UNIVERSIDAD DE LA HABANA CENTRO DE INVESTIGACIONES MARINAS

HEREDABILIDAD Y CORRELACIONES GENETICAS Y FENOTIPICAS PARA CARACTERES DE CRECIMIENTO EN EL CAMARON BLANCO Litopenaeus schmitti (Burkenroad, 1936), (Decapoda, Dendrobranchiata).

Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas.

Autor: M.C. Ubaldo Bécquer Zuñiga Tutores: Dra. ANA MARIA IBARRA HUMPHRIES Dra. GEORGINA ESPINOSA LOPEZ

CIUDAD DE LA HABANA 2005

A: Eloina, Laura y Niurka

AGRADECIMIENTOS

En estas "corridas" de mÿs de un quinquenio son muchos los dþbitos por agradecimientos, a continuaciýn tratarþ cronolýgicamente no solo que se sientan aludidos, si no expresarles mis mÿs sinceras gracias, por la ayuda recibida y el compromiso de actuar consecuentemente con la confianza depositada, para el vencimiento de este grado cientüfico, y su aplicaciýn en nuestro paüs. Agradezco: Mþxico: a la Dra Ana Marüa Ibarra Humphries, quien de acuerdo con

nuestras

autoridades acadþmicas me acogiý tres veces en su lab, a su equipo de trabajo y estudiantes eventuales de postgrado: Ing.Josþ Luis Ramirez, biýloga Susana, Macklys, Gabriel y los hoy graduados: Fabiola, Carlos, Pedro, Chalüo, Cesar, Martün, al resto de la comunidad del CIBNOR, BCS. A quien considero parte de mi familia y agradezco permitirme compartir con la de ellos, la familia Ruiz-Beltrÿn: Cþsar, las Anas, el junior y el Ilde. Yaguanabo, Cienfuegos:

A los humildes trabajadores de este laboratorio que nos

acogieron como suyos: directivos, servicio, tþcnicos, choferes, custodios y operadores de mantenimiento; a mis genes paternos dispersos por Trinidad. CIM-UH: ..a nuestra profesora de Zoologüa III, hace muchos aûos; la Dra Marüa Elena Ibarra Martün, nuestra directora actual, muchas gracias por apoyarnos con todos los recursos a su alcance: para financiar viajes, dietas, salarios, compra de insumos especüficos, a mis colegas del CIM-UH. Biologüa: ..a nuestra profesora de Bioquümica I y II, hace muchos aûos tambiþn, la Dra Georgina Espinosa Lýpez, por su ejemplo laboral, sus consejos, su paciencia, su conducciýn satisfactoria de toda esta aventura, gracias. A los GEDECANES y el resto del MIP por permitir utilizar sus instalaciones y apoyarnos en este experimento. Menciýn especial a mis amigos que contribuyeron con sus prþstamos cibernþticos a mi promiscuidad para el anÿlisis de los datos y confecciýn de los documentos obligatorios: Rogelio, Ariel Ruiz, Gabriel Mÿrquez, Arial Arias, Cesar-Ana, postgrado del CIBNOR, Aidita, Tania-Laida, Erick PB, Yuriem, mis amigos del CNAP-CITMA, entre otros. A los profesores Vicente Berovides Alvarez y Raquel Ponce de Leýn, asü como el Consejo Cientüfico de la Facultad de Biologüa e invitados del CIM-UH, por la oponencia en la predefensa, A todos, muchas gracias.

SINTESIS

En Cuba el cultivo de camarÿn marino Litopenaeus schmitti ha sido una actividad priorizada por el Estado, por la cantidad de empleos que genera y los ingresos obtenidos por la comercializaciÿn del producto final. Trabajos previos indican el conocimiento de la estructura genþtica de las poblaciones de esta especie empleando marcadores moleculares, existen estudios sobre reproducciÿn y nutriciÿn. Finalmente, el cierre del ciclo de cultivo en cautiverio sumado a la experiencia de casi dos dþcadas en esta actividad promueven la necesidad de comenzar el mejoramiento genþtico de L. schmitti por crýas selectivas en el paýs. En este trabajo se describe una metodologýa para la formaciÿn de grupos genþticos por inseminaciÿn artificial, colocando el producto sexual de cada macho a cuatro hembras, obteniendo

cuarenta y siete (47) grupos, con los que se evaluaron

parümetros genþticos y correlaciones, en caracteres relacionados con el crecimiento en los estadios de postlarvas tempranas, juveniles, preadultos y adultos, en el camarÿn blanco L. schmitti. Los efectos fijos "corrida", "dimorfismo sexual" y el "origen del macho" afectaron de forma significativa los componentes de varianza, en el estimado de parümetros genþticos y correlaciones, teniendo que corregir þstos en el modelo utilizado (MTDFREML). Los estimados de heredabilidad obtenidos en este trabajo para caracteres de crecimiento en L.schmitti, se encuentran entre 0.21 û 0.107 a 0.56 û 0.161, indicando la existencia de variaciÿn genþtica de moderada a media, suficiente para ser explotada en este pie de crýa. Se detectÿ un incremento en los estimados de heredabilidad para caracteres de crecimiento a travþs del ciclo de vida hasta preadultos y una disminuciÿn en adultos, relacionado con el incremento del crecimiento esperado durante el desarrollo hasta un müximo en que se ponen de manifiesto funciones relacionadas con la supervivencia y reproducciÿn. Las correlaciones genþticas obtenidas entre los caracteres de crecimiento evaluados son positivas permitiendo obtener mejoras en unos sin afectaciÿn de los otros. El carücter con la correlaciÿn genþtica müs alta con el peso total es el ancho de cefalotÿrax (1.00) en preadultos

y adultos, y ambos caracteres presentan

heredabilidades entre 0.38 û (0.135) y (0.53 û 0.153). Las correlaciones producto-momento de las medias por familia en la ontogenia de los caracteres de crecimiento, fueron significativas en todos los estadios a partir de juveniles de L.schmitti,

permitiendo predecir desde el estadio juvenil lo que ocurrirü en preadultos y adultos.

INDICE GENERAL Introducción.........................................................................................................1 Capítulo 1. Revisión Bibliográfica.........................................................................8 1.1 Genética como herramienta en el Mejoramiento animal............................................8 1.2 Heredabilidad, Correlaciones y Estadística..............................................................10 1.2.1 Estimación de la heredabilidad..............................................................................10 1.2.2 Correlaciones.........................................................................................................12 1.2.3 Estadística y Mejoramiento genético......................................................................13 1.3 Camarón....................................................................................................................17 1.3.1 Programas de Mejoramiento genético en camarones Peneidos............................20 1.3.2 Cuba: Potencialidades, situación actual y perspectivas.........................................26

Capítulo 2. Materiales y Métodos.........................................................................31 2.1 Población fundadora..................................................................................................31 2.2 Formación de familias................................................................................................31 2.3 Cría de larvas.............................................................................................................35 2.4 Mantenimiento hasta talla de marcaje........................................................................36 2.5 Preadultos y adultos...................................................................................................38 2.6 Tratamiento de los datos originales y Estadística......................................................41

Capítulo 3. Resultados..........................................................................................45 3.1 Comparación entre lotes fundadores..........................................................................45 3.2 Formación de grupos genéticos por inseminación artificial........................................45 3.3 Variables morfométricas en el ciclo de vida de L.schmitti...........................................46 3.4 Análisis de significación de efectos fijos y aleatorios..................................................47 3.5 Cálculo de heredabilidades, correlaciones genéticas y fenotípicas por MTDFREML.............................................................................................................49 3.5.1 Varianzas y covarianzas fenotípicas........................................................................49 3.5.2 Varianzas y covarianzas genéticas..........................................................................50 3.6 Correlaciones producto-momento...............................................................................53

Capítulo 4. Discusión.............................................................................................55 4.1 Lotes fundadores.........................................................................................................55 4.2 Grupos genéticos.............................................................................................. ..........57 4.3 Efectos, heredabilidades y correlaciones...............................................................62 4.3.1 Efectos......................................................................................................................62 4.3.2 Heredabilidades........................................................................................................64 4.3.3 Correlaciones............................................................................................................73

Conclusiones...........................................................................................................78 Recomendaciones...................................................................................................80 Referencias.............................................................................................................81

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Componentes de varianza para un diseño de medios hermanos paternos. Tabla 2. Interpretación de los componentes de varianza observados en un análisis de parientes. Tabla 3.Estimas de heredabilidad para caracteres de crecimiento con diferentes modelos en disímiles especies de camarones Tabla 4. Alimentación, intercambio de agua diario y la salinidad para los diferentes estadios y subestadios en la cría de larvas del camarón L. schmitti. Tabla 5. Esquema de alimentación en la cría hasta postlarvas (PL15) de L schmitti . Tabla 6. Origen y época en que se realizaron las diferentes corridas para la formación de las familias. Recorrido de las variables temperatura (0C) y oxígeno disuelto (p.p.m.) en la superficie del agua del estanque en la fase de engorde. Tabla 7. Descripción del análisis de varianza con salida univariada, fuente de variación, grados de libertad y cuadrados medios de los caracteres evaluados, en la morfometría de los genitores procedentes de Tunas de Zaza y Cienfuegos, en el camarón Litopenaeus schmitti. Tabla 8. Resultados del post hoc Tukey (STATISTICA 6.0) en los lotes silvestres parentales. Comparación entre medias (± error estándar) de los caracteres evaluados. Tabla 9. Razones sexuales empleadas en la formación de grupos genéticos en el camarón camarón blanco Litopenaeus schmitti, también se incluye el número de desoves y la cantidad de familias formadas. Tabla 10. Cantidad y tipo de familias formadas por inseminación artificial en el camarón blanco Litopenaeus schmitti, también se incluye el número de reproductores y el número de la corrida. Tabla 11. Valores del cociente entre el número de familias de hermanos completos y el número de machos en los diferentes estadios en la cría de grupos genéticos en Litopenaeus schmitti. Tabla 12. Análisis de significación de los efectos sobre los caracteres. Descomposición del análisis de varianza, grados de libertad(g.l) y cuadrados medios en el estadio de postlarva, del camarón blanco Litopenaeus schmitti. Tabla 13. Comparación entre el cuadrado de las medias utilizadas en los cálculos, (± desviaciones estándares de los valores originales) mediante post hoc Tukey (STATISTICA 6.0), para los caracteres medidos en el estadio de postlarva de L.schmitti. Tabla 14. Análisis de significación de los efectos sobre los caracteres. Descomposición del análisis de varianza en fuentes de variación, grados de libertad(g.l) y cuadrados medios de los caracteres medidos en el estadio de juveniles, del camarón blanco L.schmitti. Tabla 15. Comparación entre el cuadrado de las medias utilizadas en los cálculos, (± desviaciones estándares de los valores originales) mediante post hoc Tukey (STATISTICA 6.0), para los caracteres evaluados en las diferentes corridas en el estadio de juvenil, en L.schmitti.

