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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 109 886 kN´umero de solicitud: 9502329 kInt. Cl. : A01H 4/00

11 N´ umero de publicaci´on: 21

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˜ ESPANA

C12N 5/04

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SOLICITUD DE PATENTE

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22 Fecha de presentaci´ on: 27.11.95

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71 Solicitante/s: Tong Yang Moolsan Co. Ltd.

Byuck San 125 Bldg 12-5 Tong Ja-Dong Yong San-Ku, Seul, KR

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30 Prioridad: 08.10.94 KR 94-25775

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72 Inventor/es: Joo - Hag, Kim y

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74 Agente: L´ opez Cort´ es, Jos´ e

43 Fecha de publicaci´ on de la solicitud: 16.01.98

Kyung - Ho, Chung

43 Fecha de publicaci´ on del folleto de la solicitud:

16.01.98

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54 T´ıtulo: Proceso para la producci´ on en masa de bulbos de siembra de ajo, libres de virus, a traves

de la t´ ecnica de cultivo de tejidos vegetales.

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57 Resumen:

Nuevo proceso para la producci´on en masa de microbulbos y minibulbos de ajo libres de virus a trav´es de t´ecnicas de cultivo tisular de plantas, que comprende las etapas de: derivar callos de los meristemas apicales de dientes de ajo; regenerar v´astagos a partir de los callos; derivar multiv´astagos de los v´astagos regenerados; multiplicar los multiv´astagos a trav´es de subcultivos repetitivos; formar microbulbos libres de virus a trav´es del cultivo tisular de la planta; y, finalmente, formar minibulbol libres de virus a trav´es de cultivo de multiv´astagos en campo abierto, con lo que puede mejorarse mucho el rendimiento de la producci´on con una disminuci´ on de etapas, una mayor velocidad de multiplicaci´ on de los v´astagos, un menor n´umero de etapas del proceso y tambi´en un aumento de la densidad de los v´astagos en un recipiente de cultivo.

Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 109 886 A1 DESCRIPCION Antecedentes de la invenci´ on 5

Campo de la invenci´ on La presente invenci´on se refiere, en general, a un nuevo proceso para la producci´ on en masa de microbulbos y minibulbos de ajo, libres de virus, a trav´es de la t´ecnica de cultivo de tejido vegetal y, m´ as particularmente, a un perfeccionamiento en el rendimiento de la producci´ on.

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Descripci´ on de la t´ ecnica anterior El ajo (Allium sativum L.) es una planta importante y u ´til, hasta el punto de que no s´ olo se utiliza frecuentemente como especia sino que se aprovecha tambi´en para alimentaci´on sanitaria y productos farmac´euticos. El ajo es un tipo de planta que se propaga de forma vegetativa a trav´es de dientes. En consecuencia, el desarrollo de nuevas variedades de ajo s´olo es posible a trav´es de la selecci´on gen´etica, dado que la selecci´on por cruce es imposible. Como ocurre con la mayor´ıa de las restantes plantas de propagaci´ on vegetativa, el ajo sufre gravemente con las enfermedades virales, por ejemplo, el ajo se infecta f´acilmente por pat´ogenos conocidos como el virus del mosaico del ajo (el VMA) y el virus latente del ajo (VLA), que provocan una disminuci´ on del rendimiento y una degradaci´ on de la calidad. Los productos qu´ımicos agr´ıcolas desarrollados hasta ahora no pueden tratar estas enfermedades virales. Por lo tanto, para resolver los problemas virales, se han realizado muchos intentos a trav´es de mejoras en el bulbo de siembra. Hasta la actualidad, un ajo de siembra libre de pat´ ogenos es conocido como el mejor medio para eliminar los problemas atribuibles a las enfermedades virales. La infecci´on por los virus del ajo provocaron en Corea una disminuci´ on del rendimiento del 40-50 %. Aunque el uso de ajos de siembra libres de virus es un medio efectivo para reducir los da˜nos atribuibles a las enfermedades virales, los agricultores no pueden utilizarlo f´ acilmente porque no se ha desarrollado un m´etodo efectivo para la producci´ on en masa y econ´ omica de ajos de siembra libres de virus. Para resolver el problema de la enfermedad viral, se puede utilizar la t´ecnica del cultivo de tejidos vegetales para la producci´ on de ajos de siembra libres de virus. Se han desarrollado diversos procesos para la producci´ on de ajos de siembra libres de virus a trav´es de la t´ecnica del cultivo de tejidos vegetales, que pueden clasificarse en los cuatro grupos siguientes: primero, un meristema apical se separa de un diente de ajo y se cultiva en un medio adecuado para obtener del mismo de uno a varios v´ astagos, seg´ un se describe en la Patente Rumana N◦ . 96914, concedida el 30 de mayo de 1989 (denominado en lo sucesivo el “proceso de cultivo de meristema apical”); segundo, se deriva un callo de un meristema apical separado y se multiplica, diferenci´ andose en v´ astagos de ajo, seg´ un se describe en la Solicitud de Patente Japonesa N◦ . Heisei 1-300771, solicitada por Aginomoto K.K. el 21 de noviembre de 1989 (denominado en lo sucesivo “proceso del cultivo de callo”); tercero, el proceso Sumitomo, descrito en la revista Plant Cell Tissue Organ Culture 32, 2. 275-183 (1993) de Sumitomo Chemical, Jap´ on, que es similar al proceso de cultivo de meristema apical pero que comprende adem´as multiplicar un v´astago derivado de un meristema apical, a trav´es de subcultivos (denominado en lo sucesivo “proceso sumitomo”); cuarto, un proceso descrito en la Solicitud de Patente Japonesa N◦ . Heisei 1-19850 solicitada el 31 de enero de 1989 por Shin Nippon Seitetsu K.K., en el que una masa de v´ astagos no diferenciada, denominada primordio de v´ astagos, se deriva de un meristema apical de un diente de ajo y se multiplica, desarroll´ andose en v´astagos (denominado en lo sucesivo el “proceso del primordio de v´ astagos”). Para entender mejor las caracter´ısticas de la invenci´on, se presentar´ a una descripci´ on de los procesos arriba mencionados en relaci´ on con algunos dibujos. Haciendo referencia a la Fig. 2, en ella se presenta un esquema que ilustra e: proceso de cultiva de meristema apical. Como puede verse en este esquema de flujo, los v´astagos se derivan a partir del meristema apical del diente, form´ andose acto seguido en microbulbos. Este proceso es inconveniente en varios aspectos. En primer lugar, porque los meristemas apicales del diente, al tener un tama˜ no de aproximadamente 0,3 mm o menos, se separan continuamente bajo microscopio a fin de conseguir un gran n´ umero de v´ astagos, por lo que el proceso es muy lento. En segundo lugar, los meristemas de v´ astagos separados tienen muy poca viabilidad en la primera etapa. Otro inconveniente importante del proceso de cultivo de los meristemas apicales es que se necesitan tantos dientes de ajos como microbulbos se desee producir. Adem´ as, se tarda mucho tiempo en producir microbulbos. Por ejemplo, se requieren 8 meses para llevar a efecto el proceso, desde el cultivo inicial del meristema de v´astagos separados hasta el 2

