Uso del pez cebra como animal modelo para estudios de nanotoxicidad Sandra Rainieri [email protected]

JORNADA “NANOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN” 1 Junio 2015 ©AZTI

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Toxicidad NP metálicas

In vitro

Estrés oxidativo Inflamación Apoptosis …

Mecanismo de acción no siempre claro Faltan protocolos estandarizados y resultados uniformes Pocos estudios in vivo y a largo plazo ©AZTI

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Modelos animales para estudios de toxicidad • Los ensayos de toxicidad son obligatorios para cada aditivo / nuevo ingrediente • Los procedimiento estándar incluyen ensayo in vitro e in vivo • Los estudios con animales son caro, complicados, low-throughput y éticamente problemáticos

Solución: utilizar sistemas alternativos para llevar a cabo ensayos iniciales. Invertebrados

Embriones

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Pez cebra (Danio rerio)

• • • • •

Fácil y económico de mantener Reproducción externa Embriones transparente Herramientas genética Test alternativos

MODELO RECONOCIDO • • • • • •

Biología del desarrollo Enfermedades humanas Desarrollo de medicamentos Eco-toxicología Investigación alimentaria Acuicultura

Zebrafish

5 hpf

48 hpf

5 hpf

120 hpf

Alimentación espontanea (ANIMAL)

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© AZTI-Tecnalia. Todos los derechos reservados.© AZTI-Tecnalia. Todos los derechos reservados.

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Estudios in vivo alternativos al uso de animales Inflamación- cepa transgénica expresa mieloperoxidasa (mpx).

que

Estrés oxidativo – tinción con fluoróforo que detecta producción de ROS. Además, estimación daño oxidativo (peroxidación lipidica, daño proteinas, ADN….). Apoptosis – tinción con fluoróforo que detecta muerte celular programada. ©AZTI

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Estudios in vivo alternativos al uso de animales Absorción / Bioacumulación

Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014

López-Serrano et al., Nanotoxicology., 2014

Espresión genica – genes individuales o mediante array.

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Fases de un estudio de nanotoxicidad • Caracterización físico – química de las NPs con diferentes técnicas (a T0 y durante el experimento). • Definición de un protocolo de exposición adecuado. • Evaluación del absorción y distribución en el sistema biológico utilizado (durante el experimento). • Evaluación de end-points de toxicidad específicos.

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Estudio sobre la toxicidad de AgNPs comerciales Objetivos del trabajo: 1) Definir un protocolo adecuado para la evaluación de la toxicidad de NPs metálicas con embriones de pez cebra. 2) Clarificar si la toxicidad se debe a NPs o a liberación de Ag+. 3) Verificar si existen biomarcadores de toxicidad comunes entre diferentes tipos de AgNPs.

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Fase 1: definición protocolo exposición 96h

OECD 236 (FET test)

Protocolo 1 4hpf-48hpf

Protocolo 2 72hpf-120hpf

48h

48h

Protocolo 3 96hpf-120hpf

nAg coloidal

24h

Absorción y distribución

Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014

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Fase 2: NPs vs Ag+ Embryo water

nAg coloidal Polytech & Net y AgNO3

Agua desionizada

• Toxicidad aguda • Expresión génica Ag+ (complejos con aniones) = NO efecto

Ag+ (NO complejos) = efecto

100

% Mortality

80 60

nAg deionized water

40

nAg embryo water

20 0 0.01 ppm

1 ppm

5 ppm

nAg concentration

Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014

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NP vs Ag+

AgNPs vs AgNO3 (agua desionizada) Análisis transcriptómico

Genes inducidos/ reprimidos !! NO genes comunes!!

Mecanismo diferente

Procesos biológicos

1 proceso común: “cellular macromolecule metabolic process”

Mecanismo diferente

Rutas metabólicas

1 en común Metabolismo lipídico

Mecanismo diferente ©AZTI

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NP vs Ag+ • Toxicidad de las AgNPs debida al tamaño nano y a la liberación de iones. • El mecanismo de acción de las AgNPs depende del medio y de la concentración.

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Fase 3: Comparación efectos diferentes AgNPs Nanoplata coloidal Polytech & Net 100

LC50 6.24 ppm

80

% Mortality

19.05nm

60 40 20 0 0.01 ppm

AgNPs SIGMA + citrato

1 ppm

5 ppm

7 ppm

11 ppm

15 ppm

120

% Mortality

100 80 60 40

LC50 1.07 ppm

20

10.82 nm

0 0,093 ppm 0,1875 ppm 0,375 ppm 0,75 ppm

Suplemento alimentario

1,5 ppm

3 ppm

100

Mortality %

80

5.9 nm

LC50 0.076 ppm

60 40 20 0

Más toxico! ©AZTI 6/2/2015 0,05625 ppm 0,1125 ppm 0,225 ppm

0,45 ppm

13 0,9 ppm

Comparación efectos diferentes AgNPs Expresión diferencial de genes seleccionados Products NPs Ag

mt

il1β

slc16a9a opn1mw2

ucp3

nAg colloidal Polytech & Net NPs Ag Sigma Supplement nAg

up-regulated

(p