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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 188 140 kInt. Cl. : A61K 38/17, C12N 5/00

11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

A61K 48/00, //A61K 47:48 A61K 38:17, A61K 38:18 A61K 38:17, A61K 38:19 A61P 43/00

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 99910331.0 kFecha de presentaci´on: 05.03.1999 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 1 059 931 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 20.12.2000

T3

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54 T´ıtulo: Utilizaci´ on del factor de crecimiento de monocitos CD137 o un an´ alogo funcional del mismo

para producir un medicamento.

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73 Titular/es: MERCKLE GmbH

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72 Inventor/es: Schwarz, Herbert y

30 Prioridad: 15.07.1998 EP 98103859

Graf-Arco-Strasse 3 D-89079 Ulm, DE

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

ES 2 188 140 T3

16.06.2003

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.06.2003

Aviso:

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Langstein, Joachim

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74 Agente: Gil Vega, V´ıctor

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 188 140 T3 DESCRIPCION Utilizaci´on del factor de crecimiento de monocitos CD137 o un an´ alogo funcional del mismo para producir un medicamento. 5

La presente invenci´on se refiere a la utilizaci´on del factor de crecimiento de monocitos CD137 para fomentar la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos, y en particular a la utilizaci´on de CD137 para el tratamiento de diferentes estados patol´ ogicos para los que se puede aplicar una terapia nueva mediante el efecto estimulador de proliferaci´on de CD137.

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Los monocitos perif´ericos de la sangre y los macr´ofagos procedentes de ´estos de cavidades corporales y tejidos son componentes del sistema fagocitario mononuclear del cuerpo. En particular, los monocitos y macr´ofagos representan c´elulas efectoras del sistema defensivo inmunol´ ogico del cuerpo. Los monocitos se desarrollan a trav´es de varias etapas intermedias a partir de las c´elulas madre hematopoy´eticas en la m´edula o´sea. Circulan en la sangre durante un per´ıodo de aproximadamente 20 a 30 horas. Desde ah´ı migran a los diferentes ´organos y sistemas h´ısticos, donde se desarrollan en macr´ ofagos espec´ıficos del sitio. En este proceso son marcados por el tejido adyacente y desarrollan funciones adicionales. Por ello, en funci´ on del tipo de tejido, se distingue por ejemplo entre macr´ ofagos del pulm´ on (macr´ ofagos alveolares), de la cavidad abdominal (macr´ofagos peritoneales), del bazo (macr´ ofagos espl´enicos), del h´ıgado (c´elulas de Kupffer), de las articulaciones, del hueso (osteoclastos), del tejido conjuntivo, del cerebro y de los ri˜ nones.

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Los monocitos y macr´ ofagos poseen una posici´on central en el marco de las reacciones de inflamaci´ on que se desarrollan en el cuerpo. En tejido no inflamado, el objetivo de los macr´ofagos consiste en la eliminaci´ on de c´elulas envejecidas. Adem´as, producen una gran cantidad de factores solubles importantes para la comunicaci´ on dentro del sistema inmunitario. Sin embargo, si las c´elulas est´an implicadas en un proceso de inflamaci´ on, se encuentran en un estado activado con propiedades fenot´ıpicas y funcionales muy diferentes. En ese caso desempe˜ nan importantes funciones de efector que influyen en la evoluci´ on de la enfermedad. Entre ´estas se encuentran la fagocitosis y la destrucci´ on intracelular de microorganismos, inmunocomplejos y c´elulas da˜ nadas, pero tambi´en las reacciones de citotoxicidad dependientes e independientes de anticuerpos contra c´elulas tumorales, par´ asitos y c´elulas infectadas por virus. Adem´ as, los monocitos y macr´ ofagos representan un papel central en la inducci´ on y regulaci´ on de la respuesta inmune, ya que adem´ as se trata de c´elulas con una alta actividad secretora que influyen en la respuesta inmune mediante el incremento de la liberaci´ on de citoquinas. La CD137 es un miembro de la familia de receptores de factor de necrosis tumoral y tambi´en se la conoce por las denominaciones ILA o 4-1BB (hom´ologo del rat´ on) (Kwon, B.S., et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:1963, 1989; Schwarz H. et al., Gene 134:295, 1993; Alderson, M. R. et al., Eur J Immunol 24:2219, 1994). La CD137 es expresada por linfocitos y monocitos activados, dependiendo la expresi´ on por c´elulas primarias de una activaci´ on (Schwarz H. et al., Blood 85:1043, 1995). Por ejemplo, la expresi´on de CD137 se puede inducir r´ apidamente mediante activaci´ on de linfocitos T con fitohemoaglutinina (PHA) o forbol-12-miristato-13-acetato (PMA). En los monocitos, la CD137 se puede inducir mediante activaci´ on con lipopolisac´ arido (LPS), IL-1β y PMA. En los linfocitos B, la expresi´on de CD137 se induce mediante anticuerpos contra inmunoglobulina de superficie celular o TMA y mediante transformaci´ on con EBV (virus de Epstein Barr). En c´elulas no linfoides (en particular condrocitos), la CD137 se puede inducir con intensidad mediante la citoquina proinflamatoria citoquina IL-1β. Mediante corte y empalme diferencial se generan formas solubles de CD137, que se pueden detectar en concentraciones elevadas en sueros de pacientes con artritis reumatoide (Michel, J., et al., Eur J Immunol 28:290, 1998). El gen para la CD137 humano se encuentra en el cromosoma 1p36 en un gen emparentado con agrupaci´ on (Schwarz, H., et al., Biochem Biophys Res Com 235:699, 1997). El documento WO-A-94/26290 describe el receptor de superficie celular 4-1BB y el ligando correspondiente del mismo.

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El documento EP-A-0 426 458 describe un factor de crecimiento que se obtiene a partir de la l´ınea celular de tumor de h´ıgado humano T3M-30Lu y estimula la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos, as´ı como su utilizaci´on para estimular la defensa inmunitaria.

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Tambi´en se sabe que la prote´ına CD137 recombinante en forma inmovilizada provoca una activaci´ on de monocitos. El resultado de esta activaci´ on es una expresi´on intensificada de citoquinas proinflamatorias, una inhibici´ on de la citoquina antiinflamatoria IL-10 y la inducci´ on de marcas de activaci´on, como ICAM (Langstein J. et al., J Immunol 160-2488, 1998). En dicho documento no se describe ning´ un efecto prolongador de la vida o estimulador de la proliferaci´ on en monocitos. 2

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Como ya se ha mencionado m´as arriba, los monocitos poseen una funci´ on clave en el marco de la respuesta inmune y tienen una importancia esencial en la generaci´ on de reacciones inmunes benignas contra tumores y pat´ ogenos. Atra´ıdos por se˜ nales, como por ejemplo de citoquinas, migran de la circulaci´ on sangu´ınea hacia el lugar de la inflamaci´ on. Una acumulaci´ on de monocitos y macr´ofagos es una se˜ nal caracter´ıstica de las inflamaciones cr´onicas. Esta acumulaci´ on es estimulada adem´as por citoquinas liberadas en el lugar de la inflamaci´ on, como por ejemplo factor estimulador del desarrollo colonias de macr´ofagos (M-CSF), factor estimulador del desarrollo de colonias de granulocitos-macr´ ofagos (GM-CSF) e interleucina 3 (IL-23), que tienen efectos favorables sobre la supervivencia de monocitos y macr´ofagos (Young, D. A., J. Immunol 145:607, 1990; Xing, Z., et al., Am J Respir Cell Mol Biol 6:212, 1992; Bratton, D. L., et al., J Clin Invest 95:211, 1995). Hasta ahora se supon´ıa que los monocitos y macr´ofagos perif´ericos no estaban capacitados para la proliferaci´ on, es decir, para la multiplicaci´ on (v´ease Xing, Z. et al., Supra; van Furth, R., et al., Blood 54-485, 1979).

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A partir de lo anteriormente expuesto se puede observar que el tratamiento de numerosas enfermedades, como por ejemplo tumores, infecciones por bacterias, hongos o virus, se podr´ıa mejorar de forma notable si, mediante la multiplicaci´on de monocitos/macr´ ofagos, se pudiera provocar un aumento de la fagocitosis y la destrucci´ on intracelular de microorganismos, inmunocomplejos y c´elulas da˜ nadas, y tambi´en mejorar las reacciones de citotoxicidad dependientes e independientes de anticuerpos contra c´elulas tumorales, microorganismos y c´elulas infectadas por ´estos.

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Tambi´en es sabido que diferentes formas de tratamiento terap´eutico, como por ejemplo la quimioterapia o la radioterapia de pacientes de c´ ancer, as´ı como la administraci´on de inmunosupresores, reducen dr´ asticamente la cantidad de monocitos y macr´ofagos. Una vez finalizados los procesos terap´euticos de este tipo, en general es deseable aumentar la cantidad de monocitos/macr´ofagos de nuevo a los valores normales y, por lo tanto, estabilizar de nuevo el sistema inmunitario del paciente.

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Por consiguiente, un objetivo de la presente invenci´ on consiste en poner a disposici´on un m´etodo que posibilite el aumento selectivo de la cantidad de monocitos perif´ericos y, por lo tanto, la cantidad de macr´ofagos para permitir un mejor tratamiento terap´eutico de estados patol´ogicos asociados con una cantidad insuficiente de monocitos/macr´ofagos.