ES 2 109 886 A1 microbulbo. Por otra parte, es pr´ acticamente imposible obtener microbulbos gen´eticamente homog´eneos, porque se derivan de diversos explantes.

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Haciendo referencia a la Fig. 3, en ella se ilustra el proceso de cultivo de callo, que marca un avance sustancial, comparado con el proceso de cultivo de meristema de v´ astagos. Como se ilustra en dicha Figura, consiste principalmente en obtener un callo a partir de un meristema apical de un diente de ajo, multiplicar el callo a trav´es de subcultivos repetitivos, regenerar v´ astagos a partir del callo y disponer los v´astagos en microbulbos de ajo. Pero este proceso tiene igualmente varios inconvenientes. En primer lugar, es pobre en cuanto a la eficiencia de la producci´ on, debido a la limitaci´on del n´ umero de los subcultivos. Es decir, es necesario que el subcultivo del callo se realice muchas veces a fin de conseguir una cantidad suficiente de callos, pero el n´ umero de subcultivos se limita a unas 8 veces en este proceso, porque el ´ındice de regeneraci´on disminuye fuertemente despu´es de que los subcultivos contin´uen m´ as de 8 veces. Otro inconveniente importante es que es dif´ıcil predeterminar el n´ umero de v´ astagos regenerados debido a la fluctuaci´ on en el ´ındice de regeneraci´on y es muy probable que una porci´on importante de los v´astagos regenerados se vitrifiquen, dando lugar a una dificultad en el control del n´ umero de v´ astagos. Otro inconveniente m´as es que la velocidad de multiplicaci´on de los callos es lenta (4 veces/mes). La formaci´ on de microbulbos de ajo por separaci´ on del meristema apical se consigue a trav´es de un m´ınimo de 4 etapas en este proceso, por lo que para esto se necesita mucho tiempo, es decir, alrededor de 8 meses. Por otra parte, el proceso de cultivo de callo encuentra algunas dificultades para que puedan obtenerse v´astagos gen´eticamente homog´eneos. Por uno de los dos procesos, el proceso de cultivo de meristema y el proceso de cultivo de callos se pueden producir s´olo un n´ umero limitado de microbulbos de ajo libres de virus. Un n´ umero reducido de los microbulbos de ajo libres de virus se cultivan en campos abiertos a efectos de la propagaci´ on en masa de los ajos. No obstante, la velocidad de multiplicaci´ on del ajo en campos abiertos es lenta (5-6 veces/a˜ no), y por otra parte, los bulbos quedan gradualmente infectados por virus a trav´es de los insectos vectores cuando se cultivan en campo abierto. Con referencia a la Fig 4, se presenta un esquema de flujo que ilustra el proceso Sumitomo, reconocido como el mejor entre los procesos sugeridos hasta ahora. Como puede verse en la figura, el proces´ o Sumitomo comprende la obtenci´ on de v´ astagos a partir de un meristema de v´ astago de un diente de ajo, someter los v´astagos a subcultivo varias veces para conseguir su proliferaci´ on y disponer los v´ astagos proliferados en microbulbos. Por muy bueno que pueda ser el proceso Sumitomo, tiene tambi´en algunos inconvenientes como ocurre con los dem´as procesos. En primer lugar, dado que el meristema de v´ astago, que es de tama˜ no muy peque˜ no y cuya viabilidad inicial es muy baja, debe ser cultivado continuamente, el rendimiento es bajo. Otro inconveniente importante del proceso Sumitomo es que la velocidad de multiplicaci´on del v´ astago es igualmente lenta (2,5 veces/mes). Adem´as, se tarde mucho tiempo para el tratamiento a baja temperatura a fin de la necesaria mejora de la formaci´ on de microbulbos de ajo a partir de los v´ astagos (unos 6 meses). El tiempo que va desde el cultivo inicial hasta la formaci´ on de microbulbos es demasiado largo igualmente (12 meses). Adem´as, varios explantes hacen pr´acticamente imposible obtener v´ astagos gen´eticamente homog´eneos. Como en esta descripci´on, parece probable que el proceso Sumitomo no sea econ´omicamente adecuado para la producci´ on en masa de microbulbos de ajo libres de virus. Volviendo a la Fig. 5, en ella se presenta un esquema de flujo que ilustra el proceso del primordio de v´ astago. Comprende obtener primordios de v´ astagos de los meristemas apicales de dientes de ajo, hacer proliferar los primordios de v´astago y disponerlos en microbulbos de ajo. Se necesita un cultivo rotativo en la etapa de inducci´ on y proliferaci´on de los primordios de v´ astagos. Debido a limitaci´ on de las facilidades para el cultivo rotativo, es pr´ acticamente imposible la producci´on en masa de los primordios de v´ astagos. Adem´ as, la fecundidad de los primordios de v´ astagos es baja (2-5 veces/mes). Se necesita un tratamiento a baja temperatura (5±2◦ C) para formar los microbulbos. Otro inconveniente importante del proceso del primordio de v´ astagos es que el tiempo que va desde el cultivo inicial hasta la formaci´ on de microbulbos es largo (12 meses). Adem´as, es imposible obtener v´astagos gen´eticamente homog´eneos porque se derivan de diversos explantes.

