INVESTIGA I+D+i 2015/2016 GUÍA ESPECÍFICA DE TRABAJO SOBRE “IMAGEN Y BIOMEDICINA” Texto de D. Daniel Luque Buzo, Dña. Amparo Vivo y D. Fernando González-Camacho Octubre de 2015

Introducción a la microscopía Desde los comienzos de la Humanidad el hombre se ha hecho preguntas en relación al entorno que le rodea y sobre sí mismo y su propia naturaleza. La necesidad de tener respuestas nos ha conducido a indagar cada vez más en busca del conocimiento. Fue a finales del siglo XVI y durante el s. XVII cuando se produce una revolución científica: se establece un método de estudio basado en la observación, la formulación de preguntas y la experimentación; se crean las primeras sociedades científicas y surgen las primeras revistas médicas donde se publican los resultados. Es precisamente a este periodo al que hay que remontarse para encontrar los orígenes del microscopio, en el padre e hijo Janssen y en Galileo Galilei. Estos primeros instrumentos compuestos estaban formados por dos lentes colocados a ambos extremos de un tubo rígido. Estos instrumentos iniciales eran toscos, con poca resolución. El naturalista Leeuwenhoek, con su destreza para pulir lentes consiguió dar el empujón definitivo a la microscopía. A partir de este momento aparece un mundo desconocido a los ojos de la humanidad, el descubrimiento del mundo microscópico, de nuevas formas de vida, aparece el concepto de célula, el empleo vertiginoso de este instrumento ya será imparable. El perfeccionamiento del microscopio óptico llegó en el siglo XIX, con las correcciones de las aberraciones cromáticas de las lentes, y el empleo de los objetivos de inmersión que permitieron llegar al máximo posible de la resolución óptica. A partir de este momento los avances, en cuanto al microscopio óptico, han sido puntuales, como el microscopio de

fluorescencia, el microscopio de contraste de fases, o el microscopio confocal. A principios del siglo XX, Hans Busch desarrolló las primeras lentes electromagnéticas, capaces de dirigir un haz de electrones de forma análoga a la que una lente óptica lo hace con la luz. Pocos años después, en 1931, el físico Ernst Ruska, junto con el ingeniero Max Knoll, utilizaron este descubrimiento para construir el primer microscopio electrónico de transmisión (TEM, del inglés Transmision Electron Microscope): un instrumento capaz de superar la máxima resolución posible de un microscopio óptico gracias a la menor longitud de onda de los electrones respecto a los fotones de luz visible. En los siguientes años, Ernst junto con Bodo von Borries, trabajaría en el perfeccionamiento del microscopio electrónico, mientras su hermano y doctor en medicina Helmut Ruska comenzaba a aplicar estos microscopios a la investigación en medicina y biología, siendo el primero en estudiar las estructuras de diversos microorganismos, especialmente virus, hasta ese momento inaccesibles al microscopio óptico. En 1937 Manfred von Ardenne desarrolló el primer microscopio electrónico de barrido (SEM, del inglés Scanning Electron Microscope). Mientras que el TEM utiliza los electrones transmitidos a través de la muestra para proporcionar una imagen de proyección de la muestra, el SEM utiliza el haz de electrones para escanear una muestra cubierta de carbón o un metal y así obtener una imagen tridimensional de la superficie de la misma. Microscopía óptica de muestras biológicas La observación directa de muestras biológicas en un microscopio óptico resulta complicada debido a que éstas y el medio en el que se encuentran son prácticamente lo mismo: agua. La escasa diferencia en sus índices de refracción produce un escaso contraste, lo que conlleva a que no se distingan las muestras de su entorno. Para poder observar estas muestras es necesario aumentar el contraste para que destaquen sobre el fondo. Uno de los procedimientos más comunes es el empleo de colorantes específicos, bien mediante tinciones con un solo colorante (tinciones monocromáticas), bien mediante una combinación de dos o más colorantes. El microscopio que se emplea para la observación de las muestras así tratadas se denomina microscopio de campo claro y la observación es sencilla ya que el contraste entre el fondo y la muestra es muy evidente. Estos métodos son una práctica muy habitual en parasitología, bacteriología, histología, y un largo etcétera. El empleo de colorantes supone, en la mayoría de los casos, la “muerte” de la muestra a observar, ya que para evitar el deterioro de la misma, se realiza un proceso de fijación de la muestra que permite preservarla. No obstante, hay circunstancias donde necesitamos observar nuestras muestras pero preservando su viabilidad y

