Leer por completo este protocolo antes de su uso.

25OH Vitamina D Total ELISA I.

USO PREVISTO

Ensayo inmunoenzimático para la medición cuantitativa in vitro de 25-hydroxyVitamina D2 y D3 (25OH-D2 y 25OH-D3) en suero.

II.

INFORMACIÓN GENERAL

A.

Nombre propietario:

DIAsource 25OH Vitamina D Total ELISA Kit

B.

Catalogue numero:

KAP1971

C.

Fabricado por:

: 96 tests

DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium. Para asistencia técnica o información de pedido contactarse: Tel : +32 (0)10 84.99.11 Fax : +32 (0)10 84.99.90

III. ANTECEDENTES CLÍNICOS La Vitamina D es el término genérico utilizado para designar la Vitamina D2 o ergocalciferol y Vitamina D3 o colecalciferol. La Vitamina D3 humana se produce de manera natural cuando la piel se expone a los rayos solares ultravioletas. En el hígado principalmente, la Vitamina D es metabolizada a 25-HidroxiVitaminaa D3 (25OH D3) la cual es la principal forma de Vitamina D circulante en el cuerpo. El 25OH D3 es un precursor para otros metabolitos de Vitamina D y también tiene una actividad limitada por sí misma. El derivado más activo es la 1,25-hidroxiVitaminaa D3, producida en el riñón (o placenta) por 1-hidroxilación de 25OH D3. La Vitamina 25OH D3 estimula la absorción intestinal tanto del calcio y el fosforo así como la reabsorción ósea y la mineralización. La Vitamina 25OH D3 puede también ser activada en otros tejidos responsables por el transporte de calcio (placenta, riñón, glándula mamaria…) y glándulas endocrinas (glándulas paratiroideas, células beta…) La Vitamina D3 y la Vitamina D2 están también disponibles por ingestión mediante la alimentación o suplementos dietarios. Como la Vitamina D2 es metabolizada de manera similar a Vitamina D3, ambas contribuyen al estado general de Vitamina D en un individuo. Esta es la razón por la cual es muy importante medir ambas formas de 25OH Vitamina D igual para un correcto diagnóstico de deficiencia de Vitamina D, insuficiencia o intoxicación. La deficiencia de la Vitamina D es un importante como factor de riesgo para en los resultados de raquitismo, osteomalacia, osteoporosis senil, cáncer y embarazo. La medición de ambas formas de 25OH Vitamina D es también requerida para determina la causa de concentraciones séricas anormales de suero en pacientes. Se ha demostrado que la intoxicación con Vitamina D causa daños renales y tisulares.

IV.

PRINCIPIOS DEL MÉTODO

El kit DIAsource 25OH Vitamina D Total ELISA es un Ensayo Inmunosorbente Unido a Enzima en microplaca. Durante un primer paso de incubación de 2 horas, a temperatura ambiente, la 25OH Vitamina D Total (D2 y D3) presentes en los calibradores, controles y muestras es disociada de las proteínas de unión séricas para fijar en los sitios de unión de un anticuerpo monoclonal específico. Después de 1 paso de lavado, una cantidad fija de 25OH Vitamina D-marcada con biotina en presencia de peroxidasa de rábano picante (HRP), compite con la 25OH Vitamina D2 y 25OH Vitamina D3 que no se encuentra marcada presente en los sitios de unión del anticuerpo monoclonal específico. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente la microplaca es lavada para detener la reacción de competencia. La solución Cromogénica (TMB) es adiciona e incubada durante 15 minutos. La reacción es detenida con la adición de la Solución de Parada y la microplaca es luego leída a la longitud de onda apropiada. La cantidad de sustrato invertido es determinado colorimétricamente por medición de la absorbancia, la cual es inversamente proporcional a la concentración de 25OH Vitamina D Total ELISA (D2 y D3) de las muestras que son determinadas por interpolación de dosis desde la curva de calibración. V. RECTIVOS PROVISTOS Reactivos

96 Test Kit

Código de color

96 pozos

Azul

1 vial liofilizado

Amarillo

Reconstitución Listo para uso

Microplaca (96 pozos separables) con anti 25OH Vit. D2 y D3 (anticuerpos monoclonales) CAL