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Este objetivo se pudo resolver sorprendentemente partiendo de la comprobaci´ on de que la prote´ına de superficie celular CD137, conocida en s´ı, y an´ alogos funcionales de la misma, en contra de las suposiciones existentes hasta el momento, inducen la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos independientemente de las c´elulas madre hematopoy´eticas. De forma sorprendente, esto supone el acceso a numerosas posibilidades nuevas de aplicaci´on terap´eutica de la CD137. A continuaci´ on se explican m´as detalladamente formas de realizaci´ on especiales de la presente in´ venci´on con referencia a las figuras adjuntas. Estas muestran: Figura 1: (A) la secuencia de ADNc y la secuencia de amino´ acidos de CD137 humana derivada de ´esta. Tanto el p´eptido se˜ nal (posici´ on +1 a +17) como el dominio de transmembrana (posici´ on +187 hasta +213) est´ an subrayados. Los sitios de glicosilaci´on potenciales est´ an marcados con asteriscos; tambi´en se indican sitios de fosforilaci´ on potenciales (posici´ on +242 para la prote´ına quinasa C; posiciones +234 y +235 para la case´ına quinasa II); la se˜ nal de poliadenilaci´ on se indica en negrilla; (B) una alineaci´ on de las secuencias de amino´ acidos de CD137 humana y murina; los amino´ acidos id´enticos est´an representados mediante l´ıneas verticales; los amino´acidos con alta, escasa o ninguna similitud est´ an indicados con dos puntos, punto o en blanco, respectivamente. Figura 2: La inducci´on de apoptosis de monocitos mediante CD137.

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Figura 3: (A) la inducci´ on de la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos mediante prote´ına CD137-Fc on de colonias de monocitos inmovilizada a base de la incorporaci´on de la 3 H-timidina; la formaci´ inducida por CD137. Figura 4: La influencia de M-CSF y GM-CSF sobre la proliferaci´ on de monocitos inducida por CD137; (A) cultivo de monocitos perif´ericos sobre prote´ına Fc o CD137-Fc en ausencia o en presencia de anticuerpos neutralizantes contra M-CSF, GM-CSF y/o IL-3; (B) mediante M-CSF y GM-CSF no se induce ninguna proliferaci´ on de monocitos; en cada caso se representa la incorporaci´on de 3 H-timidina.

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ES 2 188 140 T3 Figura 5: La inducci´on de (A) crecimiento y (B) proliferaci´on de monocitos mediante residuo condicionado de cultivos celulares cultivados con prote´ına CD137-Fc.

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Figura 6: Una comparaci´ on de la inducci´ on de proliferaci´on de monocitos mediante CD137-Fc soluble (sCD137-Fc) y CD137-Fc inmovilizada; como control se indican Fc inmovilizada, Fc soluble (sFc) as´ı como el soporte no tratado. Figura 7: Ensayos para la inducci´ on de la proliferaci´ on de monocitos con Fc, CD137-Fc, TNFR-Fc y anti-CD68

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Figura 8: Ensayos para la inducci´ on de la proliferaci´ on de monocitos con Fc (barras claras) o CD137-Fc (barras negras) combinada con LPS o M-CSF. Figura 9: Una fotograf´ıa de monocitos perif´ericos (A) cultivados sobre Fc o CD137-Fc inmovilizada, ampliaci´ on 400x; (B) despu´es de 10 d´ıas de cultivo sobre CD137-Fc inmovilizada, ampliaci´on 500x.

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Figura 10: En la mitad izquierda del gr´ afico, la expresi´on de M-CSF por monocitos despu´es de 1 a 8 d´ıas de cultivo sobre Fc inmovilizada (barras blancas) o CD137-Fc inmovilizada (barras negras); y en la mitad derecha del gr´ afico la expresi´on de M-CSF en presencia de Fc soluble o CD137-Fc soluble despu´es de 8 d´ıas de cultivo. Figura 11: La cantidad de monocitos vivos despu´es de la neutralizaci´on de M-CSF; se indica la cantidad de monocitos vivos tratados con Fc (c´ırculos) o CD137-Fc (cuadrados) o con 100 ng/ml de M-CSF (tri´ angulos) sin adici´ on (s´ımbolos claros) o despu´es de la adici´ on (s´ımbolos negros) de 2 µg/ml de anticuerpo anti-M-CSF neutralizante. Figura 12: Monocitos despu´es de 8 d´ıas de cultivo, mostrados con una ampliaci´on 300x, en presencia de prote´ına Fc o CD137-Fc soluble o inmovilizada (1 µg/ml en cada caso). El aislamiento, la secuenciaci´ on y la caracterizaci´on de CD137 humana fueron descritos por primera vez por Schwarz, H., et al., en Gene (1993), 134, 295, documento al que se hace referencia aqu´ı de forma expresa. Tal como ya se ha mencionado, la invenci´on se refiere a la utilizaci´on de CD137 y “an´ alogos funcionales” de la misma. Los an´alogos funcionales en el sentido de la presente invenci´ on son en particular variantes, derivados, formas solubles y formas multim´ericas de CD137 que, a pesar de su diferencia con la forma nativa de la CD137, poseen la actividad biol´ ogica deseada seg´ un la invenci´on y, por lo tanto, se pueden utilizar para los fines mencionados. En particular, los an´ alogos funcionales seg´ un la invenci´ on han de tener la capacidad de unirse a las c´elulas diana, es decir, a los monocitos perif´ericos, para poder inducir as´ı la proliferaci´on de monocitos. Las variantes de CD137 incluyen, por ejemplo, prote´ınas obtenibles mediante una o m´as sustituciones, deleciones, adiciones, inserciones y/o inversiones de amino´acidos partiendo de la secuencia representada en la Figura 1A. Las variantes de CD137 seg´ un la invenci´ on deber´ıan coincidir en aproximadamente un 60 a un 100 %, por ejemplo entre aproximadamente un 80 y un 100 %, con la secuencia de amino´acidos seg´ un la Figura 1A. Las modificaciones de la secuencia de amino´acidos nativa se pueden llevar a cabo de forma conocida en s´ı, por ejemplo mediante mutaci´on de los nucle´otidos correspondientes en la secuencia de nucle´otidos. Por ejemplo, se pueden sustituir entre s´ı: amino´ acidos con un resto alif´atico similar, como isoleucina, valina, leucina y alanina; restos con un grupo lateral polar similar, como lisina y arginina; como glutamina y asparagina; o ´acido glut´ amico y a´cido asp´ artico. Los an´alogos funcionales incluyen adem´ as formas de CD137 no glicosiladas o glicosiladas de modo diferente. Se puede influir en el patr´ on de glicosilaci´on por ejemplo mediante elecci´on selectiva del sistema de expresi´ on en caso de producci´on recombinante de CD137. Tambi´en existe la posibilidad de modificar selectivamente la secuencia de amino´acidos en el ´area de sitios potenciales de N-glicosilaci´on de tal modo que no se produzca ninguna glicosilaci´on. Los an´alogos funcionales tambi´en incluyen variantes naturales de CD137 que se producen por ejemplo por corte y empalme de ARNm alternativo o por disociaci´on proteol´ıtica de CD137, pudiendo presentar secuencias de amino´acidos acortadas N-terminales o C-terminales. Tambi´en se pueden obtener variantes mediante la deleci´on selectiva de amino´acidos o secuencias de amino´acidos terminales o interiores que no tienen importancia para la funci´ on biol´ogica deseada. Por ejemplo, tambi´en se pueden someter a deleci´on o sustituir de forma selectiva restos de ciste´ına para evitar la formaci´ on de puentes de disulfuro intermoleculares falsos. Los derivados de CD137 pueden contener uno o m´ as restos qu´ımicos unidos mediante 4

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modificaci´on qu´ımica o enzim´atica a trav´es de grupos laterales funcionales de restos de amino´ acidos. Se pueden obtener derivados de CD137 mediante derivaci´ on de grupos funcionales en cadenas laterales de amino´acidos o en el t´ermino N o el t´ermino C de la prote´ına. Por ejemplo, se pueden incorporar de forma conocida en s´ı grupos glicosilo, grupos acilo, restos de l´ıpido, grupos fosfato, restos de pol´ımero, como por ejemplo cadenas laterales de polietil´en-glicol. Una forma especial de la derivaci´on consiste en el enlace N-terminal o C-terminal con otra secuencia de amino´acidos. Las prote´ınas funcionales de este tipo se pueden producir tanto de forma qu´ımica como de forma recombinante.

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´ Los an´alogos seg´ un la invenci´ on incluyen adem´ as formas solubles de CD137. Estas incluyen el dominio extracelular de la prote´ına total o parcialmente, mientras que los dominios de transmembrana est´an parcial o totalmente delecionados. Adem´as, estas formas no presentan la parte citoplasm´ atica C-terminal de la secuencia. Seg´ un la invenci´ on, las formas solubles de CD137 son especialmente ventajosas en caso de utilizaciones in vivo, dado que de este modo por ejemplo se simplifica notablemente la administraci´ on intravenosa de un preparado farmac´eutico. Una forma soluble preferente de la CD137 es un polip´eptido con los restos de amino´ acidos +18 a +186 seg´ un la Figura 1A. La invenci´ on tambi´en abarca otros an´ alogos en forma de fragmentos funcionales solubles o insolubles, es decir, secuencias parciales o secuencias parciales compuestas de la forma nativa de la CD137.

