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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 062 509 kInt. Cl. : A61K 35/18

11 N.◦ de publicaci´ on: 5

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˜ ESPANA

A01N 1/00 F25D 25/00

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 90902326.9 kFecha de presentaci´on : 31.01.90 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 457 782 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 27.11.91

T3

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54 T´ıtulo: Un m´ etodo de congelar gl´ obulos rojos.

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73 Titular/es: The Secretary of State for

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72 Inventor/es: Thomas, Michael John Glynn;

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74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Fernando

30 Prioridad: 08.02.89 GB 8902791

Defence in her Britannic Majesty’s Governnment of the United Kingdom of Great Britain and Northern Ireland Whitehall London SW1A 2HB, GB

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.12.94

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.12.94

Aviso:

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Bell, Susan Helen; Nash, Stuart Graham y Parry, Ernest Sidney

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 062 509 T3 DESCRIPCION La presente invenci´on trata de la congelaci´ on de gl´obulos rojos (eritrocitos) durante almacenamiento prolongado de tal manera que permanecen adecuadas para transfusi´ on de sangre. 5

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El almacenamiento de la sangre para usar en servicios de transfusi´ on es bien conocido. La sangre ´til m´ axima se almacena habitualmente en condiciones de refrigeraci´ on a 4◦ C, donde tiene una vida u de aproximadamente 5 semanas. El mantenimiento de suministros adecuados requiere por lo tanto la cooperaci´on continua de los donantes. Desgraciadamente hay per´ıodos, tales como la proximidad del per´ıodo de Navidad, donde los suministros pueden hacerse escasos. Tambi´en hay ocasiones en la que graves desastres conducen a que un ´area particular quede escasa en suministros. Tambi´en un n´ umero creciente de personas desea almacenar su propia sangre, por ejemplo antes de cirug´ıa electiva. Hay, por tanto, un requerimiento de un m´etodo de almacenamiento prolongado de suministros de sangre. El almacenamiento duradero de la sangre se hace posible congelando sangre a temperaturas muy bajas a las que despu´es se almacena. Desgraciadamente se ha probado que la congelaci´ on de la sangre seg´ un se suministra es imposible. Es habitual almacenar sangre en unidades est´ andar de aproximadamente 450 ml, siendo ´este el volumen donado por un donante en una sola donaci´ on. A los pacientes que reciben transfusiones se les da habitualmente un n´ umero integro de tales unidades. La congelaci´on de tal volumen de sangre da como resultado la hem´ olisis de los gl´ obulos rojos que hace a la sangre in´ util para uso futuro en transfusiones. La hem´ olisis da como resultado la liberaci´ on de potasio, que es cardiot´ oxico, y de estroma (restos de c´elulas) que puede causar insuficiencia renal. Generalmente se considera que, para ser aceptables para transfusi´ on de sangre, los gl´obulos rojos no deben tener sustancialmente m´ as de 1% de hem´ olisis. En un m´etodo por el que la sangre puede almacenarse por congelaci´on, la sangre se centrifuga para separar el plasma y las plaquetas de los gl´ obulos rojos, los cuales se mezclan con un agente crioprotector, y la mezcla se congela hasta una temperatura muy baja, habitualmente usando nitr´ ogeno l´ıquido. El agente crioprotector usado com´ unmente es glicerol. Desgraciadamente el glicerol es t´oxico, y la preparaci´ on de los gl´ obulos rojos para usar en transfusiones requiere varios lavados para eliminar el glicerol. Este es un proceso que implica un equipo costoso, requiere un alto nivel de destreza, experiencia y pr´actica constante por parte del personal responsable, y tambi´en requiere un a´rea de alta esterilidad. El proceso de lavado lleva aproximadamente veinte minutos por unidad, y da como resultado la p´erdida de entre un quince y un veinte por ciento de las c´elulas. Un agente crioprotector m´ as atractivo es el almid´on hidroxiet´ılico (HES), o levosan. La patente de EE.UU. N◦ 3.758.382 describe como se mezclan muestras de 55 ml de