espectros de MALDI para cada muestra, adquirida para valores m/z desde 1000 a 10.000.

- 12 -

Se utilizó el sistema ClinProTools (v2.0; Bruker Daltonics) para analizar los perfiles de péptidos. Los detalles sobre el análisis de MALDI-TOF MS y la selección de los péptidos de interés,

están

descritos en estudios anteriores de nuestro grupo30,32.

Análisis estadístico La normalidad de las variables se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las variables continuas se expresaron como media ± desviación estándar, mediana y rango y se compararon mediante el test

U de Mann-Whitney. Las variables categóricas se

analizaron mediante chi-cuadrado o la prueba de probabilidad exacta de Fisher. Las asociaciones entre variables se analizaron mediante el coeficiente de correlación de Spearman.

El análisis estadístico fue realizado con el programa SPSS v15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) considerando significación estadística un pvalor 50%) en los pacientes con NIgA, observamos que los péptidos en suero con m/z 1466, 1617, 5905, 5966, 9289 estaban aumentados en pacientes con lesión tubulointersticial T2 en comparación con los otros dos grupos (T0, T1). Pero, no se encontraron diferencias significativas en los péptidos en suero m/z 3264, 5337, 5889 entre los diferentes grados de afectación tubulointersticial.

En el plasma, los péptidos con m/z 2661 y 2790 estaban aumentados y los péptidos con m/z 1063, 1078 estaban disminuidos en los pacientes con lesión tubulointersticial T2 en comparación con los otros dos grupos (T0, T1).

En la orina, los péptidos urinarios con m/z 1945 y 2491 estaban aumentados en comparación con el grupo de pacientes con afectación tubulointersticial T0 y T1.

De forma contraria, los péptidos urinarios con m/z 1769, 1898, 2977, 3004, 3389, 3406, 4658, y 4752 estaban disminuidos en los pacientes con afectación tubulointersticial T2, en comparación con el grupo de pacientes con afectación T0 y T1. - 16 -

Como se muestra en la Figura 1a-d, los péptidos urinarios con m/z 1945, 2392 y 4013 de pacientes con lesión S1 aumentaron, pero el péptido con m/z 3389 disminuyó en comparación con los pacientes con NIgA clasificados como glomeruloesclerosis segmentaria S0. Sin embargo, no se hallaron asociaciones entre la glomeruloesclerosis y los péptidos en suero y plasma.

En cuanto a la hipercelularidad endocapilar, la lesión descrita como E0, se asoció con una disminución de los péptidos con m/z 1546 y 3264, mientras que el péptido con m/z 3242 estaba aumentado en el suero de pacientes con nefropatía IgA (Figura 2a-c). Además, los péptidos con m/z 3242 y m/z 8602 estaban aumentados en el plasma de los pacientes que presentaban hipercelularidad endocapilar (E1) (Figura 3a-b). No se hallaron asociaciones entre los péptidos urinarios.

No se observaron asociaciones entre los péptidos de suero/plasma u orina y la proliferación mesangial en los pacientes con NIgA.

Como se muestra en la Tabla 4, los péptidos con m/z 1466, 1617, 3193, 3264, 5337, 5889, 5905, 5966 y 9289 en suero, los péptidos con m/z 1063, 1078, 2661 y 2790 en el plasma, y los péptidos con m/z 1769, 1898, 1945, 2491, 2977, 3004, 3389, 3406, 4658 y 4752 en orina de los pacientes con NIgA estaban asociados con la lesión - 17 -

fibrosis intersticial / atrofia tubular (IFTA).

Asociación entre péptidos y doble de la creatinina sérica Como se describió anteriormente, se observó un asociación entre los péptidos con m/z 2953, 5337, 9289 en el suero y m/z 9287 en el plasma con una peor evolución de la función renal en los pacientes con NIgA. Además, se observó una asociación entre los péptidos de orina con m/z 1769, 1898, 1913, 1945, 2491, 2756, 2977, 3004, 3389, 4752 y el doble de la creatinina sérica en el mismo grupo.

