k

19

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

k ES 2 061 387 kN´umero de solicitud: 9202641 kInt. Cl. : G01N 21/64

11 N.◦ de publicaci´ on: 21 51

˜ ESPANA

5

C09K 11/64 C09K 11/60 C09K 11/08 A61B 5/00

k

12

SOLICITUD DE PATENTE

k

22 Fecha de presentaci´ on: 30.12.92

k

43 Fecha de publicaci´ on de la solicitud: 01.12.94

k

43 Fecha de publicaci´ on del folleto de la solicitud:

01.12.94

k

A1

71 Solicitante/es: Universidad de Oviedo, y en

su representaci´ on D. Lorenzo Pueyo Casaus, Vicerrector de Investigaci´ on. San Francisco, 3 33003 Oviedo, ES 72 Inventor/es: Sanz Medel, Alfredo; Pereiro Garc´ıa, M. Del Rosario; D´ıaz Garc´ıa, Marta Elena y Liu, Yi-Ming

k k

74 Agente: No consta

k kResumen:

54 T´ıtulo: Sensor ´ optico de ox´ıgeno basado en complejos fosforescentes metal-ferr´ on. 57

Sensor o´ptico de ox´ıgeno basado en complejos fosforescentes metal-ferr´on que pueden ser inmovilizados sobre la superficie s´olida de las part´ıculas de una resina intercambiadora ani´ onica. Los complejos contienen un grupo SO3 que hace posible la inmovilizaci´ on y consistencia en al menos un ion aluminio complejado con una mol´ecula de ferr´ on. La fase sensora emite fosforescencia con un m´aximo de unos 600 nm cuando es excitada utilizando una longitud de onda de aproximadamente 390 nM, logrando un tiempo de vida de la emisi´on fosforescente muy largo. La emisi´on fosforescente es altamente sensible a la desactivaci´on por ox´ıgeno. Los complejos son inmovilizados sobre un soporte s´ olido por un proceso de cambio i´ onico. El indicador inmovilizado no se lixivia en presencia de agua o disolventes org´anicos comunes. Se proporciona un sistema FIA adecuado para la construcci´on de biosensores en que el ox´ıgeno forma parte de la reacci´on de reconocimiento.

Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

1

ES 2 061 387 A1

DESCRIPCION Sensor o´ptico de ox´ıgeno basado en complejos fosforescentes metal - ferr´ on. La presente invenci´on se refiere a un sensor para la determinaci´ on sensible de ox´ıgeno en mezclas de gases y en muestras l´ıquidas, as´ı como a un sistema de an´ alisis por inyecci´on en flujo, con un solo canal, que hace uso de este transductor de ox´ıgeno en reacciones biosensoras mediatizadas por ox´ıgeno. Estos complejos, cuando se hallan protegidos por “medios organizados” (p.e. micelas, ves´ıculas) en una disoluci´ on o retenidos sobre una superficie s´ olida consistente en una resina intercambiadora, exhiben una fuerte fosforescencia a temperatura ambiente (RTP) que es desactivada de modo sensible en presencia de ox´ıgeno. En otro aspecto, la invenci´on consiste en la inmovilizaci´on sencilla y efectiva sobre superficies s´ olidas, por un proceso de intercambio i´onico, de un indicador sensible al ox´ıgeno. En un tercer aspecto, en esta invenci´ on se detalla un m´etodo anal´ıtico de calibraci´on basado en medidas de tiempos de vida de RTP las cuales, dado el largo tiempo de vida de la emisi´ on fosforescente, pueden ser realizadas utilizando instrumentaci´ on relativamente simple. En esta invenci´on se da cuenta de la utilizaci´on de complejos fosforescentes metal-ferr´ on, desactivables por el ox´ıgeno, para la construcci´ on de un sensor de ox´ıgeno, del procedimiento de inmovilizaci´on del indicador sensible al ox´ıgeno -v´ıa proceso de intercambio i´onico, sobre una superficie s´olida para la fabricaci´ on del sensor- y el principio de an´ alisis con sensores basado en medidas de tiempo de vida de la fosforescencia a temperatura ambiente. Antecedentes La medida de la concentraci´ on de ox´ıgeno en mezclas gaseosas, muestras acuosas y fluidos biol´ ogicos es una pr´ actica esencial y muy frecuente en laboratorios anal´ıticos, plantas de procesos y hospitales. Actualmente, el m´etodo m´as ampliamente utilizado para controlar de modo continuo y determinar la concentraci´ on de ox´ıgeno, es un sensor electroqu´ımico basado en el electrodo de Clark. Sin embargo, los sensores electroqu´ımicos presentan ciertos problemas, como por ejemplo: deriva con el tiempo (p.e. debido a contaminaci´on del electrodo), falta de reproducibilidad, supone introducir una conexi´ on el´ectrica a los pacientes, la superficie del sensor necesita de un aporte continuo y constante de ox´ıgeno, etc. Por ello, se dedica hoy un gran esfuerzo investigador hacia la b´ usqueda de posibles t´ecnicas alternativas, como son los sensores qu´ımicos de naturaleza ´optica. Entre las ventajas de los sensores ´opticos, particularmente de aquellos basados en fibras ´opticas, se encuentra la posibilidad de miniaturizaci´on, el empleo de material inerte en su construcci´on, y su alta flexibilidad caracter´ısticas todas ellas altamente deseables para aplicaciones “in vivo”. Casi todos los sensores ´opticos descritos hasta la fecha para el an´ alisis de ox´ıgeno est´ an basados en la medida de la disminuci´ on de la intensidad de fluorescencia de un indicador adecuado que es desactivado por ox´ıgeno molecular (el cual 2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2

