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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 183 944 kInt. Cl. : A61K 38/10, A61K 39/00

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˜ ESPANA

A61K 39/12, A61K 39/395 C07K 7/08, C07K 16/28 C12P 21/08, G01N 33/53 G01N 33/536, G01N 33/566

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 96912697.8 kFecha de presentaci´on: 11.04.1996 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 822 828 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 11.02.1998

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54 T´ıtulo: Prote´ına de 55 a 75 kda aislada que se une a prote´ınas pri´ onicas.

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73 Titular/es: LUDWIG INSTITUTE FOR

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72 Inventor/es: Brentani, Ricardo R.;

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74 Agente: Polo Flores, Carlos

30 Prioridad: 12.04.1995 US 421059

CANCER RESEARCH 605 Third Avenue, 33rd Floor New York, New York 10158, US Fundacao Antonio Prudente

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.04.2003

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.04.2003

Aviso:

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De Souza, Sandro J. y Martins, Vilma R.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION Prote´ına de 55 a 75 KDA aislada que se une a prote´ınas pri´ onicas. ´ Ambito de la invenci´ on Esta invenci´on se refiere a la identificaci´on y aislamiento de prote´ınas que se unen a prote´ınas pri´ onicas, denominadas en adelante PrP. M´as particularmente, las prote´ınas aisladas de la invenci´on tienen un peso molecular desde alrededor de 55 kD a alrededor de 72 kD seg´ un se determina mediante SDS-PAGE, y se denominan en adelante prote´ınas anti-PrP o prote´ınas de uni´ on a PrP. Tambi´en se describe un p´eptido aislado que consta de una secuencia de amino´acidos de la citada prote´ına de uni´ on/prote´ına anti-PrP. Tanto el p´eptido como la prote´ına tienen diversas eficacias de diagn´ ostico. En el caso del p´eptido, se puede usar, por ejemplo, para producir anticuerpos los cuales se usan por su parte para identificar a la prote´ına anti-PrP. Tambi´en, el p´eptido puede unirse, ´el mismo, a la PrP. De forma similar, se puede usar la prote´ına completa de la misma manera. Se pueden diagnosticar o detectar diversas enfermedades asociadas con los priones usando estos materiales. Adem´ as, se puede detectar la presencia de PrP en una muestra usando la prote´ına de la invenci´on. Antecedentes y t´ ecnica anterior Los “priones” o “part´ıculas proteicas infecciosas” han estado implicados en un n´ umero de estados patol´ogicos. Las enfermedades asociadas con los priones conocidas se denominan en general encefalopat´ıas espongiformes, debido a una caracter´ıstica com´ un de las enfermedades, es decir, la formaci´ on de “agujeros” en el tejido craneal. La enfermedad m´ as com´ unmente reconocida asociada con los priones es con mucho la “tembladera”, encontrada en ovejas y cabras. Los animales afectados pierden coordinaci´on, y finalmente son incapaces de mantenerse en pie. Las enfermedades asociadas con los priones adicionales incluyen encefalopat´ıa del vis´on transmisible; enfermedad del desgaste cr´ onico de la mula, del ciervo y del alce; encefalopat´ıa espongiforme felina; y encefalopat´ıa espongiforme bovina (“enfermedad de las vacas locas”). Entre los humanos, se ha asociado el Kuru, o “muerte de la risa” con el canibalismo. El trastorno humano m´ as grave asociado con los priones, no obstante, es con mucho la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Este estado se hace evidente en general por el desarrollo de demencia en el sujeto. Es una causa de gran preocupaci´ on porque se puede transmitir atrog´enicamente, tal como mediante transplante de c´ornea, uso de instrumentos quir´ urgicos contaminados, inyecci´ on de hormonas de crecimiento purificadas u otros materiales derivados de pituitaria, as´ı como por la implantaci´on de materia dura o electrodos en el cerebro. Los estados patol´ ogicos adicionales asociados con los priones incluyen la enfermedad de Gerstmann-Str¨ausslerScheinker (da˜ no de lataxia y cerebelo), e insomnio familiar fatal. Ambos de estos estados son hereditarios, y aparecen de forma t´ıpica en la edad madura. Al principio, se crey´o que los estados antes mencionados estaban causados por un virus 2