Asociación entre los péptidos y los parámetros clínicos. No se encontraron asociaciones entre los parámetros clínicos y el perfil de péptidos de suero/plasma y orina de los pacientes con NIgA.

Se halló una correlación inversa entre los péptidos urinarios derivados de la UMOD (m/z 1898, 1913) y los niveles basales de creatinina sérica y proteinuria. Del mismo modo, se encontró una correlación positiva entre los péptidos derivados de A1AT (m/z 1945, 2392, 2505) y la proteinuria.

La mayoría de nuestros pacientes presentaban diferentes grados de hematuria en el momento del diagnóstico, por lo que no fue posible determinar la influencia de la hematuria en los cambios del perfil de

- 18 -

péptidos.

- 19 -

Discusión

La importancia de la nefropatía IgA se basa en su incidencia y pronóstico: de un 15 a 40% de los casos presentan insuficiencia renal crónica terminal después de 20-25 años de seguimiento

33

, lo que

requiere la búsqueda de técnicas de temprano y fácil diagnóstico.

En este estudio prospectivo, nos propusimos realizar un análisis preliminar el cual tiene como principal objetivo identificar a través del análisis proteómico en sangre y orina potenciales biomarcadores peptídicos asociados a las lesiones histológicas que marcan un peor pronóstico de la enfermedad utilizando la clasificación de Oxford.

Nosotros observamos un perfil de péptidos en suero/plasma y en orina, en pacientes con NIgA que permitió diferenciarlos de los sujetos sanos. De los péptidos obtenidos a través del análisis de muestras de orina, hemos identificado en el grupo de pacientes dos péptidos correspondientes a uromodulina (UMOD) (m/z 1898, 1913), tres péptidos correspondientes a la alfa-1-antitripsina (A1AT) (m/z 1945, 2392, 2505) y un péptido derivado de la B2microglobulina (m/z 2714). También fueron identificados en el plasma de pacientes con NIgA un péptido con m/z 1063 que correspondía a la Bradiquinina y un segundo péptido con m/z 1898 del complemento C4a. - 20 -

que correspondía a fragmentos

La nefropatía IgA puede presentarse con un curso muy variable, que puede ir desde una histología prácticamente normal hasta formas agresivas de daño glomerular o tubular como afectación glomerular necrotizante severa, glomeruloesclerosis, atrofia tubular avanzada o fibrosis intersticial. La atrofia tubular/ fibrosis intersticial y la glomeruloesclerosis han sido identificados como potentes predictores de mal pronóstico en esta glomerulopatía

34

También factores de riesgo como el sexo masculino, la hipertensión, la proteinuria, ausencia de hematuria y la insuficiencia renal se han descrito como marcadores de peor evolución de la enfermedad renal 2

.

En este sentido, numerosos esfuerzos han sido dirigidos a encontrar una asociación entre una amplia gama de lesiones histológicas y las manifestaciones clínicas de esta patología. La clasificación de Oxford es una reciente clasificación histopatológica que incluye cuatro lesiones bien definidas, desarrollada como un sistema de evaluación cuantitativo útil y reproducible de la nefropatía IgA, en el que se analizan cada una de las lesiones histológicas como potentes predictores de la evolución de la enfermedad renal. Así, a través de esta clasificación, es posible encontrar de forma más precisa un diagnóstico histológico para posteriormente ofrecer un pronóstico de la enfermedad, beneficiando el inicio de tratamiento terapéutico temprano.

- 21 -

Recientemente, nuevos métodos han sido descritos para identificar biomarcadores biológicos en diferentes tipos de fluidos, entre ellos el análisis proteómico. En un estudio previo de nuestro grupo

30

, hemos

demostrado que el perfil de péptidos obtenido a través de la tecnología de esferas magnéticas unido a MALDI-TOF permite evaluar diferencias entre péptidos urinarios de pacientes con enfermedad glomerular crónica y población sana, sugiriendo un patrón de péptidos diferencial como paso previo hacia la clasificación de los pacientes con enfermedad glomerular. En este estudio, fue descrita una combinación de péptidos urinarios derivados de la UMOD y de la A1AT capaces de clasificar correctamente a los pacientes con enfermedad glomerular.