Tabla 16. Análisis de significación de los efectos sobre los caracteres. Descomposición de la análisis de varianza en fuentes de variación, grados de libertad (g.l.) y cuadrados medios de los caracteres medidos en el estadio de preadultos, del camarón blanco Litopenaeus schmitti. Tabla 17. Comparación entre el cuadrado de las medias utilizadas en los cálculos (± desviaciones estándares de los valores originales) mediante post hoc Tukey (STATISTICA 6.0), para los caracteres medidos por sexo y las diferentes corridas en el estadio de preadultos, en Litopenaeus schmitti. Tabla 18. Análisis de significación de los efectos sobre los caracteres. Descomposición del análisis de varianza en fuentes de variación, grados de libertad(g.l.) y cuadrados medios en el estadio de adultos, del camarón blanco Litopenaeus schmitti. Tabla 19. Comparación entre el cuadrado de las medias utilizadas en los cálculos, (± desviaciones estándares de los valores originales) mediante post hoc Tukey (STATISTICA 6.0), para los caracteres evaluados por sexo y corridas en el estadio de adultos del camarón Litopenaeus schmitti. Tabla 20. Análisis de significación del efecto “origen del macho” (OM) sobre los caracteres, en la corrida 3; descomposición del análisis de varianza en fuentes de variación, grados de libertad (g.l.) y cuadrados medios de los caracteres medidos en el estadio de postlarva del camarón Litopenaeus schmitti. Tabla 21. Análisis de significación del efecto “origen del macho” (OM) sobre los caracteres en la corrida 3; descomposición del análisis de varianza en fuentes de variación, grados de libertad (g.l.) y cuadrados medios de los caracteres medidos en el estadio de juvenil, del camarón blanco Litopenaeus schmitti. Tabla 22. Comparación entre el cuadrado de las medias utilizadas en los cálculos, (± desviaciones estándares de los valores originales) mediante Post hoc Tukey (STATISTICA 6.0), para los caracteres en la corrida 3,. Análisis del efecto “origen del macho” (OM) en los estadios de PL y Juveniles, de L. schmitti. Tabla 23. Análisis de significación del efecto “origen del macho” (OM) sobre los caracteres en la corrida 3; descomposición del análisis de varianza en fuentes de variación, grados de libertad (g.l.) y cuadrados medios de los caracteres medidos en el estadio de preadultos, del camarón blanco Litopenaeus schmitti. Tabla 24. Análisis de significación del efecto “origen del macho” (OM) sobre los caracteres en la corrida 3; descomposición del análisis de varianza en fuentes de variación, grados de libertad (g.l.) y cuadrados medios de los caracteres medidos en el estadio de adultos, del camarón blanco Litopenaeus schmitti. Tabla 25. Comparación entre el cuadrado de las medias utilizadas en los cálculos, (± desviaciones estándares de los valores originales) mediante Post hoc Tukey (STATISTICA 6.0), para los caracteres en la corrida 3. Análisis del efecto origen del macho (OM) en los estadios de preadultos y adultos, de L. schmitti. Tabla 26. Matriz de varianzas y covarianzas fenotípicas en el estadio juvenil de Litopenaeus schmitti. Tomado del fichero de salida Mt-76 del programa MTDFREML.

Tabla 27. Matriz de varianzas y covarianzas fenotípicas en el estadio preadulto de Litopenaeus schmitti. Tomado del fichero de salida Mt-76 del programa MTDFREML. Tabla 28. Matriz de varianzas y covarianzas fenotípicas en el estadio adulto de Litopenaeus schmitti. Tomado del fichero de salida Mt-76 del programa MTDFREML. Tabla 29. Matriz de varianzas y covarianzas genéticas en el estadio de postlarvas de Litopenaeus schmitti. Tomado del fichero de salida Mt-76 del programa MTDFREML. Tabla 30. Matriz de varianzas y covarianzas genéticas en el estadio juvenil de Litopenaeus schmitti. Tomado del fichero de salida Mt-76 del programa MTDFREML. Tabla 31. Matriz de varianzas y covarianzas genéticas en el estadio preadulto de Litopenaeus schmitti. Tomado del fichero de salida Mt-76 del programa MTDFREML. Tabla 32. Matriz de varianzas y covarianzas genéticas en el estadio adulto de Litopenaeus schmitti. Tomado del fichero de salida Mt-76 del programa MTDFREML. Tabla 33. Estimaciones de heredabilidad (± errores estándares) para los diferentes caracteres morfométricos evaluados, en la ontogenia de L.schmitti. Todos los datos. Tabla 34. Estimaciones de heredabilidad (± errores estándares) para los diferentes caracteres morfométricos evaluados, en la ontogenia de L.schmitti. Se extrajeron las familias donde el origen del macho es diferente. Tabla 35. Correlaciones genéticas (rG ± error estándar, bajo la diagonal) y fenotípicas (rP sobre la diagonal) en juveniles, preadultos y adultos de L.schmitti. Todas las observaciones Tabla 36. Correlaciones genéticas (rG ± error estándar, bajo la diagonal) y fenotípicas (rP sobre la diagonal) en juveniles, preadultos y adultos de L.schmitti. Se extrajeron las familias donde el origen del macho es diferente. Tabla 37. Matriz de correlaciones del producto-momento de las medias por familia (N en postlarvas y juveniles =39; preadultos y adultos = 33); y valores de significancia (p), para todos los caracteres evaluados en la ontogenia de L.schmitti.

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Mapa del archipiélago Cubano, mostrando las regiones de captura de la población silvestre de camarón y el laboratorio donde se efectuaron los experimentos. Figura 2. Representación esquemática de las medidas morfométricas en adultos de L.schmitti.

Figura 3. Foto de un abdomen de camarón, mostrando un elastómero de color azul en el último somite abdominal en la porción dorsal derecha.

LISTA DE ABREVIATURAS

PT

Peso total

LC

Largo de cefalotórax

LT

Largo total

AC

Ancho del cefalotórax

H5S

Altura del quinto somite abdominal

H6S

Altura del sexto somite abdominal

2

h

Heredabilidad

PL15

Postlarva con 15 días después de la metamorfosis.

PL60

Postlarva con 60 días después de la metamorfosis, juvenil.

rP

Correlación fenotípica

rG

Correlación genética

Cf

Bahía de Cienfuegos

Tz

Tunas de Zaza

Full sib

Hermanos fraternos o completos

Half sib

Medios hermanos

cov(FS)

Covarianza de hermanos fraternos

cov(HS)

Covarianza de medios hermanos

t

Correlación intraclase

VA

Varianza genética aditiva

VE

Varianza ambiental

VP

Varianza fenotípica

VD

Varianza de dominancia

Ne

Número efectivo poblacional

σ2W

Varianza entre progenies, dentro de hembras.

σ2D

Varianza dentro de hembras.

σ2S

Varianza entre machos.

MTDFREML OM

Máxima verosimilitud restringida libre de derivadas, multicarácter, programa. Origen del macho

INTRODUCCION La acuicultura representa uno de los sectores con mayor crecimiento en la economía mundial. Las capturas de las poblaciones silvestres en la mayoría de las especies acuáticas están por encima de sus rendimientos máximos sostenibles. Los futuros incrementos productivos serán a través de crías en cautiverio. En contraste con organismos desarrollados en las diferentes ramas agropecuarias, la mayoría de las especies acuáticas se encuentran en estadios incipientes de domesticación. Existen pocos estudios sobre selección genética para aumentar caracteres como crecimiento y resistencia a enfermedades, en programas comerciales con especies explotadas por la acuicultura. La aplicación de los principios genéticos en la acuicultura es un fenómeno relativamente reciente, frecuentemente

necesitan

poblaciones

silvestres

para

conformar

sus

reproductores, también la mayoría de las especies cultivadas de plantas y animales acuáticos son muy similares a sus formas silvestres (Lutz, 2001). Gjedrem y Fimland (1995) plantean que un programa de cría selectiva de especies acuícolas exitoso puede ayudar a la industria en la oferta consistente de productos de elevada calidad. La genética puede aplicarse en la acuicultura buscando varios objetivos, no solamente un aumento en la producción, sino también se pueden mejorar varios aspectos como: relaciones alométricas diferentes, cambios en los componentes bioquímicos del músculo, aumento de las adaptaciones a condiciones de cultivo y la conservación de los recursos naturales. El desarrollo y mantenimiento de programas de cría para especies en acuicultura requiere algunos pasos; entre ellos está la definición del carácter a mejorar, la

elección de la población inicial que va a ser utilizada como base para la selección, estimación de los parámetros genéticos, escoger los métodos de selección, desarrollo de pruebas para la evaluación constante de los cambios genéticos y una diseminación eficiente de los animales mejorados en el universo productivo (Tave, 1989). Paralelo a todo lo anterior se pueden utilizar herramientas para acelerar el mejoramiento genético, logrando los objetivos de selección en menor tiempo, como cruzamiento entre líneas, manipulación de sexos, poliploidías, transferencia y mapeo de genes entre otros(Lutz, 2001). Gall (2003) analiza la necesidad de estimar los parámetros genéticos para poder decidir el método apropiado de selección e identificar los caracteres que maximicen el aumento del valor neto de la progenie de los animales seleccionados. Usualmente estos estimados se toman de la literatura científica, o se diseñan experiencias específicas en condiciones parecidas a las de la producción para obtenerlos. Gjedrem (1999) consignó que un buen diseño e implementación de programas de cría en acuicultura debe incrementar la productividad, con una reducción de los costos de producción. Los primeros beneficios consisten en un incremento de la tasa de crecimiento, reducción de la mortalidad y una utilización más eficiente del alimento disponible. El establecimiento y desarrollo de los programas de cría necesitan de una inversión de capital inicial, así como costos operacionales; pero se amortizan muy rápido; en la industria del salmón del Atlántico en Noruega las tasas costo / beneficio están en el orden 1/15 (Gjedrem, 1999). 2

Los análisis clásicos para el mejoramiento genético de plantas y animales terrestres pueden aplicarse a los organismos acuáticos, adaptando en cada caso las características biológicas de la especie objeto de estudio. Los organismos acuáticos generalmente presentan elevadas fecundidades, ciclos de vida complejos con fases larvarias y drásticos cambios morfológicos, fisiológicos y etológicos relacionados con variaciones en los ecosistemas de cría y en las variables físico-químicas, con relativa complejidad para reproducirlas en condiciones artificiales. Se han realizado diferentes estudios en algunas especies con importancia para la acuicultura que informan una elevada variación genética para la tasa de crecimiento, entre los que se encuentran: el salmón del Atlántico (Gunnes y Gjedrem, 1978), peces gatos (Dunham, 1987), trucha de arco iris (Gunnes y Gjedrem, 1981), tilapia (Eknath et al. 1993) y ostras (Lannan, 1972). Este proceso también alcanza, en estadios de desarrollo muy incipiente, a la industria del cultivo de camarones Peneidos. En Cuba el cultivo de camarón marino siempre ha sido una actividad priorizada por el Estado, por la cantidad de empleos que genera y los ingresos obtenidos por la comercialización del producto final. Trabajos previos indican el conocimiento de la estructura genética de las poblaciones de esta especie empleando marcadores moleculares (Espinosa et al. 2003; Borrell et al. 2003); existen estudios sobre reproducción y nutrición (Ramos 1990). Finalmente, el cierre del ciclo de cultivo en cautiverio (Ramos et al. 1995), sumado a la experiencia de casi dos décadas en