sangre total que contienen un anticoagulante (citrato-dextrosa acidulada) con 40% en p/v de HES de peso molecular medio 40.000 a 70.000 de modo que la concentraci´on final era 12 a 14% en p/v de HES. La mezcla se sumerg´ıa en nitr´ ogeno l´ıquido a -190◦C y se agitaba a 200 revoluciones/minuto hasta que se congelaba. Despu´es de almacenamiento a -140◦ C durante hasta una semana la mezcla se descongela por inmersi´on durante 60 segundos, con agitaci´ on a 160 revoluciones/minuto, de un ba˜ no de agua a 47◦ C. Se alcanzaban factores de recuperaci´ on de hasta 99% (media 97,4%) de gl´ obulos rojos. Los vol´ umenes usados para congelar, esto es 55 ml, son s´olo fracciones de unidades est´andar y provocar´ıan complicaciones indeseables si se usaran en procedimientos de transfusi´on convencionales. En un desarrollo de este proceso, que tiene en cuenta la congelaci´on de unidades est´ andar de sangre, la Patente de EE.UU. 4018911 describe un m´etodo para congelar sangre usando HES de peso molecular medio 150.000. La sangre se centrifuga para separar el plasma y las plaquetas de los gl´ obulos rojos, y algo del plasma se mezcla con HES. La raz´on para la adici´ on de plasma es que se pensaba que era necesaria para la protecci´ on de los gl´ obulos rojos. La mezcla de plasma y HES se mezcla entonces con un volumen m´as o menos igual de c´elulas dando una proporci´ on de HES en la mezcla resultante del orden de 14%. Una donaci´ on de unidad est´ andar de 450 ml se ha reducido para entonces a aproximadamente 405 ml. Esta mezcla de plasma y HES se a˜ nade a los gl´obulos rojos en una bolsa de congelaci´on y la bolsa se coloca en un soporte unido a un agitador pendular, despu´es de m´as mezcla. El soporte est´a hecho de dos placas laterales de metal perforadas con bisagras y unidas con tornillos, entre las que se mantiene la bolsa de sangre con una rigidez conferida por las placas laterales que est´an hechas de acero inoxidable, a fin de mantener una secci´on transversal sustancialmente uniforme durante la congelaci´on. La secci´on transversal uniforme permite la congelaci´ on m´ as r´apida, manteniendo las placas de acero la bolsa esencialmente r´ıgida durante la agitaci´ on. La bolsa y el soporte se sumergen verticalmente en nitr´ ogeno l´ıquido y se agitan mientras el contenido se congela. El proceso de agitaci´ on es necesario cuando se est´ a congelando una unidad de 405 ml debido al volumen de la unidad y a la necesidad de mantener una velocidad r´ apida de congelaci´on para minimizar la hem´ olisis de los gl´ obulos rojos. La sangre se descongela con prop´ositos de transfusi´ on sumergi´endola en un ba˜ no de agua a sustancialmente 54◦ C con agitaci´on mec´anica durante 2

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un per´ıodo de sustancialmente un minuto. Con este tratamiento la sangre puede usarse para transfusi´ on inmediatamente, (con tal de que la hem´ olisis est´e en un nivel aceptable) lo cual es su principal ventaja sobre las unidades de sangre congeladas con glicerol. Esto es debido a que el crioprotector extracelular HES no es t´oxico ni inmun´ ogeno, asemej´ andose al gluc´ ogeno del cuerpo, as´ı que no hay necesidad de su eliminaci´on. El Documento US 4018911 describe un m´etodo de ensayo para congelar muestras de s´ olo 25 ml usando este m´etodo en el que una media de 99,2% de los gl´ obulos rojos se recupera en el estado despu´es de descongelado, y 87,3% era estable en disoluci´ on salina isot´ onica despu´es de media hora. Sin embargo, los resultados para unidades est´andar de tama˜ no completo eran mucho peores, con un grado de recuperaci´on de c´elulas de hasta 97,2% y una estabilidad en soluci´on salina de hasta 75,7%. El uso de HES como crioprotector para preservar en estado de congelaci´ on eritrocitos, y rombocitos, leucocitos, c´elulas de la m´edula o´sea y otras c´elulas del organismo se describe en la Solicitud de patente del Reino Unido GB 2046772A. Las c´elulas se separan, por ejemplo, por centrigufaci´ on. separaci´on celular, filtraci´ on o adsorci´ on. Una breve descripci´ on de un proceso de congelaci´ on para eritrocitos se refiere a la separaci´on de c´elulas por separaci´on celular (que se distingue de la centrifugaci´ on, presumiblemente a fin de dejar algo de plasma con las c´elulas) y adici´ on de una soluci´ on de HES al 10% en una relaci´ on de 2/3 (HES/concentraci´ on de eritrocitos). Se reivindican tasas de recuperaci´ on de entre 95 y 98%.