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Como se ha descrito anteriormente, estos procesos convencionales no pueden producir en masa microbulbos de ajo libres de virus y, en consecuencia, son muy inconvenientes desde el punto de vista econ´ omico. En otras palabras, los procesos convencionales representan un coste de producci´ on excesivamente elevado para que puedan aplicarse a la producci´on industrial de microbulbos de ajo libres de virus. 60

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ES 2 109 886 A1 Resumen de la invenci´ on

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En consecuencia, un objeto principal de la presente invenci´ on es el de proporcionar un nuevo proceso para la producci´ on en masa de microbulbos de ajo libres de virus a trav´es de la t´ecnica de cultivo de tejido vegetal, que evita los problemas antes mencionados asociados a los procedimientos de la t´ecnica anterior. Otro objeto de la presente invenci´ on es el de proporcionar un proceso para la producci´ on en masa de microbulbos de ajo libres de virus, que permite que el rendimiento de la producci´on mejore mucho y se reduzcan las etapas del proceso, como se ilustra en la Fig. 1. Bas´andose en un estudio intensivo y a fondo de los presentes inventores, han podido alcanzarse los objetos anteriores proporcion´ andose un proceso para la producci´ on en masa de microbulbos de ajo libres de virus, que comprende las etapas de: derivar un callo de los meristemas apicales de dientes de ajo y propagar el callo; regenerar los v´astagos a partir del callo; multiplicar multiv´ astagos a trav´es de subcultivos repetitivos; y formar microbulbos libres de virus a partir de los multiv´ astagos. Breve descripci´ on de los dibujos

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Los objetos anteriores y otras caracter´ısticas y ventajas de la presente invenci´on aparecer´an con mayor claridad en la siguiente descripci´on detallada, que se realiza con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales: la Figura 1 es un esquema de flujo que ilustra un proceso para la producci´on en masa de microbulbos de ajo libres de virus, seg´ un la presente invenci´ on (denominado proceso de multiv´ astagos); la Figura 2 es un esquema de flujo que ilustra un proceso convencional para la producci´ on de microbulbos de ajo libres de virus, denominado proceso del cultivo de meristemas de v´ astagos;

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la Figura 3 es un esquema de flujo que ilustra otro proceso convencional para la producci´on de microbulbos de ajo libres de virus, llamado el proceso de cultivo de callos; la Figura 4 es un esquema de flujo que ilustra otro proceso convencional m´ as para la producci´ on de microbulbos de ajo libres de virus, llamado proceso Sumitomo;

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la Figura 5 es un esquema de flujo que ilustra otro proceso convencional m´ as para la producci´ on de microbulbos de ajo libres de virus, llamado proceso de primordio del v´ astago; la Figura 6 es una fotograf´ıa que muestra callos propagados en un medio en un disco de Petri, de acuerdo con la presente invenci´on;

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la Figura 7 es una fotograf´ıa que muestra v´ astagos regenerados en un medio en un disco de Petri, de acuerdo con la presente invenci´ on; la Figura 8 es una fotograf´ıa que muestra multiv´ astagos que han proliferado en un medio en disco de Petri, seg´ un la presente invenci´ on;

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la Figura 9 es una fotograf´ıa que muestra microbulbos de ajo formados en un medio en disco de Petri, seg´ un la presente invenci´ on; y la Figura 10 es una fotograf´ıa que muestra los microbulbos de ajo que est´ an almacenados de acuerdo con la presente invenci´on. Descripci´ on detallada de la invenci´ on

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Con referencia a la Figura 1, se trata de un esquema de flujo que ilustra un proceso para la producci´ on en masa de microbulbos de ajo libres de virus a trav´es de la t´ecnica de cultivo de tejido vegetal seg´ un la presente invenci´on. Como se ilustra en este esquema de flujo, en primer lugar se deriva el callo a partir de un meristema apical de un diente de ajo, regener´ andose en v´ astagos, que acto seguido se diferencian en un multiv´ astago, un racimo de v´ astagos que consta de aproximadamente 100 v´astagos. A continuaci´on, el multiv´ astago se propaga semipermanentemente y acto seguido se dispone en microbulbos. Como se ha indicado anteriormente, los procesos convencionales son adecuados para la producci´on a peque˜ na escala de microbulbos de ajo libres de virus. Por el contrario, la presente invenci´ on permite que se produzcan industrialmente microbulbos de ajo libres de virus. En el proceso Sumitomo, el n´ umero de 4

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multiv´ astagos se aumenta por 128 veces a lo largo de 4 subcultivos durante 27 semanas, dando una media de 2,5 veces al mes (ver arriba, Plant Cell Tissue Organ Cultura, supra) (“Cultivo de Organos de Tejidos de C´elulas Vegetales”). En contraste con el proceso convencional, la velocidad de multiplicaci´ on de los v´astagos puede aumentarse excepcionalmente (14-15 veces/mes) por subcultivo de los multiv´ astagos en un disco de Petri seg´ un la presente invenci´on. En consecuencia, se pueden producir en masa microbulbos de ajo libres de virus con menos trabajo, tiempo y coste. En virtud del desarrollo de un nuevo proceso de propagaci´ on en masa seg´ un la presente invenci´ on, es posible la propagaci´ on industrial en masa de variantes de l´ınea pura de ajo, lo que no pueden permitir los procesos convencionales debido a su elevado coste de producci´ on.