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de acci´on lenta encontrado en el tejido cerebral. Esta hip´ otesis se basaba en la observaci´ on de que las enfermedades se pod´ıan transmitir mediante inyecci´on de extractos cerebrales de animales afectados en animales sanos. Esta hip´otesis, sin embargo, en general ya no se acepta, porque no se ha aislado un virus a pesar de los esfuerzos coordinados para hacerlo. Lo que se ha encontrado acerca de estos estados es que, aunque son hereditarios, est´ an causados por material protein´ aceo, m´as que por a´cidos nucleicos. El material protein´ aceo se denomina pri´ on. Entre los experimentos los cuales llevaron a la hip´ otesis de que el material proteico estaba implicado estaba el tratamiento de materiales de animales infectados para inactivar prote´ınas pero no a´cidos nucleicos. En estas condiciones, no se transmiti´ o la enfermedad. Los desarrollos de esta hip´otesis han identificado una prote´ına u ´ nica en los priones de tembladera. Esta prote´ına, “prote´ına pri´ onica”, se denominar´ a PrP en adelante. Se usa de forma gen´erica para referirse a la prote´ına que forma el pri´ on. Ver, por ejemplo, Prusiner, Science 252: 15121522 (14 de junio, 1991) (“Molecular Biology of Prion Diseases”); Prusiner y col., ed., Prion Diseases of Humans and Animals (Ellis Horwood, 1992). Como con todas las prote´ınas, la PrP est´ a codificada por un gen; no obstante, la expresi´ on de la PrP no es suficiente para causar un estado asociado con los priones. Se ha determinado que la PrP puede experimentar cambios en su estructura tridimensional, que llevan a su forma pri´ onica. M´ as detalladamente, la forma benigna de la PrP muestra una geometr´ıa de alfa h´elice m´ ultiple. En la forma de priones infecciosos, no obstante, la estructura tridimensional “se alarga”, formando l´aminas beta. En resumen, la diferencia entre la forma normal, no da˜ nina de la PrP y la forma asociada con las enfermedades, por ejemplo, parece ser completamente conformacional. Biro, Medical Hip´ otesis 7: 981 (1981) sugiri´ o primeramente la “hidropat´ıa complementaria”, un concepto cr´ıtico para entender la invenci´ on descrita aqu´ı. El concepto que expuso Biro se basaba en una observaci´ on de que se observ´o que las interacciones prote´ına/prote´ına eran es´ argument´ pec´ıficas. El o que la codificaci´on complementaria, es decir, codificaci´on tanto por la cadena sentido como “antisentido” de las mol´eculas de a´cido nucleico podr´ıa llevar a la especificidad requerida. Los trabajos sobre la interacci´ on entre ACTH, γ-endorfina, angiotensina II, hormona liberadora de la hormona luteinizante, y fibronectina, y sus receptores, apoyan esta hip´otesis. Ver Bost, y col., Mol. Cell Endocrin 44:1 (1986) (ACTH); Carr, y col., J. Neuroimmunol 12: 329 (1986) (γ-endorfina); Elton, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85: 2518 (1988); (angiotensina II); Mulchahey, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 83: 9714 (1986) (hormona liberadora de la hormona luteinizante); y Brentani, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85: 364 (1988) (fibronectina). Todos estos trabajos apoyaron un concepto planteado como hip´ otesis por Blalock, y col.,

