Universidad de Granada Instituto de Biotecnología Facultad de Medicina Departamento de Fisiología

Determinación de los haplotipos de anemia falciforme y su correlación con los niveles de estrés oxidativo en pacientes de 6 meses a 15 años de edad en Panamá

Iryna Rusanova Granada, 2010

Editor: Editorial de la Universidad de Granada Autor: Iryna Rusanova D.L.: GR 830-2011 ISBN: 978-84-694-0210-8

D. DARÍO ACUÑA CASTROVIEJO, Catedrático de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Granada,

CERTIFICA QUE Dña Iryna Rusanova, Licenciada en Bioquímica, ha realizado bajo su dirección y en el Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada, el trabajo titulado: “Determinación de los haplotipos de anemia falciforme y su correlación con los niveles de estrés oxidativo en pacientes de 6 meses a 15 años de edad en Panamá”, reuniendo el mismo las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor.

Granada, 20 de octubre de 2010

Vº Bº Director

La interesada

Darío Acuña Castroviejo

Iryna Rusanova

Dña. GERMAINE ESCAMES, Profesora Titular Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Granada,

CERTIFICA QUE Dña Iryna Rusanova, Licenciada en Bioquímica, ha realizado bajo su dirección y en el Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada, el trabajo titulado: “Determinación de los haplotipos de anemia falciforme y su correlación con los niveles de estrés oxidativo en pacientes de 6 meses a 15 años de edad en Panamá”, reuniendo el mismo las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor.

Granada, 20 de octubre de 2010

Vº Bº Director

Germaine Escames

La interesada

Iryna Rusanova

Beca y proyectos de investigación que han financiado este estudio:

Este trabajo se ha realizado en el Laboratorio del Grupo de Investigación CTS101: Comunicación Intercelular, del Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada, en el Centro de Investigación Biomédica, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, y el Hospital del Niño de Panamá.

1. Becas disfrutadas Beca SENACYT-IFARHU.

2. Proyectos de Investigación que han financiado la investigación: 1. Financiación del Grupo de Investigación CTS-101: Comunicación Intercelular. 2. Secretaría Nacional de Cencia, Tecnología e Innovación (SENACYT) de Panamá, proyecto FID08-124.

3. Publicaciones científicas:

Autores: Rusanova I, Escames G, Cossio G, de Borace R, Chahbouni M, López LC, Díez T, Acuña-Castroviejo D Título: Oxidative stress status, clinical outcome, and -globin haplotypes in sickle cell anemic pediatric patients Ref. Revista: Eur J Haematol 2010, in press: doi: 10.1111/j.1600-0609.2010.01528.x. Financiación: CTS-101 - FID08-124 Áreas: Hematology Posición/Áreas: 35/61 F. Impacto: 2.345 PMDI: 20846340 Clave: artículo Autores: Rusanova I, Cossio G, Moreno B, Perea J, de Borace R, Perea M, Escames G, Acuña-Castroviejo D Título: β-Globin Gene Cluster Haplotypes in Sickle Cell Patients From Panamá Ref. Revista: Am J Hum Biol 2010, submitted: Financiación: CTS-101 - FID08-124 Áreas: Biology Posición/Áreas: 23/76 F. Impacto: 2.121 PMDI: Clave: artículo

4. Congresos:

Comunicación oral en el XIII Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología de APANAC. Tema: ―Estrés Oxidativo, clínica y los haplotipos del custer globínico Beta en los pacientes pediátricos panameños con Anemia Falciforme‖ Presentado el día viernes 8 de octubre, en la sala 102, en el horario de 14:00 a 14:15 horas en el Centro de Convenciones de la Ciudad del Saber, Panamá, República de Panamá.

Comunicación en forma de poster titulada: ―BIOMARCADORES DEL ESTRÉS OXIDATIVO, MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y LOS HAPLOTIPOS DEL CLUSTER GLOBÍNICO BETA EN LOS PACIENTES PEDIÁTRICOS PANAMEÑOS CON ANEMIA DREPANOCÍTICA―, dentro de la LII Reunión Nacional de la Sociedad Española de Hematología y Hemoterapia (SEHH) y XXVI Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia (SETH), a celebrar en Las Palmas de Gran Canaria, los días 28 al 30 de octubre de 2010. Nº DE PÓSTER: PO-24.

“Hay dos formas de vivir la vida. Una es pensar que nada es un milagro. La otra es pensar que todo es un milagro.” Albert Einstein

“Elige un trabajo que te guste y no tendrás que trabajar ni un día de tu vida. “ Confucio

AGRADECIMIENTOS Desde que inicié este programa de Doctorado en Biotecnología impartido entre las dos universidades: Universidad de Panamá y Universidad de Granada, puedo mirar hacía atrás y decir que se ha recorrido un camino muy interesante, lleno de experiencias. Quiero agradecer en primer lugar a la Universidad de Panamá por haber abierto este programa, por las clases, ricas en conocimientos impartidos por distintos profesores. Quiero dar un agradecimiento especial al Doctor Tomas Díez como coordinador de este programa y persona que me apoyó mucho en este camino.

Este tipo de experiencias en primer lugar abren camino para conocer gente, las necesidades del país, y en este sentido quiero agradecer la suerte de haber conocido a la Dra. Gradys Cossio, pediatra- genetista del Hospital del Niño, quién me presentó la problemática de salud que existe en Panamá y la necesidad de realizar estudios científicos. Sin este enlace entre el hospital y la universidad, no sería posible hacer investigaciones biomédicas aplicadas, tan necesarias para los países como Panamá. Gracias a todos los directivos del Hospital por abrirnos puertas y poder conseguir las muestras de sangre requeridas para este estudio. Gracias a la doctora Gradys Cossio por su positivismo y gran espíritu de luchadora constante por mejorar las condiciones de la investigación en el hospital.

Sin el apoyo del Doctor Darío Acuña- Castroviejo de la Universidad de Granada no sería posible hacer este estudio completo y novedoso. Gracias, Doctor Acuña, por depositar su confianza en mí, por compartir sus conocimientos, por ofrecerme una oportunidad de aprender las técnicas y poder realizar las determinaciones completas en su laboratorio.

Agradezco a la Doctora Germaine Escames por su don de gente, su amabilidad y apoyo en los momentos difíciles. Estos aspectos son sumamente valiosos cuando uno se encuentra frente a nuevos retos. Muchas gracias, Germaine, por tu paciencia, de todo mi corazón.

Sin la sonrisa y un trato tan amable de todos los miembros del laboratorio este trabajo de día a día no sería nada fácil. Muchísimas gracias a Aracely, Ana, Anilla, Carolina, Carmen, José Antonio, Francis, José Carlos, Mariam, Miquel, Alberto, Laura y Luís Carlos.

Agradezco a mi esposo Antonio, por estar a mi lado, brindándome ánimo y confianza. Gracias, mi amor, por saber escucharme y apoyarme en los momentos difíciles.

Nada en mi vida sería posible sin el apoyo de mis padres, muchas gracias, papá y mamá por darme sus consejos, ánimo y esperanza. Sin ustedes no podría lograr muchas cosas en mi vida.

Finalmente, agradezco a la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología de Panamá por haber financiado una parte de este proyecto que corresponde al estudio de haplotipos del cluster beta en los pacientes panameños con anemia falciforme.

