USO DE AISLADOS NACIONALES EN BIOREMEDIACION ACUICOLA John Salazar Fiallo

Arkeaslab S.A Sociedad Latinoamericana de Acuicultura 2016

ALGAS MOP MICRO ORGANISMOS

CAMARONES Y/O PECES

ALIMENTO BALANCEADO FERTILIZANTES MELAZA CAL OTROS

HECES SOLIDAS / LIQUIDAS MUDAS + MO DEL SUELO Y OTROS MATERIALES

CAPACIDAD DE CARGA ?

Acumulación e Inhibición

Población Natural de Microorganismos

Materiales de Desecho en Aumento

El estado de los fondos de los estanques es proporcional a nuestro conocimiento y habilidad en el manejo de piscinas ?

Los bajos niveles de profundidad influyen en el rápido crecimiento y acumulación de poblaciones de algas bentonicas

Beatriz Borrega

La generación de lodos reducidos no mineralizados, tiende a producir metabolitos tóxicos afectativos

Beatriz Borrega

La acumulación de hierro no mineralizado, genera acidez y produce mortalidades de carácter permanentes.

Yader Rodríguez

Alternativas Posibles de Corrección : Condicionantes: • Alimento • Densidad de Población • Renovación • Insumos Adicionales • Limo en Suspensión • Suelos Agrícolas • Material Orgánico Histórico • Suelo Biológicamente Pobre

Alternativas: • Comederos o Automatización • Capacidad de Carga • Recirculación • Puesta de lo Necesario • Corrección de Suelos • Evaluación Previa • Bioremediación

Bioremediacion • Se define como el uso de microorganismos vivos, componentes celulares y sus enzimas para transformar y/o mineralizar, materiales orgánicos, residuos de agentes contaminantes y provocar una alteración del estado Redox de metales. • En 1980, Yasuda y Taga anticiparon que las bacterias serian útiles como agentes de control biológico de enfermedades y como activadores de la tasa de regeneración de nutrientes en acuacultura.

Componentes necesarios para un proceso de Bioremediacion Aceptor de Electrones

SUSTRATO CONTAMINADO

Bacterias

Células

Donador de Electrones

CO2

Acetato Residuos

Lípidos

Domésticos DONADORES DE ELECTRONES

Piruvato

Carbohidratos

Proteínas

Metanol

BACTERIAS INTERACCION METABOLICA

JUEGAN UN ROL IMPORTANTE EN LA DINAMICA DE NUTRIENTES EN LOS SISTEMAS DE PRODUCCION DE ACUACULTURA

OXIDACION

PRINCIPALES RESPONSABLES DE MANTENER EL EQUILIBRIO ECOLOGICO ENTRE MATERIALES VIVOS O MUERTOS EN EL SUELO Y AGUA

Todos los ciclos biogeoquimicos estan vinculados y el metabolismo relacionado con la transformacion de estos nutrientes, tiene impacto global.

(Prescott et.al 2002)

REDUCCION

CARBONO NITROGENO AZUFRE FOSFORO HIERRO MANGANESO

CICLO BIOGEOQUIMICO

Cuestionario Base • En que radica la importancia de manejar cepas propias de una comercial. • Es necesario llevar a cabo un proceso de Bioremediacion en piscinas de producción acuícola? • Hacia donde va dirigida la eficiencia del producto biológico a usar ? • Que resultados debo de observar una vez iniciado el proceso ? • El balance bioquímico del agua se puede afectar debido a la densidad poblacional del consorcio bacteriano? • Que tipo o clase de agentes biológicos debemos usar ?

Diagrama Conceptual del Flujo de Carbono durante la Descomposición de un Sustrato MODELO AGREN & BOSSATA

Co2

SUELO – SUSTRATO - DETRITUS

BIOMASA MICROBIANA

N2

CICLO DEL NITROGENO

MO NH3 AMONIACO

Que hace la Bioremediacion BIOTRANSFORMACION

 La actividad biológica generada por un consorcio microbiológico, altera la estructura molecular de los materiales y el grado de alteración determina si se ha producido biotransformacion o mineralización.

• DESCOMPOSICION DE UN COMPUESTO ORGANICO EN OTRO SIMILAR NO CONTAMINANTE O MENOS TOXICO.

