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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 186 963 kInt. Cl. : A01N 63/00

11 N´ umero de publicaci´on: 7

51

˜ ESPANA

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C12N 1/20

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 98124694.5 kFecha de presentaci´on: 24.12.1998 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 1 021 954 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 26.07.2000

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Aislados de rizobacterias para su utilizaci´ on contra hongos del suelo fitopat´ ogenos y pro-

cedimiento para la utilizaci´ on de aislados de rizobacterias.

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73 Titular/es: Dr. Gabriele Berg

Thomas-Mann-Strasse 6 A 18055 Rostock, DE Robert Dahl

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45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.05.2003

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 186 963 T3

16.05.2003

Aviso:

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72 Inventor/es: Berg, Gabriele;

Dahl, Robert y Kurze, Stefan

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74 Agente: Zuazo Araluze, Alexander

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 186 963 T3 DESCRIPCION Aislados de rizobacterias para su utilizaci´on contra hongos del suelo fitopat´ ogenos y procedimiento para la utilizaci´on de aislados de rizobacterias. 5

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La invenci´on se refiere a tres aislados de rizobacterias especiales para su utilizaci´ on contra hongos del suelo fitopat´ ogenos y a un procedimiento para la utilizaci´ on de los aislados de rizobacterias, en particular para plantas de fresas. El cultivo de fresas ha logrado una gran importancia en todo el mundo. En 1995 se recolectaron en Alemania 68,800 t y en 1998 unas 78,800 t de frutos. Con 1,155,000 t, se obtuvo en 1997 en Europa un 43 % del rendimiento mundial. Entre los productores europeos importantes se encuentran Espa˜ na, Francia, B´elgica, Alemania, Inglaterra, Austria y Finlandia. En los u ´ ltimos a˜ nos se registr´ o en el mundo un crecimiento de la producci´on de fresas (1980: 1,795,000 t; 1997: 2,661,000 t; Food And Agriculture Organisation (FAO), 1998). La fresa (Fragaria x Magna Thuill.) es una planta perenne que se multiplica mediante estolones. En el cultivo comercial de fresas, se plantan las plantas j´ovenes (plantas verdes o frigoplantas) en las postrimer´ıas del verano o bien en primavera. Tras un lavado de las ra´ıces, tiene lugar un almacenamiento a una temperatura de - 2◦ C (frigoplantas) a lo largo de varios meses. Los hongos del suelo fitopat´ ogenos pueden causar elevadas p´erdidas de rendimiento en las fresas. Numerosas micosis atacan como par´asitos el sistema vascular de las ra´ıces e impiden el transporte de asimilados, minerales y agua. Como consecuencia, se secan los ´organos de la planta que se encuentran a flor de tierra, mientras las ra´ıces se atrofian e igualmente se extinguen. Ejemplos de traqueomicosis difundidas mundialmente son la Phytophthora fragariae y el Verticillium dahliae. Estos dan lugar a la podredumbre de las ra´ıces y a s´ıntomas de marchitamiento y dan lugar en plantaciones de fresas a p´erdidas de rendimiento de hasta el 80 % (Noticias de Dahl, Dathe, Seem¨ uller)