0

Adicionar 2 ml agua destilada

VI. MATERIALES NO SUMINISTRADOS El siguiente material es necesario, pero no se proporciona dentro del kit: 1. Agua destilada 2. Pipetas de 50 ul, 150 ul, 200 ul, y 1 ml (se recomienda el uso de pipetas de precisión con puntas desechables de plástico) 3. Mezclador Vortex 4. Agitador magnético 5 Agitador horizontal de microplacas (300 a 700 rpm) 6. Lavadora para microplacas 7. Lector de microplacas para 450 y 650 nm (lectura monocromática) VI. VII. PREPARACION DE REACTIVOS A. Calibrador 0: Reconstituir el calibrador 0 con 2 ml de agua destilada B. Calibradores 1 - 5: Reconstituir los calibradores 1-5 con 1 ml de agua destilada C. Controles: Reconstituir los controles con 1 ml de agua destilada. D. Solución de trabajo conjugado HRP: ¡La solución de trabajo conjugado HRP debe prepararse durante la incubación y mínimo 1 hora 45 minutos antes de su uso¡ (cf X.B.5) Prepare un volumen adecuado de solución de trabajo conjugado HRP por mezcla del conjugado concentrado, el HRP concentrado y el tampón del conjugado de acuerdo al número de tiras a utilizar, como se indica en la tabla: Por ejemplo para 6 tiras (48 pozos): 100 µl de conjugado concentrado y 50 µl de HRP Concentrado para 10 ml de tampón de conjugado. Use un vortex para homogenizar. Dejar que el conjugado de trabajo HRP a temperatura ambiente y evitar la exposición directa a la luz solar o usar viales de vidrio oscuro para esta preparación. La preparación de conjugado de trabajo HRP no es estable y debe ser descartado si no es utilizado.

Calibrador 0: matriz biológica con gentamicina y proclin CAL

N

5 viales liofilizado

Amarillo

2 viales liofilizado

Plateado

Adicionar 1 ml agua destilada

Calibradores 1-5 (ver el valor exacto en las etiquetas de los viales)en suero de caballo con gentamicina y proclin CONTROL

N

Controles N = 2 En suero humano con proclin

INC

BUF

Tampón de Incubación con caseína y proclin CONJ

1 vial 20 ml

Verde

CONC

Conjugado concentrado 25OH Vit D CONJ

BUF

Tampón de conjugado con caseína y proclin HRP

CONC

1 vial 0.3 ml

Azul

Adicionar 1 ml agua destilada

Listo para uso Diluir 100 x con tampón de conjugado

1 vial 30 ml

Rojo

Listo para uso

1 vial 0.2 ml

Amarillo

Diluir 200 x con tampón de conjugado

HRP concentrado

WASH

SOLN

CONC

1 vial 10 ml

Café

Solución de lavado (TRIS-HCl)

CHROM

TMB

Solución cromogénica TMB

1 vial 12 ml

Diluir 200 x con agua destilada (usar un agitador magnético).

Listo para uso Café

(Tetrametilbenzidina) STOP

SOLN

Solución de parada

1 vial 12 ml

No. de tiras

Volumen conjugado concentrado ( µl )

Volumen HRP concentrado ( µl )

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

30 50 60 80 90 100 120 140 160 180 200 220

15 25 30 40 45 50 60 70 80 90 100 110

Volumen de tampón de conjugado ( ml ) 3 5 6 8 9 10 12 14 16 18 20 22

E. Solución de Trabajo Lavado: Preparar un volumen adecuado de Solución de Trabajo Lavado adicionando 199 volúmenes de agua destilada a 1 volumen de Solución de Lavado (200x). Usar agitador magnético para homogenizar. Descartar la solución de trabajo de lavado que no se utilice al final del día. VIII. ALMACENAMIENTO Y EXPIRACION DE REACTIVOS  Antes de la apertura o de su reconstitución, todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de vencimiento indicada en la etiqueta del vial, siempre y cuando se mantenga bajo una temperatura de 2 a 8 °C.  Después de la reconstitución, los calibradores y controles son estables durante ocho (8) semanas a una temperatura de 2 a 8°C. Para períodos más largos de almacenamiento, las alícuotas deben realizarse y mantenerse a una temperatura de -20°C para un máximo de 4 meses. Evite realizar continuas etapas de congelación y descongelación.  La solución de lavado recién preparada debe utilizarse el mismo día.  Las alteraciones en la apariencia física de los reactivos del kit pueden indicar inestabilidad o deterioro.

