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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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11 N´ umero de publicaci´on: 6

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˜ ESPANA

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A61K 31/575

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93905856.6 kFecha de presentaci´on : 10.02.93 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 637 243 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 08.02.95

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54 T´ıtulo: Nuevos antibi´ oticos de aminosterol.

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73 Titular/es:

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72 Inventor/es: Zasloff, Michael;

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74 Agente: Carpintero L´ opez, Francisco

30 Prioridad: 18.03.92 US 853634

The Children’s Hospital of Philadelphia 34th Street & Civic Center Boulevard Philadelphia, PA 19104, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.07.97

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 102 021 T3

16.07.97

Aviso:

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Moore, Karen y Wehrli, Suzanne

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 102 021 T3 DESCRIPCION Nuevos antibi´ oticos de aminosterol. 5

Antecedentes de la invenci´ on Esta invenci´on se refiere a un antibi´ otico de aminosterol sustancialmente puro que puede aislarse de los tejidos del tibur´ on com´ un caz´ on, Squalus acanthias.

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Durante varios a˜ nos, se han aislado agentes antibi´ oticos de una amplia serie de especies animales. Se cree que estos agentes juegan un papel en la inmunidad innata de un animal (Boman, H.G. Cell 65, 205-207 (1991)) y comprenden una diversidad de sustancias antibi´ oticas usadas en la defensa contra microbios ambientales. En ciertas composiciones fisiol´ ogicas, los antibi´ oticos se descargan sobre superficies epiteliales (Bevins, C.L. et al., Annu. Rev. Biochem. 59, 395-414 (1990); Samakovlis, C., et al., EMBO J. 10, 163-169 (1991); Nicolaides, N., Science, 19-26 (1974)), se secretan en fluidos corporales internos (Boman, H.G., et al., Annu. Rev. Microbiol. 41, 103-126 (1987)) o se utilizan dentro de las vacuolas de c´elulas defensivas fagoc´ıticas (Lehrer, R.I., Cell 64, 229-230 (1991)). Hasta la fecha, solamente se ha identificado en animales un n´ umero limitado de antibi´ oticos de bajo peso molecular, incluyendo p´eptidos (Steiner, H. et al., Nature 292, 246-248 (1981); Ganz, T., et al., J. Clin. Invest. 76, 1427-1435 (1985); aticos (Daly, J. W. Zasloff, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84. 5449-5453 (1987)), alcaloides bacteriost´ et al., Toxicon 25, 1023-1095 (1987); Preusser, H. J. et al. Toxicon 13, 285-289 (1975)), y l´ıpidos (Kabara, J.J., Lipids 12, 653-659 (1987); Bibel, D.J. et al., J. Invest. Dermatol. 92, 632-638 (1989); Tiffany, J.M. et al., Lipids Res. (eds. Paoletti, R. y Kritchevsky, D.) 22, 1-62 (1987); Brissette, J.L. et al.,J. Biol. Chem. 261, 6338-6345 (1986). Resumen de la invenci´ on Ahora se ha observado que el est´ omago del tibur´ on caz´on, Squalus acanthias, contiene cantidades abundantes de un antibi´ otico de amplio espectro no pept´ıdico, activo contra bacterias gram-positivas y gram-negativas, hongos y protozoos. La determinaci´ on estructural del antibi´ otico, 24-sulfato de 3β[3-[4-amino-n-but-1-ilamino]-n-prop-1-ilamino]-7α, 24ζ-dihidroxi-5α-colestano, revela que es un esteroide cati´onico anfip´ atico, caracterizado por una condensaci´ on de una sal biliar intermedia con espermidina, que tiene la estructura (en su forma totalmente ionizada):

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Por lo tanto, esta invenci´ on se refiere a composiciones sustancialmente homog´eneas del compuesto de f´ ormula I, a sales famarc´euticamente aceptables del compuesto de f´ormula I, a composiciones farmac´euticas que comprenden una cantidad antibi´ otica eficaz del compuesto de f´ ormula I o una sal del mismo y a procedimientos para el tratamiento de infecciones microbianas en seres humanos o en animales no humanos, que comprenden la administraci´ on a dicho animal de una cantidad antibi´ otica eficaz del compuesto de f´ ormula I (por motivos de concisi´ on, denominado en este documento “escualamina”) o una sal del mismo. Breve descripci´ on de los Dibujos

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La Figura 1 es una serie de espectros que ilustran las etapas de aislamiento de la escualamina del est´omago del caz´ on.