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esta actividad promueven la necesidad de comenzar el mejoramiento genético de Litopenaeus schmitti por crías selectivas en el país. Tomando en consideración lo planteado, la HIPÓTESIS de este trabajo fue la siguiente: Existe variación genética suficiente (h2 > 0.20) en caracteres relacionados con el crecimiento del camarón blanco Litopenaeus schmitti y éstos están correlacionados genéticamente (rG > 0.50 ). A partir de esta hipótesis el OBJETIVO GENERAL de este trabajo fue: Estimar la heredabilidad de caracteres relacionados con el crecimiento, así como sus correlaciones genéticas y fenotípicas, en la ontogenia del camarón blanco L. schmitti, a través de los grupos genéticos formados. Con el fin de dar cumplimiento a este objetivo se realizaron las siguientes TAREAS: •

Formación y mantenimiento de grupos genéticos para evaluar caracteres de crecimiento.

•

Evaluación de la significación de los efectos fijos sobre los componentes de varianza en el estimado de parámetros genéticos y correlaciones.

•

Estimación de parámetros genéticos del crecimiento en el camarón blanco, L. schmitti, mediante el uso de programas genéticos específicos, (MTDFREML).

•

Estimación de correlaciones genéticas y fenotípicas entre los caracteres de crecimiento en el camarón blanco L.schmitti, mediante el uso de programas genéticos específicos, (MTDFREML).

4

•

Evaluación de la asociación entre los caracteres de crecimiento y su comportamiento en la ontogenia de L. schmitti, mediante el cálculo de los coeficientes de correlación del producto-momento.

La tesis cuenta con síntesis, introducción, cuatro capítulos, las conclusiones, recomendaciones, y la relación de la bibliografía consultada. En el primer capítulo se describe la relación de la genética y la mejora de los méritos productivos en plantas y animales; se explican los conceptos de heredabilidad, correlaciones genéticas y fenotípicas, así como se describe de forma general el uso de los métodos estadísticos en el mejoramiento genético por crías selectivas. Posteriormente se introduce la especie de camarón objeto de este estudio, se desglosan los principales programas de mejoramiento genético a nivel mundial, culminando este capítulo con las particularidades, situación actual y perspectivas de este tema en Cuba. El segundo capítulo contiene los materiales, métodos y procedimientos que se emplearon en la realización de este trabajo, haciendo énfasis en la metodología para la formación de grupos genéticos, marcaje y evaluación de las variables morfométricas en el ciclo de vida en instalaciones artificiales. Los resultados se presentan en el tercer capítulo, organizados

en

la

comparación

morfométrica

de

las

poblaciones

que

contribuyeron a la formación de familias, características de las variables morfométricas en las diferentes etapas del cultivo, posteriormente se evalúa la significación de los efectos que se introducen en el programa para el cálculo de la heredabilidad del crecimiento y correlaciones genéticas y fenotípicas. Finalmente se obtienen estos valores. 5

En el cuarto capítulo se discuten los resultados y se analiza el aporte de cada uno de ellos al cumplimiento del objetivo del trabajo. El trabajo cuenta con 3 figuras y 37 tablas. Se consultaron 121 citas bibliográficas. La NOVEDAD CIENTÍFICA del trabajo reside en que, por primera vez, para la ciencia, se obtienen valores de heredabilidad para el crecimiento, y correlaciones genéticas en los diferentes estadios en el ciclo de vida del camarón blanco L.schmitti y para un crustáceo con explotación comercial en Cuba.

También

resultan novedosas en la especie y en organismos acuáticos en Cuba, la aplicación de técnicas como obtención, aislamiento y medición de familias de medios hermanos paternos, aplicación de elastómeros para el marcaje de familias y la utilización del programa MTDFREML para la estimación de componentes de varianza. La IMPORTANCIA TEÓRICA de este trabajo descansa en sus aportes al conocimiento de la genética y de la genética cuantitativa en particular de los Peneidos y en especial de L. schmitti a través de todo su ciclo de vida. La IMPORTANCIA PRÁCTICA radica en que la metodología utilizada se podrá aplicar al mejoramiento genético de L. schmitti y a programas de mejoramiento genético con especies afines. Algunos de estos resultados han sido premiados en los balances de investigación del Centro de Investigaciones Marinas-UH y en los Foros de Ciencia y Técnica. La pre-defensa de esta tesis se realizó frente al Consejo Científico de la Facultad de Biología y del Centro de Investigaciones Marinas. Publicaciones relacionadas con la tesis

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1. Increase in spawning quality of the Atlantic White Shrimp (Litopenaeus schmitti) by mating control in first captive generation. U.Bécquer, G. Espinosa, N. Hernández, C. Guerrero. Rev.Inv. Mar. (en prensa). 2. Variación genética y morfológica en poblaciones naturales y cautivas del Camarón Blanco Litopenaeus schmitti en Cuba 2002 G.Espinosa López, U.Bécquer Zuñiga, Y.Borrell Pichs, J. Romo Ramos, R.Díaz Fernández, J.Azanza Ricardo y R de Dios. Pub Electrónica” CIVA 2002 (http://www.civa2002.org Pag 778-784 3. Estimación de la heredabilidad para el crecimiento en postlarvas tempranas del Camarón Litopenaeus schmitti por diseño de medios hermanos paternos. U. Bécquer y G. Espinosa. Pub Electrónica” CIVA 2002 (http://www.civa2002.org Pag 874-876. 4. La Genética en el Cultivo de Camarón Penaeus schmitti en Cuba: Resultados y Perspectivas. 2002. U. Bécquer, R. Díaz, N. Hernández, J. Azanza, G. Espinosa, Y. Borrell, J. Romo C. Guerrero. Revista Acuacultura del Ecuador. Pag 33-36. (El mismo trabajo salió en la Pág web de la Cámara Nacional de Acuicultura de Ecuador. Noticias CNA.html) 5. El cultivo del camarón blanco Litopenaeus schmitti en Cuba. Algunas herramientas que contribuyen a su optimización. “Forum Iberoeka Santiago de Chile Octubre 16-21. 2003” Publicación Electrónica http://www.cyted.com/forumiberoeka2003. Georgina Espinosa López, Ubaldo Bécquer Zúñiga, Yaisel Borrell Pichs, Tania Rodríguez Ramos y Vivian González Pérez. 6. Análisis poblacional del camarón blanco cubano (Litopenaeus schmitti) utilizando aloenzimas como marcadores genéticos. (2003) Georgina Espinosa López, Rogelio Díaz-Fernández, Ubaldo Bécquer Zuñiga, Jorge Matos, Jesús Romo Ramos y Yaisel Borrell Pichs. Rev. Inv. Mar. 24 (1): 11-16 7. Patrones electroforéticos de proteínas durante el desarrollo del camarón blanco Litopenaeus schmitti. D. Hernández, U. Bécquer, M. Montalván, y G. Espinosa. Rev. Inv. Mar. (en prensa).

Los resultados han sido presentados en 5 eventos científicos internacionales y 3 nacionales, entre los que se destacan, el V Congreso Latinoamericano de Acuicultura (Ecuador, 2001); Congreso Internacional de Genética en Acuicultura (Chile, 2003); ACUACUBA 2003 (C.Habana) y MARCUBA 2003 (C. Habana).

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CAPITULO 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1 GENETICA COMO HERRAMIENTA EN EL MEJORAMIENTO. La genética es la ciencia que estudia la herencia de las características observables en los individuos (g.Mendeliana), en las poblaciones silvestres (g.poblacional) y en las poblaciones en cautiverio (g.cuantitativa). Constituyendo el Mejoramiento Genético el campo de aplicación de la genética cuantitativa, que estudia la herencia de los caracteres fenotípicos relacionados con la producción, y establece sobre la base de esos estudios las mejores metodologías para incrementarla, al mejorar genéticamente la población en cautiverio (Falconer, 1989; Falconer y Mackay,1996 ). Los caracteres cuantitativos están influenciados por la acción de múltiples genes (poligenes), causando una continuidad en la distribución de fenotipos en la población. Las características observables en los individuos constituyen su fenotipo, que es determinado por su genotipo y la influencia ambiental. Utilizando las metodologías adecuadas podemos definir que parte del fenotipo es el resultado del genotipo del individuo, después de delimitar los efectos ambientales. También se pueden aplicar herramientas que nos permitan incrementar la veracidad al estimar qué tanto del fenotipo observado en un individuo es heredable a su progenie. La contribución genética de los caracteres productivos, o caracteres cuantitativos como la talla o la tasa de crecimiento, se expresan generalmente como la heredabilidad del carácter evaluado, representando qué proporción de la varianza

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fenotípica observada es debida a efectos genéticos.(Becker,1984; Falconer, 1989; Falconer y Mackay,1996; Lynch y Walsh,1998). La heredabilidad de un carácter métrico es una de sus propiedades más importantes, expresa la proporción de la varianza total atribuible a las diferencias de los valores de cría, y es la que determina el grado de semejanza entre parientes, en sentido estrecho. La función más importante de la heredabilidad en los estudios genéticos de los caracteres métricos es su papel predictivo, expresa la relación del valor fenotípico como guía del valor de cría. Solo el valor fenotípico de los individuos puede ser directamente medido, pero es el valor de cría quien determina su influencia en la próxima generación (Falconer, 1989; Falconer y Mackay,1996). La heredabilidad mide el grado de correspondencia entre el valor fenotípico y el valor de cría. El intervalo de este parámetro es de 0 a 1, indicando cerca de cero un fuerte componente ambiental, mientras que valores cercanos a la unidad representan una elevada influencia genética y un bajo componente ambiental. La heredabilidad es una medida específica de la población y sólo es válida para el ambiente donde se ha determinado.(Falconer y Mackay,1996). Uno de los objetivos de un plan de selección puede ser obtener mayor beneficio con un carácter de elevada heredabilidad (Gall, 1990; Gjedrem,1997; Ibarra, 2000), si se utiliza como criterio de selección se puede esperar mayor progreso genético por generación.