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Estos documentos de la t´ecnica anterior indican que podr´ıan almacenarse y recuperarse gl´ obulos rojos, usando HES como un crioprotector, con niveles de hem´ olisis aceptables, en partidas muy peque˜ nas (25 ml en la Patente de EE.UU. 4018911). Sin embargo, hasta ahora no ha sido posible almacenar y recuperar gl´obulos rojos en cantidades compatibles con t´ecnicas de transfusi´ on. Adem´ as la variaci´ on en los factores de recuperaci´ on para muestras nominalmente id´enticas es inaceptablemente alta. As´ı, aunque se conoce desde hace mucho tiempo el valor potencial de un servicio de transfusi´ on que implica gl´ obulos rojos congelados crioprotegidos con HES, hasta ahora se ha probado que es imposible idear un m´etodo que d´e niveles de hem´olisis aceptables durante la recuperaci´on con una variaci´ on aceptablemente baja en los niveles.

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De acuerdo con la presente invenci´ on un m´etodo para congelar gl´ obulos rojos usando HES como crioprotector incluye las etapas de centrifugar una unidad de sangre para separar el plasma y las plaquetas de los gl´ obulos rojos, mezclar los gl´ obulos rojos con HES, y congelar la mezcla, caracterizado porque los gl´ obulos rojos antes de mezclarse tienen un Volumen de C´elulas Empaquetadas de no menos de 90% y porque el HES en la mezcla est´a presente en no m´as de 7% en p/v de HES/gl´ obulos rojos.

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El volumen de c´elulas empaquetados, o hemocrito, es una funci´ on bien conocida en la t´ecnica y se define, por ejemplo, en la P´ agina 32 de “Practical Haemotology” de Sir John V Davie y S M Lewis, 6a ¯ edici´on, Churchill Livingstone 1984, ISBN 0444301981-9. Se tendr´an en cuenta que con el m´etodo de la presente invenci´on, en contraste con la t´ecnica anterior, no hay sustancialmente plasma en la mezcla. Adem´as, a pesar de la p´erdida de cualquier efecto protector que podr´ıa estar proporcionado por el plasma, el m´etodo de la presente invenci´on usa porcentajes significativamente menores de p/v de HES/gl´ obulos rojos.

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Aparte del logro de niveles de hem´olisis aceptables, otra ventaja del m´etodo resulta de la ausencia de plasma y de la reducci´ on en HES.

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El plasma contiene muchas prote´ınas diferentes, incluyendo factores responsables de la coagulaci´ on de la sangre, uno de los cuales es el Factor 8. Se ha encontrado que cuando se mezcla HES con plasma hay una tendencia progresiva de que algunas prote´ınas, especialmente los factores de coagulaci´ on, componentes complementarios, inmunoglobulinas, y fibronectina, se hagan insolubles, seg´ un se incrementa el HES (S Bell, MSc Thesis, Library of Brunel University). Estas prote´ınas forman agregados que hacen que el plasma desarrolle un color lechoso. Al encontrarse con plasma sin tratar, in vivo o in vitro, estos agregados pueden servir como focos para m´ as agregaci´ on de prote´ınas, mientras que al mismo tiempo el HES puede interactuar con m´ as prote´ınas en el plasma fresco. El residuo resultante es eliminado por macr´ ofagos y podr´ıa reducir temporalmente la inmunocompetencia del paciente. Debido a que son afectados los factores de coagulaci´ on y la fibronectina, el tiempo de hemorragia podr´ıa prolongarse en proporci´ on a la “dosis” de HES. El HES est´ a preferiblemente en forma de una disoluci´ on de 40% en p/v de HES, y el HES puede tener un peso molecular medio en el intervalo de 150.000 a 200.000.

