26ª REUNIÓN DEL GRUPO DE TRABAJO SOBRE ANÁLISIS Y TOXICIDAD DE LAS PROLAMINAS Lovaina (Bélgica), 20-22 Septiembre 2012 Un año más, la Asociación de Celíacos de Madrid ha asistido a la reunión del Grupo de Trabajo sobre Análisis y Toxicidad de las Prolaminas, dedicado al estudio de métodos de detección de gluten en alimentos así como de técnicas analíticas, para valorar anticuerpos específicos de la enfermedad celíaca en sangre. A continuación se resumen los temas tratados en ambos campos.

Estudios analíticos En este apartado se presentaron diversos trabajos relacionados con el desarrollo y utilización de métodos de detección de gluten en alimentos. El anticuerpo R5 es, hoy por hoy, el único validado para este fin, mediante la técnica ELISA tipo sándwich. Este anticuerpo fue obtenido inicialmente contra las secuencias tóxicas de las secalinas (gluten de centeno) que, además, reconoce igualmente secuencias similares en la cebada (hordeinas) y el trigo (gliadinas), pero no en la avena (aveninas). A pesar de ello, se investigan otras variantes de dicha técnica, como es el ELISA tipo competitivo, así como otros anticuerpos alternativos al R5, como el anticuerpo G12. Por otro lado, existen otras técnicas no enzimáticas, como la cromatografía o la espectrometría de masas, para realizar dichos análisis con igual o mayor fiabilidad. El Dr. Clyde Don (Holanda), miembro de la Asociación Americana de Química Clínica (AACC, American Association for Clinical Chemistry), está evaluando los resultados de un estudio colaborativo en el que participan varios laboratorios y que va encaminado a validar nuevos tests de detección de gluten en alimentos. Actualmente, han sido sometidos a estudio dos tests de la empresa R-Biopharm: Ridascreen Gliadin R7001 (técnica ELISA tipo sándwich) y Ridascreen Gliadin R7021 (técnica ELISA tipo competitivo). Las muestras alimentarias empleadas para la validación son proporcionadas por el Grupo de Trabajo sobre Análisis y Toxicidad de las Prolaminas (WGPAT, Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity). Para ello, han añadido cantidades conocidas y variables de gluten que se distribuyen homogéneamente en el producto alimenticio. El estudio es doble ciego, es decir, los laboratorios participantes desconocen la cantidad de gluten de las muestras que reciben, y analizan por duplicado cada una de ellas. El test tipo sándwich (R7001) ha sido evaluado por 15 laboratorios y los resultados obtenidos han mostrado resultados muy similares en las repeticiones realizadas en cada laboratorio así como entre diferentes laboratorios. Es necesario recordar que este test ya fue validado por un estudio Asociación de Celiacos de Madrid