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1.2 HEREDABILIDAD, CORRELACIONES y ESTADÍSTICA. 1.2.1 Estimación de la Heredabilidad (h2). Para obtener estimaciones de la heredabilidad, existen tres métodos: (1) Por análisis de varianzas, (2) por análisis de regresión , y (3) por medio de la respuesta a la selección (Falconer y Mackay, 1996; Roff, 1997; Lynch y Walsh,1998). En los primeros dos métodos es necesaria la subdivisión de la población en estructura de familias de hermanos completos o medios hermanos, ya que esto permite separar la varianza total del carácter en sus diferentes componentes causales, y el conocimiento del grado de relación o parentesco entre los miembros de esas familias nos permite definir qué tanto de la variación total observada para el carácter se debe a variación genética. En un diseño entre parientes para el análisis de los descendientes, un número de machos se aparea al azar con varias hembras. Se mide un número de descendientes por hembra, adquiriendo de esta forma los datos. Las medidas individuales forman una población de familias de medios hermanos paternos y hermanos completos. Se realiza un análisis de varianza, en donde la varianza fenotípica se divide en sus componentes observables atribuibles a las diferencias entre la progenie de diferentes machos (entre machos, σ2S), a las diferencias entre la progenie de hembras copuladas con el mismo macho (entre hembras, un mismo macho, σ2D); y a las diferencias entre individuos descendientes de una hembra (entre progenie, σ2W). Utilizando posteriormente las fórmulas clásicas para la derivación de las varianzas genéticas (Beckert, 1984; Falconer y Mackay, 1996). 10

Las tablas 1 y 2 muestran los componentes de varianza en un diseño de medios hermanos paternos y su interpretación para un análisis entre parientes, obteniendo los estimados del parámetro al aplicar las siguientes fórmulas: h2S = 4 σ2S / σ2S + σ2D + σ2W h2D = 4 σ2D / σ2S + σ2D + σ2W h2S + D = 2 ( σ2S + σ2D ) / σ2S + σ2D + σ2W

Según Falconer y Mackay (1996) se puede valorar la precisión de los estimados de heredabilidad por el cálculo de los errores estándares, es importante minimizar los errores estándares. Cuando se planifican experimentos de heredabilidad, se debe conocer qué número de observaciones se necesitan para cierto grado de precisión; recomendando la mayor posible, dentro de las limitaciones impuestas por la disponibilidad de instalaciones; la cuestión del diseño también depende del número de individuos medidos por familia, limitado también por el espacio, operarios y el costo, si se incrementa el número de individuos medidos por familia, disminuye el número de familias criadas, el problema radica en encontrar el mejor compromiso entre muchos animales medidos y muchas familias criadas, que minimicen la varianza del muestreo. En un análisis entre parientes, al formar grupos genéticos divididos en familias de medios hermanos paternos y hermanos completos, si N es el número de familias, n el número de individuos por familia, el número total de individuos medidos por familias es : T = nN Por lo tanto la correlación intraclase es t, la varianza de muestreo de correlación intraclase es:

σ2 t = 2 [ 1 + (n – 1) t ] 2 (1-t)

2

/ n(n –1) (N-1). La varianza de la

11

correlación intraclase es mínima cuando n = 1 / t , asumiendo que las varianzas por desviación de dominancia

y ambiente común son bajas: t = h2 / 2 para

hermanos completos y t = h2 / 4 para medios hermanos, por lo tanto el diseño más eficiente es n = 2 / h2 para familias de hermanos completos y n = 4 / h2 para diseños de medios hermanos. En ganadería los parentales utilizados a veces son de un grupo seleccionado, sobre la base del carácter donde se va a determinar la heredabilidad, o carácter correlacionado con él; esta selección reduce la varianza entre parentales y consecuentemente la covarianza entre parientes. Cuando el número de descendientes y parentales medidos es semejante, la proporción óptima de los parentales seleccionados en cada grupo es alrededor del 5%.

1.2.2 Correlaciones En los estudios genéticos es necesario distinguir dos causas de correlaciones entre caracteres: genéticas y ambientales. La causa genética de la correlación es principalmente la pleiotropía, y en otros casos el desequilibrio de ligamiento, particularmente en poblaciones derivadas de cruces entre lotes divergentes. La pleiotropía es la propiedad de un gen de afectar dos o más caracteres, por ejemplo genes que incrementan la tasa de crecimiento influyen en la talla y el peso, existiendo correlación entre estos caracteres, sin embargo genes que afectan la acumulación de grasas en el cuerpo influyen sobre el peso pero no sobre la talla, por lo que no hay correlación (Falconer y Mackay,1996). El primer problema a considerar en la estimación de las correlaciones entre caracteres es

12

como las correlaciones genéticas y ambientales se combinan juntas para dar una correlación fenotípica directamente observable. Si ambos caracteres tienen una baja heredabilidad, la correlación fenotípica se determina fundamentalmente por la correlación ambiental, y si poseen una elevada heredabilidad, la correlación genética es la más importante (Roff y Mousseau,1987). La forma de estimar las correlaciones genéticas es análoga a la estimación de la heredabilidad, partiendo de la similitud entre parientes, pero en este caso buscamos descomponer los componentes causales de covarianza entre dos caracteres, mediante un análisis de covarianza, el cual se realiza en el mismo contexto que la heredabilidad, esto es, estructurando a la población con un grado de parentesco conocido que permita derivar las varianzas y covarianzas causadas entre y dentro de familias para dos caracteres. (Beckert, 1984). Las correlaciones genéticas pueden ser estimadas mediante la siguiente ecuación: rG = COVG x,y / (VarG x * VarGy)1/2 donde: rG : correlación genética x,y; COVG producto de las varianzas genéticas de X y Y.

x,y

: covarianza genética x, y; VarG

x

* VarGy:

1.2.3 Estadística y Mejoramiento Genético Gianola (2002) expone que los programas de selección genética en animales intentan maximizar alguna función de mérito que se piensa tiene una base genética. Típicamente, los animales con el mérito esperado más alto se conservan para ser los padres de la siguiente generación, mientras que aquellos con el mérito más bajo son desechados. El mérito puede representarse formalmente

13

mediante una función lineal o no lineal de los valores genéticos para varias características que se consideran importantes desde el punto de vista de generar ganancias económicas o bien de aportar algún beneficio a la humanidad. El componente genético del mérito no puede ser observado, así que tiene que inferirse a partir de las observaciones hechas en los candidatos a selección o en sus parientes. Esto presenta al menos tres problemas estadísticos: 1) determinar si las características que forman parte de la función de mérito tienen una base genética

(estimación

de

parámetros

genéticos);

2)

obtener

métodos

razonablemente precisos para inferir el mérito (“evaluación genética”), y 3) decidir qué hacer con los animales que tengan las mejores evaluaciones. Muchas características observables (ya sean continuas o discretas) parecen tener un modo de herencia poligénico, y están sometidas a influencias ambientales considerables. Las bases de datos de la zootecnia pueden ser muy grandes, multivariadas, distribuirse a veces en forma gaussiana, definitivamente no-normal en otros. La estructura de los datos puede ser de corte transversal o bien longitudinal, extremadamente desbalanceadas, y posiblemente exhiba patrones de datos faltantes no aleatorios. Dado todo lo anterior, no es de extrañar que la estadística haya sido tan importante para la zootecnia. Los modelos para el análisis genético cuantitativo empleados en la zootecnia consisten de los siguientes componentes: 1. Una función matemática que relaciona las observaciones con parámetros de localización y efectos “aleatorios”. Los efectos “aleatorios” pueden incluir 14

componentes genéticas, como pueden ser los valores genéticos aditivos (Falconer y Mackay, 1996), dominancia y desviaciones epistáticas, así como efectos ambientales permanentes. Todos estos factores contribuyen a las correlaciones entre parientes o entre registros longitudinales de caracteres productivos, (formas funcionales lineales). 2. Parámetros de dispersión genética y ambiental, tales como componentes de varianza y covarianza. 3. Supuestos sobre la forma de la distribución conjunta de las observaciones y de los efectos aleatorios (normalidad multivariada). Fisher (1918) estableció las bases para el modelo infinitesimal y se ocupó de las consecuencias de la herencia Mendeliana a nivel fenotípico. El modelo que planteó es: observación = valor genético + residual y obtuvo un precursor del análisis de varianza al proponer una partición de la varianza genética en componentes aditivos y de dominancia. A partir de éstos pueden obtenerse más o menos inmediatamente las correlaciones esperadas entre los distintos tipos de parientes. Kempthorne (1954) expresó la covarianza entre características medidas en parientes en una población que se aparea al azar en términos de componentes genéticos de varianza y covarianza. Otras extensiones adicionales de los modelos genéticos estadísticos han incluido, por ejemplo, efectos maternales (Falconer, 1965), herencia citoplásmica y de clonación (Kennedy y Schaeffer, 1990). 15

El sistema lineal puede ser de orden de varios millones de ecuaciones. Esto es particularmente cierto para modelos, sean univariados o multivariados, en los cuales un efecto genético aditivo es ajustado para cada animal con un registro de producción, así como para animales sin registros en la genealogía, pero que necesitan ser incluidos para reflejar adecuadamente la covarianza genética entre parientes. Debido a que las series de datos en zootecnia pueden ser enormes, desbalanceados, y que los modelos tienen un número considerable de parámetros de localización parásitos, los métodos sencillos similares al ANOVA rara vez producen resultados satisfactorios. Henderson (1953) describió tres métodos para datos desbalanceados. El más general de ellos, usa formas cuadráticas basadas en un ajuste de mínimos cuadrados de varios submodelos, y produce estimadores no-sesgados. Harvey (1970) incorporó este método a un programa de estimación de componentes de varianza y covarianza, y fue usado ampliamente en la zootecnia. Las contribuciones subsecuentes incluyen la estimación no-sesgada de la norma mínima y su versión de varianza mínima (bajo normalidad) de Rao (1971) y La Motte (1973), respectivamente, sin embargo la distribución de muestreo de estos estimadores genera valores negativos para los componentes de varianza, se recurrió por esto a la Máxima Verosimilitud. Puesto que el sesgo que tiene el estimador de máxima verosimilitud de la varianza residual es bien conocido, el método es el de máxima verosimilitud “restringida” (con siglas en idioma inglés: REML), este procedimiento estadístico puede acomodar cualquier estructura de 16

relación genética que posean los datos; utilizando toda la información disponible adecuadamente sopesada; no requiere diseños balanceados, y tienen en consideración la cantidad de parentales seleccionados. Misztal (1998) compara los distintos paquetes de cómputo, los más ampliamente usados para modelos lineales de efectos mixtos son DFREML (Máxima Verosimilitud Restringida Libre de Derivadas, Meyer, 1991), DMU (Análisis de Modelos Mixtos Multivariados, Jensen y Madsen, 1994), MTDFREML (Modelo Multivariado de Máxima Verosimilitud Restringida Libre de Derivadas, Kriese et al., 1994), VCE (Paquete de Modelo Multivariado para la Estimación de Componentes de Varianza Covarianza, Groeneveld, 1994) y ASREML (Gilmour y Thompson, 1998).