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Cuesta demasiado producir minibulbos (2-3 g/bulbo) in vitro, que puedan servir como aut´enticos bulbos de siembra. A pesar de que puedan producirse en masa in vitro microbulbos (0,1-0,3 g/bulbo) son demasiado peque˜ nos para que sirvan como verdaderos bulbos para siembra, porque su cultivo en campo abierto no produce bulbos normales (productos finales: consistente en 6-8 dientes) sino minibulbos (2-3 g/bulbo), que pueden utilizarse entonces como verdaderos bulbos de siembra. Por lo tanto, la producci´ on de microbulbos in vitro exige una etapa adicional de cultivo en el campo sin aumentarse de ese modo el n´ umero de dientes. Es decir, a fin de obtener bulbos normales de ajo, los microbulbos se cultivan en campo libre hasta que pesan de 2 a 3 g y a continuaci´ on se cultivan en campo abierto una vez m´ as. Los microbulbos producidos in vitro son superiores en cuanto a durabilidad, por lo que pueden almacenarse durante varios meses. No obstante, se tarda mucho tiempo y cuesta demasiado formar los bulbos de siembra a partir de microbulbos producidos in vitro. Se ha desarrollado un procedimiento alternativo para superar las citadas limitaciones de los microbulbos. De acuerdo con la presente invenci´on, en un a˜ no pueden obtenerse minibulbos, que pueden servir de bulbos de siembra, con el trasplante de v´ astagos directamente al suelo y su cultivo en campo abierto. A fin de producir en masa minibulbos a trav´es de cultivo en campo abierto, deben plantarse simult´aneamente en el suelo un gran n´ umero de v´ astagos. Para ello, si los v´astagos que se producen continuamente a trav´es del cultivo de tejido de c´elulas vegetales seg´ un la presente invenci´ on se almacenan a bajas temperaturas, pueden durar un m´ınimo de 8 meses sin variaci´on alguna. En consecuencia, este almacenamiento a baja temperatura permite que puedan recogerse los v´astagos en cantidad suficiente para realizar la implantaci´ on simult´ anea en el suelo, que da lugar a la recolecci´on de muchos minibulbos. La presente invenci´on se comprender´ a con mayor claridad a medida que avance la descripci´on que sigue.

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Derivaci´ on del callo a partir del tejido de meristema apical y su multiplicaci´ on

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Una variedad de ajo coreano se planta en un suelo que se contiene en una c´ amara de crecimiento a andose en ella. En el momento en que el ajo crece vigorosamente, una temperatura de 24-26◦C, cultiv´ se cultiva a unos 30-31◦C durante 7-10 d´ıas y a continuaci´on, a unos 36-37◦C durante 30 a 40 d´ıas, a fin de desactivar los virus presentes en la planta. Despu´es del tratamiento t´ermico, se retiran las partes a´erea y radicular de las plantas. Acto seguido, s´ olo se recogen las partes que contienen meristemas apicales, esteriliz´andose con alcohol al 75-80 % durante 5 min., seguido por un agente lixiviante (soluci´ on de hipoclorito s´ odico al 2-3 %: NaOCl) durante 15-20 minutos. Una vez lavadas con agua esterilizada tres o cuatro veces, las partes que contienen los meristemas apicales se cortan bajo microscopio a fin de separar los meristemas apicales (de aproximadamente 0,3 mm o menos) situados por encima del sistema radicular. A fin de obtener un callo a partir de ellos, estos meristemas apicales se cultivan en medio s´olido de Murashige y Skoog (denominado aqu´ı en lo sucesivo “medio MS”) (ver Murashige T. y F. Skoog, Physiol. Plant 15: 473-497 (1962)) que contiene de 0,1 a 0,2 ppm (mg/L) de 2,4-D (´ acido 2,4 -diclorofenoxiac´etico), un regulador del crecimiento de las plantas, durante 2 a 3 meses. Estos callos se propagan subcultiv´ andolos varias veces en el mismo medio que el utilizado para la obtenci´ on del callo. La temperatura preferida para derivar y propagar el callo es del orden de los 24 a 26◦ C, independientemente de la hora del d´ıa o de la noche. La Figura 6 es una fotograf´ıa que muestra los callos cultivados en un disco de Petri, que contiene el medio MS con 0,1 mg/L 2,4-D. Regeneraci´ on de v´ astagos a partir del callo

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Un medio para regeneraci´ on de los v´astagos a partir del callo (denominado aqu´ı en lo sucesivo “medio de regeneraci´on del v´ astago”) consiste en medio b´ asico de MS conteniendo 2-3 % de sacarosa, 0,3-3,0 mg/L de bencilaminopurina (BA) y 0,7 % de agar. Entre diversos medios b´asicos probados, el medio MS 5

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es el m´as adecuado para producir v´ astagos ricos y sanos. Los v´ astagos que se regeneran a partir del callo en un disco de Petri se ilustran en la Figura 7. Un medio que contenga 0,3-3,0 mg/L de bencilaminopurina (BA), sola o en combinaci´ on con 0,1 mg/L de un a´cido α-naftilenac´etico (NAA) es m´as adecuado para regenerar v´astagos a partir del callo que cualesquiera otros medios que contengan diversas citoquininas y auxinas. Multiplicaci´ on de los v´ astagos

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En la Tabla 1 se muestra la composici´on de un medio para multiplicaci´ on de los v´astagos. Los v´astagos regenerados se transfieren al medio y se cultivan a fin de obtener multiv´ astagos. La velocidad de multiplicaci´ on de los multiv´ astagos es baja en la primera etapa, pero aumenta si los v´astagos se subcultivan dos o m´as veces. El n´ umero de los v´ astagos aumenta en aproximadamente 14-15 veces en un mes, por lo que alrededor de 400 v´astagos crecen en un disco de Petri est´ andar con un tama˜ no de 10 x 1,5 cm. Bas´andose en el hecho de que los subcultivos pueden continuarse durante m´ as de 3 a˜ nos sin ninguna regeneraci´on ni vitrificaci´ on de los v´astagos, es evidente que los multiv´astagos pueden ser subcultivados de forma semipermanente. La composici´on del medio para la multiplicaci´ on del v´ astago es similar al medio de regeneraci´on de los v´ astagos, excepto que la cantidad de nitr´ ogeno de amonio se reduce a la mitad del nivel de MS, y que se a˜ nade 0,3-3,0 mg/L de bencilaminopurina (BA) junto con 0,05-0,2 mg/L de a´cido α-naftilenac´etico. on de 4000-6000 lux, y 16 horas de luz/8 Los subcultivos se mantienen a 24-26◦C, con una iluminaci´ horas de oscuridad como fotoper´ıodo. La temperatura se mantiene a unos 24-26◦C, independientemente de la hora del d´ıa y de la noche.