es un triplete en su estado fundamental). En los u ´ ltimos a˜ nos se han descrito diferentes indicadores fluorescentes para su uso en la construcci´on de sensores de ox´ıgeno. Entre ellos, los hidrocarburos arom´ aticos polic´ıclicos y sus derivados son los m´as com´ unmente utilizados por dos razones: a) son desactivados por el ox´ıgeno de modo eficiente, y b) son bastante solubles en silicona, la cual es por otro lado, altamente permeable al ox´ıgeno. Las principales desventajas de estos sensores de ox´ıgeno basados en la desactivaci´on de la fluorescencia son su falta de sensibilidad en ciertas situaciones importantes, lo cual conduce a bajas precisiones, y las altas se˜ nales de fondo, que hacen empeorar a´ un m´ as los l´ımites de detecci´on. De hecho, la se˜ nal anal´ıtica detectada cuando se utilizan sensores fluorescentes de ox´ıgeno est´ a constituida, en gran medida, por el ruido de fondo que se a˜ nade a la se˜ nal debida a la desactivaci´ on de la fluorescencia por el ox´ıgeno. Este ruido de fondo procede de las reflexiones de la luz incidente y del ensanchamiento de la banda luminiscente generada por otros componentes del sistema como la fibra o´ptica y/o la matriz polim´erica usada en la construcci´ on de la membrana del sensor. Los sensores de ox´ıgeno basados en fosforescencia son normalmente m´as sensibles y tienen mucho menor ruido de fondo que los fluorescentes. Los indicadores fosforescentes desactivables por el ox´ıgeno ofrecen emisiones con tiempos de vida m´ as largo, y por tanto, permiten medir la fosforescencia a mayor tiempo de retardo, cuando la energ´ıa de la fuente de excitaci´ on y el posible fondo hayan desaparecido. Ello da lugar a la obtenci´ on de se˜ nales con muy poco ruido y bajo fondo. De lo anterior se deduce que el uso de sensores fosforescentes conlleva una mejora importante en la sensibilidad y precisi´on. La solicitud de patente de USA N◦ 904963 por Hauenstein y col. describe un sensor de ox´ıgeno basado en la desactivaci´on de la fosforescencia de ciertos complejos tipo lant´ anico -base de Schiff (o B-dicteona), dispuestos sobre matrices polim´ericas. Un prop´ osito general de la presente invenci´on es proporcionar materiales fosforescentes desactivables de modo altamente sensible por el ox´ıgeno, la construcci´on de sensores ´opticos que exhiban caracter´ısticas qu´ımicas, fisicoqu´ımicas y espectrosc´opicas favorables para la construcci´ on de la fase sensora, p.e. estabilidad fotoqu´ımica, longitudes de onda de excitaci´on y de emisi´on (400 y 600 nm. respectivamente) adecuadas, compatibles con la tecnolog´ıa de fibra o´ptica disponible en la actualidad, amplios desplazamientos de Stokes (p.e. 200 nm) y largos tiempos de vida del estado excitado (aprox. 0,3 ms) y que permitan, por tanto, realizar las medidas utilizando instrumentaci´on simple y de bajo precio. Adem´ as, los materiales sensores aqu´ı propuestos son baratos y muy f´ aciles de preparar. Otra aportaci´ on de esta invenci´on consiste en proporcionar materiales fosforescentes con grupos adecuados que permitan la inmovilizaci´on f´ acil y efectiva del indicador sobre soportes s´olidos. Una contribuci´ on adicional de esta invenci´ on es caracterizar fases sensoras fosforescentes para la medida de ox´ıgeno que puedan ser dispues-