1.3 CAMARÓN Los camarones aunque poseen un alto valor todavía no se han domesticado a escala comercial. Una de las dificultades presentes es la selección de animales para el incremento de caracteres productivos debido al elevado coeficiente de variación relacionado con una fuerte influencia ambiental sobre la expresión fenotípica (Hedgecock et al.1982). Epidemias recientes en algunas especies han demostrado la vulnerabilidad de esta industria emergente. La necesidad, y oportunidad para el mejoramiento genético de estos organismos acuáticos es grande. Una condición definitiva para la implementación de un programa de cría selectiva para camarones Peneidos es el control de todo el ciclo de vida en instalaciones 17

artificiales, incluyendo la reproducción, evitando con la introducción de organismos silvestres la posibilidad de contacto con patógenos. El mantenimiento de camarones domesticados es un elemento importante en el desarrollo de una industria sostenible. Gjedrem y Fimland (1995) revisan las potencialidades de las crías selectivas en camarones y la comparan con la industria del salmón, planteando que el objetivo para un programa de cría puede ser la producción de animales más eficientes ; la selección de ejemplares más favorables y adaptados al ambiente donde van a ser criados. Puede combinarse la selección individual y familiar para caracteres con baja heredabilidad (supervivencia, rendimiento), pronosticando una mayor eficiencia. Las estimaciones de ganancia genética para el crecimiento son altas por la elevada fecundidad del camarón, la relativa amplia variabilidad genética y el corto intervalo entre generaciones. Preston (et al. 1999) trabajando con Marsupenaeus japonicus, compararon lotes seleccionados y no seleccionados, obtuvieron una ganancia en tercera generación de selección para el crecimiento del 14%, concluyen que es una implicación significativa para crías selectivas en esta especie. Para implementar los mejores programas de mejoramiento genético basados en la selección, el conocimiento de parámetros, como la heredabilidad de la tasa de crecimiento relativo y las correlaciones genéticas entre caracteres de crecimiento son fundamentales. El uso de los métodos que se basan en el conocimiento de estos parámetros permite obtener la máxima ganancia genética por generación. El análisis de datos productivos de varios laboratorios, que utilizan diferentes lotes 18

con distintas potencialidades productivas, indican que las diferencias genéticas son importantes en la determinación de la talla y el crecimiento en camarones Peneidos (Chow y Sandifer, 1991). La heredabilidad para la tasa de crecimiento ha sido estimada para diferentes camarones Peneidos, como Litopenaeus stylirostris, L. vannamei (Lester, 1988), en esta última especie han realizado sus contribuciones, Lester y Lawson (1990); Fjalestad et al. (1997); Carr et al. (1996); Moss et al (1999); Suárez (et al,1999); Argue et al (2002) en el Instituto Oceánico (HI, EUA); Pérez-Rostro e Ibarra (2003 a y b) en el CIBNOR (México); en Marsupenaeus japonicus se presentan los trabajos de Hetzel et al. (2000) en CSIRO (Australia) y P.monodon (Benzie et al. 1997). Estudios recientes mostraron que la heredabilidad del crecimiento en crustáceos es similar a la encontrada en peces, estimaciones de heredabilidad en especies de camarón han sido obtenidas por diversos autores (tabla 3); las variaciones observadas pueden reflejar diferencias entre: (a)especies, (b) diseños experimentales utilizados para estimar la heredabilidad, así como (c)condiciones ambientales, en las (d)frecuencias genéticas en las poblaciones evaluadas de una sola especie, además de la (e)edad de la evaluación. Con la implementación de esta tecnología se suministrará al sector comercial un abastecimiento significativo de camarón cultivado proveniente de lotes mejorados, sentando las bases para evaluar grupos genéticos seleccionados en muestreos de desafío a patógenos específicos, así como protocolos de prevención y tratamiento terapéutico para enfrentar los retos venideros contra las pandemias de etiología viral que tanto han afectado a esta industria a nivel mundial. 19

Se deben establecer tecnologías de cuarentena y mantenimiento para proteger el material genético obtenido y su adecuada diseminación al universo productivo. La resistencia a enfermedades y el aumento de la tasa de crecimiento deben constituir los caracteres prioritarios a mejorar al implementar un programa de selección por crías selectivas. La depresión de la diversidad genética puede causar impactos negativos sobre los caracteres productivos en camarones cultivados (Sbordoni et al. 1986 y 1987). Para examinar los niveles de variación genética en cultivo se deben diseñar muestreos frecuentes y estables a los diferentes lotes, estos muestreos se deben establecer claramente en los programas de cría.

1.3.1 Programas de Mejoramiento Genético en camarones Peneidos Clifford III y Preston (2001) como parte de la Alianza Global para la Acuicultura (GAA) escriben un informe preliminar sobre una encuesta denominada International Global Shrimp OP:2001, sobre domesticación y técnicas de crías selectivas en camarones; incluyó a granjeros, operadores de centros de desove, criadores de reproductores, e instituciones gubernamentales de investigación. Se obtuvieron 77 respuestas pertenecientes a 24 países. Con la excepción de la Polinesia Francesa y Nueva Caledonia, los camaroneros del continente americano utilizaron lotes domesticados, como reproductores, antes de sus colegas asiáticos. El 64% de los encuestados forman la población base de líneas cultivadas y el resto de poblaciones silvestres, un por ciento menor combina ambos orígenes. 20

Con relación a las generaciones mantenidas en cautiverio el 50% retiene en cultivo hasta más de 16 generaciones, las líneas más viejas corresponden a Brasil, Venezuela, México y la Polinesia Francesa donde se informan hasta 30 generaciones de L.stylirostris. En muchas empresas comerciales las crías selectivas se realizan como componentes integrales del banco de reproductores, otros utilizan el mismo sistema de cultivo para ambos objetivos, las instalaciones varían desde jaulas hasta sistemas de canales rápidos. Las estrategias de crías selectivas incluyen la selección masal / individual, familiar y la selección intra familiar. De forma general los programas de crías selectivas en América, utilizan la inseminación artificial para obtener familias de medios hermanos (1 macho copula con dos hembras), de cada desove se seleccionan nauplios que son criados hasta postlarvas tempranas, cada familia se “siembra” individualmente en jaulas colocadas en un estanque común, después de cinco semanas 100-150 juveniles por familia se marcan con elastómeros, donde son colocados en otro estanque por aproximadamente diez semanas, después son pesados y medidos, las familias son evaluadas para caracteres específicos, utilizando análisis estadísticos (Modelo Lineal General, ANOVA, Análisis de Regresión). Alrededor del 5% de las familias se segregan para la próxima generación de cría selectiva. (Clifford III y Preston, 2001). Entre otros aspectos y a manera de conclusión de esta encuesta se prevé que las investigaciones futuras se encaminen a elevar las tasas de mejoramiento genético, 21

prevención de enfermedades, incremento del número de caracteres y líneas seleccionadas, bioseguridad, criopreservación de gametos, análisis de variabilidad genética por microsatélites, así como el desarrollo de líneas de camarones seleccionadas para tolerar condiciones ambientales específicas. Gjedrem (1999) refiere dos colaboraciones Noruegas en América, en camarones Peneidos, el Instituto Oceánico (Hawaii, EUA) en cooperación con el Instituto Noruego

de

Investigaciones

en

Acuicultura

(AKVAFORSK),

desarrollaron

experimentos de selección con L.vannamei durante 1994-1997. Los criterios de selección fueron tasa de crecimiento y resistencia contra el Virus del Síndrome de Taura (TSV). La variación fenotípica para la tasa de crecimiento fue relativamente baja, sin embargo los estimados de heredabilidad para este carácter fueron elevados, 0.5 en medios hermanos maternos y 0.45 para hermanos completos. Después de una generación de selección se calculó una ganancia genética de 4.4% hasta el peso de cosecha y un 12.4% de ganancia para supervivencia después del muestreo de desafío ante el TSV. En Colombia, se comenzó un programa de selección en 1997, mediante un convenio entre el Centro de Investigaciones de Acuicultura (CENIACUA) y AKVAFORSK. Los objetivos fueron incrementar la resistencia en contra del TSV y la tasa de crecimiento. Se evaluaron tres lotes de 52 a 70 familias anualmente, el primero mostró una elevada variación genética (h2= 0.40) y una variación media para la supervivencia en los estanques (h2= 0.13), se encontró una correlación genética significativa entre crecimiento y supervivencia.

22

Goyard et al. (1999), pertenecientes al Instituto Francés del Mar (IFREMER) han estado relacionados con investigaciones sobre camarón desde que se creó el Centro Oceanológico del Pacífico en Tahití (AQUACOP). Los programas de cría se iniciaron en 1992, se han domesticado varias líneas pertenecientes a L.stylirostris (5), L.vannamei (1), Penaeus.monodon (1) y Fenneropenaeus indicus (1), con diferentes orígenes, obteniendo hasta 24 generaciones en cautiverio. Se llevó a cabo una experiencia sobre selección masal para el incremento de la tasa de crecimiento durante seis generaciones, las generaciones 4ta y 5ta mostraron un incremento del crecimiento hasta la talla de cosecha de 18 y 21% al compararlas con líneas control no seleccionadas. Actualmente el programa se encuentra en una fase de optimización para determinar el mejor momento dentro del ciclo de vida para seleccionar para crecimiento (Goyard,1999). En el Instituto Oceánico (Hawaii,EUA), los investigadores Moss et al. (1999) mantienen un núcleo central de cría selectiva para L.vannamei donde progenitores libres de patógenos específicos (SPF) produjeron descendientes de 80 familias genéticamente diferentes dos veces por año, el progenitor es seleccionado de acuerdo a un valor de cría previamente asignado a la familia donde proviene, una hembra de una familia específica se aparea con un macho predeterminado por inseminación artificial, para minimizar los efectos deletéreos de la consanguinidad. Hasta la fecha se han evaluado alrededor de 500 familias para los caracteres crecimiento y resistencia al TSV, la h2 para ganancia en peso fue de 0.40 ± 0.06, en contraste la media de la h2 para la resistencia al TSV fue solo de 0.09 ± 0.03.

