Caso 206: Cálculo de Vmax y Km mediante la linealización Lineweaver-Burk

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Caso 206 : Cálculo de Vmax y Km mediante la linealización de Lineweaver-Burk (Regresión lineal sin pesos estadísticos (todas las si = 1)) (F.J. Burguillo, USAL)

CASO PRÁCTICO En el caso 205 se analizó la hidrólisis enzimática del p-nitrofenil fosfato. Se hicieron experiencias a siete concentraciones de sustrato y se midieron las velocidades iniciales de reacción. Se realizaron 5 réplicas para cada una de las concentraciones de sustrato (35 datos en total) y se obtuvieron los resultados que figuraban en la tabla del caso 205 . Para calcular los parámetros cinéticos Vmax y Km se ajustó la ecuación de Michaelis-Menten a los datos:

v=

V max [S] K m + [S]

El ajuste se realizó por “regresión no lineal con pesos estadísticos”, siendo los pesos w i = 1/(s i ) 2 y calculando la desviación estándar (s i ) asociada a cada velocidad (v i ) a partir de las 5 réplicas disponibles. De manera que los datos analizados en el caso 205 tenían, dentro del análisis, la forma de la tabla 1. El objetivo de este caso 206 es ajustar la ecuación de Michaelis y Menten a los mismos datos experimentales, pero no en su forma directa (caso 205), sino en su transformación lineal más conocida, que es la de Lineweaver y Burk o doble inversa:

1 v

=

1

V max

K

1 m + V max  [S]

según la cual, la representación de 1/v frente a 1/[S] ha de ser una linea recta, y un ajuste de dicha recta a los datos por regresión lineal nos permitirá estimar la Vmax a partir de la ordenada en el origen y la Km a partir de la pendiente.

Teoría En general, la regresión de una variable dependiente “y” frente a una variable independiente “x” es de la forma:

y = f(x, ) +  donde θ es un vector de parámetros desconocidos y ε es el error experimental. Como es sabido, dados “n” pares de observaciones (x1,y1), (x2,y2), (x3,y3),...... (xn,yn), el método general de los mínimos cuadrados para estimar θ , consiste en calcular el valor θ que minimice la suma de cuadrados de los residuales:

WSSQ =  w i (y i − f(x i , )) 2

2

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donde WSSQ es la llamada “suma de residuales al cuadrado con pesos estadisticos” (weighted sum of squares). Siendo wi el peso estadístico calculado como el inverso de la varianza de la medida (w i = 1/s 2i ). En el caso que nos ocupa ahora, se trata de hacer una “Regresión lineal”. El problema está en decidir como vamos a hacer este ajuste. A priori, habría 2 alternativas:

Tabla 1 1/[S] (µM-1)

1/v (µmol-1 L min)

Desv.Est. de 1/v

0.0050

0.685

1

0.0050

0.680

1

0.0050

0.699

1

0.0050

0.741

1

0.0050

0.641

1

0.0100

0.758

1

....

.....

......

a) Regresión lineal sin pesos estadísticos (las desviaciones estándar de 1/v iguales a 1) En este ajuste habría que construir una tabla con 1/[S] como variable independiente, 1/v como variable dependiente y fijar todas las desviaciones estándar iguales a 1, como se muestra en la tabla 1 (como es habitual los datos empiezan por los valores mas bajos de 1/[S], que correponden a los valores más altos de [S] en la tabla del caso 205).

b) Regresión lineal con pesos estadísticos (las desviaciones estándar de 1/v se calculan correctamente) En este ajuste, las desviaciones estándar de 1/v no pueden ser las mismas que las de v, ni tampoco pueden calcularse haciendo simplemente su inverso. Como es sabido, las reglas de propragación del error permiten hacer estos cálculos de forma correcta:

s i (1/v i ) =

s i (v i ) v 2i

Los valores así estimados son los que se utilizarán en esta opción para calcular los pesos estadísticos: v 4i 1 = wi = (s i (1/v i )) 2 (s i (v i )) 2

Tabla 2 s(1/v)=s(v)/v2

1/[S] (µM-1)

1/v (µmol-1 L min)

0.0050

0.685

0.0355

0.0050

0.680

0.0350

0.0050

0.699

0.0370

0.0050

0.741

0.0415

0.0050

0.641

0.0311

0.0100

0.758

0.0476

....

.....

......

Como puede observarse (ver tabla 2), estos pesos, que son los correctos para nuestra transformación lineal, son muy diferentes unos de otros como para asumirlos constantes e iguales a 1 (procedimiento a)), ya que la aparición del término v 4 i los hace dependientes del valor de v i , aún en el caso de que las s i fuesen de tipo constante. Una práctica habitual en décadas pasadas, ha sido el ajustar la ecuación de Lineweaver-Burk usando una

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regresión lineal sin pesos estadísticos (s i = 1), lo que facilitaba los cálculos en las calculadoras de bolsillo. Esta práctica es desaconsejable, ya que aunque el error en v i hubiese sido de tipo constante (s i = 1), al hacerse la linealización doble inversa resulta obligado el ponderar los datos con pesos v 4i /(s i (v i )) 2 , pues aunque s i fuese constante (asumiéndose por ejemplo s i = 1), el término v 4i nunca podría omitirse. Historicamente cabe destacar que Lineweaver y Burk ya advirtieron de estos peligros, preveyendo un uso incorrecto de su linealización. Algún autor ha llegado a decir con humor, que la preferencia de los investigadores por esta linealización se debe a que “disimula” la desviación de la recta de los puntos experimentales y a que un ajuste de regresión lineal sin pesos siempre es más sencillo. La recomendación final es clara, los parámetros Vmax y Km debieran estimarse siempre por un ajuste de la ecuación de Michaelis-Menten en su forma directa a los datos experimentales, usando regresión no lineal (caso 205), si bien a efectos gráficos puede mostrarse, si se desea, los datos y la curva ajustada bajo la representación de Lineweaver-Burk.