Listo para uso

HCl 1M

Nota: Usar el calibrador 0 para dilución de muestras con valores mayores al calibrador más alto. No hay material de referencia internacional disponible.

IX. RECOLECCION Y PREPARACION DE MUESTRAS Este kit es adecuado para muestras de suero. El suero debe mantenerse a una temperatura de 2 - 8°C. Si la prueba no se ejecuta dentro de las 24 horas, se recomienda almacenar las alícuotas a -20°C. Evite etapas posteriores de congelación y de descongelación.

X. PROCEDIMIENTO A. Notas sobre manipulación No utilice el kit o los componentes después de la fecha de caducidad. No mezcle materiales de diferentes lotes. Permita que todos los reactivos alcancen temperatura ambiente antes de su uso. Mezcle bien todos los reactivos y muestras agitándolas suavemente. Realice pruebas de calibradores, controles y muestras por duplicado. Se recomienda la alineación vertical. Utilice un recipiente de plástico limpio para preparar la solución de lavado. Para evitar la contaminación cruzada, use puntas de pipeta desechables para la adición de cada reactivo y de muestra. Para la dispensación de la Solución cromogénica y la Solución de Parada evite el uso de pipetas con partes metálicas. Las pipetas de alta precisión o equipo automático de pipeteado mejorarán la precisión. Respete los tiempos de incubación. Para evitar derivaciones, el tiempo entre el pipeteado del primer calibrador de la primera y la última muestra debe limitarse al tiempo mencionado en la sección XIII parágrafo E. (Retardo). Prepare una curva de calibración para cada prueba, no utilice los datos de pruebas anteriores. Dispense la solución Cromogénica dentro de los 15 minutos después del lavado de la microplaca. Durante la incubación con Solución cromogénica, evite la exposición a la luz directa del sol sobre la microplaca. B. 1.

2. 3. 4. 5.

6. 7.

8. 9. 10.

11. 12. 13. 14.

Procedimiento Seleccione el número requerido de tiras para la corrida. Las tiras que no se vayan a usar deben ser guardadas en la bolsa con el desecante y almacenado de 2-8°C. Asegure las tiras dentro de un marco de apoyo Pipetear 50 µl de cada calibrador, Control y Muestra dentro de los pozos apropiados. Pipetear 150 µl de Tampón de Incubación dentro de todos los pozos. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente, en un agitador de microplaca (300 a 700 rpm). Prepare la solución de trabajo conjugado HRP debe prepararse durante la incubación y mínimo 1 hora 45 minutos antes de su uso. Aspirar el líquido de cada pozo. Lavar la placa 3 veces así:  dispensando 0.35 ml de Solución de Lavado dentro de cada pozo  aspirando el contenido de cada pozo Pipetear 200 µl de la solución de trabajo de conjugado HRP dentro de cada pozo. Incubar la microplaca durante 30 minutos a temperatura ambiente, en un agitador de placa (300 a 700 rpm) Aspirar el líquido de cada pozo. Lavar la placa 3 veces así:  dispensando 0.35 ml de Solución de Lavado dentro de cada pozo  aspirando el contenido de cada pozo Pipetear 100 µl de Solución Cromogénica dentro de cada pozo en 15 minutos siguiendo el paso de lavado. Incubar la microplaca durante 15 minutos a temperatura ambiente, en un agitador de placar (300 a 700 rpm), evitar la exposición a la luz solar directa. Pipetear 100 µl de Solución de Parada dentro de cada pozo. Leer las absorbancias a 450 nm (filtro de referencia 630 nm o 650 nm) entre 1 hora y calcular los resultados como se describe en la sección XI.

XI.

CALCULO DE RESULTADOS

1.

Leer la placa a 450 nm contra el filtro de referencia configurado a 650 nm (o 630 nm). Calcular la media de las determinaciones por duplicado. También se pueden utilizar métodos asistidos por ordenador para la construcción de la curva de calibración. En caso de utilizar procesamiento automático de resultados, se recomienda una curva de función logística de 4-parámetros es el método recomendado. Por interpolación de los valores de DO de la muestra, determine la concentración de 25OH Vitamina D en las muestras desde la curva de calibración.

2. 3.

4.

XII.

INFORMACIÓN TÍPICA

Los siguientes datos tienen solamente fines ilustrativos y no deben ser usados en lugar de una curva real de calibración en tiempo real.