3

ES 2 061 387 A1

tas tanto en matrices polim´ericas como en disoluci´on. Esto ofrece la posibilidad de llevar a cabo el an´ alisis de ox´ıgeno con diferentes prop´ ositos, incluyendo la determinaci´ on de ox´ıgeno en mezclas de gases, en disoluciones acuosas y en disolventes org´ anicos. Otra finalidad de esta invenci´ on es proporcionar un m´etodo para el an´ alisis de ox´ıgeno con sensores, bas´andose en las medidas de desactivaci´ on de tiempo de vida de la fosforescencia. Finalmente, otro aporte de esta invenci´on es suministrar un sistema de an´ alisis por inyecci´on en flujo (FIA) que hace uso del sensor de ox´ıgeno de esta invenci´on, como transductor de reacciones biosensoras con ox´ıgeno involucrado. Descripci´ on detallada de la invenci´ on La provisi´ on de complejos fosforescentes metal - ferr´ on, estabilizados por “medios organizados” en disoluciones l´ıquidas o inmovilizados sobre resinas de intercambio i´onico, es una caracter´ıstica importante de esta invenci´ on. Dichos complejos son suficientemente desactivables por el ox´ıgeno tanto en forma s´ olida como en disoluci´ on para su utilizaci´on en una fase sensora. En los complejos metal-ferr´ on de esta invenci´on el cati´on met´alico incluye AI(III), Ga(III), In(III), Nb(V) y Zr(IV). Se ha encontrado que los cationes anteriormente mencionados forman complejos estables con ferr´on, y que exhiben fuerte fosforescencia a temperatura ambiente en presencia de micelas o ves´ıculas o cuando son inmovilizados sobre resinas de intercambio i´onico. Adem´ as, la emisi´on de RTP observada es muy sensible a la presencia de ox´ıgeno. Se ha encontrado, asimismo, que entre los varios tipos de “medios organizados” solo en aquellos cargados positivamente (p.e. micelas formadas por bromuro de dodecildimetilamonio) se intensifica la emisi´on de RTP del complejo Alferr´ on se halla en disoluciones de “medios organizados” es extremadamente sensible a la presencia de ox´ıgeno. Tambi´en se ha encontrado que para obtener emisi´on de RTP es esencial la presencia de al menos un grupo libre -SO3- en el complejo formado Al-ferr´ on. Se cree que las fuertes interacciones entre los grupos -SO3- y el potencial superficial positivo de superficies r´ıgidas (p.e. superficies de part´ıculas de resinas de intercambio ani´ onico) o superficies pseudor´ıgidas (p.e. micelas y ves´ıculas cargas positivamente) permite a los complejos (o triplete) residir en un microambiente m´as r´ıgido, lo que reduce la probabilidad de p´erdida de energ´ıa por colisiones no radiacionales o la desactivaci´on del estado triplete. Adem´ as la presencia en estos complejos de grupos funcionales -SO3- hace muy f´ acil llevar a cabo la construcci´on de la fase sensora a trav´es de la inmovilizaci´on de dichos complejos fosforescentes sobre soportes s´olidos v´ıa proceso de intercambio i´ onico. Los soportes s´olidos pueden ser part´ıculas de resina de intercambio ani´ onico o membranas, m´ as espec´ıficamente de tipo fuertemente b´ asico. La Figura 1 muestra el sistema FIA usado para la inmovilizaci´on de los complejos fosforescentes sobre las part´ıculas de intercambiador