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ES 2 102 021 T3 Las Figuras 2a y 2b son espectros de masas de FAB (bombardeo de ´atomos r´ apidos) y las Figuras 2c y 2d son espectros de RMN de la escualamina.

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La Figura 3 es un gr´afico que muestra los resultados de ensayos hemol´ıticos de la escualamina (cuadrados), la melitina (c´ırculos) y la magainina-II amida (tri´ angulos). Descripci´ on Detallada de la Invenci´ on

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Se aisl´o la actividad antibi´ otica del est´omago del caz´ on siguiendo una modificaci´ on de un procedimiento usado anteriormente en el aislamiento de antibi´oticos pept´ıdicos del est´omago del Xenopus. V´ease, Moore, K.S. et al., J. Biol. Chem. 266, 19851-19857 (1991). La actividad antimicrobiana se ensay´o usando E. coli y se purific´ o a trav´es de una serie de etapas que incluyen extracci´ on org´ anica, cromatograf´ıa de exclusi´on molecular, HPLC de fase inversa y HPLC de intercambio cati´onico. En la etapa final de la purificaci´ on (Figura 1d), solamente pudo detectarse una especie molecular por cromatograf´ıa de capa fina (TLC) usando yodo, ninhidrina y procedimientos detecci´on por carbonizaci´ on. Una soluci´on acuosa de escualamina (aproximadamente 0,5 mM) no tuvo absorbancia entre 220 nm y 700 nm, demostrando la ausencia de radicales arom´aticos, enlaces pept´ıdicos, sistemas conjugados lineales y otros crom´oforos. La retenci´on de la actividad sobre la columna de intercambio cati´ onico (Figura 1c) demostr´ o que las especies moleculares deb´ıan presentar una carga positiva neta a pH 3.

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La estructura qu´ımica de la escualamina se determin´o por espectroscop´ıa de masas de FAB y espectroscop´ıa de resonancia magn´etica nuclear (RMN). El espectro de masas de FAB, en la forma de ion positivo, produjo un s´ olo modelo de fragmento caracterizado por un ion molecular de 628 unidades de masa at´omica (amu) (Figura 2a). Se detectaron especies secundarias a 548 amu y 530 amu, consecuentes as de agua (18 amu), respectivamente. La medida con la p´erdida de un ion de SO3 (80 amu) solo o adem´ de la masa del ion molecular dio un valor de 628,4739, consecuente con una composici´on elemental de as complejo, caracterizado C34 H66 O5 N3 S1 . En la forma de ion negativo, se obtuvo un espectro de masas m´ por un ion molecular fuerte a 626 amu (Fig. 2b). La estructura qu´ımica de la escualamina se estudio por RMN de prot´ on y 13 C, usando t´ecnicas uni y bidimensionales (Fig. 2c,d). En dimetilsulf´ oxido, la escualamina present´ o un espectro de prot´ on caracter´ıstico de un esteroide (0,5-2,5 ppm) y una mol´ecula de espermidina (3,05-3,3 ppm). La espectroscop´ıa de correlaci´on bidimensional permiti´ o la asignaci´on de todos los desplazamientos qu´ımicos y estableci´o que el esteroide conten´ıa un enlace de anillo α-AB. Las posiciones del OH libre en C-7, el sulfato en C-24 y la espermidina en C-3 se establecieron inequ´ıvocamente por el an´ alisis completo de los espectros 2DTOCSY, COSY y NOESY. El grupo amino espec´ıfico de la espermidina implicado en el acoplamiento al n´ ucleo esteroideo se dedujo por al an´ alisis de RMN (Fig. 2c,d) y se confirm´o por el espectro de masas obtenido en la forma del ion negativo (Fig. 2b), que revel´ o iones de masa 481, 496 y 555, consecuentes con fragmentos generados por la p´erdida de todo o parte del radical de espermidina (Fig. 2b).

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La estructura deducida del antibi´ otico aislado del est´omago del caz´on es como se ha mostrado anteriormente (en forma completamente ionizada) en la F´ ormula I. La mol´ecula tiene una estructura de anillo esteroideo similar al colestanol. La espermidina se acopla a la posici´ on C-3, reemplazando el grupo cetona o hidroxilo esteroideo. Adem´ as, se observa hidroxilaci´ on en las posiciones C-7 y C-24 y el hidroxilo C-24 est´a sulfatado. La estereoqu´ımica de la uni´ on entre los anillos A y B en la escualamina (5-α) se ve frecuentemente en alcoholes biliares de muchas especies de peces. (Haslewood, G.A.D., J. Lipid Res. 8, 535-550 (1967); Tammer, A.R. en Chemical Zoology (eds. Florkin, M. y Scheer, B.T.) Vol. 8, 595-612 (1974)) De acuerdo con la estructura deducida de la escualamina, se demostr´ o que la actividad antibi´ otica era resistente a la ebullici´on y al tratamiento con proteasas.