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Una posibilidad qu´ımica de combatir estas enfermedades, es insatisfactoria en la mayor´ıa de los casos; cara (Phytophthora fragariae) o imposible (Verticillium dahliae), ya que los causantes perduran, mediante la formaci´ on de o´rganos permanentes, muchos a˜ nos m´ as all´ a de la rotaci´ on de las cosechas. En una superficie u ´ til agr´ıcola contaminada con ´organos permanentes, debe contarse en todo momento con un ataque a las plantas alimenticias, debido a diversas modalidades de infecci´on (Agrios 1998). Los s´ıntomas en plantas enfermas debido a la Phytophthora fragariae (nombre del s´ıntoma: prodredumbre roja de las ra´ıces) son, adem´ as de una considerable p´erdida de turgencia de los o´rganos a flor de tierra, tallos y pulpas coloreados de rojo en la zona de transici´ on de la ra´ız al inicio del brote. El hongo pasa el invierno en el suelo con oosporas, clamidosporas o micelio en matrices org´anicas. En primavera, se liberan zoosporas y se difunden a trav´es de las aguas sub´ alveas. Es posible un control limitado en relaci´on con plantas resistente, suelos de secado r´ apido, rotaci´ on de las cosechas y fungicidas sist´emicos (Agrios, 1998 y Manual del medio naturista, 1998). Verticillium dahliae muestra los primeros s´ıntomas a menudo s´ olo durante la recolecci´on. Con las elevadas temperaturas veraniegas, se marchitan las plantas, mientras que con climas m´as fr´ıos y h´ umedos, se recuperan. Las hojas m´as viejas tienen en los bordes zonas marrones y secas, mientras las hojas m´as j´ ovenes permanecen compactas. En etapas avanzadas, se secan plantas completas, la mayor´ıa de las veces por nidos. Verticillium dahliae pasa el invierno en el suelo formando microesclerotias, micelios en residuos de las plantas o en rizosfera de hierbas silvestres que sirven como intermediarios. S´ olo hay posibilidades muy limitadas de combatirlos mediante tratamiento del suelo y tratamientos t´ermicos en climas calientes. La rotaci´on de las cosechas no es adecuada para combatirlos, ya que las micoesclerotias formadas perduran en el suelo durante 15 a˜ nos (Agrios 1198; Fravel, 1992; Manual del m´edico naturista, 1998). Un control sobre el cultivo de tipos tolerantes o resistentes es poco prometedor, ya que la resistencia frente al Verticillium probablemente se codifica en forma multigen y por lo tanto no es absoluta (Dathe, Noticias). Los progresos alcanzados hasta ahora en los m´etodos de cultivo aplicados convencionalmente (por ejemplo los tipos tango o senga), dieron lugar a un descenso de la calidad del fruto (Simpson, 1996). La rizosfera se caracteriza, al ser una capa del suelo pr´ oxima a las ra´ıces, por una elevada concentraci´on de materias nutritivas y por una elevada circulaci´ on de substancias. Como h´ abitat natural, la rizosfera de las fresas se caracteriza por una gran abundancia de organismos nocivos, neutrales y u ´ tiles (bacterias, hongos, etc.). Las rizobacterias u ´ tiles se definen seg´ un su funci´ on para la planta. Se diferencia entre funciones que estimulan el crecimiento de la planta y efectividad antagonista frente a fitopat´ ogenos 2

ES 2 186 963 T3 (Berg, 1996; Lynch 1990).

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En el momento del transplante, se ve perturbada esta comunidad microbiana en las ra´ıces limpiadas de la planta. Adem´as, al plantarla pueden resultar da˜ nadas las ra´ıces, con lo que los pat´ogenos pueden encontrar una ventaja competitiva y quedan abiertas posibles puertas a la infecci´ on. Mediante la aplicaci´ on protectiva de antagonistas bacterianos artificialmente inoculados, a los que pertenecen tambi´en las cepas bacterianas indicadas, se ofrece o posibilita por primera vez la lucha integrada en el proceso agr´ıcola de producci´ on y de bajo coste. Se reduce claramente el ataque a las plantas por parte de hongos malignos que se cr´ıan en el suelo, en particular Phytophthora fragariae y Verticillium dahliae, mientras se fomenta el crecimiento de las plantas y aumenta el rendimiento. Los hongos malignos se ven obstaculizados para infectar las ra´ıces debido a la abundancia, elevada artificialmente, de antagonistas, ya que ´estos forman una “capa protectora” alrededor de las ra´ıces (Weller 1998). Los antagonistas son efectivos mediante los mecanismos combinados competencia, antibiosis y lisis (Chet y otros, 1990). As´ı por ejemplo en la DE-OS 195 02 065 A1 se describe un aislado CON/M/91-08 de la clase de hongos Coniothyrium minitans para combatir los activadores de las enfermedades de las plantas que forma esclerotias. Se observ´ o que el aislado tiene una elevada actividad antagonista, sobre todo frente al activador de enfermedades S. sclerotiorum, que origina podredumbre en los m´ as diversos ´organos de plantas de cultivo, como girasoles, tomate, tabaco, lechuga y colza. En la WO 93/19602 A1, se describe un procedimiento para combatir enfermedades de plantas, en particular de Pseudocercosporella herpotrichoides, utilizando aislados a partir de la cepa bacteriana Pseudomonas fluorescens. La WO-A-97/32973 describe enzimas quitinol´ıticas a partir de, entre otros, Steptomyces albido flavus. Mediante su capacidad de atacar la pared de las c´elulas de los hongos, pueden utilizarse estas quitobiosidasas como fungicidas en el ataque de los hongos.