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Una unidad preferida se basa en la unidad est´ andar de donante de 450 ml y tiene sustancialmente 200 ml de gl´ obulos rojos mezclados con sustancialmente 35 ml de soluci´ on de HES al 40% para dar una 3

ES 2 062 509 T3 unidad total para congelaci´ on de aproximadamente 235 ml.

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Los gl´obulos rojos pueden tratarse ventajosamente con un anticoagulante y conservante (tal como, por ejemplo, citrato-fosfato-dextrosa-adenina (CPDA), citrato-fosfato -dextrosa (CPD), o heparina) antes de mezclarse con el HES. El proceso de congelaci´ on tiene lugar preferiblemente en nitr´ ogeno l´ıquido con la mezcla en una bolsa de congelaci´on mantenida en un bastidor que tiene dos placas perforadas paralelas entre las que est´ a contenida la bolsa de congelaci´on, estando adaptadas entre s´ı permaneciendo mientras paralelas.

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Un bastidor preferido tiene placas de aluminio de forma curvada, siendo la curva una secci´ on de configuraci´ on cil´ındrica o, preferiblemente, esf´erica.

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Se ha encontrado que la mezcla de la bolsa de congelaci´ on es muy sensible al engrosamiento local de la bolsa durante el proceso de congelaci´on. Hay una tendencia de la mezcla a expandirse durante la congelaci´on, y los bastidores de congelaci´on de la t´ecnica anterior se distorsionan para dar pandeo local, para acomodarse a esta expansi´ on, o evitan la expansi´ on adecuada, causando as´ı da˜ nos por aplastamiento. Permitiendo el movimiento normal de placas paralelas se evita el engrosamiento local de la mezcla de congelaci´on.

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Con el m´etodo de acuerdo con la presente invenci´on, el volumen de una unidad est´ andar, cuando se prepara para congelaci´ on (235 ml), es tal que se ha encontrado posible congelar la mezcla a velocidad adecuada sin agitar la bolsa de congelaci´ on como se requer´ıa por los m´etodos anteriores. Esto da como resultado una reducci´ on significativa en el requerimiento de equipo y en complicaciones de operaci´on, y tambi´en evita una causa potencial de hem´ olisis (da˜ no f´ısico a las c´elulas causado por agitaci´ on). Los gl´obulos rojos despu´es de centrifugar preferiblemente se hacen pasar directamente a una bolsa de congelaci´on en la que est´a almacenado HES.

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La sangre congelada por el m´etodo anterior se prepara preferiblemente para transfusi´ on por inmersi´ on andose as´ı otra posible causa de hem´ olisis), durante en agua caliente a alrededor de 43,5◦C, sin agitar (evit´ aproximadamente diez minutos hasta alcanzar aproximadamente la temperatura del cuerpo humano. Se ha encontrado que, usando el m´etodo anterior para congelar y descongelar una unidad de sangre, basada en una unidad est´ andar de donante, puede alcanzarse un rendimiento de c´elulas estables en soluci´on salina, en media hora, de 91% DT ± 0,75% y una media de recuperaci´ on durante la descongelaci´on de 99,1% ± 0,12%. La sangre puede estar lista para transfusi´ on a un paciente en once minutos desde la retirada del almacenamiento en nitr´ ogeno l´ıquido. Un m´etodo de llevar a cabo la invenci´ on, y un aparato para usar con la invenci´ on, se describir´ an ahora, a modo de ejemplo s´ olo, con referencia a los dibujos esquem´aticos adjuntos, de los que: la Figura 1 es una vista esquem´atica del procedimiento desde recibir una unidad est´ andar de sangre de un donante hasta la mezcla de HES y gl´ obulos rojos en una bolsa de congelaci´on;