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Puede prepararse una composici´ on sustancialmente homog´enea de escualamina, el compuesto de F´ ormula I, mediante los procedimientos de purificaci´ on y aislamiento descritos anteriormente y descritos con m´as detalle en el Ejemplo 1. Por “sustancialmente homog´eneo”, seg´ un se usa aqu´ı, se entiende una composici´ on que tiene una pureza mayor que aproximadamente el 95%, como se muestra por cromatograf´ıa de capa fina y RMN. Pueden prepararse sales farmac´euticamente aceptables de escualamina por procedimientos bien conocidos en la t´ecnica. Tales sales incluyen, pero sin que exista limitaci´on, sales de sodio, potasio, amonio y cloruro.

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La escualamina descrita en este documento parece no tener precedentes en el reino animal. Aunque est´an presentes sulfatos de alcoholes biliares en peces, no se ha descubierto ninguna mol´ecula tal como la 3

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escualamina en peces o en otros animales marinos. Una revisi´on de las estructuras qu´ımicas de aminosteroles que se producen de forma natural, revel´ o la similitud de la escualamina con varios esteroides cati´onicos aislados a partir de plantas medicinales y usados en el tratamiento de infecciones por par´ asitos intestinales. V´ease Rahman, A. -U., Handbook of Natural Products Data (Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1990). Por ejemplo, la escualamina se asemeja a la aminosterol conemorfina antipar´ asita procedente de la planta india Chonemorpha fragrans. (Shah, V.G. et al., Steroids 53, 559-565 (1989)). Esta mol´ecula tiene un sistema de anillo esteroideo id´entico a la escualamina, con el grupo amino primario en C-3; sin embargo, difiere debido a la presencia de un segundo grupo amino sobre una cadena lateral acortada de colesterol y por la ausencia de un radical hidroxilo o un sustituyente ani´ onico.

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Los resultados de ensayo presentados m´as adelante sugieren que la escualamina tiene un amplio intervalo de actividad antibi´ otica potente contra una pluralidad de microorganismos incluyendo bacterias gram-positivas y gram-negativas, hongos, protozoos y similares. Por lo tanto, la escualamina proporciona un procedimiento para tratar o controlar una infecci´ on microbiana provocada por los organismos que son sensibles a la escualamina. Tal tratamiento comprende la administraci´ on a un hospedador o a un tejido susceptible o afectado por una infecci´on microbiana, de una cantidad antimicrobiana de escualamina. Debido a sus propiedades antibi´ oticas, la escualamina tambi´en puede usarse como conservante o esterilizante de materiales susceptibles a la contaminaci´on microbiana. Pueden prepararse composiciones farmac´euticas que comprenden escualamina como ingrediente activo, en una cantidad suficiente como para producir un efecto antibi´ otico en un hospedador o tejido susceptible, y un veh´ıculo est´eril, no t´ oxico y farmac´euticamente aceptable. Una dosis antibi´ otica eficaz de escualamina podr´ıa variar de paciente a paciente, y de infecci´ on a infecci´on, pero es de esperar que tal dosis est´e en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg/kg. Los veh´ıculos farmac´euticos adecuados, que incluyen cargas, tampones no t´oxicos, soluci´ on fisiol´ ogica salina y similares, son bien conocidos en la t´ecnica y se describen, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin, un texto de referencia convencional en este campo. La composici´on puede usarse por v´ıa t´ opica o sist´emica y puede estar en cualquier forma adecuada, tal como un l´ıquido, s´ olido o semis´olido, incluyendo soluciones inyectables, comprimidos, ung¨ uentos, lociones, pastas, c´apsulas y similares. La escualamina tambi´en puede administrarse en combinaci´ on con otros adyuvantes, inhibidores de proteasas o f´armacos compatibles, cuando tal combinaci´ on se considere deseable o ventajosa para combatir la infecci´on provocada por microorganismos perjudiciales, incluyendo protozoos, virus y similares. Aunque no se desea estar limitado por ninguna teor´ıa, se asume que la escualamina ejerce su actividad antibi´ otica mediante la perturbaci´ on de la permeabilidad de la membrana. Por la estructura qu´ımica de la escualamina, ´esta se concibe como un detergente “naciente”. En agua, el sulfato que lleva la cadena lateral y el radical de espermidina est´ an libres y no se encuentran forzados. Como tal, la mol´ecula no deber´ıa presentar un momento dipolar fijo o una segregaci´ on espacial fija de dominios polares y apolares, caracter´ısticos de detergentes destructores de membranas. Sin embargo, en un medio con una baja constante diel´ectrica, se supone que las interacciones electrost´aticas entre el grupo amino terminal de la espermidina y el sulfato en C24 podr´ıan juntar las cadenas laterales para formar un “mango” sobre la estructura plana del anillo esteroideo, dando como resultado una estructura secundaria semejante a un “cesto”: Un mango hidr´ ofilo situado sobre un cesto hidr´ ofobo. La mol´ecula ahora podr´ıa presentar una polarizaci´ on definida de restos hidr´ ofilos e hidr´ ofobos. Una transformaci´ on similar caracteriza a los p´eptidos de magainina, que presentan una peque˜ na estructura secundaria en agua, pero que se organizan en una α-h´elice anfip´ atica tras la uni´on a una membrana. Podr´ıa parecer que el radical de espermidina permite que la escualamina se una a membranas compuestas por fosfol´ıpidos cargados negativamente, caracter´ısticos de l´ıpidos bacterianos, proporcionando la misma base de selectividad que se ha explicado para otros agentes antibi´ oticos cati´onicos destructores de membranas, tales como la magainina.