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Las formas solubles de CD137 seg´ un la invenci´ on se pueden producir de forma conocida en s´ı. Por ejemplo, se puede llevar a cabo una producci´ on recombinante partiendo del fragmento de ADN correspondientemente acortado. Tambi´en existe la posibilidad de producir formas de CD137 acortadas mediante digesti´on selectiva con proteasa. 25

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Los an´alogos funcionales del polip´eptido descrito en concreto en la Figura 1A utilizables seg´ un la invenci´on incluyen adem´ as polip´eptidos equivalentes funcionales aislables de otros mam´ıferos o de otros sistemas celulares del mismo mam´ıfero. Un equivalente funcional en este sentido es, por ejemplo, el factor aislado de ratones con la denominaci´ on 4-1BB, descrito en el documento US 5,674,704, as´ı como los an´ alogos funcionales derivados a su vez de ´este, como por ejemplo fragmentos del mismo. La CD137 y sus an´alogos funcionales arriba descritos se pueden utilizar seg´ un la invenci´ on tanto en forma monom´erica como en forma multim´erica.

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En caso de una utilizaci´ on en forma monom´erica es especialmente conveniente que la prote´ına est´e inmovilizada. La inmovilizaci´ on puede tener lugar de forma conocida en s´ı en una matriz de soporte. Esta matriz de soporte puede ser por ejemplo la superficie de un recipiente de cultivo en el que se puede cultivar un sistema celular con contenido de monocitos. Otra matriz de soporte adecuada puede consistir por ejemplo en part´ıculas polim´ericas que se pueden suspender en un sistema de cultivo con contenido de monocitos.

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El especialista puede determinar f´ acilmente mediante pocos ensayos preliminares la cantidad ´optima ´ de mol´eculas inmovilizadas por unidad de superficie. Esta puede ser por ejemplo entre 1011 y 1017 mol´eculas de CD137 o de los an´ alogos funcionales de ´esta por cent´ımetro cuadrado, en particular entre aproximadamente 1013 y 1014 , como por ejemplo aproximadamente 6*1013.

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La inmovilizaci´on puede tener lugar mediante cualquier m´etodo habitual conocido por los especialistas, siempre que ello no influya o apenas influya negativamente en la actividad biol´ ogica deseada de la mol´ecula de CD137 inmovilizada. La inmovilizaci´on puede tener lugar por ejemplo mediante adsorci´ on de la mol´ecula en un soporte o mediante enlace covalente con el soporte, por ejemplo utilizando mol´eculas de engarce difuncionales que se unen, por ejemplo, a trav´es de grupos funcionales de restos de amino´ acidos. En este contexto se pueden formar puentes de amida, diazo, isocianato o disulfuro entre el engarce y la CD137 (v´ease, por ejemplo, Vitetta, et al., 1987, Science 238, 1098; Pastan, et al., 1986, Cell, 47, 641; o Thorpe, et al., 1987, Cancer Res, 47, 5924).

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Otra posibilidad de inmovilizaci´ on consiste en la expresi´on de CD137 sobre la superficie de c´elulas transformadas con ADN codificador de CD137, como por ejemplo c´elulas CHO. 60

Tambi´en existe la posibilidad de modificar de forma selectiva la secuencia de amino´acidos de CD137 para facilitar la inmovilizaci´ on. Estas modificaciones son por ejemplo los, as´ı llamados, “tags” que act´ uan como anclaje, como por ejemplo la modificaci´on conocida como anclaje de hexahistidina, o ep´ıtopos que pueden ser reconocidos como ant´ıgenos de anticuerpos (descritos por ejemplo en Harlow, E. y Lane, D., 5

ES 2 188 140 T3 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Estos anclajes pueden servir para la sujeci´ on de CD137 a un soporte fijo, como por ejemplo una matriz polim´erica presente por ejemplo en una columna de cromatograf´ıa, una placa de microtitulaci´ on o un recipiente de cultivo. 5

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Una forma de realizaci´ on especialmente adecuada de un an´ alogo funcional de CD137 adecuado para la inmovilizaci´on consiste en una prote´ına de fusi´ on del dominio extracelular de CD137 y la parte Fc de una mol´ecula de IgG. Las mol´eculas de fusi´ on de este tipo se puede inmovilizar de forma especialmente ventajosa en soportes que tienen unida prote´ına A o un anticuerpo anti-Fc. La producci´ on de CD137-Fc se describe en Schwarz, H. et al., Blood, 87, 7 (1996), 2839-2845, documento al que se hace referencia aqu´ı de forma expresa. Los agregados multim´ericos de CD137 utilizables seg´ un la invenci´ on incluyen preferentemente entre 2 y 5 mol´eculas de CD137 o an´ alogos funcionales de ´esta. La agregaci´on de las mol´eculas pept´ıdicas individuales ha de tener lugar de modo que no se impida su uni´ on con monocitos. Preferentemente se producen agregados de CD137 multim´ericos a partir de las mol´eculas de fusi´ on arriba descritas, que abarcan los dominios extracelulares de CD137 y la parte Fc de una mol´ecula de IgG. La dimerizaci´on puede tener lugar por ejemplo mediante reticulaci´ on con un anticuerpo anti-Fc. De este modo se obtiene un agregado dim´erico de CD137. Tambi´en se puede lograr una dimerizaci´on mediante la formaci´ on de puentes de disulfuro entre la parte Fc de dos mol´eculas de prote´ına de fusi´ on. La dimerizaci´on tambi´en se puede llevar a cabo utilizando engarces qu´ımicos bifuncionales, como por ejemplo engarces con grupos sulfidrilo terminales, como ditio-bis-(succinimidil)-propionato, N-succinimidil-3(2-piridil-ditio)-propionato, o carbodiimidas reactivas, como por ejemplo clorohidrato de 1-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida. Los multim´ericos superiores, como por ejemplo mol´eculas con cinco unidades de CD137, se pueden obtener a partir de las mol´eculas de IgG pentam´ericas de la parte Fc y del dominio extracelular de CD137. Un primer objeto de la invenci´ on se refiere a la utilizaci´on de la prote´ına de superficie celular CD137 denominada factor de crecimiento de monocitos, producida por linfocitos T activados, o de un an´ alogo funcional de la misma para la producci´ on de un medicamento para la estimulaci´ on de la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos, en caso dado tambi´en de c´elulas progenitoras y/o precursoras (v´ease m´as abajo), de un mam´ıfero. Una “estimulaci´on” de la proliferaci´on de monocitos en el sentido de la invenci´on incluye tanto la inducci´on de la proliferaci´ on de monocitos no proliferantes como el apoyo adicional de monocitos ya en proliferaci´ on. Los monocitos perif´ericos son un componente del sistema sangu´ıneo perif´erico. En el adulto se encuentran en una concentraci´ on entre 80 y 540 y en el ni˜ no en una concentraci´ on entre 80 y 720 c´elulas por µl de sangre bajo condiciones fisiol´ogicas. Como es sabido, diversos estados patol´ ogicos est´an asociados con una reducci´ on de la cantidad de monocitos y/o c´elulas derivadas de ellos, en particular macr´ ofagos de diferente especificidad h´ıstica (v´ease m´as arriba). A partir de las funciones fisiol´ ogicas conocidas de monocitos y c´elulas derivadas de ellos se puede deducir que un aumento de la cantidad de monocitos, por ejemplo de un valor en el rango fisiol´ ogico inferior a un valor fisiol´ ogico superior, mediante un aumento de la proliferaci´on tambi´en podr´ıa resultar terap´euticamente u ´ til. Tambi´en se puede pensar que mediante una inducci´ on artificial de una monocitosis (aumento de la cantidad de monocitos en la sangre a valores superiores a 540 c´elulas por µl de sangre) se puede apoyar el sistema defensivo monocitario del cuerpo en la defensa de infecciones. Por consiguiente, otro objeto de la presente invenci´on se refiere a la utilizaci´on de CD137 o un an´ alogo funcional del mismo para producir un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con un trastorno de un sistema celular que incluye monocitos y/o c´elulas derivadas de ellos y/o progenitores y/o precursores de ellos, en particular monocitos y/o c´elulas derivadas de ellos, como macr´ofagos (v´ease la representaci´on esquem´atica del sistema hematopoy´etico en Concepts of Gene Therapy, (1997) Editorial Walter de Gruyter Berlin, Strauss, M. y Barrager, J. A. (Editores), p. 236, tab. 12.1, documento al que se hace referencia aqu´ı de forma expresa); o cuya formaci´on y/o evoluci´ on se puede tratar terap´euticamente mediante la estimulaci´on de la proliferaci´ on de c´elulas de dicho sistema celular.

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Un trastorno en el sentido arriba indicado puede incluir un perjuicio cong´enito o adquirido, permanente o transitorio, parcial o completo de una o m´ as funciones fisiol´ ogicas de las c´elulas corporales afectadas. 60

Por ejemplo, un sistema celular de este tipo es el, as´ı llamado, sistema celular mieloico, cuyas c´elulas se derivan de c´elulas progenitoras de la m´edula o´sea. Los granulocitos y monocitos son componentes t´ıpicos de este sistema. 6

ES 2 188 140 T3 La utilizaci´on seg´ un la invenci´ on est´ a especialmente indicada cuando dicho trastorno abarca un trastorno funcional o una reducci´ on de la cantidad de monocitos por debajo de una concentraci´ on de 80 c´elulas por cada µl de sangre, y/o una reducci´ on de c´elulas derivadas de ´estas. 5

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Un primer campo de aplicaci´ on preferente para la CD137 consiste en las enfermedades que forman parte de las lesiones del sistema hematopoy´etico condicionadas por quimioterapia o radioterapia. La quimioterapia y la radioterapia se aplican frecuentemente para el tratamiento de las m´ as diversas enfermedades tumorales, o en el marco de una terapia mielosupresora o mieloablativa para la preparaci´ on de trasplantes de m´edula o´sea o de ´organos. Con frecuencia, esto tiene como resultado una leucopenia y, asociada con ´esta, una reducci´on de la cantidad de monocitos. La morbilidad y la mortalidad de los pacientes aumenta considerablemente a causa de una mayor susceptibilidad a las infecciones. Mediante la administraci´on seg´ un la invenci´ on de CD137 o monocitos tratados con CD137 se podr´ıa mitigar o eliminar la leucopenia de modo m´ as eficaz. Otro campo de aplicaci´ on se refiere a la utilizaci´on de CD137 o an´ alogos funcionales para el tratamiento de trastornos de cicatrizaci´ on tales como los observados, por ejemplo, en pacientes de di´alisis, diab´eticos o pacientes con insuficiencia venosa cr´onica. En este caso se trata de trastornos de cicatrizaci´on resultantes de un tejido de granulaci´ on que est´ a presente en una medida insuficiente o que funciona de forma insuficiente y que consiste principalmente en macr´ofagos (es decir, monocitos diferenciados).