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la Figura 2 es una vista en planta de una placa que se usa en un bastidor de congelaci´ on para usar con la invenci´on;

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la Figura 3 es una vista en planta correspondiente a la Figura 1 y que muestra una bolsa de congelaci´ on en posici´ on sobre la placa, y; la Figura 4 es un alzado lateral, en secci´ on, de un bastidor de congelaci´ on con la bolsa de congelaci´on en posici´ on.

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Una unidad est´ andar de sangre (450 ml) de un donante (no mostrado) se dona a trav´es de un tubo 10 (Fig. 1) hasta una bolsa 11 de almacenamiento que contiene un anticoagulante y conservante (CPDA) que se cierra herm´eticamente y se coloca en una centr´ıfuga (no mostrada). Centrifugar la bolsa 11 da como resultado la separaci´on del plasma y las plaquetas, que se extraen y fluyen hasta una bolsa 12.

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Gl´ obulos rojos (sustancialmente 200 ml), empaquetados hasta un PCV no menor de 90%, pasan a una bolsa de congelaci´ on 13, que contiene sustancialmente 35 ml de almid´on hidroxiet´ılico (HES), preferiblemente al 40% en p/v y de peso molecular de 150.000 a 200.000. Esto da aproximadamente 25,5% de 4

ES 2 062 509 T3 HES en el fluido externo a, y que ba˜ na, los gl´obulos rojos, de modo que el HES est´ a presente en no m´as de 7% p/v de HES/gl´ obulos rojos (preferiblemente 6% p/v de HES/ gl´ obulos rojos).

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La bolsa 13 de congelaci´ on es de configuraci´ on plana, delgada y cuadrada. La bolsa 13 se retira entonces y se cierra herm´eticamente despu´es de extraer el aire, y el HES y los gl´obulos rojos se mezclan mediante, por ejemplo, inversi´on y rotaci´ on manuales durante varios minutos. El proceso desde la donaci´on de sangre hasta el cierre herm´etico de la bolsa 13 debe llevarse a cabo en circunstancias est´eriles, y preferiblemente el procedimiento se dispone de modo que las conexiones desde el tubo 10 hacia la bolsa 13 de congelaci´on son continuas y sin fracturas, y que cualquier desenganche pueda efectuarse por separaci´on y cierre herm´etico simult´aneos de cualquier conexi´on. Los procesos generales de centrifugaci´ on, y de mezcla de los gl´obulos rojos con el disolvente (HES) son bien conocidos en la t´ecnica - por ejemplo en el Documento US 4018911 y de ah´ı que no necesiten una explicaci´on m´ as completa aqu´ı.