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Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar el aislamiento, actividad y biodistribuci´on de la escualamina. Ejemplo 1 55

Aislamiento de Escualamina

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Se capturaron tiburones Squalus acanthias de la costa de Nueva Inglaterra. Se congel´ o el tejido de est´omago de los tiburones (400 g) inmediatamente despu´es de la disecci´on, se pulveriz´o en nitr´ ogeno l´ıquido y se extrajo con cinco vol´ umenes de acetonitrilo al 60% y a´cido trifluoroac´etico al 1% (TFA) durante varios d´ıas. Despu´es de la centrifugaci´ on a 8.000 rpm en una centr´ıfuga Sorvall GS3 (DuPont, Wilmington, Delaware) durante 30 minutos, el sobrenadante se liofiliz´o y se resuspendi´ o en 250 ml de 4

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TFA al 0,1%. Despu´es, la muestra se extrajo por una modificaci´ on del procedimiento de Folch (Folch, J., et al., J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957); Roos, D.S. et al., J. Cell. Biol. 101, 1578-1590 (1985)): se a˜ nadieron 15 vol de cloroformo-metanol (2:1) y se retir´ o el precipitado resultante; a la fase org´ anica se a˜ nadieron 0,2 vol de KCl 0,1 M en H2 O y se dejaron separar las dos fases despu´es de una mezcla vigorosa. La fase acuosa se recuper´o y se liofiliz´o, se resuspendi´ o en 30 ml de H2 O, despu´es se introdujo en una columna de filtraci´ on en gel de 45 x 5 cm Bio-Gel P-30 (Bio-Rad, Richmond, California) en TFA al 0,1% y acetonitrilo al 20%. Las fracciones se secaron al vac´ıo, se resuspendieron en agua y se ensayaron como se ha descrito anteriormente. (Moore, K.S., et al., J. Biol. Chem. 266, 19851-19857 (1991)) La Figura 1a muestra la absorbancia a 254 nm para fracciones de la columna de filtraci´ on en gel P-30 y el histograma indica la actividad antimicrobiana relativa contra E. coli D31. Se recogieron fracciones activas que conten´ıan mol´eculas de bajo peso molecular (500-1.000 daltons) y se introdujeron en una columna de HPLC de fase inversa C18 (4,6 x 220 mm, Aquapore OD-300, Applied Biosytems, San Jos´e, CA). Despu´es de lavar la columna extensivamente y dejar que la absorbancia volviera a la l´ınea basal, la columna se eluy´ o con un gradiente lineal de 0-60% en 45 minutos, a un caudal on B (TFA al 0,08% en acetonitrilo). Los de 1 ml/min con tamp´ on A (TFA al 0,1% en H2 O) y tamp´ resultados se muestran en la Figura 1b en la que (como en las Figuras 1c y 1d) la l´ınea fina muestra la absorbancia a 220 nm, la l´ınea gruesa muestra el gradiente de tamp´ on y los puntos indican actividad antimicrobiana minoritaria contra E. coli D31 . El corchete con las flechas indica el pico antimicrobiano principal que se recogi´ o durante la siguiente etapa de purificaci´ on. A continuaci´ on, las fracciones que conten´ıan el pico principal de actividad se introdujeron en una columna de HPLC de intercambio cati´ onico fuerte (4,5 x 200 mm, 5 µm, 300 ˚ A, polisulfoetil aspartamida, poli LC, Columbia, MD.), despu´es de lavar primero la columna extensivamente, como se ha indicado anteriormente, y dejar que la absorbancia volviera a la l´ınea basal. Los resultados se muestran en la Figura 1c. El gradiente era de 0-60% en 45 minutos a 1 ml/min con tamp´on A (KH2 PO4 5 mM, pH 3, acetonitrilo al 25%) y tamp´ on B (KH2 PO4 5 mM, pH 3, acetonitrilo al 25% y NaCl 1 M). Las fracciones que conten´ıan el pico principal de actividad despu´es se introdujeron en una columna de HPLC de fase inversa C4 (4,6 x 25 mm, 5 