Procedimiento paso a paso 1.- Crear un archivo con los datos x,y,s En este caso no es necesario, bastará con cargarlo en su momento desde c:\curso.

2.- Ajuste de los datos a la ecuación lineal de Lineweaver-BurK a) Regresión lineal sin pesos estadísticos (Desv.Est. de 1/v iguales a 1) • Seleccinar en el menú principal la opción “Ajustes”, seguida de la opción “Lineal; múltiple lineal; módulos GLM” y seguidamente “Ejecutar”. El programa nos ofrece, para empezar, la posibilidad de guardar los resultados del ajuste en un archivo, contestaremos de momento que “no”. • A continuación se despliega un submenú con todas las opciones disponibles: Empezaremos seleccionando “Nuevos datos” para importar nuestro archivo de datos (c:\curso\caso206s1.dat), a continuación iremos respondiendo al programa en la forma usual y al volver al menú de partida seleccionaremos ahora la opción “Regresión lineal simple (recta)” Automaticamente el programa hace el ajuste de regresión lineal por mínimos cuadrados y muestra la siguiente tabla con los resultados:

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Como vemos, la ordenada en el origen (intercept) vale 0.6242, de donde como intercept= 1/Vmax, se deduce que Vmax=1.60. A partir de la pendiente y teniendo en cuenta que pend=Km/Vmax, se obtiene que Km =19.4. Si comparemos estos valores con los encontrados por el ajuste a la ecuación directa realizado en el caso 205, observamos que si han variado, ya que alli se obtenían una Vmax=1.58 y una Km=18.1. Las diferencias no son excesivas por tratarse de datos bastante precisos, pero ejemplifican bien que sí hay diferencias y que éstas serían aún mayores con datos menos precisos. y

A continuación el programa muestra la matriz de correlación de los parámetros, seguida de la tabla que muestra los datos experimentales junto a los valores teóricos ajustados. Por último, aparece una tabla con toda la estadística asociada al ajuste.

y

Seguidamente el programa muestra diferentes opciones para representar los datos, elegiremos “Gráfica ejes originales”, ya que esta gráfica es la que corresponde ahora a 1/v frente a 1/[S] (que son nuestros datos originales en este caso).

y

Para terminar la sesión, pulsar “Cancelar” > “Cancelar” > “Salir” y se devolverá el control al menú principal.

b) Regresión lineal con pesos estadísticos (Desv.Est. de 1/v correctas) • Seleccinar en el menú principal la opción “Ajustes”, seguida de la opción “Lineal; múltiple lineal; módulos GLM” y seguidamente “Ejecutar”. El programa nos ofrece, la posibilidad de guardar los resultados en un archivo, contestaremos que “no”. •

A continuación se despliega un submenú con todas las opciones disponibles: Empezaremos seleccionando “Nuevos datos” para importar nuestro archivo de datos (c:\curso\caso206scorrecta.dat), a continuación iremos respondiendo al programa en la forma usual y al volver al menú de partida seleccionaremos ahora la opción “Regrgrsión lineal simple (recta)”

Automaticamente el programa hace el ajuste de regresión lineal por mínimos cuadrados y muestra la siguiente tabla con los resultados:

la ordenada en el origen (intercept) vale 0.6288, de donde como intercept= 1/Vmax, se deduce que Vmax=1.59. A partir de la pendiente y teniendo en cuenta que pend=Km/Vmax, se obtiene que Km =18.2. Si comparemos estos valores con los

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encontrados por el ajuste a la ecuación directa realizado en el caso 205, observamos que son prácticamente los mismos, ya que allí se obtenían una Vmax=1.58 y una Km=18.1. Por tanto, cuando se utiliza la linealización de Lineweaver-Burk haciendo el ajuste de regresión lineal con los pesos correctos, los valores de Vmax y Km son idénticos a los que se obtendrían con una regresión no lineal a la ecuación de Michaelis-Menten directa. Con la existencia de los ordenadores actuales, no compensa el ajustar transformaciones lineales de ecuaciones originales, ya que habría que hacer un trabajo “extra” para calcular correctamente los pesos estadísticos para esa linealización, por otra parte la sencillez de cálculo de la regresión lineal frente a la no lineal es hoy obviada por los ordenadores. y

A continuación el programa muestra la matriz de correlación de los parámetros, seguida de la tabla que muestra los datos experimentales junto a los valores teóricos ajustados. Por último, aparece una tabla con toda la estadística asociada al ajuste.

y

Seguidamente el programa muestra diferentes opciones para representar los datos, elegiremos “Gráfica ejes originales”, ya que esta gráfica es la que corresponde ahora a 1/v frente a 1/[S] (que son nuestros datos originales en este caso).

y

Para terminar la sesión, pulsar “Cancelar” > “Cancelar” > “Salir” y se devolverá el control al menú principal.