necesitamos recurrir a otras técnicas de observación que no impliquen fijación y ni el empleo de colorantes. Es de destacar el caso de los cultivos celulares, extensamente empleados tanto en diagnóstico como en investigación. Todo cuarto de cultivos necesita de un microscopio donde se puede comprobar el estado del cultivo, su crecimiento, su aspecto citopático, etc. En este caso se emplea un microscopio invertido equipado con un sistema que aprovecha las propiedades de la luz (diferencia de fases) para destacar y hacer visible los contornos de las células sobre el medio en el que están creciendo. Este microscopio, se denomina de contraste de fases y dispone de dos anillos de fases que proporcionan el contraste necesario. Otro microscopio que aprovecha otra de las propiedades de la luz (diferencia en la interferencia) para resaltar la muestra sobre el fondo sin necesidad de tinciones es el microscopio de contraste interdiferencial (DIC) o Nomarsky. Este instrumento utiliza una serie de polarizadores y prismas para lograr observar la preparación en relieve, con sensación de 3D. Otra técnica empleada para la observación tanto de muestras vivas como de muestras fijadas es la microscopía de fluorescencia, basada en la capacidad que tienen ciertas sustancias para absorber energía procedente de una determinada longitud de onda seguida de la emisión de luz en una longitud de onda mayor. El microscopio de fluorescencia (epifluorescencia) comenzó a utilizarse de manera habitual en los laboratorios a principios de la década de los 70 del siglo XX y ha tenido una gran evolución durante estos años llegando al desarrollo del microscopio confocal. Éste, se trata de un microscopio de fluorescencia muy sofisticado que permite obtener imágenes de alta calidad y resolución eliminando la luz fuera de foco y permitiendo hacer secciones ópticas de muestras gruesas. Los métodos más sencillos en los que se utiliza la fluorescencia es mediante el empleo de colorantes que tienen afinidad por un componente determinado de la célula, de todos los posibles el más empleado es la tinción del núcleo celular mediante el empleo de intercalantes de ADN, como el DAPI, pero existen muchos más como el mitotracker, que tiñe mitocondrias, la faloidina para marcar el citoesqueleto de actina, tinción de membranas, de lípidos y un largo etcétera. Estas tinciones suelen combinarse con procesos más complejos como son la inmunofluorescencia, en la que se emplean anticuerpos específicos conjugados con fluorocromos para detectar proteínas determinadas. Esta técnica es muy utilizada tanto en investigación como en diagnóstico de enfermedades. Otra de las modalidades es el empleo de sondas de ácidos nucleicos marcadas fluorescentemente. Esta técnica se conoce como hibridación in situ fluorescente (FISH) y es muy empleada en el diagnóstico de enfermedades genéticas.

Cultivo de células MA104 infectadas con Rotavirus. Transcurridas seis horas después de la infección, el cultivo se fijó y se marcadó con el colorante DAPI que tiñe los núcleos en azul, y una doble inmunofluorescencia, en rojo para detectar el retículo endoplásmico y en verde para detectar la proteína vírica NSP4. Los lugares que presentan coloración amarillo y naranja es donde existe una colocalización entre la proteína viral y el retículo. Dejando a un lado las técnicas de microscopía de luz transmitida (campo claro, contraste de fases y contraste interdiferencial) y centrándonos en las de fluorescencia (epifluorescencia y confocal), podemos considerar que estas técnicas se emplean en dos grandes campos, por un lado en la investigación biomédica y por otro en el diagnóstico clínico. La microscopia de fluorescencia empleada en el diagnóstico en microbiología va asociada a la realización de la técnica de inmunofluorescencia para detectar la presencia directa del patógeno, o bien la evidencia de su presencia mediante la detección de antígenos específicos. Los laboratorios de diagnóstico suelen estar equipados con microscopios sencillos de epifluorescencia donde observan las muestras y las dan como positivas o negativas en función del resultado observado y de los controles llevados. Esta técnica de diagnóstico suele acompañar a otras técnicas moleculares como son la PCR o el ELISA. Por otro lado, los microscopios de epifluorescencia también son muy habituales en los laboratorios de investigación de determinadas áreas, como son de biología celular, microbiológicos, etc. Estos