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

4

ani´ onico. Las soluciones son bombeadas por una bomba perist´ altica comercial (Gilson Minipuls 2) a trav´es de una minicolumna empaquetada con alrededor 0,25 ml de las part´ıculas de resina h´ umeda. La preparaci´ on detallada de la minicolumna se autodescribe en la Figura 2. Pueden ser utilizados tubos de tefl´ on o polietileno para conectar la minicolumna y el contenedor de la disoluci´on (Figura 1). El ejemplo siguiente indica un modo espec´ıfico de llevar a cabo el proceso de preparaci´on de la fase sensora de ox´ıgeno seleccionada. Ejemplo 1 Preparaci´ on del material sensor elegido: complejo Al - ferr´ on enlazado a part´ıculas de resina. En un matriz de 100 ml. a˜ nadir 0,3 ml. de disoluci´ on de A1(III) (1g ml-1) 35 ml de disoluci´on de ferr´ on (Fluka AG, Suiza) 3x10-3 M y 10 ml. de disoluci´on reguladora de pH 5.5 ´acido ac´etico/acetato s´odico. Mezclar y enrasar con agua. Utilizar el sistema FIA descrito en la Figura 1, con la minicolumna empaquetada con aproximadamente 0,25 ml de la resina intercambiadora fuertemente b´ asica, Dowex 1x2-400 (SIGMA). Limpiar el sistema de flujo primero con una disoluci´ on de HCI 6M y despu´es con HCI 2 M hasta que no se observe por Absorci´on At´ omica con llama se˜ nal de hierro en el elu´ıdo. Limpiar el sistema con agua hasta obtener pH neutro en el elu´ıdo. Bombear la disoluci´ on del complejo Alferr´ on preparado anteriormente a trav´es de la columna empaquetada con la resina a una velocidad de flujo t´ıpica de 1 ml/min. Lavar la resina con una disoluci´ on de NaCl 1 M y despu´es con agua destilada. Retirar las part´ıculas de resina as´ı tratadas (indicador de ox´ıgeno) y mantenerlas en agua destilada hasta su uso. Los complejos RTP as´ı inmovilizados sobre la resina de intercambio ani´ onico no se lixivian ni con agua ni con disolvente org´ anicos comunes como etanol, acetona, etc. Adem´as, la emisi´on fosforescente del indicador resultante es muy sensible a la presencia de ox´ıgeno. Para llevar a cabo la determinaci´ on de ox´ıgeno las part´ıculas de resina con el complejo absorbido (fase sensora) pueden ser utilizadas directamente en disoluciones l´ıquidas o bien pueden disponerse en membranas s´olidas polim´ericas. La fase sensora responde al ox´ıgeno con diferente sensibilidad cuando se exponen a disoluciones acuosas directamente o cuando se dispersa en matrices s´olidas hidrof´ obicas. La sensibilidad de un sensor luminiscente de ox´ıgeno puede ser evaluada midiendo la relaci´ on entre la liminiscencia emitida por el sensor en muestras saturadas de nitr´ ogeno y en muestras saturadas de aire. Las part´ıculas seleccionadas de resina activada en contacto con agua exhiben una sensibilidad hacia ox´ıgeno extremadamente elevada (la relaci´on de intensidades es superior a 1000) lo cual las hace muy adecuadas para detectar ox´ıgeno a muy bajos niveles, o alternativamente, para detectar muy peque˜ nas variaciones en el contenido de ox´ıgeno (como as´ı ocurre en las aplicaciones de reacciones biosensoras mediatizadas por ox´ıgeno). Cuando se dispersan estas part´ıculas de resina en una matriz polim´erica hidrof´ obica la relaci´on de luminiscencia decrece a valores en tomo a 10, 3