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Comparados con los v´ astagos producidos por los procesos convencionales, estos multiv´astagos tienen caracter´ısticas favorables en muchos aspectos, seg´ un se expone a continuaci´on: en primer lugar, estos multiv´ astagos tienen un sistema radicular bien desarrollado; en segundo lugar, pueden ser subcultivados semi-permanentemente; tercero, tienen una elevada poblaci´on de v´ astagos, alrededor de 400 por disco de Petri; y, por u ´ltimo, el per´ıodo de almacenamiento a baja temperatura necesario para la formaci´ on del bulbo antes de su u ´ ltima etapa es breve (alrededor de 2 meses). Particularmente, la presente invenci´on es superior al proceso del primordio del v´ astago en cuanto a la fecundidad del multiv´ astago, como es evidente por el hecho de que el n´ umero de los v´ astagos propagados seg´ un el proceso de la presente invenci´on es de aproximadamente 100 por racimo, mientras que el n´ umero de v´ astagos seg´ un el proceso del primordio del v´ astago es de s´olo unos 10. La Figura 8 es una fotograf´ıa que muestra los multiv´ astagos propagados en´ergicamente en el medio de multiplicaci´on de v´ astago seg´ un la presente invenci´ on.

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astagos Formaci´ on in vitro de microbulbos a partir de multiv´ Una decimoquinta parte de los multiv´ astagos propagados en el medio se transfiere a otro medio fresco de multiplicaci´on de v´ astagos, subcultiv´ andose en el mismo, con el objetivo de reproducir v´ astagos. El resto, es decir, catorce decimoquintas partes de los multiv´astagos, se transfieren a un medio para formar microbulbos de ajo. Una vez almacenados a 4◦ C durante 2 meses, los multiv´astagos se transfieren al medio, disponi´endose en microbulbos. Con referencia a la Figura 9, en ella aparece una fotograf´ıa que muestra los microbulbos formados en el medio para formaci´ on de bulbos en un disco de Petri.

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Un medio para formaci´ on de bulbos a partir de v´ astagos (denominado en lo sucesivo “medio de formaci´on de bulbos”) consiste en un medio b´ asico MS que contiene 9 % de sacarosa, 0,1-2,0 mg/L de a´cido α-naftilenac´etico y 0,7 % de agar. Una vez cultivados durante 2 meses, los microbulbos podr´ıan ser recolectados si cada uno de ellos pesara como m´ınimo 0,2 g. Los microbulbos recolectados se someten a secado durante 5 d´ıas. Los microbulbos se ponen entonces en un recipiente a fin de que no se marchiten y a continuaci´on se almacenan en frigor´ıfico a 4-5◦C. on de 4000-6000 lux y 16 horas de luz/8 horas Los cultivos se mantienen a 24-26◦C, con una iluminaci´ de oscuridad como fotoper´ıodo.

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La Figura 10 muestra el microbulbo almacenado.

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ES 2 109 886 A1 Formaci´ on de minibulbos a partir de multiv´ astagos

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Un gran racimo de los multiv´ astagos propagados, consistente en 100 v´ astagos, se divide en peque˜ nos racimos, cada uno de ellos consistente en unos 5 v´astagos, que se plantan en oto˜ no en campo abierto. En este momento, ya que los v´ astagos propagados in vitro son d´ebiles, se plantan antes del per´ıodo general para la siembra de ajo (de finales de octubre a los primeros d´ıas de noviembre) a fin de tener tiempo suficiente para que se desarrolle el sistema radicular. Los v´astagos que han sido producidos despu´es de la implantaci´on en oto˜ no se almacenan a bajas temperaturas durante el invierno y se plantan en primavera en campo abierto. Sin tratamiento a baja temperatura durante unos 3 meses, no se formar´ıa ning´ un microbulbo a partir de los v´astagos que fueron implantados en primavera. Almacenamiento a largo plazo de los multiv´ astagos producidos en masa

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A fin de producir minibulbos en campo abierto a partir de los multiv´ astagos, es necesario almacenar los multiv´ astagos durante varios meses, porque los v´ astagos se propagan continuamente durante todo el a˜ no, pero se plantan en el suelo una o dos veces al a˜ no. Una vez transferidos del medio de multiplicaci´ on de v´ astagos al medio de formaci´ on de bulbos, los multiv´ astagos pueden almacenarse a baja temperatura de 4 a 6◦C durante un m´ınimo de 5 meses sin deterioro en las condiciones de una iluminaci´on de 500-1500 lux y 16 horas de luz/8 horas de oscuridad de fotoper´ıodo. Gracias a este almacenamiento a largo plazo de los v´astagos, se pueden suministrar de inmediato una gran cantidad de los v´ astagos necesarios para la producci´ on de minibulbos a trav´es de cultivo en campo abierto. Ensayo de los virus

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Para an´ alisis de los virus se utilizan extractos de callos, multiv´astagos y microbulbos triturados. Se aplica el an´alisis ELISA para examinar si hay o no virus presentes en las muestras. Estos an´ alisis muestran que los microbulbos, incluidos los callos y multiv´ astagos producidos de acuerdo con el proceso de la presente invenci´on tienen muy pocos o ning´ un virus.