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Un bastidor de congelaci´on (Figuras 2, 3, 4) tiene 2 placas 20, 21, que es cada una sustancialmente cuadrada y est´ a curvada para formar parte de la superficie de una esfera, siendo las esferas conc´entricas, teniendo la exterior un radio aproximadamente 3 mm mayor que la interior. la esfericidad es, por ejemplo, de tal orden que hay un desplazamiento de 2 cm en el centro de una cuerda del bastidor de aproximadamente 3 cm (habi´endose encontrado este tama˜ no de bastidor adecuado para la congelaci´ on de una unidad est´andar de sangre). Los bordes de cada placa, 20, 21, tienen rebordes 22 para permitir que las placas se sit´ uen en relaci´on entre s´ı. Cada placa est´ a formada de un material, preferiblemente aluminio, que tiene buenas propiedades de conducci´ on t´ermica, y tiene una pluralidad de perforaciones 23 (Fig 2) que ocupar´ an sustancialmente 50% del ´area de la superficie. La bolsa 13 de congelaci´on se coloca en la placa 21 de modo que esta completamente rodeada por partes perforadas de las placas (v´ease la Fig 3). La segunda placa 20 se coloca entonces sobre la primera placa 21 y la bolsa 13 y se mantiene en posici´on mediante un n´ umero de pinzas, tales como las que se muestran en 24 en la figura 4. Los brazos de retenci´ on 25 de cada pinza tienen un ligero grado de flexibilidad y se sit´ uan a fin de que retengan los bordes de los bastidores 20, 21 donde no est´ an superpuestos a la bolsa 13 de congelaci´on. Los bastidores 20, 21 y la bolsa 13 de congelaci´ on se sumergen entonces verticalmente en una cuba (no mostrada) de nitr´ ogeno l´ıquido, congel´ andose r´ apidamente la mezcla HEN/gl´obulos rojos en aproximadamente 30 segundos. Hay una tendencia de la mezcla a expandirse al congelarse, y la flexibilidad de los brazos de retenci´on de las pinzas 24 permite que las placas 20, 21 se separen ligeramente para compensar esta expansi´on. Sin embargo, la curvatura de las placas 20, 21 evita que se distorsionen, con el resultado de que permanecen paralelas entre s´ı en todos los puntos y mantienen el grosor de la bolsa de congelaci´ on constante sobre toda su a´rea. Se ha encontrado que esto es importante, ya que se ha encontrado que la expansi´ on local de la bolsa de congelaci´on da como resultado una hem´ olisis local incrementada. La sangre congelada como se describe arriba puede almacenarse a la temperatura del nitr´ogeno l´ıquido durante per´ıodos considerables. Cuando se retira de un congelador se prepara preferiblemente para tranon durante un per´ıodo de sfusi´ on por inmersi´ on en agua caliente a aproximadamente 43,5◦C sin agitaci´ aproximadamente 10 minutos durante los cuales su temperatura puede dejarse aumentar hasta, preferiblemente, la temperatura de la sangre humana antes de usarse para transfusi´ on. Se ha encontrado que usando este m´etodo se alcanzan niveles de hem´olisis del orden de no peores del 1% que es un rendimiento apreciablemente mejor de gl´obulos rojos que el que se alcanza con m´etodos de congelaci´on y preparaci´ on anteriores. La siguiente Tabla 1 da detalles de 10 muestras congeladas y recuperadas mediante el m´etodo descrito arriba. El bastidor de congelaci´ on usado ten´ıa ´areas perforadas de las placas 20, 21 de 0,9 mm de grosor y bordes no perforados de las placas de 1,2 mm de grosor.

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ES 2 062 509 T3 Tabla 1

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Resultados de control de calidad despu´es de la descongelaci´on para los paquetes de 235 ml de HES (Levosan/sangre)

% de estabilidad en soluci´on salina

% de recuperaci´on

10 1 2

Hora

2 Horas

30

91,5 88,5 99,3 paquete uno 90,1 87,5 99,1 paquete dos 92 89 99,0 paquete tres 92,5 90 99,2 paquete cuatro 90,3 87,8 99,1 paquete cinco 90,4 87,8 99,1 paquete seis 91,3 88,9 99,1 paquete siete 91,1 88,8 99,1 paquete ocho 90,6 88,2 98,9 paquete nueve 90,5 88,2 98,9 paquete diez estabilidad media en 12 hora recuperaci´on media = 99,1% en soluci´ on salina = 91,0% DT 0,12% DT 0,75% La estabilidad media en plasma es 4% superior a la estabilidad en soluci´ on salina

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La Tabla 2 detalla par´ ametros importantes que muestran que la eficiencia de suministro de ox´ıgeno y la supervivencia de los gl´obulos rojos no se alteran ni se afectan significativamente por el m´etodo descrito arriba.