23

Crocos et al. (1999) describen este tema en Australia, planteando que la industria del camarón en el país-continente es relativamente nueva, aunque se han obtenido avances liderados por CSIRO (Organización de Investigaciones Industriales y Científicas de la Comunidad de Naciones) en la domesticación de camarones y crías selectivas. En Marsupenaeus japonicus, la industria tiene una fuerte dependencia de la eficiencia productiva y de los precios en el mercado. Experiencias en ambiente controlado dieron como resultado un 11% de incremento por generación en el crecimiento por crías selectivas, al compararlo con un lote no seleccionado hasta talla comercial resultó en un incremento de 10-15%, que representa un aumento entre un 21-34% del valor por tonelada de camarón cosechado. La otra especie de interés para los cultivadores australianos es Penaeus monodon, se comparó la tasa de fecundidad entre reproductores cautivos y silvestres, se obtuvieron 200,000 huevos por desove, superiores a desovadoras silvestres de talla similar, demostrando que la capacidad reproductiva de camarones cautivos puede ser un carácter a considerar en programas de mejoramiento genético. (Crocos et al. 1999). McIntosh y Carpenter (1999) comentan sobre el trabajo en BAL (Belize Aquaculture, limited) una empresa que tiene como objetico mantener animales que resistan altas densidades de cría, altas cargas de nutrientes y cero intercambio de agua. Los programas de cría se basan en una población fundadora SPF, teniendo gran cuidado en lo concerniente a bioseguridad, todos los lotes utilizados

24

provenían de Hawaii de la especie L.vannamei y un lote de L.stylirostris calificado de “Elevada Salud” de una cepa de Ecuador. La estrategia de los programas de cría selectiva ejecutados en esta empresa de Belice siguen los protocolos desarrollados por IFREMER, por selección masal obtuvieron tres líneas diferentes de L.vannamei, cruzándolas para evitar la consanguinidad. La selección de los progenitores tiene lugar cuando los camarones alcanzan una talla de 15g, el peso es el único criterio de selección, escogiendo el 10% de la población, que es transferida hacia los estanques de progenitores (McIntosh y Carpenter, 1999). Al comparar las dos especies en relación a las condiciones pre-determinadas, L.vannamei resultó mejor, el crecimiento de L.stylirostris es muy sensible a elevadas densidades de siembra, se trabaja en varias generaciones de esta especie para obtener mejoras por crías selectivas de este carácter. También existen reportes del laboratorio de Genética Acuícola del Centro de Investigaciones Biológicas, B.C.S. México, con la especie L.vannamei, los trabajos relacionados con la estimación de la heredabilidad y correlaciones genéticas y fenotípicas son los objetivos primarios de este equipo. Pérez-Rostro et al. (1999), encontraron en los estimados de heredabilidad un marcado efecto materno que disminuye en estadios posteriores del ciclo de vida. Pérez-Rostro e Ibarra (1999), no encontraron interacción genotipo-ambiente al criar familias replicadas en dos ambientes diferentes, la h2 varió entre 0.14 y 0.23, también consignan varianzas diferentes entre sexos, concluyendo que las intensidades de selección tendrían que ser diferentes, si se desea una misma respuesta. Este laboratorio mantiene un 25

programa de selección estable, basado en índices para la mejora del crecimiento, control

de

endogamia

y

transferencia

al

sector

productivo

de

estas

investigaciones. Además de los resultados ya expuestos sobre el mejoramiento genético en las principales empresas mundiales, es muy probable que existan otras entidades y grupos de investigaciones que no divulgan sus resultados, protegiendo sus protocolos, en una actividad muy competitiva; otros mantienen solo un pequeño número de familias para no estar a menos con la competencia, sin resultados significativos.

1.3.2 Cuba: particularidades, situación actual y perspectivas Los países latinoamericanos con costas al Océano Atlántico desde Belice hasta Brasil poseen en sus aguas someras la especie de camarón blanco Litopenaeus schmitti, sin embargo han introducido la especie exótica del Pacífico Americano, Litopenaeus vannamei para realizar sus actividades de cultivo a escala comercial. A diferencia de estas empresas, las autoridades de Cuba han cultivado el L.schmitti por décadas, esta especie según Pérez-Farfante y Kensley (1997) pertenece al género Litopenaeus, formado por camarones de télico abierto, petasma con costa ventral pequeña que no alcanza el margen distal del lóbulo lateral, surco y cresta adrostal pequeños, cresta gastrofrontal ausente y cresta hepática prominente. A este género pertenecen además especies como L. vannamei, L. stylirostris, L. occidentalis y L. setiferus.

26

Los ejemplares de L. schmitti tienen un tamaño máximo de 175 mm los machos y 235 mm las hembras. Presentan un surco y cresta rostral muy corta no excediendo de la mitad anterior del carapacho, cresta gastrofrontal ausente, cresta post-rostral bien definida anteriormente, pero no posteriormente. Las antenas tienen entre 2.5 y 2.75 veces la longitud del cuerpo. Los lóbulos laterales del petasma son lisos en su porción distal. El télico sin placas laterales pero con dos costillas subparalelas en la porción anterior del esternite XIV, cada una seguida posteriormente por una protuberancia redonda y rígida y el margen posterior del esternite XII con dos pares de proyecciones relativamente largas. Su coloración varia entre azul translúcido, blanco y gris, algunas veces con un matiz verdoso o amarillento. Los adultos son frecuentemente blancos, translúcidos con manchas azules dispersas sobre todo el cuerpo. Su clasificación taxonómica es la siguiente: Phylum Arthropoda Subfilum Crustacea Clase Malacostraca (Latreille 1806) Subclase Eumalacostraca (Grobben 1892) Cohorte Eucarida (Caimán 1904) Orden Decapoda (Latreille 1803) Suborden Dendrobranchiata (Bate 1888) Superfamilia Peneoidea (Rafinesque 1815) Género Litopenaeus (Perez-Farfante y Kensley, 1997) Especie Litopenaeus schmitti (Burkenroad 1936)

La especie L. schmitti se distribuye en el Mar Caribe, incluyendo Cuba, Islas Vírgenes y probablemente las Antillas Menores. En aguas continentales se extienden desde Belice por toda la costa atlántica de Centro y Sur América hasta 27

Lagunas, Brasil. Habitan a una profundidad de 2-47 m, siendo más abundantes entre los 15-30 m, en los fondos fangosos y algunas veces sobre arena. Los juveniles se encuentran en áreas estuarinas y los adultos son marinos. Son omnívoros, se alimentan con algas, restos de plantas y varios tipos de animales como gusanos, moluscos y pequeños crustáceos. Los individuos de este género son diurnos, más activos al amanecer. Esta especie en Cuba desova en la plataforma sur cerca de la costa, entre los 3 y 10 m de profundidad, en los meses de marzo a septiembre y la mayor intensidad de hembras maduras se observan en el mes de julio. A partir del desove se suceden 11 estadios larvales: 5 nauplios, 3 protozoeas y 3 mysis en el océano. Las postlarvas migran muy tempranamente a zonas estuarinas y se concentran en aguas marginales y someras donde hay abundante vegetación y materia orgánica. Entonces cambian su hábito de vida, de planctónico a bentónico y se desarrollan rápidamente hasta llegar a sub-adultos. Cuando llegan a la edad adulta, se dirigen a las aguas oceánicas y en las zonas de desove las hembras maduras completan el ciclo de vida. Fonseca y Alaiza (2002), ambos directivos del Grupo Empresarial del Cultivo de camarón en Cuba (GEDECAM; MIP), informaron la existencia de cuatro camaroneras para el cultivo semi-intensivo del camarón marino Litopenaeus schmitti , con un área de espejo de agua de aproximadamente 2,100 hectáreas en los estanques. Nuestro país posee tres centros de desove, una fábrica para la producción de balanceados y ocho plantas para el procesamiento del camarón y otros mariscos. En el año 2002, se estimó una producción de 2,300 toneladas de 28

camarón con talla comercial que significa un rendimiento de aproximadamente 1.1 toneladas por hectárea por año. Los laboratorios deben producir 1,200 millones de postlarvas (PL10), más una pequeña cantidad para reabastecer la pesquería silvestre. Se planifica una re-estructuración del laboratorio de Boca Ambuila, provincia de Cienfuegos, dirigido por el Centro de Investigaciones Pesqueras (MIP), para desarrollar estudios investigativos-comerciales en temas relacionados con el mejoramiento genético de especies acuáticas de importancia, incluyendo la especie foránea Litopenaeus vannamei. El financiamiento para el desarrollo del cultivo del camarón en Cuba partió siempre de una intención gubernamental, también reforzada por la representación de la FAO en nuestro país, a través del Programa de Cooperación Técnica y el Programa de Naciones Unidas para el Desarrollo, específicamente el CUB/86/004 denominado “Camarón”, para el apoyo técnico al Plan Nacional de Cultivo de camarón, cuyo monto ascendió a un millón de dólares. Desde el punto de vista técnico se ha trabajado en la caracterización de las especies cubanas de camarones Peneidos y especies relacionadas (Labacena et al. 1994, García Machado et al. 1993 , Espinosa et al. 1996) y especialmente estudios en el camarón blanco Litopenaeus schmitti, del cual se cuenta con poblaciones silvestres y domesticadas. El objetivo fundamental ha sido la caracterización de las poblaciones naturales con vistas a un mejoramiento genético perspectivo de la especie y poder fomentar bancos de reproductores con control genético de los mismos. El trabajo ha consistido en el empleo del

29

polimorfismo morfológico y electroforesis de proteínas (Espinosa et al. 1989; Díaz et al. 1995, Espinosa et al. 2003). Al cerrar el ciclo de cultivo en cautiverio para el camarón blanco, L. schmitti (Bueno,1990 ; Ramos et al. 1995) se sientan las bases para el mejoramiento genético del recurso , teniendo en consideración también la caracterización genética-bioquímica de nuestras poblaciones silvestres. Se han realizado trabajos conjuntos entre el Departamento de Bioquímica de la Facultad

de

Biología

y

el

Centro

de

Investigaciones

Marinas,

ambos

pertenecientes a la Universidad de La Habana, han dirigido el esfuerzo a la formación de familias en las que se han estimado parámetros genéticos, la búsqueda y caracterización de marcadores microsatélites y de inmunidad innata, potencialmente útiles en la caracterización de estas familias. En Cuba existe un marcado interés por el sector productivo y las instituciones académicas, para incorporar a escala comercial este tema, que sumado a la infraestructura existente y a la experiencia práctica de casi dos décadas, garantizarán enfrentar con éxito el mejoramiento de los bancos de reproductores, produciendo descendientes con méritos productivos superiores a la población base. Actualmente en Cuba ha comenzado la introducción de Litopenaeus vannamei en las estaciones de cultivo de camarón. Si el desarrollo de esta introducción fuera exitoso la experiencia adquirida en la especie autóctona, permitirá desarrollar trabajos de mejoramiento genético en esta especie tan explotada desde el punto de vista comercial. 30

CAPITULO 2. MATERIALES y MÉTODOS 2.1 POBLACIÓN FUNDADORA Se realizaron arrastres utilizando barcos camaroneros comerciales en aguas del archipiélago Cubano (230 10’ 34’’ y 190 9’ 32’’ latitud N, y 740 7’ 55’’ y 840 57’ 11’’ longitud W): específicamente en la Bahía de Cienfuegos, y en aguas aledañas al poblado de Tunas de Zaza, para capturar progenitores del camarón blanco Litopenaeus schmitti. Después se trasladaron a las instalaciones productivas del Centro de Desove de Yaguanabo, Empresa de Producción de larvas y primeras postlarvas YAGUACAM, provincia de Cienfuegos (800LW y 220LN ) (Figura 1). Estos lotes fueron muestreados, durante el proceso de aclimatación, desde el punto de vista morfológico, registrando las siguientes medidas: peso total húmedo, PT(gr) ; largo total, LT(mm); largo del cefalotórax, LC(mm); ancho del cefalotórax, AC(mm); y altura del quinto y sexto somite abdominal, H5S y H6S(mm). Excepto para el peso, que se realizó en una balanza Sartorius (± 0.01g), las demás medidas se efectuaron con un Pie del Rey (0.1mm)(Figura 2).