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colaborativo en el año 2002. El test tipo competitivo (R7021), analizado por entre 11 y 13 laboratorios que emitieron resultados admisibles, según la muestra, mostró mayores discrepancias, aunque los resultados han sido aceptables. Por su parte, la Dra. Elisabeth Hammer (Reino Unido) presentó dos tests, comercializados por la empresa británica Rommer Labs, que emplean el anticuerpo G12. Este anticuerpo, desarrollado por la empresa española Biomedal, reconoce específicamente una secuencia que aparece repetida 5 veces en el péptido más tóxico del gluten de trigo, que es el denominado 33-mer. También reconoce secuencias similares en la cebada y el centeno, y detecta, además, la avena. El test AgraQuant Gluten G12, diseñado para realizar análisis en laboratorios, emplea la técnica ELISA tipo sandwich y ha sido calibrado con las muestras del WGPAT, obteniéndose buenos resultados. El otro test, denominado AgraStrip Gluten G12, está pensado para un uso doméstico y consiste en tiras inmunocromatográficas que detectan gluten por cromatografía, utilizando también el anticuerpo G12. Los métodos inmunológicos de detección, basados en anticuerpos, son suficientemente sensibles para detectar cantidades de gluten inferiores a 20 mg por kg de alimento (mg/kg) ó partes por millón (ppm), límite que determina si un producto se considera sin gluten o no según la normativa vigente. Son rápidos y permiten realizar análisis de forma rutinaria sin emplear grandes equipos. Sin embargo, no han resuelto el problema de detectar la cantidad real de gluten que contiene un alimento, ya que las técnicas desarrolladas y empleadas actualmente detectan gliadinas, pero no gluteninas, que también parecen ser tóxicas. Como norma se asume que gliadinas y gluteninas aparecen en igual proporción en el gluten, por lo que el contenido en gluten de un alimento se estima multiplicando por dos el resultado de la detección de gliadinas. El problema es que esta proporción puede variar de unos alimentos a otros, por lo que se sobreestima la toxicidad cuando hay más gliadinas que gluteninas y se subestima cuando las gluteninas son mayoritarias. Por otro lado, los resultados dependen del anticuerpo que se use y, en todo caso, deben ser calibrados con muestras de referencia que contienen cantidades conocidas de gluten. Por este motivo se investigan métodos no inmunológicos como alternativa para detectar gluten con mayor exactitud. La Dra. Katharina Konitzer (Alemania) presentó dos métodos cromatográficos y otro basado en espectrometría de masas. Los métodos cromatográficos permiten medir el contenido proteico mediante la emisión de radiación ultravioleta (método RPHPLC-UV) o bien fluorescencia (método RP-HPLC-FLD). Ambos tienen gran capacidad para detectar el contenido real de gluten, pero presenta varios problemas: el análisis lleva varias horas, la presencia de otras proteínas distintas al gluten puede interferir en el resultado y no detectan cantidades de gluten por debajo de las 250 ppm en el caso del método RP-HPLC-UV o de 25 ppm si el método empleado es RP-HPLC-FLD. En cuanto a la espectrometría de masas (LC-MS), es un método muy sensible pero no cuantifica el contenido de gluten con fiabilidad. Por tanto, dichos métodos no son recomendables para detectar gluten en alimentos, aunque sí podrían ser útiles para conocer el contenido en gluten de muestras que se empleen en estudios colaborativos para la calibración de otros métodos. La Dra. Païvi Kanerva (Finlandia) comentó cómo afecta la modificación química o enzimática del gluten durante la elaboración de alimentos a la hora de detectar la toxicidad del producto final. Es habitual en la industria alimentaria someter al gluten a un proceso de deamidación para aumentar su solubilidad. En estos casos, la toxicidad detectada puede llegar a ser la mitad o incluso dos tercios inferior a la toxicidad real. La técnica ELISA tipo competitivo tiene mayor capacidad de detección que la tipo sándwich para este tipo de muestras deamidadas. En varias ocasiones se ha analizado el contenido en gluten de la leche materna, por las implicaciones que ello pueda tener en el desarrollo de enfermedad celíaca en lactantes con predisposición genética. Los resultados han sido muy dispares, y oscilan entre 5 y 95 ng/ml si el método empleado es ELISA tipo sándwich o entre 29 y 9000 ng/ml si el método es de tipo competitivo. Además, no se ha observado correlación entre la cantidad de gluten ingerida y la cantidad de gluten detectada en la muestra de leche. La Dra. Carmen Mena (España) presentó

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los resultados obtenidos recientemente en su laboratorio en relación a este tema. Nuevamente, los datos son poco concluyentes, después de haber analizado numerosas muestras con distintos métodos analíticos. Se calcula que la cantidad de gluten en la leche materna es muy inferior a la que se mide habitualmente en los alimentos, por lo que los métodos diseñados para detectar gluten en alimentos no funcionan bien en el caso de la leche materna. Por ejemplo, la muestra de leche debe ser diluida mucho menos que si se tratase de un producto alimenticio si se quiere detectar gluten en ella, por lo que su procesamiento es más complicado al ser más viscosa. A esto se suma el elevado contenido en grasas y en proteínas (se han llegado a detectar más de 976 proteínas diferentes), que interfieren en la cuantificación, además de que la composición de la leche varía a lo largo de lactancia. A pesar de todo, esperan obtener mejores resultados adaptando los protocolos de detección. En este apartado se presentó también una estrategia para elaborar cerveza sin gluten. Se puede optar por utilizar cereales sin gluten o pseudocereales como materia prima, o bien reducir la toxicidad durante la elaboración de la cerveza si la materia prima es un cereal con gluten. La Dra. Verena Knorr (Alemania) ha estudiado la posibilidad de reducir la toxicidad aprovechando la actividad degradadora de gluten que poseen unas enzimas que se encuentran en los propios cereales y que actúan durante el proceso de malteado. Ha obtenido buenos resultados con cebada y con centeno. En lo referente a la avena y su toxicidad, después de analizar 78 genes de aveninas (proteínas equivalentes a las gliadinas del gluten de trigo) en 13 especies de avena, no se ha encontrado ninguna de las secuencias tóxicas que reconoce el anticuerpo R5 en trigo, cebada y centeno, y tampoco las que reconoce el anticuerpo G12, aunque en este caso hay secuencias similares que se diferencian en al menos 2 aminoácidos de las reconocidas por G12. Estos resultados refuerzan la idea general de que las avenas no son tóxicas. No obstante, hay caracterizadas dos secuencias que no aparecen en trigo, cebada ni centeno y que son tóxicas para celíacos.