mm, Vydac, The Separations Group, Hesperia, CA) con los mismos tampones que se usaron para la columna C18 . El gradiente fue de 0-30% en 20 minutos seguido por 30-50% en 30 minutos. V´ease la Figura 1d. La muestra de escualamina purificada se alcaliniz´ o con hidr´ oxido s´ odico, despu´es se aplic´o a una placa de cromatograf´ıa de capa fina de gel de s´ılice 60 (Merck, Darmstadt, Alemania) y se revel´ o con un o una banda disolvente de isopropanol-acetonitrilo-H2O-´acido ac´etico (68:10:68:4). Solamente se detect´ on por carbonizaci´ on. (Rf = 0,12) por yodo, ninhidrina y procedimientos de detecci´ La Figura 2a es el espectro de masas de FAB de la escualamina, en forma de ion positivo, y la Figura 2b es el espectro de masas de FAB de la escualamina, en forma de ion negativo. El inserto de la Figura 2b muestra el sustituyente espermidina con l´ıneas que indican fragmentos de la mol´ecula que son consecuentes con los iones observados. R es 24-sulfato de 7α,24ζ-dihidroxi-5α-colestano. El an´ alisis de FAB se realiz´o sobre un espectr´ ometro de masas de campo alto VG Analytical ZAB 2-SE que funcionaba a un voltaje de aceleraci´on de 8 kV. Se us´o una pistola de iones de cesio para generar iones para los espectros de masas adquiridos, que se registraron usando un sistema de datos PDFF 11-250J. La calibraci´ on de masas se realiz´o usando yoduro de cesio. El an´ alisis de las muestras se realiz´o usando una matriz de glicerol:tioglicerol 1:1 (v/v). La Figura 2c es un espectro de RMN de prot´ on de la escualamina. Se examin´ o a 600 MHz, en un espectr´ ometro Bruker AM 600 (Bruker, Karlsrhue, Alemania), una soluci´on de escualamina (2 mM) en nales entre 0,5 y 2,0 ppm inclu´ıan prote´ınas esteroideas. Las se˜ nales entre 2,8 y DMSO a 37◦C. Las se˜ 3,1 ppm corresponden a los protones de -NCH2 de la espermidina. Las condiciones utilizadas fueron: 16 barridos, SW- 2.500 Hz, SI 4K, repetici´ on 2 seg., a´ngulo de oscilaci´on 90◦ . o la soluci´on de escuaLa Figura 2d es un espectro de RMN 13 DEPT de la escualamina. Se examin´ lamina (6 mM) en D2 O, pH 2,3 a 37◦ C, a 100,62 MHz, en un espectr´ometro Bruker AM 400 (Bruker, Karlsrhue, Alemania). Las condiciones utilizadas fueron: puntos de datos de 32K, SW=25 KHz, 43.000 barridos. Los picos se han fasado de forma que las resonancias de CH y CH3 son positivas y las resonancias de CH2 son negativas. (Doddrell, D. M. et al., J. Mag. Res. 48, 323 (1982); Doddrell, D.M. et al., J. Chem. Phys. 77, 2745 (1982)). Se han suprimido dos resonancias adicionales, correspondientes a los dos carbonos cuaternarios (a 36,15 y 43,18 ppm), visibles en el espectro 1D13 C CPD, por la secuencia de pulsos. La posici´on de la espermidina en C-3, el OSO3 en C-24 y el OH en C-7 se dedujeron del an´alisis 5

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de los experimentos 2D TOCSY, COSY y NOESY. Las asignaciones completas se obtuvieron a partir de los estudios anteriores as´ı como de los experimentos HMQC 1J y 3J. La uni´on del anillo α-AB se dedujo a partir de los desplazamientos qu´ımicos de 13 C sobre los dos carbonos cuaternarios, y los dos grupos metilo (C-18 y C-19) por comparaci´ on con los espectros publicados del α y β colestano. (Reich, H.J. et al., J. Amer. Chem. Soc. 91, 7445 (1969); Balogh, B. et al., Nature 233, 261 (1971)). Ejemplo 2 Actividad Antimicrobiana de Escualamina

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Se ensay´ o escualamina in vitro contra varios organismos microbianos para evaluar su espectro de actividad.