microscopios, además van equipados con ordenadores y cámaras muy sensibles que sean capaces de capturar imágenes de fluorescencia. Para estudios muy finos de colocalización entre proteínas, o la captura tridimensional de imágenes se emplea un microscopio mucho más sofisticado, el microscopio confocal, que va a permitir hacer secciones ópticas de las muestras que se observan permitiendo el estudio fino en un único plano independientemente del espesor de la muestra, también va a permitir reconstruir las secciones ópticas tomadas para obtener una imagen tridimensional de la preparación. Microscopía electrónica de muestras biológicas A pesar del beneficio que supone la mayor resolución del microscopio electrónico con respecto al microscopio óptico, las características propias del equipo generan varias limitaciones para la observación del material biológico. El haz de electrones interacciona fuertemente con la materia, lo que implica que la columna del microscopio electrónico debe estar en alto vacío (por lo que las muestras observadas deben resistir un proceso de deshidratación) y que el haz de electrones va a producir un fuerte daño sobre las sensibles muestras biológicas. Además, los electrones tienen una capacidad de penetración muy limitada (habitualmente 0.5-1 µm), lo que junto con las limitaciones anteriores va a requerir una especial preparación de los especímenes a estudiar en función de la naturaleza de las mismas y de las estructura a analizar. En el caso de soluciones de macromoléculas o microorganismos de pequeño tamaño (menores que la capacidad de penetración de los electrones) es posible su observación mediante técnicas de tinción negativa y criomicroscopía electrónica. En el caso de la tinción negativa, el espécimen bajo estudio es adsorbido sobre una superficie de carbón previamente ionizada y posteriormente es embebido en una sal de un elemento pesado electrodenso y resistente al daño electrónico (acetato de uranilo, formiato de uranilo, fosfotungstato amónico, silicotungstato amónico, etc.). Este proceso, por una parte va a preservar la muestra y nos va a dar una imagen invertida o negativa de la misma; ya que donde hay material biológico (poco electrodenso) los electrones va a transmitirse y donde hay sal pesada (muy electrodensa) los electrones son detenidos. Las principales ventajas de esta técnica son la facilidad de preparación y el alto contraste de las imágenes obtenidas. Por otra parte, la necesidad de adherir la muestra a una superficie, la deshidratación intrínseca a la técnica y el uso de agentes de tinción pueden alterar la estructura bajo estudio. En el caso de la criomicroscopía electrónica la muestra es congelada a temperaturas cercanas a la del nitrógeno líquido a alta velocidad de forma que el agua se adquiere una estructura vítrea o amorfa. A diferencia del hielo “convencional”, que tiene estructura

cristalina, el hielo vítreo carece de estructura y es poco electrodenso. Mediante esta técnica es posible la observación directa de las macromoléculas en su estado nativo e hidratado, ya que la baja temperatura protege al espécimen de la deshidratación y, parcialmente, del daño electrónico. Sin embargo, la escasa diferencia en electrodensidad entre el hielo vítreo y el material biológico que embebe hace que el contraste sea muy bajo. Además, es posible obtener información sobre la superficie de la muestra mediante la generación de réplicas y sombreados metálicos de la misma. Finalmente, mediante el uso de las modernas técnicas de procesamiento digital de imagen es posible recuperar la información tridimensional de las estructuras bajo estudio a partir de las imágenes de proyección obtenidas tanto por tinción negativa como mediante criomicroscopía electrónica.

Partículas de rotavirus visualizadas en el microscopio electrónico mediante análisis de cortes ultrafinos (izquierda), tinción negativa (centro) y criomicroscopía electrónica (derecha). Barra de escala: 100 nm. En el caso de muestras de mayor tamaño como células, tejidos y órganos, el haz de electrones es incapaz de atravesar el espécimen, por lo que es necesaria la generación de cortes ultrafinos para poder observar la ultraestructura de la muestra bajo estudio. Durante este proceso la muestra debe ser fijada mediante químicos como formaldehido, glutaraldehido y tetróxido de osmio; deshidratadas e incluidas en una resina plástica. Posteriormente, la muestra incluida será cortada con un ultramicrotomo para obtener secciones muy finas (normalmente menos de 100 nm) que permiten el paso de los electrones. Dichas secciones serán contrastadas mediante soluciones de metales pesados como citrato de plomo y acetato de uranilo y observadas en el microscopio electrónico. Si los procesos de deshidratación e inclusión son realizados a baja temperatura, hablamos de criosustitución y se obtiene una mayor preservación de la ultraestructura bajo estudio. Por otra parte, al igual que en especímenes de menor tamaño, es posible generar replicas metálicas que nos proporcionaran información topológica o de superficie de la