30

En la WO-A-93/185 135 se describe un aislado bacteriano (Streptomyces dicklowii) que tiene propiedades nematicidas y fungicidas.

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La US-A-5,597,565 describe nuevos aislados de bacterias conocidas con efectividad antihongos de por ejemplo Pseudomonas fluorescens y Serratia plymuthica. La acci´on de los aislados descritos se dirige contra hongos como Botrytis cineria y Alternaria brassicola. Estos hongos provocan podredumbre en el almacenamiento.

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La tarea de la invenci´on era indicar un aislado, un preparado y un procedimiento para combatir hongos pat´ ogenos para las plantas, en particular hongos del suelo fitopat´ ogenos.

45

La tarea se resolvi´ o mediante aislamiento de HRO-C48, HRO-E11 y HRO-11, a partir de las tres clases mundialmente difundidas Serratia, Pseudomonas y Streptomyces. A estas clases pertenecen rizobacterias que se generan en la naturaleza, que se asientan predominantemente en la rizosfera, rica en materias nutritivas, de las plantas de cultivo m´ as diversas.

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Se ha observado que estos aislados, as´ı como los de los mutantes que provienen de los aislados y son informaciones gen´eticas para combatir los hongos fitopat´ogenos, son especialmente adecuados para plantas de fresas. Bajo informaciones gen´eticas, se entienden a continuaci´on en particular genes, secuencias de genes o del genoma del aislado o de un mutante. Los aislados se archivaron bajo los siguientes datos de incorporaci´ on en la Colecci´on Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares = DSMZ (Braunschweig, Rep´ ublica Federal Alemana) y est´an accesibles para fines cient´ıficos:

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ES 2 186 963 T3

Aislado

Denominaci´on del DSMZ

Streptomyces albidoflavus HRO11

DSM 12500

Pseudomonas fluorescens HRO-E11

DSM 12501

Serratia plymuthica HRO-C48

DSM 12502

5

10

La protecci´on de las plantas o bien la lucha contra los hongos, se realiza con un preparado que contiene una cantidad efectiva como fungicida del aislado HRO-11, HRO-E11 y/o HRO-C48. 15

Ventajosamente, la cantidad efectiva como fungicida presenta una densidad de c´elulas de las cepas de a diluido con agua potable d´ebil y tiene ventajoaproximadamente 7,5E+0,9 cfu ml−1. El preparado est´ samente una densidad de c´elulas de aproximadamente 4E+0,9 cfu ml−1 de todas las cepas.

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Utilizando los aislados o bien los aislados combinados entre s´ı HRO-11, HRO-E11 y/o HRO-C48, el aislado o bien los aislados, deben contener c´elulas vivas, c´elulas muertas, esporas, pseudomicelios, fragmentos de psudomicelios y/o excedente de cultivo. Los pseudomicelios son blastosporas de hongos de brote con forma de cadena yuxtapuestos, similares a un micelio (Pschryrembel, “Vocabulario Cl´ınico”, 258. edici´ on, Walter de Gruyter, 1998).

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Para combatir hongos pat´ ogenos para las plantas, se propone un procedimiento en el que el preparado se aplica sobre los hongos a combatir, sobre los ´organos de los hongos, sobre las plantas o partes de plantas a proteger frente a un ataque de hongos, sobre los plantones y/o en o bien sobre el suelo.

30

El procedimiento puede utilizarse en particular para combatir traqueomicosis pat´ ogenas para las ra´ıces. Se ha acreditado como especialmente adecuado para su utilizaci´on frente a las clases de hongos Verticillium dahliae y Phytophthora fragariae. Los aislados o bien mezclas de aislados deben estar formulados o bien ser utilizados como suspensi´on en el procedimiento de ba˜ no de inmersi´on.

35

Es ventajoso cuando se aplica una mezcla de aislados que presenta los aislados HRO-11, HRO-E11 y/o HRO-C48 en concentraciones distintas en cada caso. El aislado o bien mezcla de aislados puede tambi´en aplicarse sobre substancias nutritivas, substratos nutritivos o l´ıquidos nutritivos, as´ı como sobre una matriz natural o artificial.