En el presente estudio, buscamos una asociación entre los péptidos presentes en suero/plasma y orina, y las lesiones histológicas de acuerdo a la clasificación de Oxford.

Hemos observado que de las cuatro lesiones histológicas valoradas, la lesión tubulointersticial era la que se asociaba de forma significativa a un mayor número de péptidos. En concreto, se observó una correlación positiva entre el daño tubulointersticial y los niveles del péptido derivado de la A1AT (m/z 1945), y una asociación inversa entre los niveles del péptido derivado de la UMOD (m/z 1898) y la bradiquinina (m/z 1063) con la lesión tubulointersticial. - 22 -

Es

bien

conocido,

que

la

A1AT

actúa

protegiendo

la

matriz

extracelular del ataque de los neutrófilos, de allí sus efectos antiinflamatorios y anti-apoptóticos, por lo que las células epiteliales tubulares renales podrían producir A1AT en respuesta al daño tubulointersticial

35

. Además la A1AT se ha considerado como una

proteína fibrinolítica (proteasa sérica inhibidora de trombina) inducida en respuesta a la hematuria. Sin embargo también se ha descrito en la literatura un desequilibrio entre proteasas y sus inhibidores tisulares en el área inflamatoria, lo que podría justificar el papel de esta proteína en los procesos inflamatorios involucrados en la fisiopatología

de

las

enfermedades

glomerulares.

Todos

estos

hallazgos podrían justificar los altos niveles de A1AT encontrados en orina ya que es prácticamente ausente en la orina normal. A pesar de esto no está completamente claro el papel que juega la presencia de A1AT a nivel urinario.

Estos mismos resultados han sido descritos en otros estudios en los que se detectaron niveles aumentados de A1AT tanto en tejido de renal y en orina de pacientes con NIgA en comparación con sujetos sanos

35

.

Pero no sólo la A1AT tiene un papel relacionado con la lesión tubulointersticial. Nosotros encontramos una asociación inversa entre - 23 -

la UMOD y la lesión tubulointersticial. Estos resultados concuerdan con

los

descritos

por

otros

autores

que

encontraban

bajas

concentraciones de UMOD en la orina de pacientes con NIgA asociada a la lesión atrofia tubular/fibrosis intersticial en biopsias renales

36

En cuanto a la uromodulina, es una glicoproteína expresada en las células tubulares renales epiteliales, que representa la proteína urinaria más abundante. Estudios recientes sugieren un papel de la UMOD en la enfermedad renal crónica. Alteraciones en la excreción urinaria de UMOD se han asociado con la reducción de la tasa de filtrado glomerular (TFG) en diversas nefropatías

37

.

En un estudio anterior, nuestro grupo de trabajo ha observado una correlación inversa entre la UMOD, la creatinina sérica y la proteinuria en pacientes con enfermedad glomerular. En la NIgA, Wu y col.31 observaron un perfil de péptidos en orina relacionado con esta enfermedad glomerular. Los autores encontraron una disminución en la excreción urinaria de la UMOD, sugiriendo que era capaz de discriminar entre los pacientes con NIgA y el grupo de sujetos sanos. En nuestro estudio, el patrón de péptidos encontrado podría ser marcador de la lesión histológica y del daño tubulointersticial, no pudiendo asegurarse que sea específico de la nefropatía IgA.

Por otra parte, en el plasma se ha identificado también un péptido - 24 -

con

m/z

1063

que

corresponde

a

un

péptido

derivado

del

quininógeno, la bradiquinina. Nosotros observamos una disminución significativa de los niveles de bradiquinina en el grupo de pacientes que

presentaban

mayor

afectación

tubulointersticial

(T2)

en

comparación con los otros grupos (T0, T1).

La bradiquinina es un nonapéptido derivado del quininógeno. El quininógeno es un componente del sistema calicreína-quinina. Todas las quininas son fuertes agonistas del receptor de la bradiquinina 2. La activación de esta vía de señalización conduce a la producción de óxido nítrico y prostaglandinas potentes

vasodilatadores

38

. Por lo tanto, las quininas son

renales

y

presentan

actividades

antitrombóticas y antifibróticas.