25OH-EASIA

Calibrador

Unidades

0 ng/ml 5.3 ng/ml 15 ng/ml 25.7 ng/ml 54.3 ng/ml 133 ng/ml

2.66 2.39 1.83 1.46 0.81 0.21

Nota: 1 ng/ml = 2.5 pmol/ml

XIII. RENDIMIENTO Y LIMITACIONES A. Límite de detección El Límite del Blanco (LoB), límite de Detección (LoD) y el Límite de Cuantificación (LoQ) son determinados de acuerdo con la guía CLSI EP17-A. El LoB fue calculado por medición del blanco varias veces y calculando el percentil 95 de la distribución del valores de la prueba. El LoB fue calculado es 1.69 ng/ml. El LoD fue calculado como se describe en la guía. El LoD fue calculado en 2.81 ng/ml.. El LoQ fue calculado por evaluación de 5 muestras de valor bajo 14 veces en diferentes pruebas. El LoQ fue calculado como 4,39 ng/ml con un CV de 20%. B. Especificidad La reactividad cruzada de la 25OH Vitamina D Total ELISA fue determinada mediante evaluación de suero con reactantes cruzados adicionados. Los resultados son resumidos en la siguiente tabla:

Componente

Reactividad cruzada (%)

25OH-Vitamina D3 a 10 ng/ml

100

25OH-Vitamina D2 a 10 ng/ml 1,25(OH)2-Vitamina.D3 a 200 ng/ml

86

1,25(OH)2-Vitamina.D2 a 690 ng/ml Vitamina D3 a 200 ng/ml Vitamina D2 a 200 ng/ml 24,25(OH)2-Vitamina.D3 a 20 ng/ml 25,26(OH)2- Vitamina D3a a 4 ng/ml 3-epi-25 hidroxi Vitamina a 20 ug/ml

20 1.9 2.9 1.3 >100 >100 0.1

El efecto potencial de las sustancias interferentes en la muestras utilizadas con el kit 25OH Vitamina D Total ELISA fueron evaluados. Diferentes niveles de hemoglobina, bilirrubina, triglicéridos, vitamina C, bilirrubina conjugada y no conjugada y Zemplar en las muestras de suero fueron evaluadas con diferentes concentraciones de 25OH Vitamina D. Nuestro criterio de aceptación fue tener interferencia de menos del 10%. Las sustancias evaluadas no afectaron el desempeño del kit 25OH Vitamina D Total ELISA.

Sustancia

25OH Vitamina D Total ELISA

Concentración interferente (mg/dl) 250 500 250 500 250 500 50 100 50 100 50 100 50 100 50 100 50 100 7.5 125 250 500 7.5 125 250 500 7.5 125 250 500 1 10 100 1 10 100 1 10 100 0.2 2 4 0.2 2 4 0.2 2 4 0.0013 0.0025 0.0050 0.0013 0.0025 0.0050

7.6 29.3 Hemoglobina 42.5 6.0 21.5

Bilirrubina conjugada

38.6 7.6 29.3

Bilirrubina no conjugada

42.5

7.6

29.3 Triglicéridos 42.5

6.0

21.5 Vitamina C 38.6

8.7

19.8 Biotina 36.1

17.6 Zemplar

%variación media

33.5

-0.6%

Mu estr a

#

ng/ml

1

57

22.5

2

57

52.9

3

29

124.9

N

2.5%

Total

0.22 0.3% 0.64 0.9% 1.00 1.4%

0.61 0.9% 1.57 2.3% 1.74 2.5%

0.98 3.8% 1.11 2.1% 1.84 1.5%

1.54 6.0% 2.28 4.3% 3.39 2.7%

2.21 8.7% 42.9 8.1% 4.98 4.0%

2.59 10.2% 5.19 9.8% 6.25 5.0%

SD CV SD CV SD CV

Recuperación (% )

0

100

25

96

50

92 Recuperación (% )

0

100

25

105

50

95

Dos muestras con concentraciones conocidas para ser distribuidas en un rango de medición evaluado con diluciones equidistantes para determinar el rango lineal del ensayo. Se realizó un análisis de regresión linean fue ejecutado. Los resultados son resumidos en la siguiente tabla:

-4.3%

Muestra 1 Dilución de muestra

2.5%

1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 4.7%

Conc. teórica (ng/ml)

Conc. Medida (ng/ml)

Pendiente

YIntercepto

R2

Recuperación(%)