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Biochem. Biophys. Res Commun. 121: 203 (1984). Su observaci´ on fue que cuando se comparaban los codones para los amino´ acidos hidrop´ aticos con sus codones complementarios, estos codones complementarios eran en general codones los cuales codifican amino´ acidos hidr´ ofilos. Blalock, y col. observaron una correlaci´on significativa (r=0,74) entre los coeficientes hidrop´ aticos de los amino´ acidos codificados por cadenas de ADN opuestas, y as´ı pues postularon que los p´eptidos codificados por cadenas de ADN complementarias se unir´ıan unos a otros. Como se indic´ o, arriba, esta hip´ otesis est´a apoyada por un n´ umero de p´eptidos. En 1991, Goldgaber, Nature 351: 106 (5/9/91), inform´ o de la posible aplicaci´on de la complementariedad con la PrP. Goldgaber inform´ o del an´ alisis de secuencias de ADN complementarias de la PrP, y de la identificaci´ on de un marco de lectura abierta grande y solapante en la cadena de ADN “antisentido” para el gen PrP. Cuando Goldgaber analiz´ o la secuencia de amino´acido deducida para esta regi´ on codificante complementaria, encontr´ o que era casi una imagen especular de la PrP. Mientras que Manson, y col., Nature 352: 291 (7/25/91), cuestionaron este trabajo, Hewinson, y col., Nature 352: 291 (7/25/91) se˜ nalaron que ´este confirmaba su propio trabajo. Prusiner y col., Nature 362: 213 (3/18/93), proporcionaron un “pliegue” interesante en esta investigaci´on, cuando informaron de que hab´ıan encontrado una unidad de ARN del tama˜ no adecuado (4,5 kb) para hibridar con las cadenas sentido de la PrP, pero no se derivaba de la cadena antisentido de la PrP. Los informes discutidos arriba, as´ı como un informe de Moser, y col., Nature 362: 213 (3/18/93), tratan la posibilidad de la prote´ına anti-PrP, como se denominar´a en adelante, en enfermedades asociadas con priones. Hewinson, y col., sugirieron que la prote´ına complementaria pod´ıa ser un receptor de PrP. El trabajo que sigue presenta, por primera vez, la identificaci´on y caracterizaci´on de una prote´ına de uni´ on anti-PrP. Este material se puede usar para identificar la presencia de PrP en muestras, proporcionando de este modo un procedimiento de detecci´on y/o diagn´ ostico, especialmente cuando se observan otros s´ıntomas caracter´ısticos de un trastorno asociado con los priones. A la vista del predominio de los trastornos asociados a priones en organismos vivos, por ejemplo, existen usos tanto humanos como veterinarios de la invenci´on. Breve descripci´ on de las figuras La figura 1 muestra los resultados de un ensayo de inmunofluorescencia, usando anticuerpos producidos con el p´eptido de la invenci´on. La figura 2 representa an´ alisis en SDS-PAGE. En el carril A, se presentan los eluatos de las c´elulas las cuales fueron negativas en el ensayo de inmunofluorescencia. El carril B se obtuvo usando eluatos de c´elulas positivas. El carril C es una transferencia Western de un eluato del carril B, usando suero de rat´ on normal, mientras que el carril D result´ o de examinar tal eluato con el antisuero obtenido usando el p´eptido de la invenci´on.

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Las figuras 3A y 3B presentan los datos de los ensayos de inmunofluorescencia en neuronas mesencef´alicas murinaa. En la figura 3A, se muestra la uni´ on de anticuerpos marcados a las c´elulas. La figura 3B muestra la localizaci´on de la uni´ on. Las figuras 4A y 4B exponen los datos correspondientes a la caracterizaci´on inmunoelectrofotoqu´ımica de las prote´ınas de uni´ on a priones. La figura 5 muestra los resultados de experimentos que establecen la uni´ on del pri´ on a la prote´ına complementaria. Descripci´ on detallada de las realizaciones preferidas Ejemplo 1 Para enfocar la pregunta de si existe una prote´ına anti-pri´ on, se sintetiz´o un p´eptido, basado en el trabajo de Forloni, y col., Nature 362: 543-546 (1993). Forloni y col. describen el p´eptido pri´ onico “PrP 106-126”, el cual indujo la muerte celular en cultivos de hipocampo de rata primarios. El p´eptido, el cual se us´ o aqu´ı, es decir: Tyr His Val Ala Thr Lys Ala Pro His His Gly Pro Cys Arg Ser Ser Ala (SEQ ID NO.: 1) es complementario a un p´eptido derivado de la PrP, y se deriva ´el mismo de los amino´acidos complementarios 113-129 de una ORF anti-pri´ on deducida, arriba. El p´eptido sintetizado se uni´ o con hemocianina de lapa californiana (KLH), para producir un inmunogen. El inmunogen se inyect´ o entonces a ratones, de forma intraperitoneal, en intervalos de dos semanas, hasta un total de 100 ug de prote´ına total. Tras la cuarta inyecci´on, los animales se desangraron, y se titul´ o el p´eptido no unido mediante un ELISA convencional. Ejemplo 2 Una vez que se produjo el antisuero, se utiliz´o en estudios de inmunofluorescencia. Se us´o la l´ınea celular de neuroblastoma murina “neuro 2A”. Se dispusieron en placas muestras de la l´ınea celular (2x106 c´elulas/pocillo), en portaobjetos de c´amara de cultivo de tejido de ocho pocillos. Se incubaron las c´elulas, toda la noche, tras lo cual se lavaron los portaobjetos y se fijaron las c´elulas con glutaraldeh´ıdo al 1 %. Tras la fijaci´on, se a˜ nadi´ o una disoluci´ on de suero de cao un laballo 1:20, durante 1 hora a 37◦C. Sigui´ vado con disoluci´ on salina tamponada con fosfato (PBS), y despu´es se a˜ nadi´ o el antisuero, durante un per´ıodo de 2 horas. Seguidamente, se lavaron las c´elulas abundantemente, tras lo cual se a˜ nadi´ o un segundo anticuerpo, es decir, anti-IgG, unido a isotiocianato de fluoresce´ına, diluido 1:80 en Evan’s blue, durante 1 hora. Sigui´ o un lavado abundante, tras el cual se montaron los portaobjetos y se observaron. La figura 1 muestra estos resultados, aunque la reproducci´on en blanco y negro no muestra de forma muy clara el hecho de que el marcado con FITC tuvo de hecho lugar (un color verde muestra que el marcado tuvo lugar). Los resultados muestran que el antisuero reconoci´ o la superficie de las c´elulas neuro 2A. La reactividad total fue de alrededor de 15 % de la poblaci´ on total. Este resultado es similar a los resultados obtenidos por Butler, y col., J. Virol 62: 1558-1564 (1998), quie-