-Abreviaturas-

Iryna Rusanova

ABREVIATURAS ADN: ácido desoxirribonucleico

NADPH: nicotinamida adenina

ARN: ácido ribonucleico

dinucleótido fosfato

BH4: tetrahidrobiopterina

NOS: óxido nítrico sintasa

b-NFkB

O2-•: anión superóxido

Ca2+: calcio

ONOO-: peroxinitritos

ELAM-: molécula de adhesión

PCR: reacción en cadena de la

endotelial de leucocitos 1

polimerasa

eNOS: óxido nítrico sintasa endotelial

RFLP: fragmentos de restricción de

GPx: glutation peroxidasa

longitud variable

GRd: glutation reductasa

RNS: especies reactivas de nitrógeno

GSH: glutation reducido

ROS: especies reactivas de oxígeno

GSSG: glutation oxidado

SOD: superóxido dismutasa

H2O2: peróxido de hidrógeno

SCD: sickle cell disease (anemia de

HO•: radical hidroxilo

células falciforme, inglés)

IL: interleuquina

TNF-: factor de necrosis tumoral 

iNOS: óxido nítrico sintasa inducible

XO: xantina oxidasa

LPO: peroxidación lipídica

-Índice-

Iryna Rusanova

ÍNDICE Introducción 1. Anemia falciforme……………………………………………………..….. 2 1.1. Historia……………………………………………………..……. 2 1.2. Epidemiología…………………………………………….…..….. 4 1.3. Diagnóstico…………………………………………………...….. 7 1.4. Clínica de la enfermedad……………………………………...….10 1.5. Fisiopatología de la anemia falciforme………………………..….12 1.5.1. Fisiología de la hemoglobina ……………………….…12 1.5.2. Polimorfismos de genes del cluster beta………….........15 1.5.3. Otros polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)…….17 1.5.4. La variaciones en la expresión de la hemoglobina fetal...19 1.5.5. Niveles del estrés oxidativo asociado a la hemólisis…….20 1.5.6. Reducción en la biodisponibilidad de óxido nítrico……..21 2. Haplotipos de anemia falciforme……………………………………………24 3. Anemia falciforme y estrés oxidativo………………………………………..29 3.1. Radicales libres y enzimas involucradas en su producción…………29 3.2. Sistemas antioxidantes………………………………………………32 3.3. Fuentes de radicales libres en la anemia falciforme……………….. 37 3.4. Consecuencias del estrés oxidativo en la anemia falciforme……….39 4. Estrategias terapéuticas en la anemia falciforme…………………………..39 4.1. Terapias tradicionales………………………………………………..39 4.2. Terapias alternativas…………………………………………………40

Hipótesis y Objetivos…………………………………………. 44 Material y métodos…………………………………………… 48 1. Pacientes y preparación de las muestras……………………………….….. 50 2. Métodos analíticos……………………………………………………………52 2.1.

Estrés oxidativo…………………………………………………… 52 2.1.1.

Determinación de la concentración de proteínas: método

de Lówry……………………………………………………….. 53

Iryna Rusanova

2.1.2. Determinación de glutatión oxidado y glutatión reducido……..53 2.1.3. Determinación de la actividad enzimática de la glutatión peroxidasa (GPx)………………………………………….…………..55 2.1.4. Determinación de la actividad enzimática de la glutatión reductasa (GRd)………………………………………….……………56 2.1.5. Lipoperoxidación……………………………………………….57 2.1.6. Determinación de nitritos……...………………………………..58 2.1.7. Determinación de la actividad enzimática de la superóxido dismutasa……………………………………………………………...60 2.2.

Parametros hematológicos………………………………………….62

3. Análisis de AND……………………………………………………………… 63 3.1. Extracción de AND………………………………………………….63 3.2.

Análisis de haplotipos con la técnica de RFLP……………………..64 3.2.1.

PCR……………………………………………………..64

3.2.2.

RFLP……………………………………………………64

3.2.3.

Electroforesis……………………………………………65

4. Análisis estadístico………………………………………………………….. 69

RESULTADOS……………………………………………………………………….72 1. Haplotipos del cluster globínico beta………………………………………. 74 1.1. Datos generales de los pacientes y del grupo control……………….74 1.2. Haplotipos del cluster globínico beta………………………………..75 1.3. Distribución geográfica de los haplotipos identificados…………….79 2. Correlación de los haplotipos de anemia falciforme identificados en pacientes atendidos en el Hospital del Niño de Panamá con el fenotipo clínico de la enfermedad (leve, moderada y severa) y los datos hematológicos………………………………………………………………….80

Iryna Rusanova

2.1. Análisis de fenotipo clínico de acuerdo a los haplotipos del cluster globínico beta…………………………………………………………81 2.2. Valores hematológicos de acuerdo a los haplotipos determinados..82 2.3. Análisis de los valores hematológicos de acuerdo a las manifestaciones clínicas de los pacientes con anemia falciforme……82

3. Valoración del estrés oxidativo en el grupo de enfermos y el grupo control…………………………………………………………………………84 4. Correlaciones entre el estrés oxidativo y los haplotipos del cluster globínico beta, manifestaciones clínicas y los niveles de HbF expresados en los pacientes con anemia falciforme…………………………………………….88 4.1. Resultados del estrés oxidativo de acuerdo a los grupos haplotípicos………………………………………………………….88 4.2. La relación entre los biomarcadores del estrés oxidativo y el fenotipo clínico de anemia falciforme en la población panameña…………...90 4.3. La relación entre los biomarcadores del estrés oxidativo y la expresión de HbF en los pacientes falcémicos de Panamá…………………….92

DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS……………………………………………...94 1. Haplotipos del cluster globínico beta………………………………………. 96 1.1. Datos generales de los pacientes y del grupo control………………..96 1.2. Haplotipos del cluster globínico beta…………………...…………...96 2. Correlación de los haplotipos de anemia falciforme identificados en pacientes atendidos en el Hospital del Niño de Panamá con el fenotipo clínico de la enfermedad (leve, moderada y severa) y los datos hematológicos……………………………………………………………… 100 3. Valoración del estrés oxidativo en el grupo de enfermos y el grupo control……………………………………………………………………….. 103 4. Correlación del estrés oxidativo con los haplotipos, fenotipo clínico de la enfermedad y los niveles de HbF expresados……………………………... 108 CONCLUSIONES…………………………………………………………………...114

BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………….119

2

-Introducción-

Introducción

1. ANEMIA FALCIFORME.

1.1.

Historia.

La primera observación de eritrocitos falciformes se realizó en 1910 por James Herrick en un frotis de sangre periférica de un estudiante negro originario de la Grenada, el cual murió a los 32 años a causa de neumonía. Debido a la forma anormal de los eritrocitos, Herrick por primera vez utilizó el término de ―enfermedad falciforme‖. Sin embargo, tuvieron que pasar 15 años antes de que esta enfermedad fuera considerada como primaria y no debida a una infección u otra condición (Savitt y colbs., 1989). En el año 1917 Víctor Emnel por primera vez usó el término ―anemia de células falciformes‖, para establecer una entidad clínica definida, sobre la base del descubrimiento de Herrick y referiendose a la peculiar y alargada forma de las células falciformes. Hann y Guillespie, en 1927, descubrieron que la deformación de los eritrocitos estaba relacionada con el estado de oxigenación de la hemoglobina (Hb) en el desempeño de su función, y que se podía provocar esta forma falciforme saturando de dióxido de carbono una suspensión de eritrocitos. En 1947, el norteamericano James Neel, en el artículo de revisión ―The Clinical Detection of the Genetic Carriers of Inherited Disease‖ publicado en la revista Medicine (Neel, 1992), postuló la hipótesis de herencia autosómica recesiva para la anemia falciforme. Dos años después, James Neel confirmó la hipótesis en la revista Science (Nell, 1949) tras estudiar 21 familias de niños con anemia falciforme, de manera que los individuos enfermos eran homocigóticos recesivos y los individuos aparentemente sanos, que presentaban glóbulos rojos falciformes y normales, eran heterocigóticos y portadores de la enfermedad. Por lo tanto, en cada pareja de padres portadores existe un 25% de probabilidades de que nazca un hijo con anemia falciforme independientemente del sexo (Chang y colbs., 1995). Una gran aportación en el entendimiento de la base molecular de anemia falciforme fue hecha por Pauling LC, Premio Nobel de Química en 1954. Pero años antes, en 1949, Pauling, junto con Harvey Itano, S. J. Singer e Ibert Wells, publicó en la revista Science la primera prueba de la relación entre una enfermedad humana y un cambio en una proteína específica (Pauling y colbs., 1949). Utilizando la 2

Introducción

electroforesis, demostraron que la hemoglobina de los pacientes con anemia falciforme tiene la carga eléctrica diferente a la de las moléculas de personas sanas. Afirmó que la enfermedad puede ser provocada por alteración en una molécula protéica, de manera que la herencia podía influir en las mutaciones de dicha proteína, marcando así el inicio de la genética molecular. Poco después, en el año 1959, Vernon M. Ingram (Ingram, 1959) demostró que la hemoglobina S es el resultado de una mutación en el codón 6 del gen de la globina β en la que la base adenina es sustituida por la timina (GAG  GTG) lo que ocasiona que el ácido glutámico en la posición 6 de la globina sea sustituido por la valina. Como esta sustitución se lleva a cabo en una posición superficial de la molécula de hemoglobina y la carga eléctrica es diferente, la movilidad electroforética de la HbS es menor que la de la hemoglobina normal, pudiéndose ser fácilmente separada por electroforesis. El test de Murayama (Murayama M y Nalbandian RM, 1973) muestra que una solución concentrada de HbS desoxigenada se convierte en gel, mientras que la Hb adulta (HbA) desoxigenada sigue siendo soluble. Además, desde aquella época la patología es considerada como una enfermedad relacionada con el rasgo racial, ya que en su mayoría afecta a la raza negra. Drepanocitosis (del griego drepanon=hoz, y kytos= células) es otro término que determina la presencia en sangre de hematíes en forma de media luna; y es sinónimo al término anemia falciforme.