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La invenci´on se describir´ a a continuaci´ on m´ as en detalle en base a los ejemplos y con los esquemas adjuntos. Se muestra en: 45

figura 1 Resultado de un ensayo de invernadero para la acci´ on antagonista de HRO-C48 y HRO-E11 contra Phytophthora fragariae. figura 2 Resultado de un ensayo de invernadero para la acci´ on antagonista de HRO-11 respecto a Phytophthora fragariae.

50

figura 3 Rendimiento total de las variantes en el a˜ no de la plantaci´on sobre una superficie experimental 1; figura 4 Rendimiento total de las variantes en el a˜ no de la plantaci´on sobre una superficie experimental 2.

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60

La efectividad antagonista de muchas rizobacterias aut´ octonas “Biological Control Agents (=BCA)” y “Plant Growth Promothing Rhizobacteria (PGPR)” ya ha sido descrita. Como antagonistas bacterianos sirvieron por ejemplo Agrobacterium radiobacter “K84” contra Agrobacterium tumefaciens o el preparado “Quantum 4000” basado en Bacillus subtilis, para luchar frente a enfermedades nacidas en el suelo en cereales y cacahuetes. El preparado micostop lleg´o al comercio mundialmente como primer preparado biol´ ogico de control. Se basa sobre Streptomyces grisieovirides “K61” y se emplea, entre otros, contra fusariosas pat´ ogenas para el suelo y Phytophthora ssp en plantas de adorno y hortalizas.

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El aislado grampositivo HRO-11, se seleccion´ o como antagonista respecto a Verticillium in vitro (cultura dual) y tiene un efecto antagonista especialmente alto frente a Phythophtora fragariae y Verticillium dahliae, as´ı como una buena capacidad para la formaci´ on de esporas. Crece en el medio nutritivo estreptomiceteno DSM 65 l´ıquido y s´ olido de la Colecci´on B´asica Alemana (DSMZ). Los aislados de bacterias gramnegativos HRO-E11 y HRO-C48, crecen en los suelos nutritivos usuales de agar o bien medios l´ıquidos y tienen un elevado potencial antagonista comparable al del aislado HRO-11 frente a Verticillium dahliae yPhythophtora fragariae. TABLA 1 Propiedades de cultivo de los aislados antagonistas

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Clase de bacterias

n◦ aislado

medio nutritivo

incubaci´ on [◦C]

duraci´ on [h]

otros

esporaci´ on: 5 d´ıas a 4 ◦ C ´o a 22 ◦ C

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Streptomyces albidoflavus

HRO-11

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30

35

40

45

50

l´ıquido (fermentaci´on en cultivo de batch)

s´olido

DSMZ65 sin aditivo de agar

DSMZ con aditivo de agar

30

48

Serratia plymuthica

HRO-C48

DSM1

NA 2

30

18-24

Pseudomonas fluorescens

HRO-E11

DSM1

NA 2

30

18-24

Los aislados de bacterias a emplear en el marco de la invenci´on pueden ser cultivados con las correspondientes substancias nutritivas s´ olidas y l´ıquidas adecuadas (DSM 1 = substancia nutritiva del Cat´alogo de la Colecci´on B´asica Alemana para Microorganismos y Cultivos de C´elulas; NA2 = substrato nutritivo 2, (Sifin, D)). Las substancias correspondientes a la invenci´ on se aplican a plantas frigo o verdes de fresas. La aplicaci´on se realiz´ o mediante inmersi´on de 15 minutos de las ra´ıces en la suspensi´on de rizobacterias inmediatamente antes de la plantaci´on. De todas las cepas se aplicaron densidades de c´elulas de aproximadamente 4E+09 cfu ml−1 . Para ello, se diluye con agua potable d´ebil el concentrado usual en el comercio de aproximadamente 7,5E+09 cfu ml−1 . Pueden realizarse los siguientes tratamientos de protecci´ on de las plantas, sin que se haya detectado una influencia de los organismos biol´ ogicos de control empleados: fungicida: herbicidas: acaricida:

euparen contra botrhytis, sistan contra el mildiu venzar y betanal decis

Las luchas contra los herbicidas se llevaron a cabo varias veces al a˜ no. Las plantas se trataron dos veces al a˜ no con abonos completos. 55

La invenci´on se caracterizar´a a continuaci´ on m´ as en detalle en cuanto a algunas propiedades importantes, en base a ejemplos: Ejemplo 1