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ES 2 062 509 T3 Tabla 2 - Resultados de P50 y DPG (P50 es la Presi´on Parcial de Ox´ıgeno, DPG es di (o bis) fosfoglicerato). 5

Paquete N◦

Sangre total fresca en CPDA, ≤ 24 horas

DPG

P50

DPG

910 911 912 913 914 915 001 002 003 004 005 006 048 049 050 051 052 053 625 449 071 Media DT unidades

28,5 27 26 25 26,5 27 28 27 29 28 27 25,5 27,5 26 25,5 27 25,5 23,5 25,5 27,5 26 26,6 1,27 P50 mm de HG,

3,43 4,38 4,01 3,82 3,56 4,78 6,27 3,43 5,19 5,2 3,01 5,08 4,21 4,19 4,3 4,66 4,39 3,75 2,91 3,48 3,48 4,15 0,81 DPG mM/l

Mezcla antes de congelar; gl´ obulos rojos P50 DPG

Mezcla despu´es de descongelar gl´ obulos rojos P50 DPG

27,5 26 23,5 25 25 27,5 27,5 26 28 28,5 27 26,5 28,5 26 23 27 26 24 25,5 26,5 27 26,4 1,6

24 25 23 24 23 26 25,5 25,5 25,5 28 26,5 28 27 26 23 26 25,5 23,5 22 22,5 20,5 24,7 3,83

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3,86 4,88 4,4 4,33 3,86 4,66 4,72 4,5 5,22 5,28 3,63 4,58 3,51 4,22 4,2 4,56 4,81 3,74 2,9 3,32 4,19 4,27 0,61

3,82 3,85 3,86 3,76 3,86 3,84 5,79 5,56 5,41 4,88 3,31 4,57 4,39 3,72 4,05 5,41 4,73 3,22 3,01 3,79 3,4 4,19 0,64

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Se ver´a, por lo tanto, que el invento proporciona un m´etodo para preservar y recuperar unidades est´andar de gl´ obulos rojos con un nivel repetible de hem´ olisis aceptable para prop´ ositos de transfusi´ on. El hecho de que el volumen del est´andar se reduzca a aproximadamente 235 ml es una ventaja adicional ya que permite que se trasfundan m´as unidades (es decir m´as gl´obulos rojos) a un paciente de una vez. La mezcla de transfusi´ on est´a sustancialmente libre de impurezas que podr´ıan perjudicar a un paciente y la cantidad de HES es reducida comparada con la que usan m´etodos de congelaci´on de la t´ecnica anterior.

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Adem´as el proceso total es considerablemente m´ as simple que los procesos descritos en la t´ecnica anterior ya que no requiere maquinaria tal como la que se requiere para hacer vibrar el bastidor de congelaci´on y la bolsa de congelaci´ on durante un proceso de congelaci´ on. De hecho un operador puede congelar sangre sin usar m´ as equipo que manoplas protectoras y unas tenazas. Tambi´en el procedimiento de descongelaci´on puede realizarse por voluntarios sin entrenar sin nada m´ as complicado que una cubeta de que juzgan que es de agua “caliente para las manos”, estimando diez minutos, y todav´ıa alcanzan excelentes resultados. Se comprender´ a que pueden usarse diversas modificaciones del m´etodo y el equipo antes descritos dentro del alcance de la invenci´ on. Por ejemplo aunque las placas 20, 21 se han descrito como de configuraci´ on esf´erica, y estos es, por supuesto, ideal, es posible que una curvatura cil´ındrica sola o alguna forma de configuraci´ on en a´ngulo sea suficiente para mantener la naturaleza paralela de las placas aunque permitiendo todav´ıa el movimiento relativo normal durante el proceso de congelaci´ on. Tambi´en podr´ıan 7

ES 2 062 509 T3 usarse otros materiales en vez de aluminio.

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Tambi´en se comprender´ a que, aunque el m´etodo est´a destinado para usar con unidades est´ andar de sangre, para que sea compatible con las pr´ acticas de donantes y de transfusi´ on convencionales, puede usarse para unidades m´ as peque˜ nas. Por ejemplo puede usarse en la preparaci´ on de saquitos - esto es bolsas de tama˜ no peque˜ no de, por ejemplo, dimensiones de 5 cm cuadrados - para almacenamiento para uso experimental o para muestras de tipos raros de sangre.