La hemoglobinopatía S, o drepanocitosis, o SCD (sickle cell disease en inglés). Puede existir bajo 4 formas diferentes: 

Forma heterocigota o rasgo falciforme (HbAS). Aparece cuando la mutación se

encuentra en uno de los dos alelos que codifica para la proteína globina β (βA/ βS). En este caso, el paciente tiene un 30-40% de HbS y no presenta manifestaciones clínicas. 

Forma homocigota o anemia de células falciforme (HbSS). Aparece cuando la

mutación afecta a los 2 alelos del gen correspondiente a la cadena β (βS/βS). En estos casos, prácticamente toda la Hb (75-95%) es HbS, siendo el resto (5-15%) la fetal (HbF). Presenta una variedad de síntomas clínicos, desde ligeros hasta muy graves. 

Forma doble heterocigota HbS-talasemia (HbS-Tal). Aparece cuando en el

mismo paciente coexisten 2 alelos anormales, uno para la HbS y otro para la β3

Introducción

talasemia (βS/βtal). Si la síntesis a nivel del gen talasémico es nula (β0-tal), la cantidad de HbS será prácticamente la misma que en el estado homocigoto (70-90%). Si, por el contrario, sólo presenta una disminución en el gen talasémico (β+- tal), se observa la coexistencia de HbA (10-30%), HbS (60-85%), y una pequeña proporción de HbF (5%). No son tan graves como las formas de herencia tipo homocigoto HbSS y predominan en el área mediterránea más que en la raza negra. 

Forma doble heterocigota HbS-HbC (HbSC). Se debe a la coexistencia de 2

alelos anormales. Un alelo codifica la síntesis de HbS y el otro, la síntesis de HbC (βS/βC). No existe HbA mientras que existen cantidades similares de HbS y HbC (50%). La expresión clínica suele ser menos severa. 

Otras formas de asociación de HbS con distintas hemoglobinopatías (Ángeles,

G-Philadelphia, HbO Arab, etc) pueden tener una variabilidad clínica diversa.

1.2.

Epidemiología.

La anemia falciforme y la beta-talasemia son las dos de las enfermedades genéticas más frecuentes del mundo. Según los datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se estima, que un 7% de la población mundial porta genes de las hemoglobinopatías, y el 50% de estas hemoglobinopatías viene dado por la anemia falciforme o drepanocitosis (Cao y colbs., 1998). Cada año nacen alrededor de 300.000-400.000 niños con drepanocitosis, y la prevalencia de esta enfermedad oscila entre 0,1/1.000 en los países no indémicos, hasta 20/1.000 en algunas partes del continente Africano (Weatherall and Clegg, 2001). En todo el mundo, hay más portadores de talasemias que de anemia falciforme, pero la elevada frecuencia del gen de la drepanocitosis en ciertas áreas da lugar a elevadas tasas de recién nacidos afectados por esta enfermedad. La mayor concentración del gen para la drepanocitosis se da en la población negra de África ecuatorial, donde hay grupos con el gen que afecta hasta a un 40% de la población (Chang y colbs., 1995), y es aún más frecuente en Benín (Nigeria) y África oeste central (Lukens y colbs., 1993). También se presenta en países de la cuenca mediterránea, como Turquía, Grecia, Italia, España y Oriente Medio, así como en los países árabes e India Oriental. En

4

Introducción

América se da en los Estados Unidos (en personas de origen africano o afroamericano) y en el Caribe, América Central y del Sur (Brasil) (Lukens y colbs., 1993). Esta distribución se debe a que la población con el rasgo falciforme es resistente a la malaria, una enfermedad transmitida por un parásito, el Plasmodium falciparum, que vive en el interior de los hematíes durante una etapa de su ciclo vital. En zonas donde la malaria ha sido históricamente endémica, ha favorecido a la población poseedora del rasgo falciforme, aumentando la prevalencia del alelo HbS (Thomas y colbs., 2001). El gen de la drepanocitosis se ha hecho frecuente en África porque el rasgo heterocigoto confiere cierta resistencia al paludismo por Plasmodium falciparum durante la infancia, favoreciendo así la supervivencia del huésped y la consiguiente transmisión del gen de la hemoglobina anormal. Aunque la presencia de un único gen anormal puede proteger del paludismo, la herencia de dos genes anormales produce anemia falciforme y no confiere la mencionada protección, por lo que el paludismo constituye una importante causa de enfermedad y muerte en niños con anemia drepanocítica (Föller y colbs., 2009). La anemia falciforme tiene importantes repercusiones en la salud pública. Sus efectos en la salud humana se pueden evaluar en función de la mortalidad infantil. La proporción de niños afectados que sobreviven más allá de los cinco años es cada vez mayor, pero aun muchos niños corren el riesgo de muerte prematura. Cuando el impacto en la salud se mide en función de la mortalidad de los menores de cinco años, la anemia falciforme es la causa de la muerte de un 5% de este segmento de población en el continente africano (Modella and Darlison, 2008); de más de un 9% en África occidental y de hasta un 16% en determinados países como Nigeria. El 24% de la población es portadora del gen mutante, y la prevalencia de la anemia falciforme es de aproximadamente 20 casos por cada 1.000 nacidos. Esto significa que sólo en Nigeria nacen anualmente unos 150.000 niños con esta hemoglobinopatía (Magaña y colbs., 2002). La detección masiva de anemia falciforme en Estados Unidos surgió en el año 1975. Un seguimiento en la evaluación de estos niños y la administración temprana de penicilina redujo notablemente la morbilidad y la mortalidad en los niños diagnosticados. La supervivencia media estimada en los Estados Unidos de América en 1994 era de 42 años para los hombres y 48 años para las mujeres, mientras que en 5

Introducción

el año 2001 era de 53 años para los hombres y 58,5 años para las mujeres. En Jamaica, donde existe una gran migración del continente africano, la mayor mortalidad se registra entre los 6 y los 12 meses de vida, que es cuando fallece el 10% de los pacientes, pese a la considerable experiencia en el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad y a la ausencia de paludismo. En África subsahariana la mitad de los pacientes con anemia falciforme mueren antes de los cinco años, generalmente por infecciones como el paludismo y la sepsis neumocócica, o por la propia anemia. En general, en los últimos años, la esperanza de vida ha mejorado notablemente estimándose que el 85% de los niños con anemia falciforme sobreviven hasta los 18 años. La anemia falciforme representa un importante problema para la salud pública (Roberts and de Montalambert, 2007). Solo en Estados Unidos entre los años 1989 y 1992 se registraron 75.000 hospitalizaciones por año. En 1996 estas hospitalizaciones supusieron un coste de $475 millones de dólares (Ashley-Koch y colbs., 2000). Según los estudios de la Organización Panamericana de la Salud (OPS) en el año 2004, la prevalencia de HbS en algunos países latinoamericanos es importante, aunque las muestras de individuos estudiados varían entre 150 en Guatemala hasta más de 20.000 en Brasil (Tabla 1).

Tabla 1. Prevalencia de HbS en algunos países latinoamericanos, según los datos de la OPS, 2004. País

No. De Individuos

%

Brasil

21372

6,2

Colombia

1184

11,9

Costa Rica

1830

8,1

Cuba

6996

6,1

Guatemala

150

18,3

México

-

11,2

Venezuela

2132

8,7

Panamá

7604

16,0

En Panamá, según algunos estudios realizados, existe un 8 % de la población afectada por esta enfermedad (Schroeder y colbs., 1900). Sin embargo, no hay datos 6

Introducción

claros actualizados y publicados sobre la prevalencia de drepanocitosis en la República de Panamá. Sólo recientemente y gracias a la aprobación de la ley nacional de tamizaje neonatal en el año 2007, se va a poder a realizar un diagnóstico masivo y determinar la prevalencia de anemia falciforme.