2.2 FORMACIÓN DE FAMILIAS DE HERMANOS COMPLETOS Y MEDIOS HERMANOS PATERNOS POR INSEMINACIÓN ARTIFICIAL. Los reproductores fueron sometidos a la manipulación comercial vigente contenida en los Procedimientos Operativos de Trabajo (Pérez-Jar y Jaime, 2002) con fines de maduración y reproducción. De forma general, estas instalaciones son locales cerrados, con tanques ovalados de fibra de vidrio pintados de negro en su interior, fotoperíodo controlado, se utiliza la técnica de sexos separados, con alimentación

31

mezclada consistente en un balanceado de alto contenido proteico y calamar. Se mantienen los reproductores a una densidad máxima de 300 g/m2. El diseño experimental empleado para la inferencia de parámetros genéticos fue el jerárquico o anidado (Falconer y Mackay, 1996). Para la obtención de familias de medios hermanos paternos y hermanos completos se utilizaron hembras maduras que no copulaban de forma natural, siendo sometidas a la inseminación artificial. Entre las 19:30h-20:00h se revisaron las hembras colocadas en los tanques de cópula natural durante la mañana (11:00h-12:00h), las que no habían copulado se trasladaron al local de desove donde se situaron en tanques de 100 litros a una proporción de hasta 4 hembras por recipiente, también se utilizaron ejemplares que maduraron durante la tarde en los tanques de hembras debido a las altas temperaturas (28-290C). El criterio de selección de la hembra para la inseminación artificial

fue

el

grado

de

maduración

completa,

estadio

IV

(Ramos

y

Primavera,1986). Para realizar las inseminaciones artificiales se emplearon los siguientes materiales: dos pinzas; dos agujas con puntas romas, material para el contraste del espermatóforo y las células espermáticas (polietileno negro); electroeyaculador (46 voltios); marcas numeradas, metálicas y plásticas; jamos y baldes; libreta y lápices; tijeras; gasas; placas Petri (2) y portaobjetos (2); tanquetas de 100 litros; línea de aire y soplador; agua de mar y agua dulce; un microscopio estereoscópico o en su defecto una lupa para aumentar hasta 2 veces el campo visual en la disección del espermatóforo, todo el proceso bajo luz fluorescente (2).

32

Los machos que no tuvieron reacción positiva al girar el espermatóforo en el ámpula terminal con el estímulo eléctrico eran rechazados, posteriormente se le aplicaba una ligera presión para facilitar la expulsión del espermatóforo, éste se extrajo con la ayuda de las pinzas y se colocaba en una placa Petri con agua de mar, después se trasladaba a un portaobjeto donde se eliminaba el material aglutinante y las alas, teniendo cuidado de cortar bien en la base para no perder masa espermática, después se presionaba desde el extremo opuesto a las alas para expulsar toda la masa espermática. Realizado todo este proceso, se mezclaron las masas espermáticas de ambos espermatóforos para evitar la nofertilización si existía un desarrollo asincrónico de la maduración gonadal masculina. Las porciones se separaban, y se adherían al extremo de una aguja y se colocaban en una hembra entre las coxas del segundo y tercer par de pereiópodos (más cercano al segundo), esta región se secó con una gasa. Luego de colocados los espermatóforos, se doblaban los apéndices y se liberaba el ejemplar suavemente al tanque de desove correspondiente. Para formar las familias de medios hermanos paternos se utilizaron las siguientes variantes: (a) el producto sexual de un macho se le coloca a dos hembras, (b) el producto sexual de un macho se le coloca a tres hembras y (c) el producto sexual de un macho se le coloca a cuatro hembras, Para comparar las diferentes variantes en la formación de grupos genéticos se empleó un índice propuesto por Arce et al. (2001), es el cociente entre el número de familias de hermanos fraternos y el número de machos. 33

Las instalaciones de desove están climatizadas de manera semiautomática, presentan sensores instalados en algunos tanques, actúan sobre la temperatura ambiente para calentar o extraer aire y mantener la temperatura de los reservorios en 280C, los tanques son de fibra de vidrio de color negro, cilindro-cónicos de más de 200 L de capacidad, tienen acceso a agua de mar filtrada con cartucho (5µm) y tratada con luz ultravioleta y aire suministrado por un soplador. En cada tanque de desove se colocaba una hembra inseminada. Al día siguiente (07:00-08:00h) se anillaron las hembras desovadas y sólo los desoves de dos hembras con un macho común como mínimo se trasladaban para el área de eclosión. Los desoves viables que no contribuyeron a la formación de familias se entregaban a la producción comercial. El local de eclosión consta de tanques cilindro-cónicos de más de 100 L de capacidad cada uno, a los embriones “sembrados” se les somete a una fuerte aireación para evitar que se adhieran a las paredes del recipiente, también se instalan en un nivel superior bancos de luces fluorescentes, y tapas con un orificio central para la concentración de los nauplios. Los desoves se mantienen separados, conservándose la individualidad familiar, cuando eclosionan estos “huevos” y su número es suficiente para las necesidades de cría larvaria, se forman las familias.

34

2.3 CRÍA DE LARVAS Se diseñaron instalaciones específicas para criar las larvas hasta las primeras postlarvas, y mantener la separación por familias. Se utilizaron tanquetas de fibra de vidrio, con volumen de 110 L con aforo interno cada 10 L, comprados al Centro de Proyectos Navales (CEPRONA) adjunto al Ministerio de la Industria Pesquera de Cuba. Los nauplios se sembraron en un volumen de 50 L, los recipientes fueron llenados previamente con agua de mar filtrada hasta 5 µm, se instalaron resistencias con termostatos (150-300 watts, VISITHEM, Aquatic Ecosystem, Apopka, FL, EUA) acoplados a cada unidad para mantener la temperatura a 280C(±1). La "siembra'' se ajustó a 250 nauplios/L, las larvas fueron alimentadas con la diatomea Chaetoceros muelleri a razón de 60-100 000 células/mL y la clorofícea Tetraselmis suesica a una concentración de 1000 células/mL. En protozoea 3 (p3) se comienza a añadir de 0.5-2 nauplios de Artemia sp por mL, previamente sacrificados por inmersión en agua de mar hirviendo para disminuir la energía que pudieran gastar las larvas en su captura y un balanceado comercial (ABM,125µm Aquafauna, Biomarine larval diet, CL, EUA). A partir de este estadio se le añadió durante toda la cría el alga seca Spirulina sp a una dosis de 0.001 g/L dos veces al día. Se intercambió un 50% del volumen del recipiente por día y se aumentó progresivamente el nivel de las cubetas. La tabla 4 resume la alimentación en los diferentes estadios y subestadios de larvas, así como el por ciento de intercambio diario de las cubetas por estadio y el ajuste a una disminución progresiva de la 35

salinidad del agua de cultivo. La salinidad comenzó a bajarse desde p-1, llegando a mysis con 28‰ y a postlarvas con 20‰. La tabla 5 resume la alimentación en postlarvas. El balanceado utilizado en postlarvas procedía de la misma compañía que el de las larvas pero con un tamaño de partícula de 400 µm. En la cría se realizaron dos pre-cosechas para la limpieza adecuada de los reservorios y el conteo físico de las larvas. En PL15 se pesaron 50 ejemplares (PT) individualmente por unidad experimental en una balanza analítica Sartorius (0.0001, Alemania), también se conservaron en formaldehído

(4%)

para

los

análisis

morfométricos.

En

el

Centro

de

Investigaciones Marinas (CIM-UH) se midieron 50 ejemplares en PL15 por familia, obteniendo el largo total (LT, extremo anterior rostrum hasta extremo posterior del telson) utilizando un Microscopio Estéreo MBC-9 (Rusia) con un ocular de 8x y un aumento de 2, cada división del micrómetro ocular corresponde a 0.5 mm. Las postlarvas fueron cosechadas y trasladadas a la siguiente fase entre PL17-19.

2.4 MANTENIMIENTO HASTA TALLA DE MARCAJE. Por cada familia se "sembraron" 500 postlarvas en tanques de fibra de vidrio de 700L de capacidad, que tenían 1m2 de área en el fondo. Estos reservorios después de leves modificaciones (válvulas de entrada de agua y reboso para mantener el volumen en 500L), constituyeron la instalación definitiva para criar las postlarvas. El agua de mar utilizada en esta fase provenía de reservorios donde se acumula para ser filtrada con arena (20µm). El objetivo de esta etapa es que los 36

ejemplares arriben a una talla de marcaje (1-2g) para utilizar los elastómeros (Godin et al.1996; fabricados por Northwest Marine Technology, Inc., Shaw Island, Washington, EUA); cada animal fue marcado (Figura 3) para identificar su familia con un implante visible. Este sistema de marcaje por elastómeros fluorescentes implantados provee una marca interna visible externamente, se utiliza un producto biocompatible, dos partes del material de elastómeros que contiene un color fluorescente cuando se mezclan. El líquido se inyectó en los primeros somites abdominales utilizando una jeringa con aguja hipodérmica, este implante polimerizó a las pocas horas en un producto sólido. Se utilizó una combinación de 4 colores con 2 sitios del animal (dorsal izquierdo y derecho) para identificar las familias (A.M.Ibarra, comunicación personal), los animales se liberaron en un estanque común para todas las familias. Se marcaron entre 80-100 juveniles por familia, dependiendo de las corridas. La alimentación hasta juveniles consistió en un balanceado para postlarvas (Aquafauna, Biomarine larval diet, ABM, 400µm), posteriormente se añadió un balanceado de fabricación local para el inicio de engorde molido y tamizado, tomando las partículas mayores de 600 µm, también se adicionaron nauplios de Artemia sp dos veces al día. El biocriterio del sistema consistió en un intercambio de agua secuencial dividido en 3 etapas de acuerdo al peso de los ejemplares, la primera correspondiente a un 33% del volumen del tanque por día, la segunda fase a un 50 % para terminar después del muestreo de juveniles con un intercambio de un 600% por día, con un

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flujo de hasta 15 L por hora. A partir de la segunda fase es necesario colocar mallas sobre los tanques para evitar las pérdidas por salto. Esta etapa se llevó a cabo en locales interiores. Cuando los ejemplares alcanzaron la edad de PL60, se muestrearon para compilar los datos inherentes a la fase de juveniles del ciclo de vida, se compiló el peso total (PT) húmedo por juvenil en una balanza Sartorius (± 0.0001), el largo del cefalotórax (LC) y el largo total (LT), ambos en milímetros con un Pie de Rey (0.1 mm).