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nes mostraron que la infectabilidad de la PrP50 en las c´elulas neuro 2A estaba restringida a s´ olo ciertas c´elulas de la poblaci´on. La observaci´on de la que se informa aqu´ı sugiri´ o la siguiente serie de experimentos, dise˜ nados para analizar cualquier diferencia posible entre las c´elulas negativas y positivas. Ejemplo 3 En estos experimentos, se clonaron primero las c´elulas positivas y negativas mediante disoluci´on limitante. Las c´elulas positivas se derivaron del clon “IEI2” y las c´elulas negativas del clon “IC4”. Se marcaron superficialmente c´elulas vivas de cada clon con 125 I, usando el procedimiento bien conocido de la lactoperoxidasa. Despu´es del marcado, se lisaron las c´elulas, y se incubaron los extractos resultantes con el p´eptido pri´ onico PrP106−126 unido a perlas de sefarosa CNBr 4B toda la noche, con agitaci´ on. Despu´es de la incubaci´ on, se someti´o a SDSPAGE a todo el material unido (es decir, cualquier cosa que se una al p´eptido PrP106−126 ). Para llevar a cabo esto, se separaron los materiales unidos, usando un gel de concentraci´ on al 40 %, y un gel de resoluci´on al 7,5 %. Se transfirieron entonces las prote´ınas a filtros de nitrocelulosa (0,45 um de tama˜ no de poro) y despu´es se ti˜ neron, con Ponceau S al 0,5 %, para verificar la extensi´on de la transferencia. La figura 2 presenta estos resultados. El carril A corresponde al clon negativo, y el carril 5 al clon positivo. Los eluatos, cuando se compararon, revelaron que no se encontr´ o en niveles altos con los clones negativos una banda para la prote´ına de alrededor de 55-65 kD de los clones positivos. Para confirmar este resultado, se llev´ o a cabo entonces una transferencia Western, como se describe debajo. Ejemplo 4 Se trataron las c´elulas del clon positivo, como en el ejemplo 1, pero no se marcaron. Tambi´en como en el ejemplo 3, se incub´o el extracto de prote´ına no marcado con las perlas de sefarosa con PrP106−126 , y se eluy´o despu´es la prote´ına unida y se aplic´ o a filtros, tambi´en como se describi´ o. Para las transferencias Western, se bloquearon los filtros con leche en polvo grasa al 5 % en PBS, y se incub´ o entonces con suero de rat´on normal, o con el antisuero descrito arriba, y despu´es con el anticuerpo conjugado de biotina de cabra anti-rat´ on. Se a˜ nadi´ o este anticuerpo marcado durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavado abundante, se revelaron los anticuerpos, usando un sistema quimioluminiscente ECL bien conocido. Se representan los resultados en los carriles C-D de la figura 2, obteni´endose el carril C usando suero normal, y el carril D antisuero frente al p´eptido anti-pri´ on descrito arriba Los descubrimientos sugieren que el antisuero frente al p´eptido anti-pri´ on reconoce la banda de uni´ on al PrP106−126. Ejemplo 5 Los ejemplos expuestos arriba incluyen an´ alisis de cocultivos de neuronas y c´elulas gliales. La posibilidad del marcado de las c´elulas gliales no se pudo descontar, y as´ı pues, se desarroll´o un 4