5

ES 2 061 387 A1

adecuados para muchas aplicaciones “in vivo” de tipo m´edico. Se ha encontrado que la sensibilidad hacia ox´ıgeno de un sensor basado en complejos metal-ferr´ on dispersos en una matriz s´ olida polim´erica depende de varios factores entre los que se encuentran: la naturaleza del complejo, la resina, la matriz polim´erica y la concentraci´on de material activo en la matriz s´olida. Esos factores pueden ser modificados para obtener una sensibilidad espec´ıfica de ox´ıgeno para una determinada aplicaci´on. Otra aportaci´ on de esta invenci´on consiste en un principio nuevo de an´ alisis con sensores basado en medidas de tiempo de vida de la fosforescencia. Con el objetivo de enfrentarse a problemas de deriva de la se˜ nal o´ptica, en qu´ımica anal´ıtica se han utilizado con frecuencia m´etodos como el de medida de referencia a dos longitudes de onda, en el cual las se˜ nales anal´ıticas son medidas y relacionadas entre s´ı. Sin embargo, la aplicaci´ on de tales m´etodos conlleva normalmente la utilizaci´on de instrumentaci´ on con sistemas ´opticos muy complicados. Un sensor ´optico basado en medidas de tiempo de vida de la liminiscencia ofrece un sistema de referencia interno, lo que se puede considerar como una ventaja decisiva del funcionamiento del sensor. As´ı por ejemplo, el tiempo de decaimiento de la liminiscencia es independiente de la concentraci´ on de lumin´ oforo, lo que hace que no exista deriva debida a lixiviaci´on o fotodescomposici´on del reactivo, en la se˜ nal. Adem´ as, los problemas de deriva debidos a fluctuaciones en la fuente de excitaci´on y sensibilidad del detector son tambi´en superados debido a que lo que se mide es intensidad absoluta de luminiscencia. El sensor aqu´ı inventado ofrece ventajas particulares cuando se compara a otros sistemas sensores de ox´ıgeno existentes basados en la medida del tiempo de vida de la fluorescencia. Debido al largo tiempo de vida (mayor de 0,2 ms) de la emisi´on de la fase sensora aqu´ı inventada, es posible llevar a cabo las medidas del tiempo de vida de la fosforescencia utilizando instrumentaci´on opto-electr´onica relativamente simple, lo cual es siempre deseable o esencial a la hora de construir sistemas sensores de fibra o´ptica compactos y baratos. La Figura 3 muestra la manera de construir el sistema optosensor en flujo para realizar medidas de ox´ıgeno disuelto en medios l´ıquidos, basado en el sensor de ox´ıgeno inventado. El sistema de flujo est´a constituido por una bomba perist´ altica y tubo de polietileno (di´ ametro interno de 1mm). Un espectrofluor´ımetro comercial (p.e. Perkin Elmer LS 5) puede ser usado para todas las medidas de intensidad de fosforescencia y de tiempo de vida. Se ha construido una c´elula de flujo de plexiglas dise˜ nada espec´ıficamente y que encaja en el compartimento de la muestra del espectrofluor´ımetro, como se describe en la Figura 4. Esta c´elula es adecuada tanto para las determinaciones de ox´ıgeno en muestras gaseosas como en disoluci´ on. La membrana sensora se adhiere directamente a la cara interna de la ventana de cuarzo de esta c´elula de flujo. La membrana sensora colocada en la c´elula de flujo anteriormente mencionada esta formada por el complejo Al-ferr´on enlazado a las part´ıculas de 4

5

10

15

20

25

30

35

6

resina Dower 1x2-400 en una membrana de silicona de aproximadamente 50 mm de grosor. En la preparaci´ on de tales membranas activas pueden ser usados m´etodos conocidos como por ejemplo aquellos descritos por M.E. Lippitsch et al. “Fibre optic oxygen sensor with the fluorescence decay tiem as the information carrier”, Analytica Chimica Acta, 1988, vol. 205, pp. 1-6. Los sistemas sensores elegidos para realizar las determinaciones de la concentraci´on de ox´ıgeno en mezclas de gases y en muestras acuosas o disoluciones acuo-org´ anicas, est´an formados una membrana sensora consistente en el complejo Al-ferr´on enlazado a la resina de intercambio ani´onico Dowex 1x2-400, la cual es dispersada en una matriz de goma de silicona. La emisi´on fosforescente producida en la c´elula de flujo se sigue a 600 nm, siendo la longitud de onda de excitaci´ on de 390 nm y utilizando un tiempo de retardo de 0,4 ms y un tiempo de apertura de 2 ms. Por “tiempo de retardo” se entiende el per´ıodo de tiempo en que el detector est´a recibiendo la radiaci´ on a ser integrada. En las Figuras 5 y 6 se muestran las respuestas t´ıpicas de estos sistemas sensores. En el caso de muestras de gases, el tiempo de respuesta para un cambio completo de la se˜ nal est´ a en tomo a los 20 segundos y para el caso de muestras l´ıquidas tal tiempo de respuesta es alrededor de 2.5 minutos. En ninguno de los casos se ha observado efectos de hist´eresis. Se ha usado la cl´ asica ecuaci´on de StemVolmer para determinar la presi´ on parcial de ox´ıgeno a partir de las intensidades de RTP o los tiempos de vida medidos. La relaci´on se define en las ecuaciones: Io /I = KSV [O2 ] o τo /τ = K’SV [O2 ]