1.3. Diagnóstico.

Las técnicas para el diagnóstico de anemia falciforme han evolucionado al igual que nuestro conocimiento sobre esta enfermedad. Existen varias técnicas de laboratorio que permiten hacer una detección temprana de drepanocitosis y que luego deben ser comprobados con las técnicas de biología molecular. La HbS resulta de la sustitución de un aminoácido con carga (ácido glutámico), situado en la sexta posición de la cadena ß, por otro neutro (valina). Esta modificación de la carga superficial de la hemoglobina disminuye la solubilidad de la Hb, especialmente en su estado reducido (deoxi-Hb), y facilita la formación de agregados fibrilares o polímeros de molécula de Hb que alteran profundamente la morfología eritrocitaria y aumentan su rigidez.

Las técnicas que se utilizan para el diagnóstico de drepanocitosis son las siguientes:

1.

Inducción de drepanocitosis: En un medio carente de oxígeno (O2) la

hemoglobina S se hace menos soluble y forma agregados cristalinos con la consiguiente formación de drepanocitos. Se coloca una gota de sangre en un portaobjetos, se le agrega metabisulfito de sodio 2%, que es un reactivo consumidor de O2, se tapa con un cubreobjetos y se sellan los bordes con petrolato; en pocos minutos se puede observar el fenómeno (Winterbourn, 1974).

2.

Prueba de solubilidad de la hemoglobina: Aquí también ocurre una

desoxigenación de la hemoglobina S, pero utilizando sustancias como el dithionato sódico, que hace que la hemoglobina S se haga insoluble y precipite, observándose turbia la solución (Huntsman y colbs., 1970). Esta prueba es más fácil y rápida de realizar, pero puede dar falsos negativos en los pacientes con anemia severa, a menos que se realice junto al hematocrito, y en casos de hemoglobina F aumentada. Los 7

Introducción

falsos positivos pueden estar dados por otras causas de turbidez como en las disglobulinemias (Surve y colbs., 2000).

Figura 1. Inducción de drepanocitos en metabisulfito de sodio (aumento 100x).

3.

Electroforesis de hemoglobina: Prueba diagnóstica principal que involucra

separación de las diferentes clases de hemoglobina por movilidad que difiere según su carga molecular y tamaño. Sin embargo, algunas hemoglobinas migran juntas en un medio alcalino (acetato de celulosa) (Figura 2) y es necesario repetirla a un pH ácido (agar citrato) en que pueden migrar diferente (Figura 3). Por ejemplo, la hemoglobina C y la A2 migran juntas en acetato de celulosa (Kohn J, 1969), pero separadas en el agar citrato y, en este medio, la hemoglobina F se separa mejor. Entre las técnicas complementarias

utilizadas

para

identificar

hemoglobinas

anormales

o

electroforéticamente ―silenciosas‖, se menciona la isoelectrofocalización como el método de elección por su rapidez y facilidad, además de la seguridad de los resultados (Dacie JV y Lewis SM, 1991).

Figura 2. Electroforesis de Hb en acetato de celulosa a un pH 8.6, para mostrar el sitio de migración de diferentes Hb.

4.

Figura 3. Electroforesis de Hb en agar citrato a un pH 6,2, para comparar con la electroforesis en acetato de celulosa.

HPLC (cromatografía líquida de alta presión) es un método automatizado de

alta precisión que permite detectar distintas moléculas de hemoglobina (F, A, S, C, E 8

Introducción

y D). Es suficiente contar con la muestra de sangre en forma de frotis en papel filtro. Además, esta técnica es un método útil para la cuantificación inicial de HbS y F en el seguimiento de los tratamientos (Surve y colbs., 2000).

5.

Diagnóstico molecular: basado en el uso de las enzimas de restricción

específicas que son capaces de detectar el cambio de un sólo nucleótido en la cadena de ADN. La digestión con la enzima de restricción DdeI es para confirmación del genotipo de la mutación A→T en el codón 6 (6 GAG→GTG), que permite salir de la duda en caso de la talasemia beta, o HbD que puede alterar el análisis de los haplotipos. La enzima reconoce el sitio 5’-C•TNAG-3’. Si la muestra tiene la mutación S, la enzima no es capaz de realizar el corte (figuras 4 y 5) (Varawalla, 1992).

Figura 4. La enzima DdeI corta las secuencias en posiciones 27, 40, 62, 107, 488, 576. El nucleótido rojo indica el sitio mutado.

A: CCT-GAG-GAG S: CCT-GTG-GAG

DdeI

Pro –Val – Glu 5

6

7

5'

3'

-/- = SS 308 pb

+/+ = AA

Figura 5. Uso de la enzima DdeI para confirmar el diagnóstico HbS.

9

Introducción

1.4. Clínica de la enfermedad.

Las manifestaciones clínicas de la anemia drepanocítica clásica han sido bien definidas desde hace mucho tiempo y se han caracterizado por un conjunto de signos y síntomas própios de una anemia hemolítica crónica grave, con incremento de la susceptibilidad a las infecciones, retraso del crecimiento y desarrollo, crisis de dolor por oclusión vascular, cuadro torácico agudo, síndrome de secuestro esplénico, daño tisular, trastornos del sistema nervioso central, crisis aplásicas y hemolíticas y asplenia funcional (Rodgers y Schetcher, 1991). La anemia falciforme tiene un amplio espectro de manifestaciones clínicas. La mayoría de los afectados presentan anemia crónica con una hemoglobinemia de alrededor de 8 g/dl.

De acuerdo al estudio cooperativo de SCD, se definen los siguientes síntomas severos de anemia falciforme (Inati y colbs., 2003): 

Accidente cerebro vascular: síndrome neurológico agudo vascular debido a la oclusión o hemorragia. Los síntomas o signos neurológicos se prolongan más de 24 horas.



Síndrome torácico agudo: presencia de un nuevo infiltrado pulmonar en asociación con una enfermedad aguda del tracto respiratorio.



Crisis de dolor: dolor en brazos y piernas, espalda, abdomen, pecho o cabeza que dura al menos 2 horas, y que requiere atención médica. Existen dos tipos de crisis: ―crisis dolorosa o infártica‖, que se caracteriza por dolor óseo intenso y fiebre en la que no se producen cambios en la concentración de Hb; y ―crisis de secuestro‖ que suele afectar a los lactantes y niños pequeños en la que se produce un descenso rápido de la concentración de Hb en sangre y puede producir ―crisis hemolítica‖ que se caracteriza por una disminución de Hb e ictericia intensa (Ballas, 1991).



Dactilitis: sensibilidad o dolor con o sin hinchazón de las manos y pies.

 Secuestro esplénico: atribuido a la ampliación esplénica de al menos 2 cm por debajo del margen costal y una disminución de los niveles de hematocrito por debajo del 20%.

10

Introducción

La clínica de los pacientes con anemia falciforme varía inmensamente a pesar de que existe la misma mutación genética. Algunos autores clasifican

los cuadros

clínicos como grave o severo, moderado y suave, dependiendo de la presencia o ausencia de los síntomas descritos anteriormente. Los distintos subfenotipos de la clínica de anemia falciforme fueron sugeridos por Ballas en 1991, quién notó que los pacientes con frecuentes crisis de dolor tenían una evolución distinta a los que tenían ulceraciones en los píes (Ballas, 1991). La variedad clínica de anemia falciforme sigue siendo el rompecabezas para los científicos y clínicos, y se busca encontrar la explicación de ello en la fisiopatología de esta enfermedad. La situación de anemia crónica produce daños, muchas veces irreversibles a distintos órganos.