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Puede obtenerse un mejor conocimiento de la presente invenci´on a la luz de los ejemplos siguientes que se presentan para ilustrar, y no deben interpretarse como que limitan, la presente invenci´ on. Ejemplo I

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Derivaci´ on del callo del meristema apical y su multiplicaci´ on Se plantaron una variedad de ajos coreanos en suelo que se conten´ıa en una c´ amara de crecimiento, cultiv´ andose en la misma a 25◦C. Cuando los ajos crec´ıan vigorosamente, las plantas de ajos se cultivaron on a unos 36-37◦C durante 30 a 40 d´ıas, de manera a unos 30-31◦C durante 7 a 10 d´ıas y a continuaci´ que disminuyera la actividad de los virus presentes en las plantas. Despu´es de tratamiento t´ermico, se retiraron las partes a´ereas y radiculares. S´olo se recogieron las partes que conten´ıan el meristema apical, esteriliz´andose durante 5 minutos con alcohol al 75 % y acto seguido con una soluci´on diluida al 50 % de un agente comercial blanqueante (hipoclorito s´odico, NaOCl, “Yuhan RaxR”, fabricado por Yuhan Yanghang Co. Ltd., Corea) durante 15 min. Despu´es de ser lavados tres veces con agua esterilizada, las partes que conten´ıan el meristema apical fueron cortadas bajo microscopio para separar los meristemas apicales (de 0,3 mm o menos) situados por encima del sistema radicular. A fin de obtener el callo a partir de ellos, estos meristemas apicales fueron cultivados en medio apropiado en un disco de Petri con un tama˜ no de 10 x 1,5 cm, durante 3 meses (Fig. 6). El medio para obtener el call´ o consisti´o en medio b´ asico MS conteniendo el 2 % de sacarosa, 0,1 mg/L 2,4-D (´ acido 2,4-diclorofenoxiac´etico) y 0,7 % de agar, ajust´ andose para que tuviera una acidez de un pH de 5,8 antes de esterilizaci´on. Esta regeneraci´on on de 4000-6000 lux y 16 de los v´astagos se realiz´ o en condiciones de 25◦ C de temperatura, una iluminaci´ horas de luz/8 horas de oscuridad de fotoper´ıodo. El callo se multiplic´ o subcultiv´ andolo al menos dos veces en el mismo medio que para su obtenci´on. Las condiciones de cultivo fueron las mismas que para la obtenci´ on del callo a partir del meristema apical. Como se describir´ a, los callos multiplicados se utilizaron para diferenciaci´on en v´ astagos.

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7

ES 2 109 886 A1 Ejemplo II Regeneraci´ on de v´ astagos a partir de callos 5

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Un medio para regeneraci´on de v´ astagos a partir de los callos consisti´o en medio b´ asico MS que conten´ıa un 2-3 % de sacarosa, 1,0 mg/L de bencilaminopurina (BA) y un 0,7 % de agar. Una masa de los callos obtenidos en el Ejemplo 1 se dividi´ o en partes peque˜ nas id´enticas. Fueron puestos en el medio de regeneraci´on de v´ astagos y cultivados durante 2-3 meses, para que se regeneraran en v´ astagos como se ilustra en la Fig. 7. Esta regeneraci´on de los v´astagos se desarroll´ o en las siguientes condiciones: 25◦C de temperatura, iluminaci´ on de 4000-6000 lux y 16 horas de luz/8 horas de oscuridad de fotoper´ıodo. Ejemplo III Multiplicaci´ on de los v´ astagos

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La composici´on de un medio para multiplicaci´ on de los v´astagos es la ilustrada en la Tabla 1, y este mismo medio se us´o para desarrollar los v´astagos obtenidos en el Ejemplo II convirti´endolos en multiv´astagos. El medio para multiplicaci´ on de los v´astagos fue el mismo que el medio b´ asico MS excepto que la cantidad de nitr´ ogeno de amonio se reduce a la mitad del nivel del medio MS, y conten´ıa tambi´en un 2 % de sacarosa, 1 mg/L de bencilaminopurina (BA), 0,1 mg/L de a´cido α-naftilenac´etico (NAA) y 0,7 % de agar. Se seleccionaron los multiv´astagos apropiados y se transfirieron a un medio fresco en una etapa precoz de desarrollo de los multiv´ astagos. La velocidad de multiplicaci´ on de los multiv´ astagos fue lenta en la primera etapa, pero aument´ o despu´es de que los multiv´astagos fueron cultivados dos o m´ as veces. El n´ umero de v´ astagos aument´ o alrededor de 15 veces en un mes, por lo que se pudieron cultivar hasta 400 v´astagos (cuando se contaban para 0,5 cm o m´ as) en un disco de Petri con un tama˜ no de 10 x 1,5 cm, como se ilustra en la Fig. 8. Los subcultivos de los v´astagos se repitieron con el objetivo de multiplicar varias veces los v´astagos. Con m´ as detalle, un racimo formado por 100 v´astagos se dividi´o en muchos menores, cada uno de ellos formado por unos 5 v´ astagos. Los racimos menores de 3 ´o 4 v´astagos fueron transferidos a un medio fresco de multiplicaci´on, se cultivaron durante unas 5 semanas, desarroll´ andose finalmente en multiv´astagos al t´ermino del cultivo. Te´oricamente, a partir de un solo v´ astago pueden obtenerse varios millones de v´astagos con s´olo 5 a 6 cultivos repetitivos, dado que la velocidad de multiplicaci´on es de aproximadamente 15 veces al mes. Aun cuando los subcultivos se repitieron continuamente durante m´as de dos a˜ nos, los v´ astagos nunca se regeneraron ni se hicieron anormales. on de 4000Los cultivos se desarrollaron en las siguientes condiciones: 25◦ C de temperatura, iluminaci´ 6000 lux y 16 horas de iluminaci´on/8 horas de oscuridad de fotoper´ıodo. Ejemplo IV astagos Formaci´ on in vitro de microbulbos a partir de multiv´

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Una decimoquinta parte de los multiv´ astagos que proliferaron en el medio de multiplicaci´ on se transfirieron a otro medio fresco de multiplicaci´on y se cultiv´o para conseguir la re-proliferaci´on de v´ astagos. El resto, es decir, catorce decimoquintas partes de los multiv´astagos fueron trasladados a un medio para formar microbulbos de ajo. Un medio para la formaci´ on de microbulbos a partir de los v´ astagos consisti´o en medio b´ asico MS conteniendo un 9 % de sacarosa, 0,5 mg/L de a´cido α-naftalenac´etico (NAA) y 0,7 % de agar.