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protocolo para examinar esta posibilidad. Se hicieron crecer las c´elulas gliales en un cultivo, usando metodolog´ıas convencionales. Despu´es se lisaron las c´elulas cultivadas, y se usaron los extractos en an´ alisis mediante transferencia Western, usando el antisuero descrito arriba. Las c´elulas gliales eran completamente negativas, en comparaci´on con los resultados que se representan en la figura 1. Se puede inferir a partir de esto que la diana del antisuero es una mol´ecula en las neuronas, es decir, es un ant´ıgeno de las c´elulas nerviosas. Ejemplo 6 Se prepararon c´elulas neuronales del mesenc´efalo de embriones de ratones suizos de 14 d´ıas de edad, de acuerdo con Mouro Neto, y col., EMBO J 2: 1243-1248 (1983). Se pusieron estas c´elulas en cubreobjetos de vidrio de 10 mm de di´ ametro los cuales se hab´ıan recubierto previamente con poliornitina (MW: 41 kD, 1,5 ug/ul), en una mezcla de medios DMEM y F12, suplementada con glucosa, glutamina, bicarbonato s´odico, y suero de ternero fetal al 10 %. Ver Garc´ıa-Abreu, Neuros. Res. 40: 471-477 (1995), a este respecto. Tras 24 horas, no se pudo ver desarrollo neuronal importante. Se a˜ nadi´ o antisuero murino, producido frente a una secuencia de amino´acidos que consta de todos salvo el Tyr N-terminal de la SEQ ID NO.: 1, y preparado como se describi´ o, arriba, a 1:100 v/v, de tal forma que se una a las c´elulas vivas, de acuerdo con Halftler y col., Eur. J. Neurosci 1: 297-308 (1989). Tras una hora de incubaci´ on, se elimin´o cualquier antisuero en exceso, y se fijaron las c´elulas con paraformaldeh´ıdo al 4 % en tamp´ on fosfato 0,1M, pH 7,6 durante 30 minutos. Se lavaron las c´elulas r´apidamente con Triton X100 al 1 % en PBS, y se incubaron toda la noche con un anticuerpo monoclonal frente a β-tubulina III, diluido 1:100. Sigui´ o la incubaci´ on con anticuerpos marcados con FITC y RITC durante dos horas. Se montaron entonces los cubreobjetos en glicerol-propilgalato/PBS (9:1, v/v). Se observaron los portaobjetos en un microscopio Zeiss, axioplanar, con un adjunto de epi-fluorescencia. La figura 3A muestra que los anticuerpos reaccionaron con todas las c´elulas neuronales murinas, lo cual es consistente con el reconocimiento de una prote´ına de uni´ on/receptora de priones, expresada por las c´elulas neuronales. Se verific´ o la identificaci´on de las c´elulas como neuronas ti˜ nendo con los anticuerpos monoclonales contra la β-tubulina III. Se estudiaron despu´es los cubreobjetos usando un microscopio l´aser de Zeiss, del cual se muestra una secci´on confocal en la figura 3B. De este modo se localiz´o la mol´ecula unida a la membrana neuronal. Ejemplo 7 Despu´es se llevaron a cabo estudios adicionales para identificar la mol´ecula de uni´ on, y para confirmar su localizaci´ on celular. Se prepar´ o un extracto cerebral de rat´ on total, homogeneizando cerebros de rat´on en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, desoxicolato s´ odico al 0,2 %, Triton X-100 al 0,5 %, aprotinina 1 mM, leupeptina 1 mM, PMSF 1 mM, y benzamidina 1 mM, lo cual se centrifug´ o entonces a 12.000xg durante 30 mi-