Órganos afectados: Bazo: las células falciformes tienen una vida media más corta y, por tanto, son atrapados en el bazo, para ser destruidos. El secuestro esplénico es causado por el atrapamiento de las células rojas en la circulación del bazo, causando disminuciones en los niveles de Hb y un rápido aumento del órgano. Inmediatamente se requiere tratamiento con transfusiones, y un 50% requiere esplenectomía. Sistema nervioso central: se producen pequeños infartos que pueden ser clínicamente silenciosos, pero que a largo plazo producen defectos cognitivos que pueden ser detectados con

pruebas neuro-psiquiátricas. Pacientes adultos pueden

presentar aneurismas y hemorragias cerebrales. La mayoría de los pacientes con daños cerebrales requieren terapia de transfusión, y en el caso de los niños, trasplante de la médula ósea. Huesos y articulaciones: los problemas óseos se inician en la infancia. En los huesos y articulaciones se producen episodios de vaso oclusión, que conllevan a que se desarrollen anormalidades en las vertebras. La necrosis en los hombros y las caderas causan episodios de dolor que pueden requerir una intervención quirúrgica. La enfermedad puede conllevar a que se desarrollen las infecciones de las articulaciones, que acaba con la colocación de prótesis. Ojos: curiosamente, los pacientes que llevan un cuadro clínico más suave y tienen valores de hemoglobina más altos, son los que más sufren problemas oftalmológicos. La mayoría de estos daños se revelan a una edad adulta y pueden 11

Introducción

consistir en hemorragias oculares, desprendimiento de la retina y oclusiones de la arteria retinal central (Claster y Vichinsky, 2003). Sistema genitourinario: los problemas del aparato genitourinario son bastante frecuentes en pacientes con SCD. Se desarrolla esclerosis glomerular, que se manifiesta con proteinuria, y más de 5% de los pacientes desarrollan daño renal crónico. Otro gran problema es el priapismo: dolorosa y persistente erección debido a la obstrucción vaso-oclusiva de drenajes venosos de pene. Aproximadamente el 89% de los hombres desarrollan algún episodio de priapismo, que si llegan ser prolongados pueden resultar en impotencia (Claster y Vichinsky, 2003). Sistema pulmonar: el síndrome torácico agudo está en segundo lugar como causa de admisión hospitalaria. La situación se agrava por infecciones y/o embolias de grasa en las arterias pulmonares. Se desarrollan daños crónicos pulmonares que resultan en hipoxia y fibrosis pulmonar. Uno de cada tres pacientes desarrolla hipertensión pulmonar y esto disminuye significativamente la esperanza de vida de los pacientes. La principal causa de muerte en mayores de cinco años suele ser el síndrome torácico agudo, con fiebre, dolor torácico y leucocitosis. Se ha indicado que hoy en día la supervivencia de los pacientes con anemia falciforme guarda relación con la frecuencia de estas crisis (Claster y Vichinsky, 2003). 1.5.

Fisiopatología de la anemia falciforme.

1.5.1. Fisiología de la hemoglobina.

La Hb es una molécula compleja presente en los eritrocitos; su función es transportar el oxígeno a todos los tejidos del organismo. Se integra con cuatro cadenas peptídicas (globinas), cada una unida a una molécula de protoporfirina ferrosa (grupo hem), sitio donde se fija y se desplaza el oxígeno. En un hematíe hay alrededor de 280 millones de moléculas de Hb, cada una con un peso molecular de 64.458 Dalton, forma elipsoide y dimensiones 64x55x60 Aº.

12

Introducción

Figura 6. Estructura del grupo hemo de Hb, de las cuatro cadenas globinicas que forman un tetrámero conjugado, y del cromosoma 11, donde se codifica la estructura de las cadenas globinicas , , , .

Existen varias formas de hemoglobinas normales: más de 95% de la hemoglobina del adulto y de los niños mayores de 7 meses es la HbA1, compuesta por dos cadenas α y dos cadenas  (α2 2). La HbA2 es la hemoglobina que se encuentra en menor concentración en los adultos (2,5%) y está compuesta por dos cadenas α y dos cadenas . Se representa como α2 2. La HbF es el componente principal de la Hb de recién nacido. Su concentración disminuye en los primeros meses de vida y está constituida por dos cadenas α y dos . Las hemoglobinas Gower I (z2ε2), Gower II (2ε2) y Portland (2z2)

son

embrionarias y sólo aparecen durante el primer trimestre de gestación (Hoppe y colbs., 2004). La Hb Gower II es la más importante y alcanza entre 50% y 60% de toda la Hb embrionaria (Hardison, 1996). Al parecer, las cadenas polipeptídicas épsilon () y zeta (z) se sintetizan en el saco vitelino, y la Hb embrionaria tiene mucha mayor afinidad por el oxígeno. Se han descrito más de 400 variantes anormales de hemoglobinas, que difieren entre sí en uno o más nucleótidos, lo que puede traducirse en cambio de aminoácidos que repercute en la función de la proteína. Las alteraciones en la estructura de Hb se denominan hemoglobinopatías. Existen varias hemoglobinopatías: las más comunes son α- y - talasemia, que se caracterizan por deficiencia en la síntesis de una de las 13

Introducción

dos globinas, y hemoglobinopatías estructurales producidas por una mutación puntual en la estructura de la proteína. La alteración en la hemoglobina S (HbS) es la más frecuente a nivel mundial, y conlleva a la producción de anemia hemolítica crónica (Peñalosa-Espinosa y cols., 2008). Entre otras hemoglobinopatías estructurales podemos mencionar las de HbC y HbE. La HbC se caracteriza por la sustitución del ácido glutámico de la posición 6 de la cadena beta por lisina. Es una hemoglobinopatía propia de África occidental, pero puede encontrarse con cierta frecuencia en España. El estado homocigoto (CC) se caracteriza por una ligera anemia hemolítica crónica con esplenomegalia. El estado heterocigoto (AC) no produce trastorno alguno. Aunque la HbC tiende a polimerizarse en condiciones de hipoxia, no produce crisis vaso oclusivas como las de la HbS (Peñalosa-Espinosa y cols., 2008). La HbE (26 GluLys) es más frecuente en el sur de Asia y se han hecho estudios que sugieren que esta variante de Hb también ofrece cierta protección contra la malaria (Steinberg, 1995). La anemia falciforme es la primera enfermedad congénita en la cuál fue identificado el error genético específico. Durante muchas décadas fue considerado que la única causa de vaso-oclusión era la acumulación de eritrocitos falciformes en los capilares que conllevaba a los daños orgánicos. El concepto cambió a finales del siglo XX debido a las evidencias de interacción entre las células sanguíneas circulantes y el endotelio, aumento de la adhesión celular, detección de los factores de inflamación, biomarcadores de estrés oxidativo elevados y cambios en el equilibrio del sistema de vasoconstricción-vasodilatación. Finalmente, Hebbel fue el primer científico quién sugirió la presencia de la disfunción endotelial generalizada que afecta el curso clínico de la enfermedad (Hebbel y colbs., 1985; Kaul y colbs., 1989). La disfunción endotelial se define como un estado patológico caracterizado por el desequilibrio entre la producción de factores vasodilatadores y vasoconstrictores, entre las propiedades procoagulantes y anticoagulantes y por alteración de la permeabilidad vascular. Entre los factores involucrados en la disfunción endotelial se consideran los siguientes: hemolisis activado por el estrés oxidativo elevado, biología de la producción de óxido nítrico (NO), adhesión celular e inflamación (Mack y Kato, 2006).

14

Introducción

La vaso-oclusión, responsable de las crisis de dolor y daño multiorgánico, se relaciona con la inflamación, un aumentado estrés oxidativo y la disfunción endotelial. Además, se producen cambios en la disponibilidad de sustratos y cofactores para la enzima óxido nítrico sintasa, que conlleva a la disminución de biodisponibilidad de óxido nítrico y el aumento en la formación de las especies reactivas de nitrógeno. Otros estudios también indican que aumenta la respuesta inflamatoria microvascular, del mismo modo que durante la ateroesclerosis e hipertensión (Mack y Kato, 2006). Se produce un desequilibrio en el funcionamiento de las células endoteliales que conlleva al aumento de vasoconstricción y adhesión celular.

1.5.2.

Polimorfismos de genes del clúster globínico beta.