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8

ES 2 109 886 A1 TABLA 1 Medio para la proliferaci´ on de multiv´ astagos Ingredientes

5

Concentraci´on

Macronutrientes Nitrato pot´ asico (KNO3 ) Nitrato am´ onico (NH4 NO3 ) Cloruro pot´ asico (CaCl2 . 2H2 O) Sulfato magn´esico (MgSO4 . 7H2 O) Fosfato pot´ asico (KH2 PO4 ) Sulfato de hierro (FeSO4 . 7H2 O) [Na2 EDTA; 0,1 mM]

10

15

18,8 mM 10,3 mM 3,0 mM 1,5 mM 1,3 mM 1,3 mM

Micronutrientes Sulfato de manganeso (MnSO4 . H2 O) Acido b´ orico (H3 BO3 ) Sulfato de zinc (ZnSO4 . H2 O) Yoduro pot´ asico (KI) Molibdato s´ odico (Na2 MoO4 . 2H2 O) Sulfato c´ uprico (CuSO4 . 5H2 O) Cloruro de cobalto (CoCl2 . 6H2 O)

20

25

0,1 mM 0,1 mM 30,0 µM 5,0 µM 1,0 µM 0,1 µM 0,1 µM

Materiales org´anicos y vitaminas Mio-inositol Glicina Acido nicot´ınico Clorhidrato de piridoxina Clorhidrato de tiamina

30

0,56 mM 26,64 µM 4,06 µM 2,43 µM 0,30 µM

Regulador del crecimiento

35

BA (Bencilaminopurina) NAA (´ acido α-naftalenac´etico) 40

45

1,0 ppm (mg/L) 0,1 ppm (mg/L)

Despu´es de almacenados a 4◦ C durante 2 meses, los multiv´astagos proliferados fueron transferidos al medio, cultivados y dispuestos en microbulbos. Cuando los microbulbos crecieron hasta 0,2 g, fueron secados durante unos 5 d´ıas. Los microbulbos secos fueron colocados en un recipiente cerrado para que no se marchitaran y a continuaci´ on se guardaron en un frigor´ıfico, manteni´endose la temperatura a 4-5◦C (Fig. 10.). on de 4000Los cultivos se realizaron en las siguientes condiciones: 25◦ C de temperatura, iluminaci´ 6000 lux y 16 horas de luz/8 horas de oscuridad de fotoper´ıodo.

50

Ejemplo V Formaci´ on de los minibulbos a partir de multiv´ astagos

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60

Un gran racimo de multiv´ astagos multiplicados, formado por 100 v´ astagos, se dividieron en peque˜ nos racimos, cada uno de ellos formado por unos 5 v´ astagos, que a continuaci´ on fueron sembrados en campo abierto en oto˜ no. En ese momento, dado que los v´ astagos que hab´ıan proliferado a trav´es del cultivo tisular eran d´ebiles, fueron plantados en campo abierto antes del per´ıodo habitual para la siembra del ajo (de finales de octubre hasta los primeros d´ıas de noviembre) a fin de conseguir tiempo suficiente para el desarrollo del sistema radicular. Los v´astagos que hab´ıan sido producidos despu´es de la implantaci´on en oto˜ no fueron almacenados a temperatura baja durante el invierno e implantados en primavera en campo abierto. Sin tratamiento fr´ıo, no se formaban minibulbos a partir de los v´ astagos que hab´ıan sido implantados en primavera.

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ES 2 109 886 A1 Ejemplo VI Almacenamiento a largo plazo de los multiv´astagos producidos en masa 5

10

Los multiv´astagos obtenidos en el Ejemplo IV fueron divididos en otros menores, que fueron subcultivados en discos de Petri que conten´ıan un medio fresco adecuado para la proliferaci´ on de multiv´ astagos durante 5 semanas. Como resultado, se formaron hasta 400 v´ astagos por disco de Petri. Estos discos de Petri pudieron almacenarse durante un m´ınimo de 5 meses sin nuevo tratamiento, en las siguientes condiciones: el tiempo de d´ıa de 16 horas con una intensidad de luz de 4.000 a 6.000 lux, manteni´endose astagos, se pudo suministrar de inmediato a 4-6◦ C. Gracias a este almacenamiento a largo plazo de los v´ una gran cantidad de los v´ astagos necesarios para la producci´on de minibulbos a trav´es de cultivo en campo abierto. Ejemplo VII

15

Ensayo de los virus Para el an´ alisis de los virus se utilizaron extractos de callos, multiv´astagos y microbulbos triturados. Se aplic´o el an´ alisis ELISA para examinar si hab´ıan o no virus presentes en las muestras. 20

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30

Para examinar el virus del mosaico del ajo, se emple´o un kit ELISA obtenido de Agdia Co. Ltd., EE.UU.. Este an´ alisis demostr´ o que los valores num´ericos de absorci´ on visualizados en el lector del ELISA, a una longitud de onda de 405 nm, fueron de 0 a 0,002 para los microbulbos producidos de acuerdo con la presente invenci´ on, cuando se puso a cero el control negativo que no conten´ıa ning´ un virus. Para comparaci´on, los valores de los ajos normales cultivados en campo abierto fue de 1,5, lo que indicaba una seria infectaci´on de virus. Como se ha descrito anteriormente, los v´astagos de ajos pueden hacerse proliferar en masa de forma semi-permanente de acuerdo con el proceso de la presente invenci´on. Adem´ as, se permite reducir el procedimiento de producci´ on y el per´ıodo en 2 etapas y 3 meses, respectivamente. Por consiguiente, se pueden producir en masa y a bajo coste microbulbos de ajo libres de virus. En la Tabla 2 se resumen las principales caracter´ısticas entre el presente proceso y los procesos convencionales.

35

TABLA 2

Homogeneidad Gen´etica

Intermedio para Prolif.