Estudios clínicos El Dr. Paul Ciclitira (Reino Unido) presentó un nuevo estudio en el que se comprueba una vez más que los linfocitos T que reaccionan contra las gliadinas del gluten de trigo también lo hacen contra las secalinas del centeno y las hordeínas de la cebada, lo que demuestra la gran similitud existente entre las secuencias tóxicas presentes en el gluten de los 3 cereales y justifica el hecho de que un celíaco reaccione de forma adversa cuando consume cualquiera de ellos. Profundizando en los mecanismos patogénicos de la EC, el Dr. Fernando Chirdo (Argentina) habló de los estudios que está llevando a cabo sobre las vías de señalización que involucran al receptor CXCR3 y su ligando CXCL10. Según sus resultados, aún preliminares, los pacientes celíacos tienen un mayor número de células con el receptor CXCR3 en la lámina propia y niveles más altos del ligando CXCL10 en sangre que los sujetos sanos. En condiciones de inflamación, y especialmente en presencia de interferón gamma (IFN ), diversas células inmunitarias, como Asociación de Celiacos de Madrid

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neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e incluso enterocitos, son capaces de liberar CXCL10, y el receptor CXCR3 se expresa en la superficie de células T. Es interesante conocer el papel de estas moléculas, ya que las células T son clave en el proceso inflamatorio intestinal característico de la EC. Y centrándose en el proceso inflamatorio, el Dr. Conleth Feighery (Irlanda) dedicó su intervención a los linfocitos T intraepiteliales tipo gamma-delta, que se encuentran específicamente elevados en las biopsias de los pacientes celíacos, incluso después de haber eliminado el gluten de la dieta. Ha analizado la distribución de 3 subtipos de estos linfocitos en la sangre y en el intestino, tanto en niños como en adultos. Según sus resultados, los 3 subtipos están disminuidos en la sangre de pacientes celíacos adultos, pero no en niños. Sin embargo, tanto en niños como en adultos aparecen niveles muy elevados de uno de los subtipos (los otros dos se mantienen en niveles normales) en el intestino. A este tipo de linfocitos se les atribuye un papel regulador de la respuesta inmune y de ahí la importancia de su estudio. Por último, en este apartado el Dr. Frits Koning (Holanda) presentó los resultados de los ensayos clínicos realizados con pacientes para probar la eficacia de una terapia experimental encaminada a minimizar las consecuencias de posibles transgresiones a la dieta sin gluten. Se trata de la enzima AN-PEP, una prolil endopeptidasa del hongo Aspergillus niger que en el laboratorio ha demostrado su capacidad para destruir los fragmentos de gluten que son tóxicos para los celíacos. La enzima fue administrada a pacientes celíacos junto con alimentos que contenían diferentes cantidades de gluten. Para evaluar su capacidad degradadora se extrajeron muestras de fluido estomacal e intestinal a diferentes intervalos de tiempo. Se comprobó que los fragmentos tóxicos son destruidos en el estómago y no llegan al duodeno. No obstante, se observó que la eficacia de la enzima depende del tipo de alimentos ingeridos, ya que éstos pueden hacer variar el pH y por tanto la actividad enzimática. Este hecho puede condicionar la efectividad de esta terapia enzimática.