Los aspectos genéticos más estudiados son los cambios de un solo nucleótido o SNPs en el bloque o clúster de genes beta, denominados haplotipos del clúster beta. El clúster globínico beta (HBB, gene ID: 3043), se localiza en cromosoma 11 (11p15.5) y contiene alrededor de 45 kb, incluyendo cinco genes funcionales y un pseudogen (ver figura 7). El orden de ubicación de los genes en la dirección desde terminal 5' hacía terminal 3' es: épsilon, gamma G, gamma A, beta 1 pseudogen, delta, beta. Todos estos genes tienen una estructura similar (dos exones y tres intrones) que lleva a concluir que se derivan de un solo gen ancestral. Los genes de las globinas son regulados durante el desarrollo y se expresan en los momentos específicos de la vida humana. El gen épsilon y los dos gamma se expresan en las etapas embrionaria y fetal, en los tejidos eritroides, mientras que los genes delta y beta se expresan en la vida adulta. Las cadenas globinicas , , ,  están compuestos por 146 aminoácidos y poseen homología estructural. De la misma forma, las cadenas z y α son productos de genes localizados en el extremo 5‫ ׳‬del cromosoma 16, y están compuestos de 141 aminoácidos. El análisis del ADN de diversos individuos en distintas poblaciones ha puesto de manifiesto que existen mutaciones productoras de polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos está alterada (por ejemplo, variantes de la Hb), y también diferencias en las secuencias nucleotídicas que no alteran la función del gen. Estas variantes ―silenciosas‖ se definen como polimorfismos del ADN. Se ha calculado que aproximadamente una de cada 100 bases es polimórfica, ello significa que en esa 15

Introducción

posición puede haber nucleótidos distintos, y se ha demostrado que estas variaciones se presentan casi exclusivamente en las regiones adyacentes a los genes y en los intrones, mientras que las secuencias de los exones se mantienen prácticamente constantes. La introducción de técnicas de biología molecular, entre ellas, el uso de enzimas de restricción obtenidas de bacteriófagos específicos, dió un nuevo impulso para el estudio de la HbS al encontrar que existen distintos patrones de digestión o restricción dentro del clúster beta y que además, se relaciona con sus orígenes geográficos. Las técnicas de biología molecular hacen posible la determinación de los distintos haplotipos del clúster S a través de los 11 sitios polimórficos (Nagel y Fabry, 1984). La presencia o ausencia del sitio polimórfico produce los llamados fragmentos de restricción de longitud variable (en inglés, restriction fragment length polymorphisms, o RFLP). Ciertas enzimas ―cortadoras‖ o de restricción tienen afinidad exclusiva por los distintos puntos polimórficos en la cadena de ADN y por lo tanto se usan para dividirla en sus diferentes RFLP. Cuando se habla de haplotipos se hace alusión a los diversos patrones o fragmentos polimórficos de ADN a lo largo de una misma región cromosómica (Chang y colbs., 1995). La combinación o patrón aleatorio de los sitios de restricción polimórficos en un cromosoma es lo que define el haplotipo de un gen.

El clúster beta se divide en clúster 5' y 3'.

Figura 7: Esquema de cluster globínico beta.

Desde la primera descripción de estos fragmentos por Kan y Dozy (Kan y Dozy, 1980), se ha demostrado que al menos hay 5 tipos de HbS: SS-Benín, SS-Bantú (CAR, República Central Africana), SS-Senegal, SS- Camerún, SS-Árabe-Hindú (Peñuela, 16

Introducción

2005; Ofori-Acquah y colbs., 2002). Otros autores prefieren hacer la clasificación en seis haplotipos, separando el haplotipo Árabe-Hindú en Arabé-Saudi y Asiático-Índio (Rodríguez y Saénz, 1998). La importancia de conocer los haplotipos radica en que los de tipo Bantú y Benín acusan una gravedad mayor que los de tipo Senegal, Arabé-saudi y Asiáticoindio, en los cuales los pacientes pueden presentar síntomas diversos desde el segundo mes de vida, razón por la que requieren mayor y mejor atención médica continua (Peñalosa-Espinosa y colbs., 2008). Por ejemplo, se ha visto que los neonatos con haplotipo Bantú (CAR) en su estado homocigoto tienen un mayor riesgo para desarrollar accidentes cerebrovasculares (Schacter y colbs., 1988). También hay estudios donde no se encuentra la correlación entre la gravedad clínica de la enfermedad y los haplotipos (Inati y colbs., 2003).

1.5.3.

Otros polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs).

Recientemente se han hecho estudios que asocian polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) de varios genes con la gravedad clínica de la anemia falciforme. El uso de técnicas modernas de biología molecular (cDNA microarrays, análisis de polimorfismos, proteómica) permiten identificar polimorfismos (SNPs) de los genes que potencialmente pueden influir en diferentes aspectos de la fisiopatología de la anemia falciforme. En la tabla 2 citamos algunos de los genes posiblemente involucrados en las manifestaciones clínicas de la anemia falciforme.

Como podemos observar, casi todos estos genes están relacionados con la inflamación, proliferación celular, reactividad vascular y apoptosis, lo cuál apoya la idea que drepanocitosis es una enfermedad que se caracteriza por la disfunción endotelial e inflamación (Kutlar, 2007).

17

Introducción

Tabla.2. Genes que posiblemente impactan en la fisiopatología de anemia falciforme. Gen estudiado

Asociado a

Referencia

SNPs en los genes de fosfodiesterasa 7

Aumento

(PDE7), proteína asociada a

producción de HbF

en

la Kutlar, 2007

microtubulo7 (MAP7), factor de biogénesis peroxisomal7 (PEX7) y proteína kinasa 5 mitogeno-activada (MAP3K5). Receptor

de

Interleucina-4

(IL-4R, Accidente

cerebro- Kutlar, 2007

S503P), factor de necrosis tumoral vascular (TNFα,-308G)

y

receptor

-

adrenergico-2 (ADRBP, Q27E). Óxido nítrico sintasa 2 (NOS2A,

T- Hipertensión

Sharan y colbs.,

786C) y factor de crecimiento de pulmonar, priapismo, 2004; receptor beta tipo II (TGFBR2).

úlceras en los pies, Koch síndrome

Ashleyy

colbs,

torácico 2005.

agudo. Factor de crecimiento de receptor beta Coagulación, adhesión Ashley-Koch tipo III (TGFBR3),

celular, priapismo

Aquaporina (AQP1)

colbs,

y

2004,

Elliott y colbs., 2007.

Gen reductasa

methylenetetrahydrofolato Necrosis avascular (MYHFR),

la

mutación

Milner y colbs., 1991

C677T Receptor de Interleucina-4 (IL-4R,

Accidente

S503P), factor de necrosis tumoral

vascular

(TNFα,-308G), receptor beta

cerebro- Hoppe y colbs., 2004, Hoppe y colbs., 2007.

adrenérgico (ADRB2), molécula de adhesión celular vascular (VCAM1,1594), receptor de lipoproteína de baja densidad LDLR. 18

Introducción

1.5.4.

Las variaciones en la expresión de la hemoglobina fetal.

La hemoglobina fetal tiene mayor afinidad por el oxigeno e inhibe la polimerización de HbS, permitiendo llevar cantidades suficientes de oxígeno a los tejidos periféricos. La concentración de HbF al nacer es de 80% pero disminuye al cumplir los seis meses de vida. Varios factores influyen en las variaciones de HbF en los pacientes SCD: edad, sexo, cantidad de las globinas alfa, haplotipos del cluster globínico beta y locus ligado al cromosoma X, que regula la producción de los eritrocitos F (FCP). Cada una de estas variables presenta asociación con los niveles de HbF, pero la participación de FCP es de mayor prevalencia (40%) (Chang y colbs., 1995). En los pacientes con anemia falciforme se ha observado que los niveles elevados de hemoglobina fetal y los haplotipos Senegal y Árabe/Hindú se asocian con el cuadro clínico menos grave (Ruiz Cruz y colbs., 2003). También, Nagel y colaboradores (Nagel y colbs., 1991) demostraron que la presencia de por lo menos un cromosoma con haplotipo Senegal, a diferencia de otros haplotipos africanos, se asocia con altos niveles de HbF y un curso clínico mas leve. Los altos niveles de HbF se relacionan a su vez con el polimorfismo en la región promotora del gen G (-158 (CT)) que regula la expresión de HbF (Lu y Steinberg, 1996). Sin embargo, otros estudios sugieren que los niveles de hemoglobina fetal son importantes, pero no son los únicos factores que afectan la gravedad de la enfermedad. Por ejemplo, se encontraron altos niveles de HbF en pacientes con haplotipos CAR en el Líbano que no parecen mejorar la severidad de síntomas, lo que sugiere que existen otros factores y que los niveles de HbF no son los principales determinantes de la gravedad de esta enfermedad (Inati y colbs., 2003). La utilización de hidroxiurea es uno de los tratamientos más aceptados hasta ahora. Se piensa que el principal mecanismo de acción es el aumento de los niveles de HbF. Hidroxiurea es un citotóxico que causa la regeneración eritroide y también su metabolismo da lugar a un aumento en Guanilil ciclasa soluble dependiente de óxido nítrico, con una elevación de cGMP que aumenta la expresión de gen de globina gamma (Cokic y colbs., 2003). A pesar su amplio uso en la práctica médica, no todos los pacientes respondan al tratamiento con hidroxiurea. Además, se han encontrado SNPs que participan en el metabolismo de hidroxiurea y en la respuesta a 19

Introducción

la misma (Steinberg, 2005). La predicción de cómo un individuo responde al tratamiento con hidroxiurea, podría ayudar a una mejor selección de los pacientes para este fin y reducir al mismo tiempo los efectos por su toxicidad. Desafortunadamente, a pesar de algunas pistas interesantes, no es posible predecir actualmente la respuesta al tratamiento con esta molécula.