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Otro objeto de la invenci´ on se refiere a la utilizaci´on de CD137 o un an´ alogo funcional del mismo para producir un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con una respuesta inmune insuficiente. Como ejemplos de este tipo de enfermedades se mencionan: 25

a) Enfermedades tumorales favorecidas por una actividad citot´ oxica insuficiente o inexistente del sistema defensivo end´ ogeno. b) Infecciones bacterianas, virales y f´ ungicas favorecidas por una fagocitosis insuficiente o inexistente del pat´ ogeno o de c´elulas corporales infectadas por ´este.

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Tambi´en se posibilita el tratamiento de: c) lesiones o enfermedades cong´enitas o no cong´enitas, hereditarias o no hereditarias, del sistema inmunitario; y

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d) lesiones inducidas por tratamiento con inmunosupresores, como las que pueden producirse, por ejemplo, durante el tratamiento de pacientes con poliartritis cr´ onica o enfermedades autoinmunes o de pacientes de trasplantes. Tal como se explica m´as detalladamente en una secci´on posterior, el medicamento seg´ un la invenci´ on se puede utilizar en el marco de un tratamiento in vivo o ex vivo. Seg´ un otra forma de realizaci´on de la invenci´ on, tambi´en se puede utilizar CD137 o un an´ alogo funcional de ´esta en combinaci´on con como m´ınimo otro factor seleccionado entre interleucinas, linfocinas, monocinas, interferones, factores estimuladores del desarrollo de colonias y factores de crecimiento. Como ejemplos no limitativos se mencionan: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, EGF, TGF, PDGF, ILGF, MGF, EPO, G-CSF, GM-CSF y M-CSF, siendo preferentes los factores estimuladores de leucocitos, como G-CSM, GM-CSF y sobre todo M-CSF. La CD137 y el otro factor se pueden administrar de forma simult´ anea o desfasada cronol´ogicamente en cualquier orden. Es concebible una utilizaci´on combinada con factores inhibidores de apoptosis. Posiblemente, el MCSF tenga un efecto inhibidor de este tipo sobre la apoptosis de monocitos.

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Para la utilizaci´on en el marco de la presente invenci´on es adecuada la CD137 humana fundamentalmente en su forma nativa, es decir, como prote´ına con una secuencia de amino´acidos desde el resto +18 hasta el resto +255 en la secuencia seg´ un la Figura 1A o un an´ alogo funcional de esta secuencia. Sin embargo, preferentemente se utiliza el dominio extracelular de la CD137 humana correspondiente a los amino´ acidos +18 a +186 seg´ un la Figura 1A o un an´ alogo funcional del mismo. En una forma de realizaci´ on preferente de la invenci´ on se utiliza CD137 o su an´alogo funcional en forma inmovilizada o como agregado multim´erico. Un agregado de CD137 multim´erico preferente abarca 7

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de 2 a 5 mol´eculas prote´ınicas de CD137 o an´ alogos funcionales de ellas. Otro objeto de la invenci´ on consiste en un procedimiento in vitro o ex vivo para estimular la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos, en el que monocitos perif´ericos de la sangre de un mam´ıfero se ponen en contacto en un medio nutritivo con CD137 libre o inmovilizada, principalmente CD137 inmovilizada, y se incuban hasta que la cantidad de monocitos aumente preferentemente hasta su valor m´ aximo y/o hasta que se pueda observar un aumento de los monocitos.

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El aislamiento de monocitos de la sangre de un mam´ıfero se puede llevar a cabo mediante m´etodos est´andar habituales en general. La fracci´ on celular aislada puede ser una fracci´ on de monocitos pura o puede contener c´elulas que no influyan negativamente en el tratamiento de los monocitos y el posterior tratamiento del mam´ıfero con los monocitos estimulados. Por ejemplo, durante la fase de incubaci´on in vitro, junto a los monocitos puede haber por ejemplo linfocitos. Por ejemplo en los documentos de Meyskens, F. L., et al., Exp. Hematol. 1979, 7(8), 401-410; Weiner, R. S., et al., J. Immunol. Methods, 1980, 36(2), 89-97; y Contreras, T. J., et al., Cell. Immunol., 1980, 54(1), 215-229, se describen m´etodos adecuados para el aislamiento de monocitos.

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Un ejemplo no limitativo de un medio nutritivo adecuado para un cultivo in vivo o ex vivo consiste en medio RPMI suplido con un 5 % de suero bovino fetal. Una vez finalizado el cultivo es conveniente lavar la fracci´on de monocitos tratada, por ejemplo con PBS, antes de administr´ arsela de nuevo al mam´ıfero a tratar.

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Otro campo de aplicaci´ on para la CD137 o un an´ alogo funcional consiste en un procedimiento para el tratamiento regenerativo de pacientes de quimioterapia o radioterapia, en el que: 25

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a) antes de la realizaci´on de la quimioterapia o radioterapia se a´ısla una fracci´on con contenido de monocitos perif´ericos de la sangre del paciente, dicha fracci´on se incuba ex vivo con CD137 libre o inmovilizada, principalmente CD137 inmovilizada, hasta que la cantidad de monocitos aumenta o llega a su nivel ´optimo y/o hasta que se observa un aumento del tama˜ no de los monocitos, y la fracci´on sangu´ınea tratada de este modo y preferentemente enriquecida con monocitos se administra de nuevo al paciente una vez finalizada la terapia; o b) antes, durante o despu´es de la terapia se administra al paciente una cantidad eficaz de un agregado de CD137 multim´erico para estimular la proliferaci´ on de los monocitos perif´ericos end´ ogenos.

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Otro campo de aplicaci´ on de la invenci´ on se refiere a la utilizaci´on de CD137 o un an´ alogo funcional en un procedimiento para la estimulaci´on de la defensa inmunitaria no espec´ıfica end´ ogena, en el que se administra a un paciente una cantidad de CD137 o un an´ alogo funcional de ´esta que estimula la proliferaci´on de monocitos perif´ericos, en particular una cantidad de un agregado de CD137 multim´erico que estimula la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos. Este procedimiento es especialmente adecuado para su aplicaci´on a pacientes de tumores y a pacientes que padecen de una infecci´on bacteriana, viral o f´ ungica. Un agregado de CD137 multim´erico que se puede administrar ventajosamente en el marco de este procedimiento incluye entre 2 y 5 mol´eculas prote´ınicas de CD137 o an´ alogos funcionales de ´estas.

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De forma especialmente adecuada se administran an´ alogos o agregados que abarcan la secci´on extracelular de CD137 humana correspondiente a los amino´ acidos +18 a +186 seg´ un la Figura 1A o un an´ alogo funcional de ´esta con capacidad para unirse a monocitos. Para las aplicaciones in vivo resulta ventajoso utilizar CD137 humano o un an´alogo derivado de la misma. Si la CD137 se administra como prote´ına de fusi´ on, la prote´ına fusionada con CD137 tambi´en deber´ıa ser de origen humano. Tambi´en se pueden concebir otras medidas para mejorar el tiempo de permanencia de CD137 en la sangre, como por ejemplo mediante PEGilaci´on, tal como se ya se ha utilizado con ´exito por ejemplo para otras citoquinas (v´ease PEGilaci´on de G-CSF, descrita en el documento EP-A-0 335 423). La elecci´on de la dosificaci´ on correspondiente de CD137 o un an´ alogo funcional de ´esta y el plan de ´ dosificaci´on correspondiente le incumben al m´edico que establece el tratamiento. Este elegir´a una dosis adecuada y un plan de dosificaci´ on correspondiente en funci´on de la v´ıa de administraci´ on elegida, del tipo y la gravedad de la enfermedad a tratar, del estado del paciente y de su respuesta a la terapia. No obstante, en general, una dosis adecuada deber´ıa encontrarse en el rango entre aproximadamente 1 y 20 µg/kg de peso corporal/d´ıa o en el rango entre aproximadamente 0,01 y 1 nMol/kg de peso corporal/d´ıa.