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nutos. Se prepar´ o un extracto de membrana homogeneizando cerebros en Hepes 10 mM, pH 7,4, MgCl2 0,5 mM, aprotinina 1 mM, leupeptina 1 mM, PMSF 1 mM, y benzamidina 1 mM, seguido de centrifugaci´on a 600xg, 15 minutos. Despu´es se diluy´ o el sobrenadante cinco veces con el mismo tamp´ on m´ as EDTA 0,7 mM, seguido de centrifugaci´ on en un relleno de sacarosa 0,3 M a 825xg durante 15 minutos. Se resuspendi´o el sedimento en sacarosa 1,38 M, y se centrifug´o en una disoluci´on de sacarosa 0,3 M a 105.000xg durante una hora. Se recogi´ o la interfase y se suspendi´o en 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 120 mM, leupeptina 1 mM, PMSF 1 mM, aprotinina 1 mM, y benzamidina 1 mM. Se prepar´ o una fracci´ on citoplasm´atica homogeneizando cerebros en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM, leupeptina 1 mM, PMSF 1 mM, aprotinina 1 mM, y benzamidina 1 mM, y centrifugaci´ on durante una hora a 105.000 xg. El sobrenadante sirvi´ o de fracci´ on citoplasm´atica. Se resolvieron muestras de cada protocolo de tratamiento mediante SDS-PAGE, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Se expusieron las transferencias a suero producido como se describi´ o arriba (carriles de n´ umeros impares en las figuras, como se discute abajo), o suero no inmune de rat´on (carriles de n´ umeros pares, como se discute abajo). En la figura 4A, los carriles 1 y 2 muestran las transferencias Western de extractos totales; los carriles 3 y 4 son transferencias Western para los extractos de membrana, y los carriles 5 y 6 se refieren a extractos citoplasm´ aticos. Como se ver´a, se encontr´ o una se˜ nal a 60 kDa en los extractos cerebrales totales, y tambi´en se encontr´o una se˜ nal en los extractos de membrana, pero a 63-66 kDa. Tambi´en hubo una especie detectable en la fracci´on citoplasm´atica a 60 kDa. Ver carriles 1, 3 y 5. Esto sugiere que est´ an presentes dos formas de la prote´ına en las c´elulas cerebrales, siendo la forma unida a la membrana algo menos predominante, y as´ı pues s´ olo detectable en las fracciones purificadas. No se encontr´o se˜ nal cuando se us´ o suero no inmune. En la figura 4B, se muestra un an´ alisis mediante transferencia Western tras electroforesis bidimensional. Se prepararon los extractos, como se describi´ o, arriba, y despu´es se aislaron, de acuerdo con O’Farrell y col., Cell 12: 1133-1142 (1977), usando un gradiente anfol´ıtico con las partes ligeras a pH 5,0-8,0, y dos partes de un gradiente anfol´ıtico a pH 3,0-10,0 en la primera dimensi´ on, seguido de SDS PAGE al 10 % en condiciones reductoras en la segunda dimensi´ on y despu´es transferencia a membranas de nitrocelulosa. El extracto cerebral total est´ a en el panel 1, y el extracto de membrana en el panel 2. De nuevo, se us´o suero preparado como se discuti´ o arriba, seguido de IgG anti-rat´ on, marcado con fosfatasa alcalina. El sustrato para la enzima fue fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, y cloruro de nitroazul de tetrazolio. La figura 4B confirma los pesos moleculares de 60 y 63-66 kDa, con pIs de 6,9 y 6,8 en el extracto total. La fracci´on de membrana mostr´ o