1.5.5.

Niveles del estrés oxidativo asociados a la hemólisis.

Los glóbulos rojos de los pacientes anémicos tienen una membrana mucho más frágil y son mucho más vulnerables a producir hemolisis. La hemolisis supone un aumento de la destrucción prematura de los eritrocitos. Si la vida media de los eritrocitos normales es alrededor de 120 días, en un individuo con SCD los eritrocitos tienen una vida media entre 4 y 21 días. Antes se pensaba que la hemolisis se debía al contenido de HbS polimerizada y adherida a la membrana que la hace ser más rígida. Hoy día se ha demostrado que estos eritrocitos se encuentran en condiciones de alto estrés oxidativo, que provoca daño en la membrana celular. Parece ser que la hemolisis es uno de los factores implicados en la heterogeneidad de las complicaciones de esta enfermedad. Evidencias recientes demuestran que los pacientes con las complicaciones agudas, tales como hipertensión pulmonar y sistémica (Morris y colbs., 2005), priapismo (Nolan y colbs., 2005), ulceraciones cutáneas (Nolan y colbs., 2006) y riesgo de muerte repentina en los niños, se caracterizan por altos niveles de hemolisis, una vasculopatía proliferativa y disfunción en el sistema vasomotor (Morris y colbs., 2005). Se puede estimar la hemolisis a través del índice de reticulocitos. La otra forma de medir la hemolisis es a través de lactato deshidrogenasa (LDH), arginasa I y ratio arginina/ornitina, en el plasma. A cambio, los pacientes con las manifestaciones clínicas clásicas de la enfermedad, que incluyen crisis de dolor y síndrome torácico agudo, están más asociados con la patogénesis que involucra vaso-oclusión, infartos e inflamación (Platt y colbs., 1994, Kaul y Hebbel, 2000). La patogénesis de la hemolisis incluye daños en la membrana debido al estrés oxidativo. La producción de los radicales libres de oxigeno (ROS), disminución en la 20

Introducción

efectividad del sistema antioxidante, peroxidación de lípidos y proteínas de las membranas eritrocitarias conllevan a la salida del contenido hacia el espacio extracelular. El estrés oxidativo a su vez provoca activación de la iNOS (Escames G, 2006) y VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), que a su vez potencia producción de las especies reactivas de nitrógeno, vasoconstricción y la producción de la hipertensión arterial (Kato, 2007; Aslan, 2007). Por tanto, la posibilidad de estudiar los niveles del estrés oxidativo como un biomarcador de estado y avance de anemia falciforme y su posible relación con los haplotipos, tiene una significancia clínica (Kato, 2007; Aslan, 2007; Wood y Granger, 2007). Además, las ROS pueden desactivar directamente a la proteína NOS endotelial (Schulz y cols., 2004), responsable de producir NO, un importante vasodilatador. Los eritrocitos poseen un sistema de defensa complejo y eficiente en el cual se incluye el sistema glutatión y las enzimas como la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT), la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Glu-6PDH) y la NADH o NADPH metahemoglobina reductasa. Se ha demostrado que en los eritrocitos SS se generan cantidades excesivas de ROS debido a la presencia de la HbS inestable y la oxidación espontánea del hierro en el grupo hemo. Por otra parte, la vaso-oclusión que ocurre en la drepanocitosis provoca daños por isquemia-reperfusión y activación de procesos inflamatorios tisulares que aumentan la producción y liberación de ROS, así como la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) (Aslan y cols., 2003; Schulz y cols., 2004), que contribuye a la producción de las especies reactivas de nitrógeno (RNS). En los estudios con eritrocitos se ha demostrado que los niveles de anión superóxido

(O2-•),

radical

hidroxilo

(OH•)

y

peroxidación

lipídica

son

aproximadamente 2 veces mayores en pacientes con drepanocitosis que en donantes voluntarios (Ren, 2008). Igualmente se encontró una disminución en la producción o liberación de óxido nítrico durante las crisis vasooclusivas (Schulz y cols., 2004).

1.5.6.

Reducción en la biodisponibilidad de óxido nítrico.

Al NO se atribuye una serie de funciones importantes que participan en el mantenimiento del buen funcionamiento vascular. A parte de ser un vasodilatador, 21

Introducción

inhibe la agregación plaquetaria y la adhesión de los leucocitos, la proliferación y la migración de las células del músculo liso, y tiene efectos antioxidantes y antiinflamatorios (Mack y Kato, 2006). El NO liberado del endotelio difunde hacia las células musculares adyacentes, donde reacciona con hierro ferroso del grupo hemo de guanilato ciclasa aumentando la síntesis de guanosín monofosfato cíclico (cGMP) a través de guanosín trifosfato (GTP). A su vez, el cGMP activa la proteín kinasa G (PKG), que estimula el bombeo activo de Ca++ hacía sus depósitos, disminuyendo los niveles de Ca++ intracelular y, por tanto, produciendo una relajación muscular, vasodilatación y aumento del flujo sanguíneo local (Ignarro y colbs., 1987; Lincoln y Cornwell, 1993). El mismo mecanismo señalizado por el sistema cGMP/PKG a su vez inhibe la agregación plaquetaria (Radomski y colbs., 1987). La reducción de Ca++ intracelular en plaquetas disminuye la expresión de P-selectina y suprime la expresión de glicoproteína IIb/IIIa, requerida para las uniones de fibrinógeno y la activación de coagulación (Loscalzo, 2001). El NO también es un potente antagonista de la inflamación (De Caterina y colbs., 1995). En parte este efecto se debe a que NO induce la expresión de IBα, un importante inhibidor del factor NF-B (Peng y colbs., 1995). A su vez NF-B, controla la expresión de varios genes involucrados en la inflamación y en la respuesta inmune, tales como VCAM-1, ICAM-1, y E-selectina. Actualmente se estudian las posibilidades de uso de NO para la prevención de adhesión de las células rojas al endotelio. Por ejemplo, se ha demostrado que los donadores exógenos de L-arginina y NO previenen la acción protrombótica causada por la inhibición de la eNOS en las vénulas (Broeders y colbs., 1998). El NO se sintetiza a partir de la L-arginina mediante la acción de la NOS y casi enseguida adquiere un electrón no apareado, transformandose en radical de óxido nítrico (NO) (Ghafourifar and Cadenas, 2005). En el medio extracelular NO reacciona con el oxígeno y agua, formando aniones de nitratos (NO3-) y nitritos (NO2), los cuáles conjuntamente se denominan como NOx. Se conocen tres isoformas de la NOS cuyos nombres se deben al sitio donde primeramente fueron encontradas: NOS neuronal (nNOS o NOS 1), inducible (iNOS o NOS 2), endotelial (eNOS o NOS 3). La eNOS se expresa de forma constitutiva, se encuentra en las células endoteliales, plaquetas y el cerebro y su actividad es calcio-calmodulina dependiente (Gladwin y Kato, 2008). La inhibición de la eNOS conlleva a un efecto 22