96.7

96.7

100

48.5

47.6

99

24.2

24.5

12.1

11.1

92

6.0

6.2

102

Conc. teórica (ng/ml)

Conc. Medida (ng/ml)

122.9

122.9

100

61.5

64.5

105

30.7

31.5

15.4

15.0

98

7.7

7.6

99

1.00

-0.30

0.99

101

Muestra 2 Dilución de muestra

-4.4%

1/1 1/2 1/4 1/8

± SD (ng/ml)

Pendiente

1.01

YIntercepto

0.44

R2

0.99

Recuperación(%)

103

El rango lineal del ensayo esta entre 7.7. ng/ml y 122.9 ng/ml.

C.V. (% )

Muestra

C.V. (% )

5.5 ± 0.4

7.8

A

39

17.7±1.3

7.4

5.7

B

10

26.3 ± 1.3

4.7

A

24

B

35

C

35

43.0 ± 1.2

2.7

C

10

42.0 ± 1.9

4.3

D

35

81.2±2.0

2.5

D

21

85.4±7.8

9.2

SD: Desviación Estándar; CV: Coeficiente de Variación D.

Inter sitio

25OH-Vit.D2 Adicionada (ng/ml)

± SD (ng/ml)

27.4 ± 1.5

Inter técnico

25OH-Vit.D3 Adicionada (ng/ml)

INTER- ENSAYO N

Inter día

PRUEBA DE RECUPERACIÓN

-3.4%

1/16

Muestra

Interco rrida

E. Exactitud La recuperación fue verificada por la adición de diferentes niveles de 25OH Vitamina D a las muestras. Los resultados se resumen a continuación.

C. Precisión El ensayo fue calculado procesando muestras de un lapso de por lo menos 20 días con tres diferentes lotes. Los resultados son resumidos en la siguiente tabla: INTRA-ENSAYO

Intra corrida

Reproducibilidad

La reproducibilidad del ensayo fue llevada a cabo evaluando tres muestras por duplicado durante 5 días, dos veces al día, en 3 sitios con dos técnicos por lugar. Los resultados promedio son resumidos en la siguiente tabla:

E. Tiempo de retardo El tiempo de retardo entre el último calibrador y las muestras dispensadas se muestran en la siguiente tabla.

Muestra 1 Muestra 2

TIEMPO DE RETARDO 0 min (ng/ml) 10 min (ng/ml) 27.9 30.5 49.5 47.5

20 min (ng/ml) 30.2 49.0

Los resultados del ensayo permanecen siendo exactos cuando el tampón de incubación se dispensa 10 y 20 minutos después de que el calibrador ha sido adicionado en los pozos.

G. Limitaciones de la Prueba 1. La prueba es una ayuda en el diagnóstico y debe ser utilizado en conjunto con los hallazgos clínicos. 2. El rendimiento de la prueba no ha sido establecido en población pediátrica. 3. Las muestras de las que se sospecha contienen concentraciones por encima del calibrador más alto, deben ser analizadas diluidas. 4. No deben ser procesadas muestras hemolizadas. H. Método de Comparación El rendimiento de la prueba fue determinado por un estudio de correlación en tres diferentes lugares utilizando un total de 356 muestras. Las muestras se llevaron a cabo utilizando el 25OH Vitamina D Total ELISA de DIAsource y otro kit comercialmente disponible. Los resultados estuvieron en un rango entre 8.0 ng/ml a 123 ng/ml, el coeficiente de correlación entre los dos métodos fue de 0.917, con una confiabilidad del 95% en intervalo de 87.6% a 93.6%, una pendiente de 0.954 y el intercepto-Y de 3.05. La siguiente gráfica resume los resultados:

Central Único 95% (2.5-97.5%) de los resultados observados fueron usados.