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Se determinaron las concentraciones m´ınimas inhibidoras para las bacterias y levaduras mediante la incubaci´ on de 0,9-11 x 105 unidades formadoras de colonias/ml de organismo en fase logar´ıtmica, en caldo de tripticasa-soja (TSB) x 1/2 con concentraciones crecientes de muestra en placas de microvaloraci´on on m´ınima est´aticas 96-23ll (Corning, Inc., Corning, NY) a 37◦ C durante 18 a 24 horas. La concentraci´ inhibidora es la concentraci´ on de muestra a la que no se observ´ o crecimiento. La incubaci´on de control en ausencia de bacterias sirvi´ o para establecer un valor de l´ınea basal.

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Las concentraciones iniciales de muestra fueron de 2 mg/ml en acetato s´odico 250 mM, pH 6,6, HCl 11,2 mM, excepto en el caso del 3-sulfato de ´acido taurolitoc´ olico, que fue de 2 mg/ml en acetato s´ odico 50 mM, y de la escualamina, a la que no se a˜ nadi´ o HCl porque era a´cida despu´es de la u ´ ltima etapa de purificaci´ on. La espermidina HCl, el 3-sulfato de a´cido taurolitoc´ olico, la melitina, la holoturina y la ampicilina se adquierieron de Sigma (St, Louis, Missouri). El CHAPS (sulfonato de 3-[(3colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano dihidrato) se adquiri´ o de Aldrich (Milwaukee, Wisconsin). La conesina se adquiri´o de Aldrich Rare Chemicals Division (Milwaukee, Wisconsin). La magainina-II amida y la CPF-amida se fabricaron por Magainin Pharmaceuticals, Inc. (Plymouth Meeting, PA). El p´eptido CPF usado en el ensayo tiene la secuencia GFGSFLGKALKAALKIGANALGGSPQQ-NH2 . (Richter, K., et al., J. Biol. Chem. 261, 3676-3680 (1986).

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Se determin´ o la concentraci´ on m´ınima destructora (la concentraci´ on a la que se produce la destrucci´ on f´ısica del protozoo) para los protozoos, mediante la adici´ on de 15 ml de muestra (en acetato s´ odico como anteriormente) a 100 ml de caldo tripticasa-soja al 1% que conten´ıa P. caudatum (Nasco, Fort Atkinson, WI). Se observaron los organismos por microscop´ıa ´optica durante diez minutos.

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En la Tabla I se muestra la actividad de la escualamina en comparaci´ on con varias mol´eculas relacionadas distintas. TABLA I

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(Concentraci´ on M´ınima Inhibidora, µg/ml)

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ATCC N◦

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Tibur´ on CHAPS 3-Sulfato de ´acido taurolitoc´olico Espermidina Melitina Magainina II Ampicilina Conesina CPF Holoturina

E. coli (25922)

Staph. aureus (29213)

Pseudomonas aeruginosa (27853)

Strep. faecalis (29212)

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>500 >500 8-16 31-62 2-4 >500 8-16 >500

>500 >500 8-16 >250 1 >500 8-16 >500

>500 >500 16-31 31-62 62-125 >500 8-31 >500

>500 250-500 4-16 >250 500 31-62 >250

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ES 2 102 021 T3 TABLA I (continuaci´ on)

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ATCC N◦ Tibur´ on CHAPS 3-Sulfato de ´acido taurolitoc´olico Espermidina Melitina Magainina II Ampicilina Conesina CPF Holoturina

Candida albicans (14053)

Proteus vulgaris (13315)

Serratia marcescens (8100)