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Prueba in vitro de la actividad antihongo A partir de 6000 aislados de las rizosferas de fresas (Fragaria Magna Thuill.), colza (Brassica napus L.) y patatas (Solanum tuberosum L.) se seleccionaron estas cepas, que pose´ıan in vitro una fuerte 5

ES 2 186 963 T3

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actividad antihongo. Las cepas se identificaron, caracterizaron fisiol´ ogica y biol´ ogico-molecularmente y se sometieron a una protecci´on (screening) de invernadero. Con culturas duales y placas de agar, se realiz´ o la prueba de la actividad antihongo en los aislados HRO-11 (Streptomyces albidoflavus), HROC48 (Serratia plymuthica) y HRO-E11 (Pseudomonas fluorescens). Se comprobaron los mecanismos antihongos antibiosis, lisis, producci´on de sideroforas, as´ı como HCN (cianida) e IIA (´ acido ac´etico indol). Los resultados est´an listados en la tabla 2. TABLA 2

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on a la resistencia y acci´ on de fomento del Actividad antihongo frente a P. fragariae, inducci´ crecimiento de las rizobacterias a probar: actividad en prueba dual de cultivo contra V. dahliae; +++ > 10 mm zona de inhibici´ on; antibiosis: cromatograf´ıa de capa delgada (prueba de bioautografia seg´ un Berg 1996); lisis respecto a la actividad de quitinasa: test de placas (+ hidr´ olisis, - no hay hidr´ olisis) y/o actividad β - 1,3 de glucanasa; seg´ un Daugrois y otros, 1990; sideroforas seg´ un Schwyn & Neilands, 1987 (+5 - 3 mm zona naranja); HCN = cianida con “Aquaquant 14417” Merck); a ´cido ac´etico indole IAA seg´ un Sawar & Kremer, 1995 Aislado

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Actividad en cultivo dual

Mecanismos antihongo

Antibiosis

Lisis

Siderofora

Inducci´on resistencia

Crecimiento

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Streptomyces albidoflavus HRO-11

+++

+

-

+

+

+

30

Serratia plymuthica HRO-C48

+++

-

+

-

-

+

Pseudomonas fluorescens HRO-E11

+++

+

-

+

+

+

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La actividad contra Verticillium dahliae se midi´o en prueba de cultivo dual en toda la dimensi´ on de la zona de inhibici´ on. Todos los aislados empleados en el marco de la invenci´on forman zonas de inhibici´ on superiores a 10 mm (+++). Mediante cromatograf´ıa de capa delgada (prueba de bioautografia) se investig´ o una posible producci´on de antibi´ oticos de los distintos aislados. Los aislados HRO-11 y HRO-E11 formaron antibi´ oticos (+) mientras que en el aislado HRO-C48 (-) no pudo comprobarse mediante este procedimiento formaci´ on alguna de antibi´ oticos. En los aislados HRO-11 y HRO-E11 se observ´ o igualmente una posible producci´ on de sideroforas. Los halos de inhibici´ on se forman como zonas de 3-5 mm de tama˜ no coloreadas de naranja (+). Lisis se comprob´ o en el aislado HRO-C48. Para el an´ alisis de la actividad l´ıtica, se investig´ o la actividad de quitinasa o una actividad de glucanasa β - 1,3. Los aislados HRO-11 y HRO-E11 no eran activos l´ıticamente (-): La formaci´on de cianida (HCN) como producto de cambio de sustancia que induce resistencia para la planta, se detect´o con aquaquant 14417 de la firma Merck en los aislados HRO-11 y HRO-E11. Investigaciones respecto a la producci´on (IAA) de a´cido ac´etico indole, se realizaron seg´ un Sawar & Kremer 1995. Cada uno de los tres aislados de rizobacterias forman esta hormona de crecimiento de las plantas. Los aislados de bacterias se eligieron, ya que presentaban una elevada actividad in vitro. Adem´as, todos tienen en com´ un la diversidad de sus mecanismos de actuaci´on. Las bacterias Streptomyces albidoflavus y Pseudomonas fluorescens se aislaron a partir de la rizosfera de las fresas de cultivo. Serratia plymuthica HRO-C48 es un aislado de la rizosfera de la colza. El origen de los aislados se ha listado en la tabla 3.