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En relaci´on con el volumen de sangre, las concentraciones eficaces de CD137 o de un an´alogo funcional de ´esta durante la terapia pueden encontrarse en el rango entre aproximadamente 0,01 µg y 10 µg por mililitro de sangre o en el rango entre aproximadamente 0,1 pMol y 0,5 nMol por mililitro de sangre. Para aplicaciones in vitro o ex vivo, las concentraciones eficaces de CD137 o un an´ alogo funcional de ´esta pueden encontrarse en el rango entre m´ as de aprox. 0,1 µg/ml de medio, en particular m´ as de aprox. 1 µg/ml de medio, como por ejemplo hasta aprox. 50 µg/ml, o en el rango entre m´ as de aprox. 1 pMol/ml de medio, en particular m´ as de aprox. 0,01 nMol/ml de medio, como por ejemplo aprox. 2 nMol/ml de medio. La aplicaci´on in vivo de CD137 y los an´ alogos funcionales de ´esta tiene lugar ventajosamente utilizando ´ un producto farmac´eutico l´ıquido administrable por v´ıa parenteral, en particular por v´ıa intravenosa. Este contiene preferentemente un soporte farmac´euticamente aceptable adecuado para este fin y una cantidad adecuada de CD137 o un an´ alogo funcional de la misma, preferentemente en forma de soluci´on. Los principales ejemplos de soportes farmac´euticamente aceptables son soluciones acuosas, como por ejemplo soluci´on fisiol´ ogica de cloruro s´odico, soluci´ on de cloruro s´ odico tamponada con fosfato, soluci´ on de Ringer, soluci´ on lactada de Ringer y similares. Adem´as, el producto tambi´en puede contener otros aditivos, como antioxidantes, agentes formadores de quelatos o agentes antimicrobianos. La administraci´ on tambi´en se puede realizar por v´ıa oral as´ı como por inhalaci´on. La administraci´on por v´ıa intravenosa es especialmente conveniente cuando se requiere una terapia sist´emica. Para el tratamiento de enfermedades locales, como por ejemplo infecciones limitadas localmente, tambi´en puede resultar ventajosa una administraci´ on subcut´ anea o intrad´ermica selectiva. Para ´ el tratamiento local de heridas se puede utilizar por ejemplo una administraci´ on cut´ anea superficial. Esta se puede llevar a cabo mediante la aplicaci´on de una soluci´ on, una soluci´ on, una pomada o un gel.

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La concentraci´on o´ptima de CD137 o un an´ alogo funcional de ´esta en los productos farmac´euticos seg´ un la invenci´on se determina, entre otras cosas, a partir de la actividad espec´ıfica de la forma de CD137 utilizada. No obstante, las proporciones en peso adecuadas de CD137 o de un an´ alogo funcional de ´esta deber´ıan encontrarse en el rango entre aproximadamente un 0,0001 y un 1 % en peso, en particular entre un 0,0005 y un 0,01 % en peso, con respecto al peso total del producto. La concentraci´ on molar puede encontrarse por ejemplo en el rango entre aproximadamente 1 nMol y 0,1 nMol, en particular aproximadamente entre 15 y 300 nMol por 100 g del producto utilizado. Otro objeto de la invenci´ on consiste en la utilizaci´ on de una secuencia de nucle´otidos codificadora de CD137 o un an´ alogo funcional de la misma para la preparaci´ on de un producto para terapia g´ enica para el tratamiento de una de las enfermedades arriba definidas. Este tipo de productos para terapia g´ enica, que incluyen un soporte celular, en particular monocitos perif´ericos, c´elulas derivadas de ´estos o c´elulas progenitoras o precursoras de los monocitos (v´ease la representaci´on esquem´atica del sistema hematopoy´etico en Concepts of Gene Therapy, (1997) Editorial Walter de Gruyter Berlin, Strauss, M. y Barrager, J. A. (Editores), p. 236, tab. 12.1, documento al que se hace referencia aqu´ı de forma expresa), en los que est´ a incorporada la secuencia de nucle´ otidos codificadora para CD137 o para un an´ alogo funcional de ´esta en forma expresable en una construcci´on de ´acido nucleico adecuada.

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La transferencia g´enica en dichas c´elulas puede tener lugar de forma conocida en s´ı, por ejemplo con ayuda de construcciones virales, veh´ıculos no virales, como liposomas, o cualquier otra construcci´on de a´cido nucleico adecuada (G¨ unzburg, W. H. et al., Gentransfer in S¨ augerzellen, (1997) Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin; Baum, C., et al., Gen Transfer and Transgene Expression in Hematopoietic Cells, en Concepts of Gene Therapy, (1997) Editorial Walter de Gruyter Berlin, Strauss, M. y Barrager, J. A. (Editores), 233-256). La construcci´on de a´cido nucleico utilizable seg´ un la invenci´ on se combina por ejemplo con un vector v´ırico, como por ejemplo con un vector de adenovirus o un vector de adenovirus deficiente en replicaci´ on, o se liga con un vector v´ırico adenoasociado. Otra combinaci´on ventajosa consiste en la complejaci´on de las construcciones de a´cido nucleico con liposomas. En la lipofecci´on se producen peque˜ nas ves´ıculas unilaminares a partir de l´ıpidos cati´onicos mediante tratamiento por ultrasonido de la suspensi´ on de liposomas. El ADN se une i´onicamente sobre la superficie de los liposomas en una proporci´ on tal que permanece una carga neta positiva y se produce una complejaci´ on del 100 % del ADN por los liposomas. Adem´ as de las mezclas lip´ıdicas de DOTMA (bromuro de 1,2-diole´ıl-oxipropil-3-trimetil-amonio) y DOPE (diole´ıl-fosfatidil-etanol-amina), entre tanto 9

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se han sintetizado numerosas formulaciones lip´ıdicas nuevas, que se han ensayado en cuanto a su eficacia en la transfecci´on de diferentes l´ıneas celulares (Behr, J. P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 6982-6986; Felgner, J. H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 280-285; Zhou, X. & Huang, L. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203). Como ejemplos de las nuevas formulaciones lip´ıdicas se mencionan: DOTAP sulfato de N-[1-(2,3-dilole´ıl-oxi)-propil]-N,N,N-trimetil-amonio-metilo o DOGS (TRANSFECTAM; dioctadecilamidoglicil-espermina). Adem´as de la secuencia de nucle´otidos codificadora de CD137 o un an´ alogo funcional de ´esta, las construcciones de a´cido nucleico utilizables abarcan en una combinaci´on funcional operativa una o m´ as secuencias reguladoras, como promotores, se˜ nales de amplificaci´ on, intensificadores, secuencias de poliadenilaci´on, or´ıgenes de replicaci´on, genes reportadores, genes marcadores seleccionables y similares. Esta combinaci´on puede conducir a un aumento o una reducci´ on de la expresi´ on g´enica, en funci´ on de la aplicaci´on deseada.

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Adem´as de las secuencias de regulaci´on incorporadas, tambi´en puede estar presente la secuencia de regulaci´on natural de los propios genes estructurales. Dado el caso, mediante modificaci´on gen´etica se puede desconectar esta regulaci´on natural y aumentar la expresi´ on de los genes. No obstante, la construcci´on gen´etica puede tener una estructura m´ as sencilla, es decir, no se inserta ninguna se˜ nal de regulaci´ on adicional delante de los genes estructurales y no se elimina el promotor natural con su regulaci´ on. En lugar de ello, la secuencia de regulaci´on natural se muta de tal modo que ya no se produzca ninguna regulaci´on y se aumente la expresi´on g´enica. Tambi´en se pueden insertar elementos reguladores ventajosos adicionales en el extremo 3’ de las secuencias de ´acido nucleico. La construcci´on gen´etica puede contener las secuencias de ´acido nucleico en una o m´as copias. En principio se pueden utilizar todos los promotores naturales con sus secuencias de regulaci´on. Tambi´en se pueden utilizar de forma ventajosa promotores sint´eticos. Preferentemente, las secuencias reguladoras deben posibilitar la expresi´on selectiva de las secuencias de ´acido nucleico. La presente invenci´on se explica m´as detalladamente a continuaci´on a base de los siguientes ejemplos de realizaci´on no limitativos. Ejemplos de realizaci´ on

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Reactivos En R&D (Wiesbaden, Alemania) se adquirieron M-CSF y anticuerpos neutralizantes contra M-CSF, GM-CSF e IL3. Anti-M-CSF: clon 26730,11, fracci´ on de IgG purificada por prote´ına A del l´ıquido asc´ıtico de hibridoma de rat´ on. Anti-GM-CSF: clon 3209,1, anticuerpo de rat´ on IgG1 monoclonal. AntiIL3: fracci´ on de IgG purificada por prote´ına A del l´ıquido asc´ıtico de hibridoma de rat´ on. La prote´ına CD137-Fc recombinante, consistente en el dominio extracelular de CD137 humana y el dominio constante o en Alexis (Gr¨ unberg, Alemania). La prote´ına Fc de de inmunoglobulina G1 humana (Fc), se adquiri´ o en la Accurate Chemical and Scientific Corporation (Westbury, NY, EEUU). IgG1 humana se adquiri´ Ejemplo de referencia 1 Inmovilizaci´ on de CD137-Fc

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Unas placas de microtitulaci´on de poliestireno (Microtest III Tissue Culture Plates; Becton Dickinson, on de 1 µg/ml de prote´ına Franklin Lakes NJ, EEUU) se incubaron durante la noche a 4◦ C con una soluci´ CD137-Fc en PBS (soluci´ on de cloruro s´ odico tamponada con fosfato). En cada pocillo se utilizaron 50 µl de la soluci´on. A la ma˜ nana siguiente se retir´ o la soluci´on de prote´ına y las placas se lavaron con PBS. La inmovilizaci´on de Fc tuvo lugar de modo an´ alogo. Ejemplo de referencia 2 ELISA

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En R&D (Wiesbaden, Alemania) se adquirieron kits ELISA. La realizaci´on del ensayo tuvo lugar de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Las concentraciones de citoquina se determinaron 3 veces con el ensayo y se expresaron como valor medio ± desviaci´on est´andar.