En un Simposio paralelo se habló sobre la utilidad de los anticuerpos para la detección de gluten en alimentos y en el diagnóstico de la EC. Anticuerpos para la detección de gluten en alimentos Hasta ahora, los tests analíticos que detectan gluten en alimentos reconocen gliadinas, pero no gluteninas, que también son tóxicas para los celíacos. El Dr. Olivier Planquet (Francia), tras evaluar una batería de anticuerpos generados contra todo tipo de proteínas de trigo, entre ellas gliadinas, gluteninas y albúminas, y contra polisacáridos, seleccionó el anticuerpo “PQQ 3B4” de clase IgM como el que mejor reconoce gliadinas y gluteninas. Incorporado en un test basado en la técnica ELISA tipo sándwich es capaz de reconocer, aunque con poca sensibilidad, gluten en Asociación de Celiacos de Madrid

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muestras estándar de diverso origen, incluyendo gliadinas deamidadas. Sin embargo, no detecta gluten cuando se aplica sobre muestras reales de alimentos que contienen gluten que ha sido deamidado durante el procesamiento industrial, tal vez porque se encuentra hidrolizado. Se plantea utilizar la técnica ELISA tipo competitivo para ver si mejora el resultado. Ahora van a empezar a probar otro anticuerpo, WDE1 de clase IgG. Anticuerpos en el diagnóstico de la enfermedad celíaca En lo relativo al diagnóstico, el Dr. Thomas Mothes (Alemania) comentó las limitaciones actuales del análisis serológico de anticuerpos, recordando que esta prueba no tiene valor diagnóstico por sí sola. Las situaciones conflictivas que planteó son las siguientes: -

¿Cómo diferenciar un falso positivo de un celíaco potencial? Hay pacientes que tienen valores positivos de anticuerpos y genética de riesgo en ausencia de lesión intestinal. Estos pacientes pueden presentar o no síntomas digestivos. Se considera enfermedad celíaca potencial si en el futuro desarrollan atrofia de vellosidades, pero es difícil predecir si va a ser así y cuándo, por lo que se duda si se trata de un falso positivo. Es una situación típica en diabéticos. En general, se postula que puede ser debido a una ingesta reducida de gluten.

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Fluctuación de los niveles de anticuerpos en niños. En ocasiones, en edad pediátrica pueden producirse elevaciones transitorias de los niveles de anticuerpos en sangre. En ausencia de síntomas, se recomienda repetir varias veces el análisis de anticuerpos durante un tiempo antes de hacer la biopsia.

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Anticuerpos antipéptidos deamidados de gliadina (DGP) de clase IgG. Los tests analíticos que detectan anticuerpos anti-DGP de clase IgG parecen ser más fiables que los que detectan anti-DGP de clase IgA o anti-tTG de clase IgG, y son equiparables a los tests anti-tTG de clase IgA. Se consideran especialmente útiles en pacientes con deficiencia de IgA y en niños menores de dos años en los que los valores de anticuerpos anti-tTG de clase IgA pueden ser negativos.

Por otra parte, la detección de depósitos de IgA en la biopsia intestinal puede ayudar a confirmar el diagnóstico en casos dudosos ya que, aunque no exista una clara lesión intestinal en el momento de la evaluación, la presencia de dichos depósitos predice con gran fiabilidad que el paciente acabará desarrollando una enteropatía causada por el gluten. Además, en este apartado se cuestionó la nueva guía de diagnóstico de la EC en niños y adolescentes publicada por la ESPGHAN, según la cual se puede prescindir de la biopsia en pacientes con síntomas y genética de riesgo en los que el valor de anticuerpos anti-tTG de clase IgA supera en 10 veces el límite de normalidad. Según el Dr. Mothes, esta conclusión se alcanzó a partir de los resultados de un único tests de los existentes en el mercado, y se ha hecho extensiva a todos ellos. Por otro lado, no todos los tests tienen capacidad para detectar valores tan altos de anticuerpos, salvo que se repita el análisis diluyendo la muestra.

Juan Ignacio Serrano Vela Investigación y Formación

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