Introducción

vasoconstrictor y provoca efectos secundarios graves, como la hipertensión pulmonar, una de las causas de crisis y de muerte de individuos con anemia falciforme. Esta hipótesis se apoya en algunos estudios que demuestran que aumentando la actividad eNOS se mejora vasodilatación, mientras, en ratones SCD con eNOS inhibida se produce una mayor vasoconstricción (Nath y colbs., 2000). La iNOS se induce ante determinados estímulos, es capaz de sintetizar NO• en cantidades mil veces superiores a las normales y es calcio-calmodulina independiente. En ciertos procesos como la inflamación, hipoxia y el estrés oxidativo, la actividad y la expresión de la iNOS aumentan (Crespo y colbs., 1999; Sullivan y colbs., 2008). El NO• reacciona con O2•-, produciendo grandes cantidades de peroxinitritos (ONOO-), tan tóxicos como el HO• (Cadenas y colbs., 1996). También se encuentra un incremento de esta enzima en los pacientes hipertensos (Escames y colbs., 2004). Se ha demostrado que la inhibición de la producción de los radicales libres mejora la clínica de estas patologías (Crespo y colbs., 1999; Escames y colbs., 2004, López y colbs., 2008). La expresión de la iNOS está aumentada en los riñones y el hígado de los pacientes y/o ratones SCD (Mack y Kato, 2006; Diwan y colbs., 2002; Aslan y colbs., 2003). Desde los años noventa, los datos producidos en el laboratorio y con animales de experimentación proporcionaron gran información para comenzar a establecer los efectos de los eritrocitos falciformes y la hemolisis crónica sobre la disfunción endotelial y el metabolismo de NO•. Por ej., French y colbs. (1997) demostraron que la administración de las drogas inhibidoras de la eNOS en ratas provoca cambios en el endotelio cerebral, disminuye el flujo sanguíneo cerebral y aumenta la mortalidad. En los ratones SCD la reducción de concentración de NO• se asocia con el aumento en la degradación de fibrina y en la producción de trombos (Ballas y colbs., 1988). Las tres causas más importantes de la disminución de biodisponibilidad de NO• son: disminución de L-arginina en el plasma, consumo de NO• mediante la hemoglobina extracelular (Reiter y colbs., 2002) y a través de su reacción con ROS (Mack y Kato, 2006). Una de las consecuencias de la hemolisis es la liberación de la arginasa, que a su vez degrada la L-arginina, precursor necesario para la síntesis de NO•. Se ha observado que la actividad de la arginasa es dos veces mayor en pacientes con

23

Introducción

hipertensión pulmonar, dando como resultado un bajo ratio arginina/ ornitina, y una menor disponibilidad de NO• (Morris y colbs., 2005).

Figura 8. Efectos de la hemolisis sobre la biodisponibilidad de óxido nítrico (Gladwin y Kato, 2008). El NO• reacciona con la desoxiHb y la oxiHb formando nitrosilHb (Hb(Fe

2+

)-

NO) y metHb, respectivamente (Gibson y Roughton, 1957). Las constantes de estas reacciones están en el orden de 3-5 x107M -1·S -1, que significa una vida media de 1 µseg para el NO•. Con esta vida tan corta, la concentración de NO• no sería suficiente para activar a la guanilato ciclasa y no produciría sus conocidos efectos de vasodilatación (Peñuela, 2005; Herold y colbs., 2001). La reducción de biodisponibilidad de NO• puede predisponer a la crisis vasooclusiva y/o los procesos inflamatorios, ya que NO• inhibe la formación de las moléculas inflamatorias: VCAM-1, ICAM-1 y ELAM-1 (Rother y colbs., 2005). Es más, en los ratones con otras anemias, por ejemplo, con anemia hemolítica alloinmune, se ha visto que se desarrolla la hipertensión pulmonar asociada a una disminución en vasodilatación causada por una menor biodisponibilidad de NO• (Dweik y colbs., 1998).

2.

HAPLOTIPOS DE ANEMIA FALCIFORME.

Los haplotipos que más se asocian con los diversos aspectos clínicos son los haplotipos del extremo 5‫ ׳‬del clúster beta. 24

Introducción

Figura 9. El patrón de digestión del clúster con distintas enzimas de restricción (Zago y colbs., 2000). Los primeros estudios de distribución geográfica de los β haplotipos demostraron que la mutación ocurrió independientemente, al menos en tres ocasiones en África, en la Península Arábica y la India Central (El-Hazmi y colbs., 1999; Ruiz y colbs., 2003; Ofori-Acquah y colbs., 2004). En estos grupos étnicos existen varios haplotipos, pero hay un haplotipo más predominante que es el que se denomina de acuerdo al sitio. Por ejemplo, el haplotipo Senegal es más común en Senegal, donde también está presente el haplotipo Benín. El haplotipo Benín es mas común (92%) en Yoruba, Nigeria, pero también es común en Jamaica (aprox. 71%), aunque Bantú y Senegal también están presentes en Jamaica. La distribución geográfica de los s haplotipos clásicos se atribuye a los sitios de origenes independientes (Hanchard y colbs., 2007). La mutación βS apareció hace aproximadamente 30.000 años, es mucho más reciente que la separación de los genes β y α (hace mas de 450 millones de años atrás) y está relacionada con la aparición del sedentarismo humano y seleccionada bajo la presión ejercida por la malaria (Rodríguez y Saénz, 1998). Se ha demostrado que los haplotipos s clásicos son altamente conservados a lo largo de cientos de bases (Hanchard y colbs. 2007), pero también existen otros haplotipos menos frecuentes. Basándonos en el uso de las cinco enzimas de restricción dentro del clúster , tales como ε-HincII, G-HindIII, A-HindIII, 5'ψ-HincII, 3'ψ25

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HincII, podemos distinguir los haplotipos 5' mas comunes, denominados de acuerdo al sitio de su origen, y otros haplotipos encontrados, pero menos frecuentes (Shimitzu y colbs., 2001).

Tabla 3. Patrón de digestión de los haplotipos 5' del clúster globínico beta. Haplotipo Benin Bantu (CAR) Senegal Cameron ArabeHindu 1 2 3 Haplotipo 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

ε-Hinc + + + + ε-Hinc + + + + + + +

G-HindIII + + + + G-HindIII + + + + + + + + + + + +

A-HindIII + + A-HindIII + + + + + + -

5'ψ-HincII

3'ψ-HincII

+ +

+ + + +

5'ψ-HincII

+ 3'ψ-HincII

+ + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + -

El signo mas (+) significa corte de una región específica de ADN con la enzima de restricción mencionada, y el signo menos (-) significa no corte.

Se ha observado que el principal beneficio conferido por algunos de estos haplotipos en relación con la gravedad de la drepanocitosis se explica en términos de su relación directa con las concentraciones sintéticas de Hb fetal, que suele considerarse ―antifalciforme‖ porque no copolimeriza con la HbS, a la que torna más soluble. Los diferentes polimorfismos del gen de la HbS estimulan una mayor o 26

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menor síntesis de HbF, además, modifican la proporción de las cadenas G y A de la HbF en el adulto drepanocítico (Powars, 1991; Rodríguez y colbs., 1994; Powars y colbs.). Los haplotipos Sen y Árabe-hindú se asocian con mayor producción de las cadenas G, y por ende mayor porcentaje de la HbF. En el neonato y en el niño de pocos meses hay más cadenas G que cadenas A (razón 6:4). En la medida en que se inactiva la síntesis de HbF en años posteriores, se activa un mecanismo genético que favorece un descenso más acelerado de la producción de cadenas G en relación con cadenas A (Powars y colbs., 1990; Nagel, 1991), por lo que después del cuarto o quinto mes de edad la razón G:A empieza a ser 4:6, como en el adulto (Nagel, 1991). Los haplotipos Senegal y Árabe-hindú se asocian con mayores concentraciones de HbF y con la conservación de razón G:A del período neonatal normal, 6:4, lo que posiblemente contribuye a la clínica más leve. Además, los estudios del clúster globínico beta permiten hacer conclusiones de orígenes antropológicos de las poblaciones. En las Américas, los haplotipos βs permiten entender mejor las raíces ancestrales africanas de las poblaciones de raza negra. Por ejemplo, varios estudios hechos en América Central apuntan que allí predenomina el haplotipo CAR.

Tabla 4. Los parámetros de HbF, ratio G: A y la clínica de acuerdo al haplotipo del clúster beta. Haplotipo Benín (Ben)

Conc. de HbF Intermedia 5-15%

Ratio G: A 1:1

Clínica Gravedad intermedia, más leve que CAR, las principales complicaciones son uremia y la insuficiencia o disfunción de órganos importantes, tales como cerebro, riñón e hígado. De estos pacientes, 90% presentan crisis de osteonecrosis importantes después de los 20 o 25 años de edad.

Ubicación geográfica Occidente centroafricano

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Haplotipo

Conc. HbF

Rep. Centroafricana (CAR) o Bantú Senegal (Sen)

Camerún (Cam) Arabéhindú

de

Ratio G: A

Clínica

Ubicación geográfica

Muy baja,