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ES 2 188 140 T3 Ejemplo de referencia 3 Determinaci´ on de la apoptosis de monocitos 5

La fragmentaci´on de ADN se determin´o con ayuda del “Cell Death Detection ELISA” (Boehringer Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las mediciones se realizaron 3 veces. Ejemplo de referencia 4

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Aislamiento y cultivo de monocitos humanos A partir de “buffy coats” (c´elulas mononucleares de cultivo) de probandos sanos se aislaron c´elulas mononucleares de sangre perif´erica humana (PBMC). Para ello, las buffy coats se diluyeron con dos vol´ umenes iguales de PBS. Con ellas se recubri´o un volumen igual de Histopaque (Sigma, Deisenhofen, Alemania). Esta carga se centrifug´ o durante 20 minutos a 1200 g. Se aislaron las PBMC que se acumulaban en forma de una capa blanca en la superficie de separaci´ on de percoll. Se lisaron eritrocitos con 2 ml de NH4 Cl 200 mM, NaHCO3 10 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4 durante 2 minutos a temperatura ambiente. Las c´elulas se lavaron dos veces con PBS, se pelletizaron a 250 g y se resuspendieron en medio RPMI suplido con un 5 % de suero bovino fetal. Los monocitos primarios se aislaron de dicha suspensi´ on mediante elutriaci´on Andreesen, R., et al, J. Leukoc. Biol. 47:490, 1990). Los monocitos elutriados ten´ıan una pureza de un 95 % y su contenido de linfocitos T era inferior a un 3 % (estimado a base de la morfolog´ıa y del fenotipo antig´enico, es decir expresi´on de DC14, DC3, CD4 y CD8). Las c´elulas se cultivaron en bandejas de cultivo de poliestireno (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EEUU) en medio RPMI 1640, suplido con un 5 % de FCS, con la concentraci´ on celular indicada en cada caso. Ejemplo de referencia 5 Determinaci´ on de la proliferaci´ on celular

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Para medir la proliferaci´on de c´elulas individuales se utiliz´o el “In Situ Proliferation Kit” de Boehringer Mannheim, Alemania. Cada c´ amara de un soporte de 8 c´ amaras (FALCON, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania), que hab´ıan sido recubiertas con prote´ına Fc o CD137-Fc, se vacunaron con 3 x nadieron 10 µM de bromo105 c´elulas y se cultivaron durante 10 d´ıas. A lo largo de 60 minutos se a˜ desoxi-uridina (BrdU). La BrdU incorporada se visualiz´ o correspondientemente a las instrucciones de ensayo mediante te˜ nido con BrdU anti-rat´ on y FITC de rat´ on anti-oveja. Los monocitos se identificaron mediante te˜ nido con anticuerpos anti-CD14 marcado con ficoeritrina (2 µg/ml; Immunotech, Marsella, Francia). La cromatina se ti˜ no´ con 5 µg/ml de Hoechst 33342 (Sigma, Deisenhofen, Alemania) durante 5 minutos. La proliferaci´ on de las poblaciones celulares se determin´o en una placa de microtitulaci´ on de 96 pocillos. En cada pocillo, 105 monocitos se pulsaron con 0,5 µCi 3 H-tiomidina durante 24 horas, se recogieron y se contaron con un contador de escintilaci´on de microplacas TopCount (Packard, Meriden, CT, EEUU). Cada proceso se realiz´o tres veces y los resultados se indica como valores medios ± desviaci´on est´andar. Ejemplo 1

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Apoptosis inducida por CD137-Fc en monocitos 105 monocitos primarios se cultivaron sobre bandejas de cultivo de tejidos que previamente hab´ıan sido recubiertas con una prote´ına de fusi´ on consistente en el dominio extracelular de CD137 y el dominio constante de inmunoglobulina humana G1 (Fc). Como controles se utilizaron placas no tratadas y placas recubiertas con prote´ına Fc. En los pocillos revestidos con prote´ına CD137-Fc, la cantidad de monocitos vivos hab´ıa aumentado de forma significativa los d´ıas 1, 3, 5 y 7 de cultivo (Figura 2, mitad inferior). El grado de apoptosis en los mismos cultivos se determin´o a trav´es de la cantidad de ADN fragmentado (Figura 2, mitad superior). Sorprendentemente se comprob´ o que el grado de apoptosis era superior en los cultivos de monocitos tratados con prote´ına CD137-Fc. En tres experimentos independientes se obtuvieron resultados comparables. Ejemplo 2

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La CD137-Fc induce la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos y provoca la formaci´ on de colonias de monocitos (a) La CD137 indujo una fuerte proliferaci´ on de monocitos que compensaba con creces la p´erdida de 11

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c´elulas por la apoptosis igualmente inducida. 105 monocitos se cultivaron en placas de 96 pocillos recubiertos con Fc o CD137-Fc. La proliferaci´ on se determin´ o diariamente mediante un pulso de 24 horas on de 3 H-timidina, la CD137-Fc con 0,5 µCi 3 H-timidina. Tal como mostraban los ´ındices de incorporaci´ indujo de hecho una fuerte proliferaci´ on de monocitos (Figura 3A). La proliferaci´ on mostraba una correlaci´on positiva con la duraci´ on de cultivo de los monocitos en presencia de prote´ına CD137-Fc. La inducci´ on de la proliferaci´ on alcanz´o un valor m´aximo despu´es de 7 a 10 d´ıas, habiendo aumentado la as veces m´as que en el caso de las c´elulas de control. incorporaci´ on de 3 H-timidina 30 o m´ No se detect´o ninguna diferencia entre los monocitos de los pocillos no tratados y los pocillos recubiertos con prote´ına Fc (resultados no mostrados). a en concordancia con la comprobaci´ on El aumento sustancial de la incorporaci´ on de 3 H-timidina est´ de que la proliferaci´on inducida por CD137-Fc se produc´ıa muy distribuida en el cultivo. En el caso del marcado de los monocitos tratados con CD137 mediante una hora de tratamiento con bromo-desoxiuridina (BrdU) y detecci´ on subsiguiente con un anticuerpo anti-BrdU marcado con fluoresce´ına se pudo comprobar que un 9,3 % de las c´elulas (55 ± 6 de 589 ± 43) replicaban su ADN, mientras que los monocitos perif´ericos cultivados sobre soportes revestidos con Fc no mostraban ninguna incorporaci´ on de BrdU (resultados no mostrados). Adem´as, mediante an´alisis inmunocitoqu´ımicos se pudo confirmar que las c´elulas proliferantes eran en efecto monocitos y no otras c´elulas sangu´ıneas. Tal como se describe m´as arriba, la proliferaci´ on se determin´ o mediante incorporaci´ on de BrdU y la identidad de los monocitos de verific´ o mediante te˜ nido simult´aneo de CD14, una prote´ına de superficie celular espec´ıfica para monocitos. Los n´ ucleos se hicieron visibles mediante te˜ nido con el tinte de intercalaci´on de ADN Hoechst 33342. Con estos an´ alisis se comprob´ o que las c´elulas proliferantes presentaban caracter´ısticas t´ıpicas de los monocitos: eran positivas en relaci´on con CD14 y multinucleadas y presentaban la morfolog´ıa t´ıpica de los monocitos/macr´ ofagos (resultados no mostrados). (b) Tal como muestra la fotograf´ıa microsc´opica de la Figura 3B, un tratamiento seg´ un la invenci´ on de monocitos con CD137-Fc inmovilizada conduce a una formaci´ on de colonias significativa, an´ alogamente a lo ya mostrado en relaci´on con otros factores de crecimiento hematopoy´eticos. Ejemplo 3

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El M-CSF y el GM-CSF son factores adicionales esenciales para la proliferaci´ on de monocitos inducida por CD137 (a) 105 monocitos perif´ericos se cultivaron sobre Fc inmovilizada o CD137-Fc inmovilizada. De acuerdo con el plan de ensayo se a˜ nadieron anticuerpos anti-M-CSF (2 µg/ml), anticuerpos anti-GM-CSF (2 µg/ml) y anticuerpos anti-IL-3 (2 µg/ml) neutralizantes. La proliferaci´ on se determin´ o a los 10 d´ıas a trav´es de la incorporaci´ on de 3 H-timidina. Mediante los anticuerpos anti-M-CSF y anti-GM-CSF neutralizantes se logr´o una inhibici´ on completa de la proliferaci´ on de monocitos. El anticuerpo anti-GM-CSF neutralizante por s´ı solo u ´ nicamente redujo la proliferaci´ on en un 18 %. El anticuerpo anti-IL-3 no influy´ o en modo alguno en la proliferaci´ on inducida por CD137. La adici´ on de anticuerpos anti-GM-CSF y anti-IL-3 condujo a una reducci´on sin´ergica de la proliferaci´ on a un tercio del valor original (v´ease la Figura 4A). Los resultados demuestran que el M-CSF y el GM-CSF son factores esenciales para la proliferaci´on de monocitos perif´ericos inducida por CD137. (b) Sin embargo, en otro ensayo se comprob´ o que el M-CSF y el GM-CSF, en las concentraciones inducidas por la CD137, u ´nicamente provocaban una proliferaci´ on insignificante. En placas de 96 pocillos, recubiertas con prote´ına Fc o CD137-Fc (1 µg/ml) o con M-CSF y GM-CSF en las concentraciones indicadas (ng/ml), se cultivaron monocitos perif´ericos. La proliferaci´on se determin´ o a los 10 d´ıas a trav´es o que la CD137 induc´ıa el de la incorporaci´ on de 3 H-timidina (Figura 4B). En ensayos previos se comprob´ M-CSF en concentraciones hasta 10 ng/ml. No se pudo medir ninguna inducci´ on de GM-CSF (resultados no mostrados). El M-CSF y el GM-CSF se pueden detectar in vivo en concentraciones de 10 ng/ml o 50 pg/ml (Kawano, Y., Eur J Haematol 54:147, 1995; Elner, S. G., Curr Eye Res 14:1045, 1995; Saunders, M. A., Br J Pharmacol 120:545, 1997). En la serie de ensayos representada en la Figura 4B se utilizaron M-CSF y GM-CSF en concentraciones considerablemente superiores a los valores indicados en la literatura, a saber: 100 y 1 ng/ml, respectivamente. Sin embargo, mediante el M-CSF y/o el GM-CSF s´ olo se pudo inducir una fracci´ on de la proliferaci´ on en comparaci´ on con la CD137. Esto se puede interpretar como una indicaci´ on de que los factores adicionales inducidos en monocitos a trav´es de la acci´on de la 12