2.5 OBTENCIÓN DE PRE-ADULTOS Y REPRODUCTORES EN ESTANQUES DE TIERRA. Para la cría de los ejemplares hasta preadultos y adultos se utilizaron tres estanques en total, uno por cada ensayo realizado para completar el número de familias. Los estanques poseen fondo de tierra, con paredes perimetrales verticales de concreto y una ligera inclinación hacia los pesqueros con un canal interno central. Tienen un área aproximada de 0.3 ha (3000 m2) cada estanque, con una profundidad promedio de 1.0 m con zonas cercanas a la periferia de 0.3 m. Poseen tres estructuras de entrada y tres de salida donde se incluye un pesquero central, el agua de suministro se traslada por un canal revestido de concreto. Se aplicó la tecnología de obtención de reproductores en ciclo cerrado estandarizada para esta especie por Ramos et al. (1995), criando los camarones en estanques de tierra en el sistema de cultivo semi-intensivo. 38

Se invirtieron los primeros centímetros del fondo del estanque en las zonas más reducidas con una azada, después se secó durante una semana para oxidar los productos reducidos que son tóxicos y acelerar la descomposición de la materia orgánica excesiva producida en el ciclo de cultivo anterior. Los charcos del estanque son tratados con hipoclorito de calcio (65% de cloro activo) para eliminar los predadores potenciales. El estanque es llenado después de filtrar el agua con mallas de nylon de 700µm. Se esperan alrededor de 7 días hasta la siembra, para permitir desarrollar una adecuada población de plancton y bentos. Se emplearon 60 Kg/ha de UREA (46-0-0) durante el llenado con bolsas manuales fertilizando en las estructuras internas de las entradas de agua. Cuando el disco Secchi excedía los 0.7 m de transparencia se aplicaba la mitad de la dosis inicial diluida en baldes y distribuida sobre un bote por todo el estanque. Los juveniles marcados por familia fueron contados individualmente para ajustar una densidad final de 1 camarón/m2, cuando no era posible obtener esa cifra se completaba con animales no marcados. Los juveniles de todas las familias se trasladaron hasta el dique del estanque, donde se mezclaron las aguas para homogeneizar las variables físico-químicas entre el agua de traslado y del estanque, siendo liberados gradualmente. Para el mantenimiento de la calidad del agua de cultivo, se fueron añadiendo lentamente láminas de agua cuando estaban los animales, hasta alcanzar la profundidad de cultivo del estanque en una semana. Después de las 2 primeras semanas comienza el drenaje del agua y su reemplazo diario. Se utilizó un 39

intercambio de agua del 10 % del volumen del estanque por día, ajustándose de acuerdo a la regulación de los estanques contiguos en producción, se colocaron tablas en las entradas para evitar que este intercambio aumentara, garantizando que fuera siempre nocturno para compensar las pérdidas de oxígeno. Para facilitar un mejor intercambio de agua, las mallas de entrada y salida se limpiaron diariamente. El agua siempre se drenó del fondo del estanque, utilizando tablas flotantes en la primera línea de la esclusa. Se midieron diariamente los parámetros de calidad del agua (oxígeno disuelto, transparencia y temperatura), si cambiaban los parámetros se aumentaba el intercambio de agua. El alimento adicional que se suministró a los camarones en el estanque, durante todo el ciclo de crecimiento, fue un balanceado de fabricación local con un 30% de proteína, en la fase de preparación fisiológica para la reproducción se añadió calamar (Loligo sp). Siempre se alimentó dos veces al día, mañana (60%) y tarde (40%). Se realizó el muestreo morfométrico (PT, LT, LC, AC, y H6S H5S; figura 2) al finalizar el engorde (fase de pre-adultos), cuando los animales arribaron a los 6 meses de edad después del desove. Se empleó un bote y una atarralla para capturar los camarones, después fueron clasificados, hasta completar 10 por familia. En esta actividad no estimamos supervivencia, aunque si determinamos el sexo por ejemplar. El muestreo final, correspondió a los 240 días después del desove, se realizó por la cosecha total del estanque compilando los datos morfométricos (PT, LT, LC,

40

AC, H5S y H6S; figura 2), sexando y obteniendo la supervivencia total por familia con relación a la siembra de juveniles. El experimento se realizó en cuatro corridas hasta formar entre 20-30 familias de medios hermanos paternos (Falconer y Mackay, 1996). La tabla 6 presenta la composición de las corridas con relación al origen de los reproductores y la época en que se manipularon los diferentes lotes. Se definió como corrida a cada uno de los ensayos realizados para completar el número de familias necesarias en el experimento.

2.6 PROCESAMIENTO DE LOS DATOS y TRATAMIENTO ESTADÍSTICO Se confeccionaron cuatro matrices con los datos originales correspondiendo a los muestreos de biometrías para los estadios de PL15, juveniles (PL60), preadultos (180 días) y reproductores (240 días después del desove), también se incluyeron columnas informativas referentes al número correspondiente a cada organismo, corrida, familia, y sexo, en planillas de cálculos elaboradas en Microsoft EXCEL 2000 para Windows. A los datos originales se le aplicó la búsqueda de observaciones fuera del intervalo media ± 2S (promedio del carácter ± el doble de la desviación estándar), eliminando las que no se encontraban en este recorrido. Se aplicó la prueba W de Shapiro-Wilk para evaluar la normalidad de las variables medidas por estadio y por familia, y la prueba Levene para contrastar la homogeneidad de varianzas. (StatSoft, Inc. (2001). STATISTICA, data analysis software system, version 6. www.statsoft.com.) Para los cálculos prospectivos de 41

los datos originales se utilizaron los procedimientos del Modelo Lineal General (GLM) en un Modelo Mixto y un Análisis de Varianza, con salida del programa de resultados univariados por estadio y carácter; para evaluar la significación de las corridas, familia, sexo y las interacciones sobre las diferentes variables, se aplicó el modelo: Efecto : corrida (C), 4 niveles Efecto : familia (F), niveles varían con el estadio. Efecto: sexo (S), 2 niveles y ausente en PL y juveniles

Yijkl = µ + Ci + Sj + Fk(Ci) + Ci*Sj + eijkl Donde:

Yijkl es el crecimiento del individuo l de la k-ésima familia en la i-ésima corrida y el j-ésimo sexo, µ es la media paramétrica común; Fk es el efecto aleatorio de la k-ésima familia; Ci es el efecto fijo de la i-ésima corrida y Sj es el efecto fijo del j-ésimo sexo. Fk(Ci) es el efecto de anidar la k-ésima familia en la i-ésima corrida; Ci*Sj es el efecto fijo de interacción entre la i-ésima corrida en el j-ésimo sexo y eijkl corresponde al error aleatorio en el grupo l de los subgrupos ijk.

Definiendo como factores: familia, sexo y corrida, siendo el primero aleatorio y los restantes fijos. Se anidó familia en corrida, estimando las diferencias entre sexos aplicando una prueba Tukey para comparar las medias. En la Corrida 3 se analizó un efecto de origen del macho (OM), ya que en ella se formaron 14 familias de hermanos completos, correspondiendo 10 a machos provenientes de Tunas de Zaza con hembras de Cienfuegos, los restantes 4 grupos eran entre machos y hembras de Cienfuegos. Se comparó el efecto de los cruzamientos entre estos 10 grupos y los datos biométricos del otro origen en esa misma corrida.

42

Los estimados de heredabilidad en sentido estrecho, se calcularon aplicando el paquete de programas MTDFREML (siglas en inglés de Modelo Animal Multivariado de Máxima Verosimilitud Restringida Libre de Derivadas ; Meyer, 1991; Boldman et al. 1995), después de introducir los efectos fijos antes mencionados.

MTDFREML

es

un

paquete

de

programas

para

estimar

componentes de varianzas y co-varianzas utilizando un modelo animal. Pueden utilizarse

para

caracteres

univariados,

bivariados

y

modelos

animales

multivariados con medidas repetidas, incluyendo caracteres con expresión ligada al sexo. Pueden obtenerse soluciones para efectos fijos, valores de cría, y efectos aleatorios no correlacionados, varianzas del muestreo, y contrastes. Este paquete de programas puede incorporar efectos genéticos aditivos, no solo para datos obtenidos en animales medidos, sino también para parentales, y otros parientes no incluidos en el archivo de pedigrí. Para cada carácter analizado se puede utilizar un efecto aleatorio correlacionado y algunos efectos aleatorios no correlacionados. Los efectos fijos, co-variables, y los efectos aleatorios no correlacionados se presentan especificados separadamente para cada carácter. Todos los programas están escritos en FORTRAN 77 ó 90. Las correlaciones genéticas entre los caracteres de crecimiento también fueron estimadas aplicando MTDFREML después de introducir los efectos de corrida y sexo en el modelo. Los errores estándares de los estimados de heredabilidad se calcularon siguiendo la metodología establecida por Falconer y Mackay (1996) así como Lynch y Walsh (1998). 43

Los errores estándares de las correlaciones genéticas se estimaron siguiendo a Roff (1997). Las correlaciones fenotípicas fueron estimadas como correlaciones siguiendo a Falconer y Mackay (1996), utilizando las varianzas y co-varianzas obtenidas en MTDFREML. rP = COVPx,y / SPx SPy Los análisis de varianza se realizaron utilizando el programa STATISTIC 6.0 para Windows,( StatSoft, Inc. 2001,. STATISTICA ,data analysis software system, version 6. www.statsoft.com.) y los parámetros genéticos fueron estimados siguiendo el manual de Boldman et al. (1995) para el uso de los programas MTDFREML. Para evaluar la asociación entre los caracteres de crecimiento y

su

comportamiento en la ontogenia de Litopenaeus schmitti, se calcularon los coeficientes de correlación del producto-momento, los cuales se obtuvieron al computar las medias por familias para los caracteres, se evaluó este comportamiento entre: postlarvas-juveniles; postlarvas-preadultos, postlarvasadultos,

juveniles-

preadultos;

juveniles-adultos

y

preadultos-adultos.

La

correlación se obtuvo utilizando el programa STATISTICA versión 6.0, también se indican los valores de p. Los niveles de significación estadística se indican en cada análisis, variando en: p