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6

ES 2 186 963 T3 TABLA 3 Origen de los aislados 5

Aislado N◦

Lugar

Habitat de aislamiento

Fecha del aislamiento

HRO-11

R¨ overshagen

Fragaria x magna (fresa de cultivo)

16.10.1995

HRO-C48

Rostock

Brassica napus. (colza)

19.07.1994

HRO-E11

R¨ overshagen

Fragaria x magna (fresa de cultivo)

16.10.1995

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Ejemplo 2 20

Identificaci´ on de las rizobacterias aisladas

25

Los aislados gramnegativos HRO-C48 y HRO-E11, se identificaron mediante ambos sistemas de prueba estandarizados BIOLOG (Haywards, U.S.A) y seg´ un particularidades taxon´ omicas (API) de bioM´erieux (Marcy-l’Etoile, F) (ver tabla 4). La identificaci´on de Streptoymes albidoflavus HRO-11, la realiz´ o la Prof. Elisabeth Wellington (U.K.) TABLA 4 Elecci´ on de resultados de identificaci´ on respecto a las cepas aisladas

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BIOLOG

35

aislado n◦

%id.

HRO-C48

86,6

API (bioM´erieux) resultado

%id.

Color

superficie olor

1-0-0-6-3-2-3 57,5

claro, beige

clara, lisa, brillante

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HRO-E11

1-1-5-7-4-5-5 89,8

45

HRO-11

50

55

—

Propiedades sensoriales

—

98,0

no

otros

Aprovechamiento Crecimiento del substrato Aprovechamiento 8,5 % NaCl de fuentes C ∗7 % NaCl D-Arabitol

claro, aspera, ´ s´ı fluorescencia glucosa, bronceado que resalta UV, sobre arabinosa, King B Agar mannosa, manitol blanco

que resalta, aspera, ´ miceliar

s´ı

xilosa, mannitol

no

no

∗s´ı

Serratia plymuthica,Pseudomonas fluorescens y Streptomyces albidoflavus, est´an asignados al grupo de riesgo 1 (sin riesgo para la salud humana). Por lo tanto, cumplen con las premisas para una posible aplicaci´on al aire libre (Anonymus, 1990). Ejemplo 3

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Experimentos de invernadero para el control biol´ogico de Phytophthora fragariae en fresas con los aislados HRO-C48, HRO-E11 y HRO-11 La actividad antihongo comprobada in vitro, pudo confirmarse en ensayos de invernadero cuyos resultados se representan en las figuras 1 y 2. Seg´ un Br¨ unner Keinath % Seem¨ uller (1193) se incluy´ o para 7

ES 2 186 963 T3 ello Phytophthora fragariae en un substrato y se mezcl´o en proporciones de un 3 % vol. bajo la tierra de las plantas de todas las variantes. Para cada variante se aplicaron tres repeticiones con 10 plantas. La evaluaci´on final de los ensayos se realiz´o 12 semanas tras la plantaci´on e inoculaci´ on sobre el rendimiento de la cosecha y toda la producci´ on de biomasa. 5

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Se representa en la figura 1 el aumento procentual de las variantes tratadas con las rizobacterias respecto al control de Phytophthora fragariae (control P.fragariae). En las barras se representan las desviaciones est´andar de la totalidad b´ asica completa de una variante. El rendimiento de la cosecha de fresas [g] de la variante Serratia Plymuthica HRO-C48 se situaba con 167 g 224 % por encima de la variante de control (+116 g) y 54 g (+104 %) por encima de la variante con Pseudomonas fluorescens HRO-E11. El rendimiento con HRO-E11 con 113 g aproximadamente 120 % superior a con el control sin tratar. En la figura 1 se muestra el resultado de un ensayo de invernadero relativo a la acci´ on antagonista de HRO-C48 y HRO-E11 respecto a Phytophthora fragariae. Se representan las variantes HRO-C48 y HRO-E11 inoculadas con P.fragariae y aplicadas a las rizobacterias y un control (+P.fragariae) con sus rendimientos de cosecha [g]. Se compara la relaci´on del aumento de rendimiento originado por las rizobacterias respecto al control. En la figura 2 se muestra el resultado de un ensayo de invernadero respecto a la acci´on de Streptomyces albidoflavus HRO-11. Se representan los controles inoculados con P.fragaria, la variante aplicada a la cepa HRO-11 y un control sin P.fragariae en comparaci´on con una variante aplicada con la cepa HRO-11 sin P.fragariae con sus rendimientos de cosecha [g]. Se compara la relaci´on del aumento de rendimiento originado por las rizobacterias respecto al control. Ensayos de invernadero con la cepa HRO-11, pudieron confirmar los efectos para la estimulaci´ on del crecimiento y control de Phytophthora fragariae. El control +P se encuentra con 145 g como promedio en 8 % sobre el control +P.fragariae. El control sin inoculaci´ on alcanz´o un rendimiento de 190 g. Esto significa 43 % (56 g) m´ as que el control +P.fragariae. En la cepa HRO-11, se calcul´ o una acci´ on estimuladora del crecimiento con +39 g frente al control sin inoculaci´on. Las diferencias reconocibles mediante comparaci´on de los diagramas en las figuras 1 y 2 en los rendimientos totales del control +P.fragariae, han de atribuirse a oscilaciones de temperatura condicionadas por la estaci´on del a˜ no en los invernaderos no climatizados. Ejemplo 4