40

45

50

55

60

65

donde Io y to son la intensidad de fosforescencia y el tiempo de vida cuando no hay ox´ıgeno presente, e I y T la intensidad y tiempo de vida en presencia de ox´ıgeno, respectivamente. KSV y K’SV son las constantes de Stem-Volner. O2 es la concentraci´on de ox´ıgeno en tanto por ciento. En la Figura 7 se muestran algunas de las gr´ aficas t´ıpicas obtenidas para la desactivaci´ on Stem-Volmer de la intensidad y del tiempo de vida. Con ambos modos de medida se ha obtenido buena linearidad. A partir de estos resultados se ha encontrado que el sistema sensor de ox´ıgeno elegido tiene una constante de Stern-Vomer KSV mayor de 0.2%−1 . Otra contribuci´ on de esta invenci´on es proporcionar un sistema FIA adecuado para llevar a cabo la construcci´on de biosensores que hagan uso del transductor de ox´ıgeno inventado para el seguimiento de reacciones biosensoras mediatizadas por ox´ıgeno. El sistema FIA contiene el sensor fosforescente de ox´ıgeno y dos minicolumnas, una de ellas que contiene una enzima oxidasa y otra minicolumna de “pretratamiento”. La minicolumna de pretratamiento se utiliza para eliminar en-l´ınea cualquier interferencia que forme parte de la muestra, tal como pueden ser cationes de metales pesados. La forma elegida del sistema FIA se muestra en la Figura 8. Como se observa en la Figura 9, la

7

ES 2 061 387 A1

fase sensora fosforescente de ox´ıgeno preferida en este sistema est´a preparada por empaquetamiento del complejo Al-ferr´ on enlazado a part´ıculas de resina Dowex 1x2-100 en una c´elula de flujo comercial. Igual que en el modo habitual, la columna con el enzima (construida por una malla de nil´ on sobre la que se ha imnovilizado la enzima glucosa oxidasa) se conecta a la entrada del sensor de ox´ıgeno. Para la inmovilizaci´ on de la enzima glucosa oxidasa sobre la red de nil´ on se puede utilizar m´etodos conocidos, como aquellos descritos por G.D. Moody et al., en “Amperinetruc enzyme electrode for the flow injection analysis of glucosa”, Analyst (Londres)., 1986, Vol. 111, pp. 605-609. La minicolumna de pretratamiento contiene la resina Chelex 100 (SIGMA) previamente acondicionada, pero podr´ıa utilizarse cualquier otro relleno en funci´ on de la interferencia que se pretendiese eliminar. Para introducir la muestra se utiliza una v´ alvula giratoria y un bucle de 100 ml. Una caracter´ıstica muy importante de este sistema FIA de bioan´alisis es que el sensor de ox´ıgeno puede ser renovado f´ acilmente. Para ello simplemente es necesario desconectar las 2 minicolumnas, introducir a trav´es de la v´alvula de inyecci´on 2 ml de la disoluci´ on Al-ferr´ on preparada como se ha descrito anteriormente, y bombear la disoluci´on portadora a trav´es del sensor continuamente durante unos 10 minutos; de este modo un nuevo optosensor de ox´ıgeno est´ a preparado para su uso. La Figura 10 muestra la respuesta de este sistema sensor a glucosa para diferentes niveles de concentraci´on en muestras acuosas. Si bien se ha descrito anteriormente en este