En pacientes con NIgA, Rocchetti y col.16 describen también una disminución significativa en la excreción urinaria de quininógeno en pacientes con NIgA, y especialmente en pacientes no respondedores a la terapia con IECAs. Los autores especulan acerca de que la diferencia en la excreción de orina del quininógeno, podría ser reflejo de la gravedad del daño renal en pacientes con NIgA.

En nuestro grupo de estudio, los pacientes no recibían tratamiento con inhibidores del sistema renina angiotensina aldosterona o antagonistas de receptores de angiotensina II al momento del - 25 -

diagnóstico por lo que no podíamos comparar el efecto de estos fármacos en los perfiles de péptidos. Se requieren más estudios con una mayor inclusión de los pacientes para demostrar este efecto.

De la misma forma, se encontró una asociación entre cuatro péptidos urinarios y la glomeruloesclerosis. De estos péptidos, tres de ellos (m/z 1945, 2392 y 4013) estaban aumentados en pacientes con S1. Por otro lado, el péptido con m/z 3389 estaba aumentado en pacientes con S0.

En

estudios

anteriores,

Kang

y

col.

3

observaron

que

la

glomeruloesclerosis segmentaria y la lesión atrofia tubular/fibrosis intersticial

reflejaban daño crónico, pudiendo utilizarse como

predictor de evolución a largo plazo en pacientes con NIgA. Nuestros hallazgos podrían reflejar que los péptidos encontrados constituyan marcadores de lesión glomerular crónica en la población estudiada.

De manera similar se identificaron cinco péptidos, en suero m/z 1546, 3264, 3242, y en plasma m/z 3242, 8602. De todos ellos los péptidos de plasma y suero con m/z 3242 y el péptido de plasma con m/z 8602 aumentaban en presencia de hipercelularidad endocapilar (E1). Mientras que los péptidos de suero m/z 1546 y 3264 estaban aumentados en la lesión E0.

- 26 -

Muchos de los pacientes con NIgA muestran proliferación mesangial, por lo tanto, esta puntuación se define como el número de células mesangiales

por

área

mesangial.

Estudios

anteriores

han

demostraron una relación entre la hipercelularidad mesangial y el grado de actividad de la enfermedad. En nuestro grupo todos los pacientes

estaban

categorizados

como

M1

al

momento

del

diagnóstico por lo que no se pudo comparar patrones de péptidos entre M1 y M0.

Por último,

se observó una asociación entre algunos péptidos en

suero, plasma y orina y el doble de la creatinina tomado como predictor de peor pronóstico renal. De los péptidos identificados se encontró una asociación inversa entre la uromodulina y el doble de la creatinina, y una

asociación positiva entre

el péptido

alfa-1-

antitripsina y el doble de la creatinina. Con base en estos hallazgos podríamos utilizar estos péptidos identificados como potenciales biomarcadores predictores de la evolución renal.

- 27 -

Limitaciones del estudio

Nosotros hemos encontrado una asociación de un perfil de péptidos con las lesiones histológicas descritas en la clasificación de Oxford. No podemos asegurar que la disminución de concentraciones urinarias de UMOD o incrementos en la excreción de A1AT estén relacionadas únicamente con la enfermedad glomerular, ya que al momento del diagnóstico nuestro grupo de estudio presentaba diferentes estadios de insuficiencia renal además de diferentes grados de lesión tubulointersticial, pudiéndose corresponder estos péptidos a un biomarcador de disfunción renal o de daño tubulointersticial.

Por otro lado, es necesario ampliar el número de pacientes incluidos en el estudio con la finalidad de disminuir las limitaciones en cuanto reproducibilidad, y de esta forma obtener un patrón de péptidos específico y más amplio.

Del mismo modo, la mayoría de nuestros pacientes presentaban algún grado de afectación mesangial siendo catalogados dentro del score M1. Esta característica de nuestra población de estudio no nos permitió evaluar la influencia de esta lesión en el perfil de péptidos.