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ES 2 062 509 T3 REIVINDICACIONES

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1. Un m´etodo para congelar gl´ obulos rojos usando HES como un crioprotector, que incluye las etapas de centrifugar una unidad de sangre para separar el plasma y las plaquetas de los gl´ obulos rojos, mezclar los gl´ obulos rojos con HES, y congelar la mezcla, caracterizado porque los gl´ obulos rojos antes de mezclarse tienen un volumen de c´elulas empaquetadas de no menos de 90% y porque el HES en la mezcla est´a presente en no m´as de 7% en p/v de HES/gl´ obulos rojos. 2. Un m´etodo seg´ un la reivindicaci´ on 1 caracterizado porque el HES est´ a presente en 6% en p/v de HES/gl´ obulos rojos. 3. Un m´etodo seg´ un la reivindicaci´ on 1 o en la reivindicaci´on 2, caracterizado porque el HES est´ a en forma de una soluci´ on de 40% en p/v de HES.

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4. Un m´etodo seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el HES tiene un peso molecular medio en el intervalo de 150.000 a 200.000. 5. Un m´etodo seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la unidad de sangre est´a basada en una unidad est´ andar de donante de 450 ml.

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6. Un m´etodo seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los gl´ obulos rojos se tratan con un anticoagulante antes de mezclarse con el HES. 7. Un m´etodo seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la congelaci´ on tiene lugar en el nitr´ ogeno l´ıquido. 8. Un m´etodo seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la mezcla est´a en una bolsa (13) de congelaci´ on.

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9. Un m´etodo seg´ un la reivindicaci´ on 8 caracterizado porque la bolsa (13) de congelaci´ on se mantiene en un bastidor que tiene dos placas (20, 21) perforadas paralelas durante la congelaci´ on, siendo las placas (20, 21) curvadas y estando situadas una respecto a la otra por medios (24, 25) que permiten que las placas (20, 21) se muevan ligeramente normales entre s´ı mientras que permanecen paralelas.

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10. Un m´etodo seg´ un la reivindicaci´ on 9, caracterizado porque las placas (20, 21) son curvadas esf´ericamente. 11. Un m´etodo seg´ un la reivindicaci´ on 9, caracterizado porque las placas (20, 21) son curvadas cil´ındricamente.

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12. Un m´etodo seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el bastidor est´a formado de aluminio. 13. Un m´etodo seg´ un la reivindicaci´ on 12, caracterizado porque las a´reas perforadas de las placas (20, 21) tienen un grosor de 0,9 mm. 14. Un m´etodo seg´ un la reivindicaci´ on 12 o la reivindicaci´on 13, caracterizado porque los bordes no perforados de las placas (20, 21) tienen un grosor de 1,2 mm.

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15. Un m´etodo seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque el bastidor no se agita durante la congelaci´on. 16. Un m´etodo para congelar gl´ obulos rojos, caracterizado porque incluye las etapas de: centrifugar una unidad est´ andar de donante de 450 ml de sangre para separar el plasma y las plaquetas y alcanzar un volumen de c´elulas empaquetadas de gl´ obulos rojos de no menos de 90% que ocupan un volumen de sustancialmente 200 ml; introducir los gl´ obulos rojos en una bolsa (13) de congelaci´ on que contiene sustancialmente 35 ml de disoluci´ on de HES al 40% en p/v, teniendo el HES un peso molecular medio en el intervalo de 150.000 a 200.000; situar la bolsa (13) de congelaci´ on en un bastidor que tiene dos placas (20, 21) curvadas paralelas adaptadas para moverse ligeramente normales entre s´ı permaneciendo mientras paralelas; y colocar el bastidor de congelar en nitr´ogeno l´ıquido y dejarlo all´ı sin agitaci´ on hasta que la mezcla de HES y gl´ obulos rojos se ha congelado.

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ES 2 062 509 T3 17. Un m´etodo para preparar gl´ obulos rojos, congelados por el m´etodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para transfusi´ on, caracterizado porque la mezcla de HES y gl´obulos rojos se sumerge on durante un per´ıodo de aproximadamente 10 en agua caliente a aproximadamente 43,5◦C sin agitaci´ minutos. 5

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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