5

10

15

20

25

30

35

8

documento la forma elegida de llevar a la pr´ actica la invenci´on, ser´ a obvio para todos los expertos en la tem´ atica que dentro del alcance de la invenci´on entra la posibilidad de realizar variaciones tal y como se define en las reivindicaciones adjuntas. Breve descripci´ on de los dibujos La Figura 1 es una ilustraci´ on esquem´atica del sistema FIA utilizado en la preparaci´on del material sensor elegido en esta invenci´on. La Figura 2 es una diagrama de la minicolumna. La Figura 3 es una ilustraci´ on esquem´atica del sistema en flujo del optosensor que contiene el sensor de ox´ıgeno de esta invenci´on. La Figura 4 es un diagrama de la c´elula de flujo. La Figura 5 es una ilustraci´ on gr´ afica de la respuesta del sensor hacia ox´ıgeno gaseoso a diferentes niveles de concentraci´on. La Figura 6 es una ilustraci´on gr´ afica de las curvas respuesta-tiempo del sensor por muestras gaseosas y acuosas. La Figura 7 es una ilustraci´on gr´ afica de las curvas de calibraci´ on basadas en intensidad de RTP (∗) y tiempo de vida ( ). La Figura 8 es una ilustraci´ on esquem´atica del sistema FIA utilizado en reacciones biosensoras mediatizadas por ox´ıgeno, que emplea el sensor de esta invenci´on. La Figura 9 es una ilustraci´ on esquem´atica del sensor de ox´ıgeno en flujo utilizado para el an´ alisis con biosensores anteriormente mencionado. La Figura 10 es una ilustraci´ on gr´ afica de la respuesta a glucosa, a niveles de sub mM, en muestras acuosas.

40

45

50

55

60

65

5

9

ES 2 061 387 A1

REIVINDICACIONES 1. Un m´etodo para detectar la presencia o cuantificar la concentraci´ on de ox´ıgeno en una muestra que comprende: Exposici´on de un complejo fosforescente metal - ferr´ on a la citada muestra que contiene ox´ıgeno y a la radiaci´on luminosa, la cual produce fosforescencia en dicho complejo. Medida de los cambios en intensidad y/o tiempo de vida de la fosforescencia emitida por dicho complejo metal-ferr´ on, resultante de la citada exposici´ on a dicho ox´ıgeno. 2. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual dicho complejo metal - ferr´ on se encuentra en una disoluci´ on micelar. 3. El m´etodo de la reivindicaci´ on 2, en el cual la citada disoluci´on micelar es una disoluci´on de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) con una concentraci´on de CTAB mayor de 1x10-3 M. 4. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual dicho complejo metal - ferr´ on se encuentra en una disoluci´ on de ves´ıculas. 5. El m´etodo de la reivindicaci´ on 4, en el cual la citada disoluci´on de ves´ıculas es una disoluci´on de bromuro de dodecildimetilamonio (DDAB) con una concentraci´ on de DDAB mayor de 5x10-3 M. 6. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual dicho complejo metal - ferr´ on se encuentra inmovilizado sobre un soporte s´ olido. 7. El m´etodo de la reivindicaci´ on 6, en el cual dicho soporte s´ olido es una resina de intercambio ani´ onico. 8. El m´etodo de la reivindicaci´ on 7, en el cual las citadas part´ıculas de resina est´ an contenidas en una matriz polim´erica que es permeable al ox´ıgeno gaseoso. 9. El m´etodo de la reivindicaci´ on 8, en el cual dicha matriz polim´erica es un elastr´ omero de silicona. 10. El m´etodo de la reivindicaci´ on 8, en el cual dicho material se usa para la medida de la concentraci´on de ox´ıgeno. 11. El m´etodo de la reivindicaci´ on 7, en el cual dichas part´ıculas de resina se disponen en disoluciones acuosas. 12. El m´etodo de la reivindicaci´on 11, en el cual se usa dicho m´etodo para la determinaci´ on de la concentraci´on de ox´ıgeno. 13. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual dicho complejo metal-ferr´ on est´a formado por al