MINERALIZACION

• ES LA DESCOMPOSICION A DIOXIDO DE CARBONO, AGUA Y COMPUESTOS CELULARES.

Parámetros Necesarios de control en una Bioremediacion viable • • • • • • • •

pH Temperatura Metabolismo del suelo : co2 Redox : suelo / agua Amonio Nitritos Nitratos Evaluacion visual y olfativa de lodos

Consorcio Bacteriano Remediador

HETEROTROFO

NITRIFICANTE

Generación de Aislados Alpha I • 1.- Evaluación metabólica del suelo y Redox. • 2.- Toma de muestras dilución – siembra y aislados. • 3.- Micro bioquímica de identificación inicial y/o secuenciación molecular. • 4.- Preservación

Alpha II (inserto) Inserto (+)

Inserto(-)

1.-Evaluación del Metabolismo del Suelo • Los suelos sanos y activos están en constante producción de Co2. • La generación de Co2 es la resultante de la digestión de los materiales orgánicos presentes, procurando de esta manera la eliminación de los mismos. • La eficiencia de un producto biológico sobre un sustrato o suelo es medible y va en directa relación con la cantidad de Co2 liberado.

Ubicación de muestras de Campo y Control

campo

control Pablo Valcare

Procedimiento in Situ 1.- Se hacen dos cuadrados en el suelo de un metro por lado. Uno en el sitio expuesto y el otro (control) en un área aparte. 2.- Coloca en recipiente pequeño con hidróxido de potasio 0,1 N, cubriendo con el vaso grande enterrado inhibiendo el contacto exterior de la muestra. 3.- Después de 24 horas se titra con gotas de fenolftaleína y acido clorhídrico 0,1 N.

Respirometria

FRASCO DE VIDRIO

CO2 CO2

HIDROXIDO DE SODIO

FONDO / SUSTRATO

En Laboratorio

HIDROXIDO DE SODIO

Mapeo de Redox

Toma de Muestras de Suelo

Bolsas para transporte de Muestras Estériles

Hisopo de Transporte de Muestras Medio Stuart

Medio especifico para recolección, transporte y conservación de muestras aptas para estudios microbiológicos.

Medio de Transporte Stuart • Esta es otra forma de tomar Muestras preservadas para transportar al laboratorio.

Tiene un mínimo aporte de nutrientes que permite la recuperación de los microorganismos sin que haya replicación. Medio semi-solido, no nutritivo de Tioglicolato de Sodio

El pH alto minimiza la destrucción bacteriana por acidificación.

Tratamiento de Muestras • Procedimiento: • Tomar con tubos de PVC de 6 cm. de diámetro. • Introducir el tubo máximo a 15 cm de profundidad del fondo. • Evitar remover la superficie. • Colocar los tubos en fundas estériles de transporte. • Mantener cadena de frio en transporte o mantener en refrigeración no mayor a 5 horas.

• Diluciones: • Solución salina (hacer diluciones hasta 5 tubos). • Sembrar en agar • AN, TSA o AM: 0,1 ml y/o 1mL • Incubar entre 27 y 30C por 24 a 72 horas. • Contar Colonias observadas.

Aislamiento • Siembra por estría y agotamiento en agar TSA o agar Nutriente. • Establecer mínimo Línea III de Pureza. • Observación Morfológica de Colonias.

Contaje de Colonias mediante: CFU Scope v1.1

Protocolos de Verificacion • • • • •

Forma Motilidad Tinción Enzimas Micro Bioquímicas

• En Microbiología, los estándares de McFarland son usados como una referencia para ajustar la turbidez de las suspensiones bacterianas hasta que el número de bacterias llegue al rango establecido específicamente para identificación y pruebas de susceptibilidad. • El estándar de McFarland mas utilizado es al 0.5% y corresponde aproximadamente a una suspensión homogénea de 1.5 x 10 a la 8e células bacterianas / ml.