Velocidad de Multiplicaci´ on (veces/mes)

Limitaci´on de Subcultivos

N◦ . de Etapas

Per´ıodo de Cultivo (meses)1

Cultivo Apical

Heterogeneidad

Ninguno

-

-

3-4

8

Cultivo del Callo

Homogeneidad posible

Callo

4-5

Limitados (∼ 8 veces)

3-4

8

Sumitomo

Heterogeneidad

V´ astago

2-5

Limitados (∼ 4 veces)

3-4

12

Primordio del V´astago

Homogeneidad posible

Primordios del V´ astago

2-5

-

3-4

Presente Invenci´on

Homogeneidad

Multiv´ astagos

14-15

Semipermanente

2

40

Proceso

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55

3

60 1

tiempo que se tarda desde repetir la etapa inicial hasta la etapa final (excepto para el per´ıodo de tratamiento en fr´ıo). 10

ES 2 109 886 A1

5

Otras caracter´ısticas, ventajas y realizaciones de la presente invenci´on aqu´ı expuestas ser´ an f´ acilmente evidentes para los que tengan conocimientos ordinarios de esta t´ecnica despu´es de leer la memoria anterior. A este respecto, aunque se han descrito con detalle considerable realizaciones espec´ıficas de la invenci´on, podr´ an efectuarse variaciones y modificaciones de estas realizaciones sin apartarse por ello del esp´ıritu ni del a´mbito de la invenci´on, tal como ha sido descrita y se reivindica a continuaci´on.

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ES 2 109 886 A1 REIVINDICACIONES 1. Proceso para producir en masa microbulbos y minibulbos de ajo libres de virus, que comprende las etapas de: 5

derivar callos de los meristemas apicales de ajo; regenerar v´ astagos a partir de los callos;

10

derivar multiv´ astagos de los v´astagos regenerados; multiplicar los multiv´ astagos a trav´es de subcultivos repetitivos; y

15

formar microbulbos libres de virus a trav´es de cultivos de tejido vegetal y minibulbos a trav´es de cultivo en campo abierto. 2. Proceso seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque dichos multiv´ astagos se multiplican en masa a trav´es de subcultivos repetitivos en un medio de multiplicaci´on de v´ astagos.

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3. Proceso seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque la citada t´ecnica de cultivo tisular de plantas comprende dividir un gran racimo formado por unos 100 v´ astagos en peque˜ nos racimos que comprenden alrededor de 5 v´ astagos. Transferir cuatro peque˜ nos racimos conteniendo medios de multiplicaci´ on, cultivarlos en el mismo y multiplicar los v´astagos a trav´es de subcultivos semipermanentemente repetitivos. 4. Proceso seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de multiplicaci´on de v´ astagos es el mismo que el medio b´asico MS, excepto que la cantidad de nitr´ ogeno de amonio se reduce a la mitad del nivel del medio MS, y porque contiene tambi´en de un 2 a un 3 % de sacarosa, de 0,3 a 3,0 mg/L de bencilaminopurina (BA) y de 0,05 a 0,2 mg/L de a´cido α-naftilenac´etico. 5. Proceso seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque la formaci´ on de microbulbos se promueve tratando previamente los multiv´ astagos a 4◦ C bajo una intensidad luminosa de 500-1500 lux durante 2 meses. 6. Proceso seg´ un la reivindicaci´ on 5, caracterizado porque el medio para la formaci´ on de bulbos se basa en medio b´asico MS, y tambi´en porque contiene un 9 % de sacarosa y de 0,1-2,0 mg/L de a´cido α-naftilenac´etico. 7. Proceso seg´ un la reivindicaci´ on 1, que comprende adem´ as la etapa de almacenar los multiv´astagos durante mucho tiempo en recipientes de cultivo que contienen medios de formaci´ on de bulbos en las on de 500-1000 lux y 16 horas/8 horas de siguientes condiciones: 4-6◦C de temperatura, una iluminaci´ oscuridad de fotoper´ıodo, antes de la etapa de formaci´ on de los microbulbos.

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kES 2 109 886 kN. solicitud: 9502329 kFecha de presentaci´on de la solicitud: 27.11.95 kFecha de prioridad:

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DOCUMENTOS RELEVANTES Categor´ıa

Documentos citados

Reivindicaciones afectadas

E

BASE DE DATOS WPI en QUESTEL, semana 9704, Londres, Derwent Publications Ltd., AN 97-036785, Clase C06 D16 P13 & JP-8205703-A (TONG YANG MOOLSAN CO LTD) * Resumen *

1,2

A

RO-96914-A (INST. LEGUMICULT. FLORICULT.) 21.02.89 * Todo el documento *

1-7

A

PATENT ABSTRACTS OF JAPAN, CD-ROM PAJ A01, 1 & JP-3160935-A (AJINOMOTO) * Resumen *

1

A

PATENT ABSTRACTS OF JAPAN, CD-ROM PAJ A01, 1 & JP-2200131-A (OHASHI et al.) * Resumen *

1,2,5,7

A

PATENT ABSTRACTS OF JAPAN, CD-ROM PAJ C10-C14, 31 & JP-62289193-A (AJINOMOTO) * Resumen *

1-7

A

SHUTO, H. et al. In vitro propagation of plants from root apex-derived calli in Chinese chive (Allium tuberosum ROTTLER) and garlic (Allium sativum). JAPAN J. BREED. 1993. Vol. 43, p´aginas 249-354

4

Categor´ıa de los documentos citados X: de particular relevancia

on no escrita O: referido a divulgaci´

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la

on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´

misma categor´ıa A: refleja el estado de la t´ecnica

de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu´ de presentaci´ on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado × para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci´ on del informe 19.12.97

para las reivindicaciones n◦ : Examinador Fco. J. Haering P´erez

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A01H 4/00, C12N 5/04

DOCUMENTOS RELEVANTES Categor´ıa

A

Documentos citados

Reivindicaciones afectadas

NAGASAWA, A. & FINER, J. Development of morphogenic suspension cultures of garlic (Allium sativum L.) PLANT CELL. TISSUE AND ORGAN CULTURE. 1988. Vol. 15, p´aginas 183-187

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Categor´ıa de los documentos citados X: de particular relevancia

on no escrita O: referido a divulgaci´

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la

on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´

misma categor´ıa A: refleja el estado de la t´ecnica

de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu´ de presentaci´ on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado × para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci´ on del informe 19.12.97

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