Paramecium caudatum

4-8 >500

4-8 >500

>125 >500

4-8 >260

>500 >500 16-31 125-250 >125 31-62 62-125 >500

>500 >500 16-31 125-250 8-16 >500 62-125 >500

>500 >500 >250 >250 4-62 >500 >125 >500

>260 >260 2-4 33-65 >65 16-33 4-8 130-260

Como se ve en la Tabla I, la escualamina se asemeja en potencia antibacteriana a la ampicilina y es algo m´as potente que los p´eptidos antimicrobianos de Xenopus contra la magainina II-amida y CPF (fragmento precursor de caerule´ına). La conesina, un alcaloide de origen vegetal, usado terap´euticamente como agente antipar´ asito, presenta actividad antif´ ungica (Candida) y anti-protozoos (Paramecium caudatum), pero carece de actividad antibacteriana, demostrando que la potente actividad antibi´ otica no es una propiedad trivial de todos los esteroides cati´onicos. La holoturina, un glic´ osido esteroideo de la holoturia (Burnell, D.J. et al., Marine Natural Products: Chemical and Biological Perspectives (ed Sceuer, P.J.) Vol. 5, 287-379 (1983)), presenta una modesta actividad contra los protozoos, pero carece de actividad antibacteriana o antif´ ungica, demostrando que los esteroides tensoactivos de la familia de las saponinas no son comparables a la escualamina en cuanto a la actividad biol´ ogica. La propia espermidina es inactiva como antibi´otico en el intervalo de concentraciones estudiado, como lo es la sal biliar ani´ onica 3-sulfato de a´cido taurolitoc´ olico, y el detergente esteroideo bipolar sint´etico CHAPS. Estos datos sugieren que la actividad biol´ ogica de la escualamina procede de la combinaci´ on sin´ergica de una sal biliar ani´ onica con espermidina, de las que cada una exhibe de forma independiente considerablemente menos actividad antibi´ otica que la escualamina. La importancia de la sustituci´ on amino sobre el anillo esteroideo de la escualamina para su actividad antibi´ otica, est´ a apoyada por estudios recientes. Se ha demostrado que la s´ıntesis de un a´cido biliar com´ un (por ejemplo, el a´cido desoxic´olico) que contiene un grupo b´ asico, imparte al esteroide una actividad antibi´ otica inesperada. (Bellini, A.M. et al., Eur. J. Med. Chem. - Chin. Ther. 18, 185-190 (1983); Bellini, A.M. et al., Eur. J. Med. Chem. - Chin. Ther. 18, 190-195 (1983); Bellini, A.M. et otico de estos ´acidos al., Arch. Pharm (Weinheim) 323, 201-205 (1990) La potencia y el espectro antibi´ biliares sustituidos con amino y sint´eticos, parece ser dependiente de la estructura del sistema de anillo y de la posici´on y naturaleza de los sustituyentes amino. En particular, la adici´ on de un sustituyente amino en la posici´ on C-3 del sistema de anillo del desoxicolato, parece potenciar notablemente la actividad antibi´ otica, aunque estos derivados presentan un espectro principalmente contra bacterias gram positivas. Las sustituciones amino tambi´en reducen dram´ aticamente la eliminaci´on hep´ atica de estos ´acidos biliares modificados de la corriente sangu´ınea y su secreci´on en la bilis (Anwer, M. S. et al., Am. J. Physiol. 249, G479-G488 (1985)), y ser´ıa de esperar que alteraran su biodistribuci´ on sist´emica en comparaci´on con las sales biliares. Ejemplo 3 Hemolisis

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A causa de su semejanza estructural con detergentes esteroideos, se ensay´ o la escualamina con respecto a su actividad hemol´ıtica contra eritrocitos humanos. nadi´ o a una suspensi´on al 10% (vol/vol) de eritrocitos humanos Cada muestra se diluy´ o en H2 O y se a˜ en soluci´ on salina tamponada con fosfato (PBS). Los eritrocitos se recogieron con heparina y se lavaron 7

ES 2 102 021 T3 una vez en 1 x PBS antes del ensayo. Se incubaron muestras a 37◦C durante diez minutos, se centrifuon de Triton X-100 garon a 12.000 x g durante un minuto y se midi´ o la DO350 del sobrenadante. La adici´ (concentraci´on final 0,1%) defini´ o un 100% de hemolisis. Los datos se presentan en la Figura 3. 5

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Aunque la escualamina presenta algo de actividad hemol´ıtica, ´esta se produce a concentraciones mayores que las observadas para un p´eptido anfip´ atico destructor de membranas no selectivo, tal como la melitina. Adem´ as, la escualamina ejerce actividad antibi´otica a concentraciones inferiores a las concentraciones en las que se observa la destrucci´ on de eritrocitos. En contraste, la actividad hemol´ıtica y antibi´ otica de la melitina cae dentro de un intervalo de concentraciones similar. As´ı pues, la escualamina presenta una selectividad relativa para c´elulas microbianas cuando se compra con la melitina, que act´ ua a trav´es de un mecanismo no selectivo de destrucci´on de membranas. Los resultados de los compuestos ensayados no incluidos en el gr´ afico de la Figura 3 son los siguientes: a 92 µg/ml, CPF mostr´o un 3% y la holoturina provoc´ o un 14% de hemolisis, mientras que el CHAPS y el 3-sulfato de a´cido taurolitoc´ olico, la ampicilina, la espermidina y la conesina provocaron < 0,5% de hemolisis. Ejemplo 4