Finalmente, se conoce la complejidad en la identificación de los péptidos en fluidos biológicos, representando un punto crucial para - 28 -

conocer cuál es la función que podrían desempeñar en el proceso de esta enfermedad.

- 29 -

Conclusiones

La nefropatía IgA es una enfermedad glomerular con un mecanismo patogénico incierto. El análisis proteómico nos permite obtener un patrón de péptidos que podría acercarnos al diagnóstico no invasivo de la NIgA y su relación con las lesiones histológicas. Futuros estudios con una inclusión más amplia de pacientes son necesarios para clarificar el rol de la UMOD/A1AT urinaria y la Bradiquinina plasmática en el proceso fisiopatológico de la nefropatía IgA.

- 30 -

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- 35 -

Leyendas figuras

Figura 1 - Péptidos en orina que se diferencian según la lesión glomeruloesclerosis segmentaria. Diagrama de cajas de las diferencias en los péptidos urinarios de m/z 1945 (a), m/z 2392 (b), m/z 4013 (c) y m/z 3389 (d) en pacientes con NIgA entre ausencia (S0) o presencia (S1) de la lesión glomeruloesclerosis segmentaria. Los valores atípicos se representan como círculos. Figura 2 – Péptidos en suero que se diferencian según la lesión hipercelularidad endocapilar. Diagrama de cajas de las diferencias en suero de m/z 1546 (a), 3264 (b), m/z 3242 (c) en pacientes con NIgA entre ausente (E0) y presente (E1) de la lesión hipercelularidad endocapilar. Los valores atípicos se representan como círculos. Figura 3 - Péptidos en plasma que se diferencian según la lesión hipercelularidad endocapilar. Diagrama de cajas de las diferencias en plasma de m/z 3242 (a) y m/z 8602 (b) en pacientes con NIgA entre ausente (E0) y presente (E1) de la lesión hipercelularidad endocapilar. Los valores atípicos se representan como círculos. Figura 4 – Diferencias en los péptidos uromodulina, alfa-1antitripsina y bradiquinina según la lesión fibrosis intersticial/ atrofia tubular - 36 -

Diagrama de cajas de las diferencias en orina de m/z 1898 (a) y m/z 1945 (b), en plasma de m/z 1063 (c) en pacientes con NIgA entre ausente

(T0)

y

presente

(T1,

T2)

de

la

lesión

fibrosis

intersticial/atrofia tubular. Los valores atípicos se representan como círculos.

- 37 -

Tablas Tabla 1 – Características demográficas, clínicas y datos bioquímicos de los pacientes con NIgA y sujetos sanos

Pacientes con NIgA Al momento de la biopsia renal Número de personas Edad, años Rango

Al final del seguimiento

Sujetos sanos

(24 meses)

19

14

42

29,5

(33-52)

(25,75-41)*

15 (79)

6 (43)

Sexo, n(%) Hombres Hipertensión, n(%) Si

No 12 (63)

Diabetes, n(%) No Si

1 (5)

Dislipidemia, n(%) Si Creatinina sérica, mg/dL Rango

No 9 (47) 2.00

3.16a

0.84*

1.40-2.57

1.26-6.18

0.71-0.97

- 38 -

Proteinuria, g/24 horas Rango Colesterol, mg/dL Rango Ácido úrico, mg/dL Rango Albúmina sérica, g/L Rango

2.28

1.30 Negativa

1.20-4.26

0.52-3.27

194

147a Nd

157-221.75

131.5-213

7.4

7.4 Nd

5.45-8.30

6.55-9.20

34

40a Nd

31-39

36.75-42.40

Si

7 (36.8)

17 (89,4)

IECAs

5 (26.3)

11(57,8)

ARA II

1 (5.3)

3(15,7)

1 (5.3)

3(15,7)

4 (21.1)

9 (47,3)

Bloqueo RAAS, n(%)

No

IECAs más ARAII Estatinas, n(%) Si

Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (DE) o medianas y rangos según convenga. *Test U de Mann-Whitney con significación estadística (P