ES 2 188 140 T3 CD137 contribuyen de forma autocrina a la proliferaci´ on de monocitos inducida por CD137. Ejemplo 4 5

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Uno o m´ as factores autocrinos solubles intervienen en la proliferaci´ on de monocitos inducida por CD137Fc La siguiente investigaci´on consisti´ o en determinar si existen estos factores en forma soluble o unidos a la superficie celular, que posiblemente intervienen adicionalmente en la proliferaci´ on de monocitos inducida por CD137. Para ello se cultivaron durante 24 horas 105 monocitos perif´ericos sobre prote´ına Fc inmovilizada o prote´ına CD137-Fc inmovilizada. Las c´elulas se separaron mediante 5 minutos de centrifugaci´on a 12.000 g. A continuaci´ on, 0, 10 y 20 µl de residuos acondicionados de estos cultivos se transfirieron a 100 µl de cultivos frescos con monocitos no tratados. La transferencia de este medio acondicionado a monocitos no tratados del mismo donante indujo un crecimiento celular dependiente de la dosis (Figura 5A) y proliferaci´on celular (Figura 5B). Para demostrar la influencia en el crecimiento celular, las c´elulas se fotografiaron despu´es de 8 d´ıas con una ampliaci´on 300x. La imagen inferior de la Figura 5A muestra a t´ıtulo comparativo monocitos cultivados durante 8 d´ıas sobre prote´ına CD137-Fc inmovilizada. Para determinar la proliferaci´ on (Figura 5B) se inmoviliz´ o Fc o CD137-Fc del modo arriba descrito sobre soportes de cultivo. A continuaci´ on se cultivaron monocitos con residuo acondicionado en la concentraci´on indicada. Tal como se describe m´as arriba, la proliferaci´ on se determin´ o a trav´es o durante 24 horas con 0,5 µCi de de la incorporaci´ on de 3 H-timidina. Para ello, a los 8 d´ıas se puls´ 3 H-timidina. El experimento se repiti´ o tres veces con resultados comparables. Ejemplo 5

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Para la inducci´ on de la proliferaci´ on de monocitos es necesario inmovilizar la prote´ına CD137

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105 monocitos perif´ericos se cultivaron sobre Fc inmovilizada y CD137-Fc inmovilizada y, en comparaci´on, tambi´en en presencia de Fc y CD137-Fc en forma disuelta. En los ensayos comparativos, la inmovilizaci´on de CD137 y Fc se impidi´ o bloqueando los recipientes de cultivo de forma no espec´ıfica con alb´ umina s´erica bovina (incubaci´ on con 200 µl BSA al 0,1 %, 30 minutos a temperatura ambiente). La proliferaci´ on se determin´ o a los 10 d´ıas a trav´es de la incorporaci´ on de 3 H-timidina. Tal como muestran los resultados representados en la Figura 6, s´olo se observ´o una inducci´ on de la proliferaci´ on de monocitos mediante CD137 cuando la prote´ına CD137 se hab´ıa inmovilizado previamente mediante recubrimiento de las bandejas de cultivo de tejidos con la misma. Por el contrario, cuando la CD137 se administr´ o como prote´ına soluble, se redujo notablemente la inducci´ on de la proliferaci´ on. En tres experimentos independientes se obtuvieron resultados comparables. Ejemplo 6

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An´ alisis de la proliferaci´ on de monocitos en presencia de TNFR-Fc y anti-CD68

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Para seguir caracterizando la inducci´ on de la proliferaci´ on de monocitos se inmovilizaron prote´ına Fc, prote´ına CD137-Fc, prote´ına de receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) y anti-CD68. La incorporaci´ on de 3 H-timidina se determin´o tal como se describe m´as arriba. En la Figura 7 se puede observar que u ´ nicamente la CD137-Fc induce de forma significativa la proliferaci´on de monocitos. Tanto el TNFR-Fc como el anti-CD68 son prote´ınas que, de forma an´aloga a la CD137, se unen a la superficie de monocitos. Con su utilizaci´on como control se pretende demostrar que u ´nicamente la uni´ on de monocitos a la superficie del recipiente de cultivo no provoca los efectos observados.

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Ejemplo 7 La CD137 y el M-CSF inducen de forma acumulativa la proliferaci´on de monocitos 55

En cada pocillo de una placa de microtitulaci´ on de 96 orificios se dispusieron 105 monocitos. Cada pocillo hab´ıa sido previamente recubierto con Fc o CD137-Fc (1 µg/ml en cada caso). Despu´es se a˜ nadieron M-CSF (100 µg/ml) y LPS (lipopolisac´ arido) (50 µg/ml) en forma disuelta. La medici´ on de la proliferaci´on a los 8 d´ıas de cultivo se llev´o a cabo a trav´es de la incorporaci´on de 3 H-timidina despu´es de 24 horas de pulsamiento con 0,5 µCi 3 H-timidina.

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Tal como muestran los resultados de ensayo representados en la Figura 8, la incorporaci´ on de 3 Htimidina en monocitos se intensifica de forma acumulativa mediante CD137-Fc inmovilizada o M-CSF. 13

ES 2 188 140 T3 En cambio, el LPS no conduce a ning´ un aumento significativo del ´ındice de incorporaci´ on, por lo que no tiene ning´ un efecto en la proliferaci´ on de monocitos inducida por CD137. Ejemplo 8 5

La CD137-Fc induce cambios morfol´ogicos en los monocitos

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105 monocitos perif´ericos primarios se cultivaron sobre placas de cultivo de tejidos no tratadas o sobre prote´ına Fc o CD137-Fc inmovilizada (1 µg/ml). Los cultivos se fotografiaron los d´ıas 1, 2, 4, 6 y 10 con una ampliaci´ on 400x (Figura 9A). Las placas de cultivo que s´ olo hab´ıan sido tratadas con prote´ına Fc u ´nicamente mostraban una ligera adhesi´ on de los monocitos. Adem´as, los monocitos conservaban su morfolog´ıa redonda. En el transcurso de 10 d´ıas, los monocitos de esta carga fueron muriendo poco a poco (figura 9A, columna izquierda). En cambio, cuando las c´elulas se cultivaron en placas de cultivo de tejidos sobre las que se hab´ıa inmovilizado prote´ına de fusi´ on CD137-Fc, se obtuvo un resultado completamente diferente. La CD137-Fc induce la adhesi´on de los monocitos. Estas c´elulas fueron adquiriendo paulatinamente una forma irregular. Este efecto se pudo observar ya desde el primer d´ıa. A medida que aumentaba la duraci´ on del cultivo, las c´elulas se distribu´ıan, aumentaban de tama˜ no y mostraban una morfolog´ıa m´ as compleja (Figura 9A, columna derecha). A los 10 d´ıas de cultivo en presencia de CD137-Fc inmovilizada se pudieron identificar tres morfolog´ıas b´ asicas de monocitos diferenciados in vitro: una forma alargada (E), una forma redonda (R) y una forma ramificada (B) (v´ease la Figura 9B). Ejemplo 9

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La CD137-Fc induce la formaci´ on de M-CSF

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(a) En un primer experimento se cultivaron 105 monocitos primarios sobre Fc o CD137-Fc inmovilizada (1 µg/ml en cada caso). Para mantener la prote´ına CD137-Fc (1 µg/ml) en soluci´ on, la inmovilizaci´on de la prote´ına CD137-Fc se impidi´ o en una carga preincubando las placas de cultivo de tejidos con suero bovino fetal (1 h a 4◦ C, no diluido). Los resultados se muestran en la Figura 10. Los residuos de cultivo se recogieron en los tiempos indicados y la concentraci´on de M-CSF se determin´ o mediante ELISA. En tres experimentos independientes se obtuvieron resultados comparables. Tal como muestra la Figura 10, la CD137 induce al expresi´ on de M-CSF. Durante los tres primeros d´ıas de cultivo, los contenidos de M-CSF eran bajos y no se observaba ninguna diferencia entre el control y los monocitos tratados con CD137. A partir del cuarto d´ıa se pod´ıa demostrar la formaci´ on de M-CSF y la concentraci´on de M-CSF aument´o de forma r´ apida y continua. La inmovilizaci´ on de la prote´ına CD137 fue una condici´ on necesaria para una formaci´ on significativa de M-CSF, dado que la CD137 soluble s´olo indujo concentraciones bajas de M-CSF. (b) En un siguiente experimento se demostr´ o que la expresi´ on de M-CSF no s´ olo es inducida por la CD137, sino que tambi´en es esencial para la supervivencia de monocitos inducidos por CD137. Para ello, los monocitos se cultivaron en presencia de prote´ına CD137 inmovilizada y anticuerpo anti-M-CSF neutralizante. Se observ´ o que sobrevivieron aproximadamente diez veces m´as monocitos en las placas revestidas con CD137-Fc en comparaci´ on con las placas revestidas con prote´ına Fc. La adici´ on de anticuerpo anti-M-CSF neutralizante redujo la cantidad de monocitos supervivientes al valor b´ asico (v´ease la Tabla 1). Durante la observaci´ on de la evoluci´on en el tiempo se comprob´ o que la mayor´ıa de las c´elulas cultivadas sobre placas de cultivo no recubiertas o recubiertas con Fc ya hab´ıan muerto al sexto d´ıa (v´ease la Figura 11). En cambio, la prote´ına CD137 inmovilizada o el M-CSF estabilizaron la cantidad de c´elulas en un nivel alto incluso al duod´ecimo d´ıa. Este efecto dej´ o de observarse despu´es de recoger el M-CSF con ayuda de anticuerpo neutralizante.