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Distribuci´ on en los Tejidos Se determin´ o la distribuci´ on en los tejidos de la escualamina, mediante extracci´on de tejidos obtenidos recientemente de Squalus, usando el mismo procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 1 para la extracci´on del est´ omago. Se extrajeron, como se ha indicado anteriormente, otros tejidos de Squalus acanthias (aproximadamente 50 g de h´ıgado, ves´ıcula biliar, bazo, test´ıculos, branquias e intestino), y se o la actividad antimicrobiana en cada tejido y se purificaron a trav´es de la etapa de HPLC C18 . Se detect´ analiz´ o una fracci´ on de fase inversa de cada tejido por espectroscop´ıa de masas de FAB. Se determin´o la producci´ on del est´ omago rociando varias diluciones sobre una placa de TLC y comparando el marcaje con ninhidrina con una curva patr´ on de espermidina. Los resultados coincidieron con la estimaci´ on obtenida por espectroscop´ıa de RMN cuando se compar´ o la intensidad de la se˜ nal de escualamina con la de un patr´ on. Se hizo una estimaci´on de la producci´ on de escualamina de otros tejidos comparando la actividad antimicrobiana de fracciones de fase inversa con la actividad procedente del est´omago. Pudo detectarse escualamina en muchos tejidos del tibur´ on.

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El h´ıgado y la ves´ıcula biliar, los o´rganos en los que se sintetizan y almacenan las sales biliares para la secreci´on en el tracto GI, son las fuentes m´ as ricas identificadas (aproximadamente 4-7 µg/g). Sin embargo, el bazo y los test´ıculos de este animal tambi´en son fuentes relativamente ricas de escualamina (aproximadamente 2 µg/g cada uno). El est´ omago (1 µg/g), las branquias (0,5 µg/g) y el intestino (0,02 µg/g) produjeron menores cantidades. Ejemplo 5 Resistencia T´ermica y a Proteasas

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Se hirvi´ o escualamina a 0,2 µg/ml en soluci´ on salina tamponada con fosfato x 1 durante quince minutos. Se aplic´ o una al´ıcuota de 2 µl de la muestra antes y despu´es de la ebullici´on a un cultivo de E. coli D31 . La escualamina retuvo su actividad antimicrobiana despu´es de la ebullici´on. 50

Se a˜ nadi´ o proteinasa K (concentraci´ on final 2 mg/ml) a 0,2 µg/µl de escualamina o a 0,8 µg/µl de magainina II amida en soluci´ on salina tamponada con fosfato x 1. Despu´es de una hora de incubaci´on a o toda su 37◦C, se aplicaron 2 µl de cada muestra al cultivo de E. coli D31. La Magainina-II amida perdi´ actividad tras la digesti´ on con la proteinasa K, pero la escualamina retuvo su actividad.

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ES 2 102 021 T3 REIVINDICACIONES

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1. Una composici´on del compuesto 24-sulfato de 3β-[3-[4-amino-n-but-1-ilamino]-n-prop-1-ilamino]7α,24ζ-dihidroxi-5α-colestano, composici´on que tiene una pureza mayor del 95%, como se muestra por cromatograf´ıa de capa fina y RMN. 2. Una sal farmac´euticamente aceptable del compuesto 24-sulfato de 3β-[3-[4-amino-n-but-1-ilamino]n-prop-1-ilamino]-7α,24ζ-dihidroxi-5α-colestano.

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3. Una composici´on farmac´eutica que comprende el compuesto 24-sulfato de 3β-[3-[4-amino-n-but1-ilamino]-n-prop-1-ilamino]-7α,24ζ-dihidroxi-5α-colestano o una sal farmac´euticamente aceptable del mismo, y uno o m´ as veh´ıculos o diluyentes farmac´euticamente aceptables. 4. 24-Sulfato de 3β-[3-[4-amino-n-but-1-ilamino]-n-prop-1-ilamino]-7α,24ζ-dihidroxi-5α-colestano para uso en medicina. 5. Uso de 24-sulfato de 3β-[3-[4-amino-n-but-1-ilamino]-n-prop-1-ilamino]-7α,24ζ-dihidroxi-5α-colestano en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de infecciones microbianas en seres humanos o en animales no humanos.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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