XVI. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS Seguridad Únicamente para uso de diagnóstico in vitro. Los componentes de sangre humana incluidos en este kit han sido evaluados por métodos aprobados Europeos y/o aprobados por FDA y fueron encontrados como negativos para HBsAg, anti - VHC, anti-VIH-1 y 2. Ningún método conocido puede ofrecer una completa seguridad de que los derivados de sangre humana no transmitan hepatitis, sida u otras infecciones. Por lo tanto, la manipulación de los reactivos, suero o plasma especímenes deben estar de acuerdo con los procedimientos de seguridad local. Todos los productos de origen animal y sus derivados han sido recolectados de animales sanos. Los componentes bovinos proceden de países donde no se ha reportado la presencia de BSE. Sin embargo, los componentes que contienen sustancias animales deben ser tratados como potencialmente infecciosos. Evite cualquier contacto de reactivos con la piel. La solución de detención contiene HCl. En caso de contacto con ésta, lave con abundante agua. No fume, beba, coma o aplique cosméticos en la zona de análisis. No pipetear con la boca. Utilice ropa de protección y guantes desechables. XVII. BIBLIOGRAFÍA

XIV. CONTROL DE CALIDAD INTERNO 



  

Si los resultados obtenidos para el Control 1 y/o Control 2 no se encuentran dentro del intervalo de valores especificado en la etiqueta del vial, los resultados no pueden ser utilizados a menos que se cuente con una explicación satisfactoria de la discrepancia. Si se desea, cada laboratorio puede realizar sus propios grupos de muestras de control, que deben mantenerse congeladas en alícuotas. Los controles que contienen azida pueden interferir con la reacción enzimática y no pueden ser usados. Los criterios de aceptación para la diferencia entre los resultados de muestras en duplicado deben basarse en las Buenas prácticas de laboratorio. Se recomienda que los controles sean analizados rutinariamente como muestras desconocidas con el fin de medir la variabilidad. Los resultados del ensayo deben ser revisados con tablas de control de la calidad. Es bueno comprobar visualmente el ajuste de la curva seleccionada por el computador. XV. VALORES ESPERADOS La ingesta en la dieta, raza, estación y edad son factores conocidos que afectan los niveles normales de 25OH.Vit.D3 Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos basados en su población local. Literatura reciente ha sugerido los siguientes rangos para la clasificación del estatus de 25OH.Vit.D: Nivel Deficiencia Insuficiencia Suficiencia Toxicidad

ng/ml < 10 ng/mL 10-29 ng/mL 30 a 100 ng/mL >100 ng/mL.

Los rangos de referencia han sido establecidos basados en el estudio de 150 individuos aparentemente sanos. Las muestras individuales de suero usadas fueron obtenidas de una fuente comercial certificada y fueron tomadas del Centro de Donantes Licenciados con consentimiento informado. 50 muestras fueron del norte de EE.UU. (Pennsylvania), 50 muestras del centro de EE.UU. (Tennessee), y 50 muestras fueron del sur de EE.UU. (Florida). Las muestras fueron tomadas en los meses de invierno (Enero-Marzo), pacientes en edades entre 21 y 92 años que y se incluyeron personas de piel oscura. Los donantes no tomaron suplementos de vitamina D, no tenían historial familiar de paratiroidismo, o enfermedades de regulación e calcio, tampoco historia de enfermedades del riñón, hígado, paratiroides, enfermedad relacionada con el calcio, cirugía bariatrica y no consumieron medicamentos que afectaran la absorción o catabolismo de la vitamina D. A continuación se muestra la tabla de resumen: Conc. más alta (ng/ml) Conc. más baja (ng/ml) Conc. media (ng/ml)

Florida 88.66 6.1 20.8

Tennessee 71.7 4.9 15.9

Pennsylvania 54.6 5.9 14.3

Total 88.6 4.9 17.2

XVIII.

RESUMEN DEL PROTOCOLO CALIBRADORES (µl)

Calibradores (0-5) Controles, Muestra Tampón de incubación

MUESTRAS(S) CONTROLES(µl)

50

-

-

50

150

150

Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación continua a 400 rpm. Prepare el conjugado HRP de trabajo una vez la incubación haya iniciado y mínimo 1 hora 45 minutos antes de su uso. Aspirar los contenidos de cada pozo. Lavar 3 veces con 350 µl de Solución de Lavado y aspirar.

Conjugado de trabajo HRP

200

200

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación continua a 400 rpm. Aspirar los contenidos de cada pozo. Lavar 3 veces con 350 µl de Solución de Lavada y aspirar. .

Solución cromogénica

100

100

Incubar durante 15 min a temperatura ambiente en agitación continua.

Solución de parada

100

100

Realice la lectura en un lector de microplacas Registre la absorbancia de cada pocillo a 450 nm (contra 630 o 650 nm)

DIAsource Catalogo No. : KAP 1971

P.I. Numero : 1700547/en

Revisión No. : 140512/1

Fecha de revision: 2014-05-12