Tubos de Macfarland

3.- Micro bioquímica, dilución del Inoculo y siembra en Micro galerías Sistema de Identificación Microgen

0,5 Macfarland

Dosificación de Reactivos en Micro galerías

Interpretación de Resultados Microgen GN ID Panel A+ Panel B

4.- Preservación de Cepas de Reserva en Viales Cryobank

Inoculo en Viales de Cryobank VIAL DE CRYOBANK

BACTERIAS

CONGELACION GLICEROL

MICROPERLAS POROSAS

Preparacion de Medios Bases Medio para Nitrificantes Agua 1L. Cloruro de amonio 1 g. Fosfato di potásico 1 g. Carbonato de calcio 1 g. Sulfato de magnesio 10 g. Sulfato ferroso 10 mg. Cloruro de calcio 10 mg. Sales inorgánicas 0,02 mg. de: • Mn, Mo, Cu, Co, Zn. • • • • • • • •

Medio para Heterotofas • AGUA 1 L. • PEPTONA O TRIPTONA 5g. • EXTRACTO DE CARNE 3g.

Bioreactor

Escalados I,II,III

Crecimiento Bacteriano • Fase Lag o de Adaptación El crecimiento microbiano puede medirse en términos de concentración celular (número de células por unidad de volumen de cultivo) o densidad celular (peso seco de las células por unidad de volumen de cultivo). En organismos unicelulares la multiplicación conduce a un aumento en el número de individuos dando lugar a una población o a un cultivo

• Fase Log o Exponencial

• Fase Estacionaria • Fase Senescente

Fase Lag o de adaptación

Log. del numero Celulas viables

NO HAY DIVISION CELULAR NO HAY INCREMENTO NETO DE MASA LA CELULA ESTA SINTETIZANDO NUEVOS COMPONENTES

CELULAS ENVEJECIDAS CARECEN DE PROVISION SUFICIENTE DE ATP LA INOCULACION EN UN MEDIO QUIMICAMENTE DIFERENTE GENERA UNA FASE DE LATENCIA MAS LARGA

TIEMPO

Fase Log o Exponencial CRECEN Y SE DIVIDEN A LA VELOCIDAD MAXIMA POSIBLE QUE LE PERMITE SU POTENCIAL GENETICO LAS CONDICIONES DE CULTIVO SON OPTIMAS SI SE HAN ADAPTADO A LA NATURALEZA DEL MEDIO

DURANTE ESTA FASE LA POBLACION ES MUY UNIFORME EN CUANTO A SUS PROPIEDADES QUIMICAS Y FISIOLOGICAS

TIEMPO

Fase Estacionaria EL CRECIMIENTO SE DETIENE Y LA CURVA SE HACE HORIZONTAL

EN ESTA FASE LOS CULTIVOS LLEGAN A 1 x 10 ? E EL TAMAÑO DE LA POBLACION FINAL VARIA EN FUNCION DE LA DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES, OTROS FACTORES Y EL TIPO DE MICROORGANISMO

TIEMPO

Fase Senescente

INCAPACIDAD DE CRECER Y REPRODUCIRSE CNV RESPUESTA GENETICA DESENCADENADA

MUERTE CELULAR PROGAMADA

Factores a Considerar • • • • • •

Adaptación Incapacidad de contacto Sobrevivencia y competencia Micro habitad y nutrientes Carga energética Depredación

Factores de Afectacion El inoculo puede convertirse en fuente importante de alimento de depredadores del suelo

Incapacidad de contactar los compuestos a degradar

Incapacidad del inoculo de competir y sobrevivir con los autóctonos

Características de un Aislado Natural • Contener un mínimo de tres, máximo 6 cepas. • Deberá tener características nitrificante y heterótrofa. • Manejable en pH 6-8. • Estabilidad biológica soportada mínimo 90 días en sustratos solidos, semisólidos y líquidos. • No generar gases. • Exclusión comprobada contra vibrios,

pseudomonas y aeromonas.

Tareas Especificas • Es importante y necesario conocer de manera técnica la eficiencia de un consorcio bacteriano antes de usarlo. • Evaluar su expresión sobre el objetivo o fin especifico por el que fue aislado o adquirido. • Muestreos microbiológicos paralelos a los análisis químicos de agua y suelo. • La tendencia debe de estar orientada a que el aislado sea de cepas autóctonas. • Producir cepas para Bioremediacion y Pre digestión.

Piscinas Inoculadas

Beatriz Borrega

Piscina Inoculada

Beatriz Borrega

Gracias por su atención [email protected]