muestra. Finalmente, de forma similar a la inmunofluoerescencia en microscopía óptica, mediante técnicas de inmunomicroscopía electrónica, es posible localizar moléculas mediante el uso de anticuerpos específicos acoplados a oro coloidal (electrodenso). Desde sus comienzos, la microscopía electrónica ha tenido un papel fundamental para moderna biología celular y estructural. Actualmente tiene un papel fundamental en la caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a la enfermedad (tanto a las enfermedades causadas por microorganismos como no infecciosas), en la determinación de la ultraestructura de células y tejidos, en la determinación de la estructura microrganismos y complejos macromoleculares en su contexto natural y un largo etcétera. La microscopía ha tenido un rol central en el campo de la virología incluyendo el descubrimiento de un gran número de virus, el diagnóstico de los mismos y la investigación de las interacciones virus-célula. Aunque en el campo del diagnóstico la microscopía electrónica ha sido desplazada por modernas técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, estas técnicas sólo son aplicables a patógenos conocidos y caracterizados. Este hecho, junto con su rapidez y su potencial capacidad para visualizar prácticamente cualquier virus, convierten a la microscopía electrónica en una herramienta fundamental para la detección y caracterización de infecciones emergentes de importancia sanitaria, nuevos agentes patógenos y alertas por bioterrorismo. En el caso de la biología estructural, la combinación de las modernas técnicas tridimensionales como el análisis de partículas individuales y la tomografía electrónica permiten visualizar la arquitectura de grandes complejos llegando a resoluciones atómicas o cuasiatómicas. En el campo de la biología celular, las modernas técnicas de preparación de muestras como la congelación a alta presión y la criosustitución, permiten una mayor preservación de las estructuras celulares bajo estudio. Este hecho junto al desarrollo de microscopios cada vez más potentes están permitiendo la caracterización de las estructuras subcelulares en su entorno hidratado nativo a la par que permiten contextualizar espacialmente dichas estructuras. Potenciales temas de debate • Como hemos visto, existen una gran variedad de técnicas de microscopía óptica, pero una de ellas es imprescindible en cualquier laboratorio que trabaje con cultivos celulares ¿Qué tipo de microscopio se emplea en estos laboratorios y por qué lo crees? ¿Cuáles son sus fundamentos físicos? • En muchos hospitales y laboratorios de diagnóstico emplean microscopios sencillos para observar muestras histológicas, son

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los microscopios de campo claro, sin embargo, el proceso de “preparado” de la muestra puede ser muy laborioso ¿qué métodos de preparación de muestras se emplean para realizar este diagnóstico? ¿Cuáles son las tinciones más comunes? La microscopia de fluorescencia es una modalidad de microscopía óptica que se emplea tanto en el diagnóstico como en investigación, ¿Cuáles son los principios por los que se rige? Y ¿Cuáles son los componentes específicos de estos microscopios? Muy habitualmente la microscopía de fluorescencia va asociada al empleo de anticuerpos específicos mediante la técnica de inmunofluorescencia ¿Cuáles son los principios fundamentales de esta técnica? ¿Qué resultados se obtienen? Un microscopio de fluorescencia muchos más sofisticado es el microscopio confocal ¿cuáles son sus principios fundamentales? ¿Cuáles crees que son los componentes que los diferencian del resto de microscopios? Con el microscopio confocal se ha llegado al límite máximo teórico de resolución óptica. Este límite se puede superar con la técnica de FRET, con los microscopios de super-resolución y con la microscopía electrónica. ¿En qué consiste la técnica de FRET? Los microscopios de super-resolución han supuesto un hito histórico ¿por qué?, ¿en qué consisten? ¿Cuáles son las aplicaciones de la microscopía electrónica al diagnóstico de patógenos? ¿Qué patógenos han sido descubiertos gracias a la microscopía electrónica? ¿Qué patógenos son diagnosticados mediante microscopía electrónica? ¿Cuál es el papel de la microscopía en enfermedades emergentes y alertas de bioterrorismo? ¿En qué consiste la moderna microscopía electrónica tridimensional? ¿Cuáles son los avances aportados por el análisis de partículas individuales y la tomografía electrónica? Microscopía electrónica de alta resolución: ¿Es posible determinar la estructura de un complejo macromolecular a nivel atómico mediante microscopía? ¿Dónde están los límites? Nuevas microscopías: ¿Qué nuevas microscopías se están desarrollando?

Fuentes de información • The source for microscopy education (Nikon). https://www.microscopyu.com/ • Microscopy Resource Center (Olympus). http://www.olympusmicro.com/index.html • Molecular expressions: http://micro.magnet.fsu.edu/index.html

• MyScope (Australian Microscopy & Microanalysis Research Facility) http://www.ammrf.org.au/myscope • Introduction to electron microscopy (FEI) http://www.fei.com/introduction-to-electron-microscopy/ • Microscopy websites https://www.jic.ac.uk/microscopy/links.html • Blog Ciencias biosanitarias para todos: http://gonzalez-camacho.blogspot.com.es/