35

Experimentos al aire libre para el control biol´ogico del marchitamiento de Verticillium dahliae en fresas con las rizobacterias HRO-C48 y HRO-E11

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En los a˜ nos 1997 y 1998 se realizaron sendos ensayos al aire libre sobre distintas superficies experimentales. Entonces pudo confirmarse con los aislados descritos el efecto antagonista y estimulador del crecimiento respecto a traqueomicosis pat´ogenas del suelo. Las superficies experimentales se investigaron en cuanto a su potencial fitopat´ ogeno. Los experimentos propios seg´ un una disposici´ on internacional correspondiente a Termorshuizen (1997) y un laboratorio ajeno (Dresde, Dahl noticias) confirmaron la propagaci´ on de la infecci´on con Verticillium dahliae. Pruebas de calidad y las pruebas enviadas a la Oficina para la Protecci´ on de Plantas de Rostock, confirmaron la gran presi´ on de la infecci´on, observada en los experimentos de laboratorio de las m´as diversas traqueomicosis pat´ogenas del suelo sobre las superficies experimentales. Mediante la aplicaci´ on por una sola vez del ba˜ no de inmersi´on antes de la plantaci´ on, pudieron medirse en la cepa HRO-C48 tras m´as de 12 meses a´ un efectos antagonistas. El establecimiento de todas las cepas medidas pudo observarse igualmente a´ un despu´es de varios meses. En las cepas HRO-C48 y HRO-E11, se aislaron un mes tras la aplicaci´ on gran abundancia de 9,00 E+06 x cfu g−1 (HRO-E11). 3 meses tras la aplicaci´on, pudieron comprobarse las cepas HRO-C48 con 5,5 E+03 x cfu g−1 y HRO-E11 con 1,6 E+04 x cfu g−1 . Como superficie nuclear de los experimentos al aire libre, se investig´o aproximadamente 1 ha. Con las cepas HRO-C48 y HRO-E11, pudieron lograrse en el a˜ no de la plantaci´on (1997) en la superficie experimental n◦ 1 (localizaci´on Stuthof) claros incrementos de rendimiento respecto a los controles, tal como se representa en el diagrama en la figura 3. Como controles, se probaron un no tratado (control) y un control con el tratamiento del fungicida sist´emico Aliette (control +A), a un fungicida sist´emico. El control tratado con Aliette, pudo delimitarse claramente con un incremento del rendimiento del 43 % respecto al control no tratado. La cepa HRO-C48 logr´o un rendimiento m´ as elevado en un 193 % (control +A) o bien 136 % (control) y las plantas igualmente enfermas ligeramente de la variante HRO-E11 lograron un rendimiento adicional del 104 % (control +A) y 147 % (control). 8