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un componente u ´nico (63-66 kDa, pI 6,8). Ejemplo 8 Un experimento crucial fue determinar si los priones se un´ıan a las mol´eculas identificadas arriba. Para determinar esto, se precipit´ o el extracto cerebral total discutido arriba, sucesivamente, con sulfato am´ onico al 30 %, 45 % y 55 %. Se disolvieron los sedimentos, se sometieron a SDS-PAGE y despu´es de transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Despu´es se llevaron a cabo transferencias Western usando suero de conejo anti-pri´ on, o antisuero frente al p´eptido discutido arriba. Se revelaron las membranas usando quimioluminiscencia aumentada, y se expusieron a una pel´ıcula de rayos X. (Los carriles de n´ umeros impares de la figura 5 muestran el trabajo del suero de conejo anti-pri´on, mientras que los carriles de n´ umeros pares muestran el trabajo del antisuero del p´eptido anticomplementario). Se ver´ a que las prote´ınas pri´ onicas estaban en la fracci´ on del 30 % (carril 5), y las prote´ınas complementarias en la fracci´on del 55 % (carril 2). El carril 2 tambi´en muestra que la fracci´ on precipitada entre 45 y 55 % de la saturaci´ on del sulfato am´onico conten´ıa ambas formas de la prote´ınas las cuales reaccionan con el antisuero frente al p´eptido pri´ onico complementario. No se encontr´ o prote´ına pri´ onica en la fracci´ on 45-55 %, seg´ un el carril 1. La fracci´on mostrada en el carril 5 no conten´ıa material reactivo con el antisuero de p´eptido anticomplementario. Cuando se incub´ o la fracci´on del 30 % con prote´ınas separadas electrofor´eticamente de la fracci´on del 55 %, hubo una reactividad detectable con el antisuero de conejo anti-pri´ on, a un peso molecular de 63-66 kDa. Ver el carril 3. Esto indica que la prote´ına pri´ onica normal, es decir, PrPc se une a la forma m´as pesada de la mol´ecula, es decir, la que se encuentra en la membrana. A la inversa, cuando se incub´ o la fracci´on del 55 % con prote´ınas separadas electrofor´eticamente de la fracci´on del 30 % (carril 6), se encontr´ o uni´ on del anticuerpo al p´eptido anticomplementario, siendo la uni´on a los tres isoformos pri´ onicos conocidos, a 30-33 kDa. As´ı pues, la prote´ına receptora fue capaz de unirse a los priones en estos ensayos. Estos ensayos se denominan ensayos de superposici´ on. Espec´ıficamente, en el primero, se incub´ o la fracci´on del 30 % solubilizada (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 120 mM, Tween al 0,05 %, con las transferencias de la fracci´on del 55 % en SDS-PAGE. La misma disoluci´on, pero usando la fracci´ on del 55 %, se aplic´o despu´es a la fracci´on del 30 % transferida. Los ejemplos anteriores exponen un p´eptido complementario a un p´eptido encontrado en la PrP. El p´eptido de la PrP es conocido, y se sabe que es neurot´oxico. El p´eptido inventivo, expuesto en SEQ ID NO.: 1, se ha usado para desarrollar anticuerpos los cuales se pueden usar para identificar neuronas, dado que la diana del antisuero es espec´ıficamente las c´elulas nerviosas. Tambi´en son una parte de la invenci´on las prote´ınas anti-PrP aisladas, tambi´en denominadas prote´ınas de uni´ on a la PrP aisladas, las cuales pueden constar de la SEQ ID NO.: 1 como parte de su secuencia de amino´ acidos, y las cuales tiene un peso molecular desde alrededor de 55 kilodaltons hasta alrededor de 72 kilodaltons 5

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seg´ un se determina mediante SDS-PAGE. Las prote´ınas, dada su capacidad de unirse a PrP, son u ´ tiles para el diagn´ostico. Como se indic´ o, se puede usar la prote´ına de 55-72 kD aislada para determinar la PrP en una muestra. La metodolog´ıa implica poner en contacto una muestra con una prote´ına de 5572 kD para formar complejos entre ellos, seguido de la detecci´on del compuesto as´ı formado. Las prote´ınas de 55-72 kD se pueden inmovilizar en una perla, pared del tubo de vidrio de una columna, y similares, pero no es necesario. Si no est´an inmovilizadas, cuando se forman los complejos en disoluci´on, se pueden determinar observando los patrones de migraci´ on en un gel, o mediante cualquiera de las metodolog´ıas convencionales conocidas en la t´ecnica. Tambi´en se puede marcar cualquier prote´ına aislada, tal como con un crom´ oforo, un radiomarcador tal como 125 I, una enzima, o cualquiera de los otros marcadores convencionales usados para determinar la uni´ on. La presencia de la PrP en una muestra puede indicar la presencia o predisposici´on hacia un trastorno asociado con los priones, tal como los descritos arriba. Estos ensayos y sistemas de diagn´ ostico se pueden usar en el contexto de

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cr´ıa de animales, medicina veterinaria, y, por supuesto, patolog´ıas humanas y/o ensayos de diagn´ ostico generales. Como se indic´ o, el p´eptido de la invenci´on se puede usar per se en procedimientos de diagn´ ostico, o como inmunogen. En el u ´ltimo caso, se puede unir a un veh´ıculo, tal como hemocianina de lapa californiana, seroalb´ umina bovina, o cualquiera de los materiales convencionales usados para “haptenizar” p´eptidos peque˜ nos. Los complejos resultantes que constan de la SEQ ID NO.: 1, o el p´eptido per se, se pueden formular en composiciones inmunog´enicas, tales como con un adyuvante. Como se indic´ o, se pueden usar los anticuerpos, ya sean policlonales en forma de antisuero, por ejemplo, o monoclonales, preparados usando t´ecnicas convencionales, los cuales se producen seguidamente a la inmunizaci´ on con los p´eptidos, para detectar c´elulas nerviosas que llevan la prote´ına anti-PrP. Tambi´en se ha encontrado que se puede hacer una prote´ına de fusi´ on de una primera prote´ına y una prote´ına pri´ onica, tal como “GST-pri´ on”. Estas prote´ınas de fusi´ on tambi´en son u ´ tiles para llevar a cabo ensayos de p´eptidos y prote´ınas antipri´ on, receptores, y dem´ as.