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Es sabido que, adem´as del M-CSF, tambi´en el GM-CSF y la IL-3 influyen positivamente en la longevidad de los monocitos en humanos. En los experimentos seg´ un la invenci´ on, en el ELISA no se pudo observar ninguna expresi´ on de GM-CSF o IL-3 despu´es de 8 d´ıas de cultivo (tanto en la carga de control como en las c´elulas tratadas con CD137) (resultados no mostrados). Sin embargo, los anticuerpos antiGM-CSF neutralizantes redujeron a la mitad el ´ındice de supervivencia de monocitos mediada por CD137 (v´ease la Tabla 1). Los anticuerpos anti-IL-3 no produjeron ning´ un efecto. Sin embargo, una combinaci´ on de anticuerpos anti-IL-3 y anticuerpos anti-GM-CSF neutralizantes redujeron la cantidad de monocitos 14

ES 2 188 140 T3 supervivientes pr´ acticamente al valor b´ asico. Esto demuestra que la IL-3 tambi´en representa un papel importante para la supervivencia de los monocitos. Una neutralizaci´ on de GM-CSF y/o IL-3 adem´as de la neutralizaci´ on de M-CSF no conduce a ninguna reducci´ on adicional de la cantidad de c´elulas. 5

El efecto positivo del M-CSF se redujo por completo mediante el suministro de anticuerpo anti-M-CSF neutralizante y pr´acticamente al nivel b´ asico mediante una combinaci´ on de anticuerpos anti-GM-CSF y anti-IL-3. TABLA 1

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Anticuerpo neutralizante2)

Est´ımulo

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Cantidad de c´elulas supervivientes1)

Valor p4)

Fc

---

8,8 ± 1,5

---

CD137-Fc

---

75,5 ± 6,8

---

CD137-Fc

α-M-CSF

9,3 ± 2,0

0,005

CD137-Fc

α-IL-3

72,3 ± 8,4

n.s.

CD137-Fc

α-GM-CSF

36,0 ± 2,5

0,006

CD137-Fc

α-M-CSF + α-IL-3

7,0 ± 1,8

0,005

CD137-Fc

α-M-CSF + α-GM-CSF

6,0 ± 3,0

0,007

CD137-Fc

α-GM-CSF + α-IL-3

19,0 ± 3,0

0,005

CD137-Fc

α-GM-CSF + α-GM-CSF + α-IL-3

4,8 ± 3,3

0,008

M-CSF

---

68,3 ±16,2

--

M-CSF

α-M-CSF

5,3 ± 2,6

0,006

M-CSF

α-GM-CSF + α-IL-3

20,8 ± 5,0

0,018

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1) Los monocitos perif´ericos primarios se cultivaron sobre prote´ına Fc inmovilizada o prote´ına CD137Fc (1 µg/ml) o se a˜ nadi´ o M-CSF en una conc. final de 100 ng/ml. 45

50

2) Los anticuerpos neutralizantes se utilizaron en una conc. de 2 µg/ml y se a˜ nadieron al comienzo del experimento. 3) Cantidad media de c´elulas y desviaci´on est´andar. A los diez d´ıas se contaron las c´elulas en cuatro campos representativos de la placa. 4) Los valores p se determinaron de acuerdo con el Test t de Student’s con ayuda del software SSPS. n.s. = no significativo.

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Ejemplo 10 La inmovilizaci´ on de prote´ına CD137 aumenta la cantidad de monocitos vivos

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105 monocitos perif´ericos se cultivaron sobre prote´ına Fc o CD137-Fc inmovilizada (1 µg/ml en cada caso) o en presencia de prote´ına Fc soluble o prote´ına CD137-Fc soluble (1 µg/ml en cada caso). Los cultivos se fotografiaron el octavo d´ıa con una ampliaci´on 300x (v´ease la Figura 12). La inmovilizaci´ on tuvo lugar por tratamiento previo de las placas de cultivo con alb´ umina s´erica bovina (30 minutos temp. ambiente, 200 µl en cada pocillo de una placa de 96 orificios). La cantidad de monocitos se reduce 15

ES 2 188 140 T3

5

notablemente en presencia de prote´ına soluble. De acuerdo con el resultado, el M-CSF s´ olo se induce cuando la prote´ına CD137 est´ a inmovilizada (v´ease el Ej. 9). Por consiguiente es probable que la CD137 s´olo act´ ue sobre los monocitos cuando un ligando de CD137 expresado por los monocitos (es decir, un compa˜ nero de uni´ on para CD137) se reticule a trav´es de la uni´ on de las mol´eculas de CD137 inmovilizadas. La CD137-Fc soluble, reticulada de forma secundaria a trav´es de anticuerpos anti-Fc, tambi´en prolonga la supervivencia de monocitos, seg´ un se observ´ o despu´es de 8 d´ıas de cultivo (resultados no mostrados). Para este experimento, la CD137-Fc (2 µg/ml) se hab´ıa reticulado previamente con anticuerpo anti-humano-Fc de cabra (2 µg/ml).

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ES 2 188 140 T3 REIVINDICACIONES 1. Utilizaci´on del factor de crecimiento de monocitos CD137 o un an´ alogo funcional del mismo para producir un medicamento para estimular la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos en un mam´ıfero. 5

10

2. Utilizaci´on del factor de crecimiento de monocitos CD137 o un an´ alogo funcional del mismo para producir un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con un trastorno de un sistema celular que incluye monocitos y/o c´elulas derivadas de ellos y/o progenitores y/o precursores de ellos; o cuya formaci´on y/o evoluci´ on se puede tratar terap´euticamente mediante la estimulaci´on de la proliferaci´ on de c´elulas de dicho sistema celular. 3. Utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 2, en la que el trastorno del sistema celular incluye una reducci´on o trastorno funcional de monocitos perif´ericos y/o c´elulas derivadas de ´estos.

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4. Utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 2 para el tratamiento de enfermedades asociadas con una respuesta inmune insuficiente. 5. Utilizaci´on seg´ un una de las reivindicaciones 2 a 4, perteneciendo la enfermedad al grupo consistente en:

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a) lesiones del sistema hematopoy´etico condicionadas por quimioterapia o radioterapia; b) trastornos de cicatrizaci´ on;

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c) enfermedades tumorales; d) infecciones bacterianas,virales y f´ ungicas; e) lesiones o enfermedades cong´enitas o no cong´enitas, hereditarias o no hereditarias, del sistema inmunitario; y

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f) lesiones inducidas por tratamiento con inmunosupresores. 6. Utilizaci´on seg´ un una de las reivindicaciones anteriores, en la que se lleva a cabo un tratamiento in vivo o ex vivo.

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7. Utilizaci´on seg´ un una de las reivindicaciones anteriores, en la que se emplea CD137 o un an´ alogo funcional de ´esta en combinaci´on con como m´ınimo otro factor seleccionado entre interleucinas, linfocinas, monocinas, interferones, factores estimuladores del desarrollo de colonias y factores de crecimiento. 8. Utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 7, en la que el factor adicional es un factor estimulador de leucocitos. 9. Utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 8, en la que el factor se selecciona entre el G-CSF, GM-CSF y M-CSF.

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10. Utilizaci´ on seg´ un una de las reivindicaciones anteriores, en la que ser emplea CD137 o su an´ alogo funcional en forma inmovilizada o como agregado multim´erico. 11. Utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 10, en la que el agregado de CD137 multim´erico incluye entre dos y cinco mol´eculas de prote´ına CD137 o sus an´ alogos funcionales. 12. Utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 10 u 11, en la que se emplea la secci´on extracelular de CD137 humana correspondiente a los amino´ acidos +18 a +186 de acuerdo con la Figura 1A o un an´ alogo funcional de ella con capacidad para unirse a monocitos.

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13. Procedimiento in vitro para estimular la proliferaci´ on de monocitos perif´ericos, en el que monocitos perif´ericos de la sangre de un mam´ıfero se ponen en contacto en un medio nutritivo con CD137 y se incuban hasta que aumenta la cantidad y/o el tama˜ no de los monocitos.

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ES 2 188 140 T3 14. Utilizaci´ on de una secuencia de nucle´otidos codificadora de CD137 o un an´ alogo funcional de ´esta para preparar un producto para terapia g´enica para el tratamiento de una de las enfermedades definidas en una de las reivindicaciones 2 a 5. 5

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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