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

6

10

menos un cati´ on met´ alico complejado con al menos una mol´ecula de ferr´on. 14. El m´etodo de la reivindicaci´on 13, en el cual el citado metal se selecciona del grupo formado por aluminio, galio, indio, niobio y zirconio. 15. El m´etodo de la reivindicaci´ on 6, en el cuya dicha inmovilizaci´on es realizada con un sistema FIA. 16. El m´etodo de la reivindicaci´ on 6, en el cuya dicha inmovilizaci´on esta basada en un mecanismo de intercambio i´onico. 17. Un sistema para analizar ox´ıgeno en muestras l´ıquidas que comprende: una c´elula de flujo en la que se dispone el optosensor, un espectrofluor´ımetro comercial, y una bomba perist´ altica. 18. El sistema de la reivindicaci´on 17, en el cual dicho optosensor esta constituido por complejos Al-ferr´on inmovilizados sobre la resina de intercambio ani´ onico Dowex 1 x 2-400, la cual se dispersa en una membrana de silicona que se dispone sobre una ventana de cuarzo. 19. El sensor de la reivindicaci´ on 18, en cual dicha membrana de silicona se cubre con una membrana de tefl´ on. 20. El sistema de la reivindicaci´on 17, en el cual dicho optosensor en flujo encaja en el compartimento de la muestra del citado espectrofluor´ımetro. 21. El sistema de la reivindicaci´on 17, en el cual dicho sistema se usa para la medida de ox´ıgeno en muestra acuosas. 22. El sistema de la reivindicaci´on 17, en el cual dicho sistema se utiliza para la medida de ox´ıgeno en disolventes org´anicos. 23. El sensor tipo c´elula de flujo de la reivindicaci´on 20, en el cual dicho sensor se utiliza para la medida de ox´ıgeno en mezclas gaseosas. 24. Un optosensor tipo c´elula de flujo que comprende la resina de intercambio ani´onico comercial Dowex 1x2-100 enlazada a complejos Alferr´ on, empaquetada en una c´elula de flujo comercial. 25. El sensor tipo c´elula de flujo de la reivindicaci´on 24, en el cual el citado sensor es usado como transductor de reacciones de bioan´ alisis mediatizadas por ox´ıgeno. 26. El m´etodo de la reivindicaci´on 25, en el cual dicho m´etodo se utiliza en la determinaci´ on de glucosa, como aplicaci´on t´ıpica para muestras biom´edicas.

ES 2 061 387 A1

7

ES 2 061 387 A1

8

ES 2 061 387 A1

9

ES 2 061 387 A1

10

ES 2 061 387 A1

11

ES 2 061 387 A1

12

ES 2 061 387 A1

13

ES 2 061 387 A1

14

kES 2 061 387 kN. solicitud: 9202641 kFecha de presentaci´on de la solicitud: 30.12.92 kFecha de prioridad:

11

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

21

˜ ESPANA

◦

22 32

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

k

51 Int. Cl.5 :

G01N 21/64, C09K 11/64, 11/60, 11/08, A61B 5/00

DOCUMENTOS RELEVANTES Categor´ıa

X A

Documentos citados

Reivindicaciones afectadas

ANALITICAL CHEMISTRY, Vol. 63, N◦ 17, 1 Sept. 1991; R. PEREIRO et al.: ”Solid-surface room-temperature phosphorescence optosensing in continuous flow sistems: An approach for ultratrace metal ion determination”. p´ag. 1759-1763 * P´ag. 1760 * * Todo el documento *

24 1-26

A

EP-A-283289 (C.R. BARD, INC.) * P´ag. 10, l´ıneas 43-65; p´ag. 11-12; p´ag. 13, l´ıneas 1-56 *

1-26

A

EP-A-457292 (ABBOTT LABORATORIES) * Col. 14, l´ıneas 23-46 *

1,6-10,26

A

PHOTOBIOLOGY, 1991. Plenum Press, New York; G. GABOR: ”The analytical uses of luminiscence”, p´ag. 267-276 * P´ag. 269,272,273 *

1,6-10,26

A

ZH. ANAL. KHIM. Vol. 45 (7), 1990; D.B. PAPKOVSKII et al.: ”Oxigen and glucose optical biosensors based on phosphorescence quenching of metalloporphiryns”, p´ag. 1741-1745. * Resumen *

1,6-10,26

Categor´ıa de los documentos citados X: de particular relevancia

on no escrita O: referido a divulgaci´

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la

on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´

misma categor´ıa A: refleja el estado de la t´ecnica

de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu´ de presentaci´ on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado × para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci´ on del informe 08.09.94

para las reivindicaciones n◦ : Examinador N. Urqu´ıa Fern´andez

P´ agina

1/1