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REIVINDICACIONES 1. Una prote´ına aislada que se une a una prote´ına pri´ onica, caracterizada por que la citada prote´ına aislada:

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i) consta de la secuencia de amino´acidos SEQ ID NO.: 1; y ii) tiene un peso molecular desde 55 kilodaltons hasta 72 kilodaltons seg´ un se determina en una SDS-PAGE al 7,5 %. 2. Un p´eptido aislado que consta de una secuencia de amino´ acidos de SEQ ID NO.: 1. 3. Un complejo inmunog´enico que consta del p´eptido aislado de la reivindicaci´on 2 complejado con un veh´ıculo. 4. El complejo inmunog´enico de la reivindicaci´on 3, en el que el citado veh´ıculo es hemocianina de lapa californiana. 5. Una composici´on inmunog´enica que consta del p´eptido aislado de la reivindicaci´ on 2 y un adyuvante. 6. Una composici´on inmunog´enica que consta del complejo de la reivindicaci´ on 3 y un adyuvante. 7. Antisuero policlonal que se une con el p´ep-

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tido de la reivindicaci´ on 2. 8. Antisuero policlonal que se une con el p´eptido del complejo de la reivindicaci´ on 3. 9. Un anticuerpo monoclonal que se une espec´ıficamente con la prote´ına aislada de la reivindicaci´on 1. 10. Un procedimiento para determinar una prote´ına pri´ onica en una muestra que consta de poner en contacto la citada muestra con la prote´ına aislada de la reivindicaci´ on 1 y determinar la formaci´ on de complejos entre la citada prote´ına aislada y la citada prote´ına pri´ onica como una determinaci´on de la prote´ına pri´ onica en la citada muestra. 11. Un procedimiento para determinar una prote´ına pri´ onica en una muestra que consta de poner en contacto la citada muestra con la prote´ına aislada de la reivindicaci´ on 2 y determinar la formaci´ on de complejos entre la citada prote´ına aislada y la citada prote´ına pri´ onica como una determinaci´on de la prote´ına pri´ onica en la citada muestra. 12. Un procedimiento para determinar una prote´ına pri´ onica en una muestra que consta de poner en contacto la citada muestra con el antisuero de la reivindicaci´on 7 u 8 y determinar la formaci´ on de complejos como una determinaci´ on de la prote´ına anti-pri´ on en la citada muestra.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales.

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Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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ES 2 183 944 T3 LISTAS DE SECUENCIAS ´ GENERAL: (1) INFORMACION 5

(i) SOLICITANTE: LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH ´ (ii) T´ITULO: PROTE´INA DE 55 A 75 KDA AISLADA QUE SE UNE A PROTE´INAS PRIONICAS ´ (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 1

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´ DE CORRESPONDENCIA: (iv) DIRECCION ´ Felfe & Lynch (A) DIRECCION:

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(B) CALLE: ‘805 Third Avenue (C) CIUDAD: Nueva York (D) ESTADO: Nueva York

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(E) PA´IS: E.E.U.U. ´ (F) CODIGO POSTAL: 10022

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(v) FORMA LEIBLE MEDIANTE ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disquete de almacenamiento de 3,5 de 1.44 MB (B) ORDENADOR: IBM PS/2

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(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS ´ (D) PROGRAMA INFORMATICO: Wordperfect

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(vi) FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NO. DE SOLICITUD: 08/421,059 (B) FECHA DE ARCHIVO: 12 abril, 1995

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(viI) FECHA DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NO. DE SOLICITUD: PCT/US96/05028

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(B) FECHA DE ARCHIVO: 11 abril, 1996 ´ DEL REPRESENTANTE/AGENTE: (viii) INFORMACION (A) NOMBRE: Mary Anne Schofield

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(B) REFERENCIA: LUD 5393.1 EP ´ DE TELECOMUNICACION: ´ (ix) INFORMACION

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´ (A) TELEFONO: (212) 688-9200 (B) TELEFAX: (212) 838-3881amino´ acido ´ PARA LA SEQ ID NO. 1: (2) INFORMACION

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(x) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 1

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(B) TIPO: amino´ acido (C) CADENA: sencilla 5

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 1: (xi) DESCRIPCION

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