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La figura 4 muestra el rendimiento total de las variantes en el a˜ no de plantaci´on sobre la superficie no 1998. Se muestran las variantes y sus renexperimental n◦ 2 en la localizaci´on de Goorstorf en el a˜ dimientos tras el total de 10 cosechas en el a˜ no de la plantaci´on. El experimento al aire libre realizado en 1998 sobre la segunda superficie experimental, confirm´o para el aislado HRO-C48 la acci´ on de refuerzo de las plantas medida el a˜ no anterior sobre la superficie experimental 1. El aislado grampositivo de Streptomyces albidoflavus HRO-11 pudo desarrollar una acci´ on m´as intensa. HRO-C48 alcanz´ o un rendimiento superior en un 2,1 % a la suma de los controles (base 100 % = 74 kg). El aislado HRO-11 se situ´ o con 105 % aproximadamente 3,5 % sobre el rendimiento del control sin tratar. Las peque˜ nas desviaciones respecto a 1997 (superficie experimental n◦ 1) han de atribuirse posiblemente a un ataque de hongos nocivos (en particular Verticillium dahliae) que nacen en el suelo en suma total hasta ahora poco asignado. Las ca´ıdas de rendimiento superiores en general observadas en el a˜ no 1997 sobre la superficie experimental n◦ 1, no se encontraron en 1998 sobre las superficies experimentales n◦ 1 y n◦ 2. Los datos atmosf´ericos (temperatura, cantidad de precipitaciones, etc) fueron durante los periodos de vegetaci´on 1997 y 1998 muy diferentes. Debido a las elevadas cantidades de precipitaci´ on y a las bajas tensiones por el calor, pudieron establecerse mejor las j´ ovenes frigoplantas en 1998. Por eso la importancia de una acci´on antagonista y de fomento del crecimiento de las variantes aplicadas contra hongos nocivos era posiblemente inferior a sobre la superficie experimental n◦ 1 (1997).

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ES 2 186 963 T3 REIVINDICACIONES 1. Aislado HRO-11 de la clase de bacterias Streptomyces albidoflavus, inclusive todos los mutantes que proceden de este aislado y sus informaciones gen´eticas. 5

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2. Aislado HRO-E11 de la clase de bacterias Psuedomonas fluorescens, inclusive todos los mutantes que proceden de este aislado y sus informaciones gen´eticas. 3. Aislado HRO-C48 de la clase de bacterias Serratia plymuthica, inclusive todos los mutantes que proceden de este aislado y sus informaciones gen´eticas. 4. Utilizaci´on de los aislados HRO-11, HRO-E11 y HRO-C48 seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el aislado est´a compuesto por esporas, pseudomicelios, c´elulas vivas, c´elulas muertas, fragmentos de pseudomicelios y/o excedente de cultivo.

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5. Utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 4, caracterizada porque la cantidad efectiva como fungicida presenta una densidad de c´elulas de una cepa o de las cepas en la gama de 7,5x109 cfu por ml. 6. Preparado con un aislado seg´ un una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una cantidad efectiva como fungicida del aislado HRO-11, HRO-E11 y/o HRO-C48 est´ a contenida all´ı. 7. Preparado seg´ un la reivindicaci´ on 6, caracterizado porque el preparado est´ a diluido y presenta una densidad de c´elulas en la gama de 4x109 cfu por ml de una cepa o de todas las cepas.

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8. Preparado seg´ un la reivindicaci´ on 7, caracterizado porque el preparado est´ a diluido con agua potable d´ebil. 9. Procedimiento para combatir hongos pat´ogenos para las plantas, caracterizado porque un preparado seg´ un las reivindicaciones 4, 5 y 6 se aplica sobre los hongos a combatir, sobre los ´organos de los hongos, sobre las plantas o partes de plantas a proteger frente a un ataque de hongos, sobre los plantones y/o en o bien sobre el suelo. 10. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 9, caracterizado porque se combaten traqueomicosis pat´ ogenas para las ra´ıces.

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11. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado porque se combaten las clases de hongos Verticillium dahliae y Phytophthora fragaria. 12. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque los aislados HRO11, HRO-E11 y/o HRO-C48 se utilizan como suspensi´on en el procedimiento de ba˜ no de inmersi´on. 13. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque los aislados HRO11, HRO-E11 y HRO-C48 se utilizan individualmente.

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14. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque los aislados HRO11, HRO-E11 y HRO-C48 se utilizan combinados. 15. Procedimiento seg´ un una la reivindicaci´ on 14, caracterizado porque los aislados HRO-11, HROE11 y/o HRO-C48 se aplican en concentraciones diferentes en cada caso.

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16. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizado porque los aislados HRO-11, HRO-E11 y/o HRO-C48 se aplican sobre materias nutritivas o substratos nutri-

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ES 2 186 963 T3 tivos o l´ıquidos nutritivos. 17. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 10, caracterizado porque los aislados HRO-11, HRO-E11 y/o HRO-C48 se aplican sobre una matriz natural o artificial. 5

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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